交感神経系はClostridioides difficile感染に対する炎症反応を促進する

2024年10月11日 12:00

ログイン

オンライン報告1017712024年10月04日オープンアクセス

交感神経系はClostridioides difficile感染に対する炎症反応を促進する

https://www.cell.com/cell-reports-medicine/fulltext/S2666-3791(24)00510-X?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS266637912400510X%3Fshowall%3Dtrue

David Tyus∙Jhansi L. Leslie∙Farha Naz∙Md Jashim Uddin∙Brandon Thompson∙William A. Petri, Jr. wap3g@virginia.edu

ハイライト

化学的交感神経切除術はC. difficile感染マウスの病理を減少させた。

ノルエピネフリンシグナル伝達をロックすることで、C. difficileによる死亡率が抑制された。

死亡率に対するα2アドレナリン受容体の影響は性差に依存し、サブタイプ特異的である。

Adra2aの遺伝的アブレーションはC. difficile感染マウスの生存率を改善する。

概要

lostridioides difficile感染症（CDI）は、宿主の反応を亢進させることにより重症化を引き起こすことで知られる、米国における院内感染の主要原因である。本研究では、交感神経系（SNS）がCDIの重症度に及ぼす影響を明らかにする。CDIのマウスモデルには、CDI発症前にSNS活性阻害剤を投与する。化学的交感神経切除またはノルエピネフリン合成の薬理学的阻害は、CDIモデルにおける死亡率と重症度を大幅に減少させる。α2アドレナリン受容体の薬理学的遮断または遺伝的切除は腸の炎症、重症度、死亡率を改善した。これらの結果は、CDIの病態における中枢神経系とα2アドレナリン受容体の役割を強調するものであり、神経系を標的とすることが重症の疾患における治療法として有望であることを示唆している。

抄録

キーワード

はじめに

日和見嫌気性菌であるクロストリジオイデス・ディフィシル（C. difficile）は、腸管バリアを破壊する毒素を産生し、下痢、大腸炎、脱水、死に至る。ディフィシル病は、その重症度だけでなく、標準的な抗生物質で治療された患者が、治療後8週間以内に20％の割合で感染を繰り返すという、他に類を見ない厄介な問題でもある2。より広くは、CDIを支える生物学的要因の理解が限られているため、リスクのある患者の特定や重症化した疾患の管理における新たな戦略の構築が妨げられている。

過去10年間で、CDIの発症における免疫系の役割が明らかになり、大きな進歩を遂げた。その後、CDIマウスを用いた実験により、CDI発症に影響を及ぼす他の生物学的システムが明らかになった。最近、Manionらは、CDIモデルを用いて、症状の発現と炎症の制御に求心性感覚ニューロンが中心的に関与していることを強調し、神経系の疾患への潜在的な寄与を示唆する研究16,17,18,19,20,21,22の土台を築いたと同時に、CDIの病態形成におけるニューロンと神経媒介物質の作用機序についての疑問を投げかけた23。

ストレス、感染症、大腸炎は複雑な相互作用を共有している。24、25、26逆説的ではあるが、うつ病とある種の抗うつ薬はともにCDIリスクの上昇に関連している。動物モデルでも患者でも、NSの構成要素、特にノルエピネフリンとその下流のアドレナリン作動性受容体（AR）が、大腸炎の発症に繰り返し関与している30,31,32,33,34,35SNSの関与が疾患の転帰に及ぼす影響の方向は多因子的であり、状況に大きく依存する（組織、感染因子、年齢など）が、免疫、バリア、微生物機能に対するアドレナリン作動性の影響はよく知られており、さらなるin vivoの例は、疾患の状況を超えたパターンの確立に役立つであろう。

本研究では、CDI病態におけるSNSの役割を調べた。CDIマウスモデルにおいてSNSの活性を阻害することにより、腸の炎症と死亡率が有意に減少することが観察された。さらに、ノルエピネフリン合成またはα2アドレナリン受容体（α2AR）の薬理学的阻害により、これらの効果が再現された。さらに、α2AR遺伝子Adra2aの遺伝子破壊は、疾患の重症度を軽減し、C. difficileが介在する病態におけるSNSとそのエフェクターの重要な役割を強調した。

結果

化学的交感神経切除はC. difficile感染マウスの腸管障害と死亡率を軽減した。

CDI発症におけるSNSの役割を調べるため、CDI感染モデルマウスを用い、6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）を用いて交感神経切除が疾患の重症度と死亡率に及ぼす影響を検証した。-OHDAはカテコールアミン作動性末端を選択的に切断する神経毒であり、疾患におけるSNSの関与を示唆する様々な場面で用いられてきた。症状の発現（2日目）において、6-OHDAを投与したマウスは、ビヒクルを投与したマウスに比べて大腸ノルエピネフリン濃度が低下していた（図1B）。重要なことは、6-OHDA投与はC. difficile感染マウスの臨床的重症度と死亡率を有意に減少させたことである（図1C、S1A、S1B）。さらに、6-OHDAは感染前に軽度の体重減少を引き起こしたが（示さず）、6-OHDA処置マウスではCDI誘発性早期体重減少が減弱した（図1DおよびS1C）。重要なことに、6-OHDAの臨床的重症度と体重減少に対する効果は、雌性CDIマウスでも明らかであった（図S1BおよびS1C）。

図1 化学的交感神経切除はC. difficile感染マウスの腸の損傷と死亡率を軽減する。

キャプション

感染後2日目において、6-OHDAを投与したマウスでは、疾患の重症度が軽いことに伴い、腸管組織の損傷が少なく、上皮構造が保たれ、出血は少なかったが浮腫は認められなかった（図1Eおよび1F）。興味深いことに、6-OHDAは2日目の糞便内容物のC . difficile菌量に影響を与えなかった。これは、C. difficile菌量に影響を与えることなく薬理学的介入により予後が改善したことを示す以前の知見と一致する（図1G-1I）6。さらに、6-OHDAは、多様な毒素レパートリーを発現するC. difficileのVPI 10643変異株（バイナリー毒素欠損株）に対する防御効果を示した（図S1D）。これらのデータを総合すると、SNSはCDIの病態に必要であり、その効果は株特異的ではないことが示唆される。

ノルアドレナリン作動性シグナル伝達の阻害はCDIの重症度を改善する

オレピネフリンはSNSの主要な神経伝達物質であり、CDIマウスの結腸では症状発現時に増加する（図2A）。しかしながら、このシステムはエピネフリン、ドーパミン、および様々な神経ペプチドも放出し、これらすべてが腸および免疫機能に重要な影響を及ぼす可能性がある。さらに、6-OHDAはノルアドレナリン作動性ニューロンとドーパミン作動性ニューロンにそれぞれノルエピネフリントランスポーターとドーパミントランスポーターを介して取り込まれ、その結果、ノルアドレナリン作動性ニューロンとドーパミン作動性ニューロンの両方の末端が破壊される。

図2 ノルアドレナリン作動性シグナル伝達の阻害はCDIの重症度を改善する。

キャプション

6-OHDAの保護作用がノルアドレナリンニューロンを介して作用するかどうかを調べるため、ノルエピネフリントランスポーター遮断薬であるデシプラミンをマウスに投与した。エシプラミンはノルアドレナリン作動性ニューロンへの6-OHDAの取り込みを阻害し、ノルアドレナリン作動性ニューロンを温存するが、ドーパミン作動性ニューロンは6-OHDAに対して脆弱なままである。デシプラミンを6-OHDA投与の30分前に注射すると、死亡率に対する6-OHDAの保護効果は完全に消失した（図2Bおよび2C）。このことは、ノルアドレナリン作動性ニューロンがCDI病態の推進に極めて重要であることを示している。

ノルエピネフリンの役割についてさらに検討するため、ドーパミンからノルエピネフリンへの変換を阻害することで、CDI誘発死亡率および臨床的重症度に対する保護効果が得られるかどうかを調べた（図2DおよびS1G）。エピカスタットは、ノルエピネフリンとエピネフリンの合成を担う酵素であるドパミンβ水酸化酵素の阻害剤である。ネピカスタットのラル投与はCDIマウスの死亡率を大幅に減少させた（図2E）。epicastatはCDI誘発の体重減少率をわずかに、しかし有意に軽減したようであった（図2F）。ネピカスタットはノルエピネフリンとエピネフリンの両方を枯渇させるはずであるが、6-OHDAはその主な産生源である副腎髄質のエピネフリンを枯渇させない42。これらのデータを総合すると、ノルエピネフリンはCDI病態を駆動するSNSの主要なメディエーターであることが示唆される。

α2ARのロックアウトはサブタイプ特異的にCDIを介した病態を予防する。

ノルエピネフリンには、α1、α2、β1、β2、β3の5つの主要なARサブタイプが存在し、いずれもGタンパク質共役型受容体で、様々な細胞型で発現している。CDIを媒介する受容体を同定するために、αあるいはβアドレナリン作動性拮抗薬をマウスに投与した（図S2；サブタイプ特異的拮抗薬については図S3A-S3Hを参照）。プラゾシンによるα1 ARのロックは、CDIマウスの死亡率にほとんど影響を与えなかった（図S2Aおよび2B）。プロプラノロール（β1/β2 AR受容体遮断薬）またはSR59230A（β3 AR受容体遮断薬）による治療も、CDIマウスの死亡率に対する保護効果をもたらさなかった（図S2C-S2F）。実際、我々の所見は、βAR遮断がCDIマウスの死亡率を悪化させる可能性を示唆している。

α2AR遮断薬RX 821002（RX；図3A）を投与すると、6-OHDAの保護効果がほぼ再現された（図3BおよびS1H）。RXはCDI誘発体重減少を防御しなかったが（図3C）、腸上皮細胞損傷を防御し、出血を予防した（図3Dおよび3E）。別のα2AR阻害剤であるヨヒンビンもCDIマウスの死亡率を低下させたが、体重減少には影響を及ぼさなかった（図S4DおよびS4E）。6-OHDAと同様、RXは浮腫を予防せず、またプレーティング法で測定した1日目の糞便ペレットやqPCR法で測定した2日目の糞便内容物中のC. difficile負荷には影響を与えなかったが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）放出で測定した場合にはわずかに減少した（図3F-3HおよびS4B）。しかし、α2受容体阻害の結果、糞便内容物中の毒素A/B濃度はわずかに減少した（図3I）。

図3 α2アドレナリン受容体の遮断はCDIが介在する病態を予防する。

キャプション

2AR受容体はさらにα2a（げっ歯類では薬理学的にα2dと定義される）、α2b、α2cのサブタイプに分けられる。e.は、特異的な薬理学的アンタゴニストを用いて、CDIマウスのα2ARの3つのサブタイプを系統的に阻害した。α2bとα2cのサブタイプを阻害しても、効果はほとんどなかった（図S3C-S3F）。注目すべきは、Adra2aサブタイプのアンタゴニストであるBRL 44408を使用した場合、死亡率に対する保護にわずかではあるが有意な効果が認められたことである（RX処置マウスの生存率15％と87％を比較）（図S3AおよびS3B）。Adra2c阻害剤JP 1302を投与しても、さらなる保護効果は得られなかった（図S3GおよびS3H）。げっ歯類とヒトのα2a受容体はAdra2a遺伝子によってコードされているが、げっ歯類のα2a受容体は異なる薬理学的プロファイルを持っている。これらの違いから、げっ歯類のα2a受容体はα2d受容体として分類されている43,44。RXは他のα2AR拮抗薬と比較してα2d ARに対する親和性が高く、α2a特異的阻害薬BRL 44408と比較してCDIマウスにおいてより大きな効果を示すことが説明できる（図3BおよびS3A）。これらの結果は、α2a AR（薬理学的にはα2d）受容体がCDIにおける疾患を媒介することを示唆している。

Adra2aの遺伝子破壊は雄性CDIマウスの死亡率を減少させる

α2ARの薬理学的阻害がCDIの重症度を改善することを観察した後、我々は、受容体の遺伝子欠損が低分子阻害の効果を再現するかどうかをテストするよう促された。α2ARにはAdra2a、Adra2b、Adra2cの3つのサブタイプがある。Adra2aと大腸炎との関連が知られていることから32,33、また受容体のAdra2a/Adra2dサブタイプの遮断が最も顕著な薬理効果を示すという我々の発見に基づき、我々はAdra2aノックアウト（KO；図S5Bの遺伝子型決定）がCDI疾患の重症度に及ぼす影響を評価することにした。

Adra2aのヘテロ接合体マウス（および野生型[WT]と同傾向）と比較して、Adra2aKOマウスは、体重減少率には影響がなかったものの、生存率と臨床スコアが著しく改善した（図3J、3K、およびS3I）。この効果はα2AR遮断で観察された薬理学的効果と一致しており、特に雄マウスで顕著であったが、雌マウスでは見られなかった（図S4F-S4H）。RXの投与は雄マウスに強い効果を示したが、雌マウスには効果がなかったことから、α2受容体の性差に依存した役割は薬理学的にも明らかであった（図S4C）。

化学的交感神経切除とα2AR遮断はCDIマウスの腸の炎症を抑える

交感神経系は炎症性疾患における免疫およびバリア機能の制御に重要な役割を果たしている。CDIでは、免疫細胞の浸潤が疾患の転帰に大きく影響する。好中球免疫と17型関連免疫はCDIからの防御に必須であるが、過剰な反応は予後不良につながる。

CDI時の腸の炎症に対するSNSの影響を評価するため、6-OHDAを投与したCDIマウスの大腸における好中球、好酸球、単球の数を評価した。単球と好酸球は比較的変化しなかったが、好中球の数と割合は6-OHDAを投与したマウスでは未投与の感染マウスに比べて有意に減少した（図4A；図S5Aのゲーティング戦略）。6-OHDA投与前にデシプラミン（「Des」と表示）で前処置した氷では、好中球数は未処置マウスと同程度であり、単球と好酸球の数はさらに多かったが、これはおそらくノルエピネフリンのバイオアベイラビリティを増加させるデシプラミンの相加的効果によるものであろう46。

図4 化学的交感神経切除はCDIマウスの腸の炎症を軽減する。

キャプション

図4 交感神経系の化学的切除によりCDIマウスの腸の炎症が減少した。しかし、6-OHDA投与CDIマウスでは、感染後2日目に、ビヒクル投与CDIマウスと比較して、糞便のKi67染色が（特に陰窩で）大きく減少していることがわかった（図S1EおよびS1F）。6-OHDAの投与により、症状発現時の上皮増殖はCDIにおけるSNS遮断の保護効果を説明するものではないと考えられる。

CDIの転帰に影響を及ぼす多様な免疫エフェクターを考慮し、われわれはLuminexサイトカインアレイを用いて、セカル組織溶解液から分子炎症反応の特徴を明らかにすることを目指した。細胞学的所見と一致して、感染後2日目の6-OHDA投与マウスでは、KCや MIP-2（CXCL1およびCXCL2としても知られる）などの好中球浸潤に関連するサイトカインおよびケモカインのレベルが、無処置マウスに比べて低下していることが観察された（図4B）。当然のことながら、2型（および他の型）免疫に関連するサイトカインも減少または不変であり、CDIにおける炎症の発症にSNSが必要であることをさらに裏付けている。α2AR遮断薬RXで治療したマウスでも同様の結果が得られた（図S4 A；Table S2 ）。これらの所見から、CDIではSNS軸が炎症を引き起こすことが示された。

考察

ここで我々は、in vivoの状況において、CDIにおける疾患の促進においてSNSが果たす重要な役割を証明した。中枢神経系ニューロンの薬理学的切除、ノルエピネフリン合成の阻害、α2ARの薬理学的遮断または遺伝的欠損が、CDIマウスモデルに防御を与えることを示した。さらに、これらの介入は炎症と組織損傷の発症を阻止することも証明した。

Manionらによる以前の研究では、CDI誘発性炎症の発症には感覚求心性ニューロンが重要であることが示された23。交感神経と感覚ニューロンの間にはクロストークがあるが、これらの系が協調して腸疾患を引き起こすかどうかはまだ不明である。しかし、多くの研究が、感覚刺激は交感神経活性を低下させ、α2AR刺激は感覚反応を低下させることを示唆している。

α2ARが交感神経活動のよく知られた負の制御因子であることを考えると、α2ARが疾患の主要な原因であるという発見はやや予想外であった。交感神経ニューロン上のα2AR自己受容体をロックすることは、理論的には交感神経のノルエピネフリン出力を増加させるはずである。しかし、これらの結果を6-OHDAやネピカスタットの結果と照らし合わせると、CDIの重症度に対するRXの作用は、交感神経上の自己受容体ではなく、シナプス後α2AR（ヘテロ受容体）を介するものであることがわかる。2ARは、ヒトおよびマウスモデルの両方において、無菌性大腸炎状態に関与している。

この研究から生じる疑問のひとつは、SNSの効果が局所的なものなのか、それとも腸管外のものなのかということである。先行研究では、局所または全身レベルで SNSに介入すると、相反する効果が得られることが示されている31。今後の研究では、局所交感神経切除（例えば外科的）が、6-OHDAのような全身的介入と同じ保護をもたらすかどうかを明らかにすべきである。血管やリンパ系臓器はSNSによって神経支配され、免疫細胞の輸送に影響を及ぼすため、局所的および腸管外への影響によって、SNS介入によって観察された影響が説明できる可能性がある。マウスの小腸に毒素Aを注射した先行研究では、小腸の全外部脱神経が毒素A誘発の上皮障害と赤血球蓄積に影響を与えることが示され、我々の観察と一致した60。しかし、急性脱神経はこれらの効果を生じさせるのに十分ではなく、著者らは腸神経系の変化が炎症の発症を支配しているのではないかと推測している。これらの相違は、われわれのモデルの違い（腸の位置、毒素と感染、時期など）によるものかもしれないが、腸管外神経支配が疾病に関与しているかどうかを明らかにするだけでなく、CDIにおける外因性神経と内因性神経の相対的役割を明らかにすることも重要であろう。

これまでの研究で、交感神経の支配が2型エフェクターを制限することが示されており、CDIにおける炎症を抑制する可能性がある。その代わりに、我々の観察結果は、マクロファージが産生する腫瘍壊死因子αや敗血症に対するα2ARの強力な刺激作用を示す文献と一致している。ノルエピネフリンは好中球の動員にも影響を及ぼすが、好中球の動員や活性に影響を及ぼす可能性のある他のメカニズムも存在することが、研究者らによって実証されている。

C.difficile毒素が疾病に必要である場合、毒素A/Bまたはその作用の減少がSNS阻害の防御効果を説明できる可能性がある。6-OHDAおよびRXの介入により、毒素A/Bのレベルはわずかに低下したが、細菌負荷は同等であった。RXを投与したマウスの糞便内容物には高い水分含量が認められ、毒素濃度を希釈する可能性がある。ドレナリン作動性成分および/またはシグナルは、宿主に直接、あるいはマイクロバイオームを介して間接的に毒素の作用に影響を及ぼす可能性がある。SNSはα2ARを介して腸管上皮細胞の増殖に影響を与える71 、72 、毒素による腸管バリアの破壊に影響を与える可能性がある。さらに、アドレナリン作動性シグナル伝達は、周皮細胞の機能を変化させる可能性があり、73,74は最近C. difficileの標的23として認識され、毒素誘発性出血75に対する潜在的な保護因子である（図1Fおよび3E）。C.difficile毒素がSNSの健康に及ぼす影響については不明な点が多いが、Xiaらは、毒素AがαAR依存的にノルエピネフリンのSNS放出を直接阻害することを示した76。C.difficile毒素がα2ARに結合するのか、SNSの他の部位に結合するのかは不明であるが、彼らの研究と我々の研究を合わせると、これらの毒素がSNSを標的とし、炎症反応を急増させることを示している可能性がある。ノルエピネフリンの役割については、ノルエピネフリンシグナル伝達の阻害がCDIマウスモデルの生存率を改善するというわれわれの知見からすると、毒素によるノルエピネフリンの産生低下は不可解である。ノルエピネフリンシグナル伝達の阻害がCDIマウスの生存率を向上させるというわれわれの知見との関連では、ノルエピネフリンシグナル伝達の阻害がCDIマウスの生存率を向上させるというわれわれの知見との関連では、ノルエピネフリンシグナル伝達の阻害がCDIマウスの生存率を向上させるというわれわれの知見との関連で不可解である。また、多くの微生物がノルエピネフリンやエピネフリンに反応することから、アドレナリン作動性シグナルは、経気道的なシグナル伝達を通して間接的にCDIの病因に影響する可能性もある。しかし、 Adra2aKOマウスでみられた効果や、メスマウスでみられたRXの効果の欠如は、α2AR遮断薬が宿主に直接作用することを示唆している。

Eは、RXとAdra2aKOの効果が性差に依存することを見いだした。82,83,84,85,86,87,88一般的に、CDIリスクは雌性患者の方が高い可能性があるが、いくつかの異なる研究で、雄性CDI患者の死亡リスクの増加が示されている。関連して、年齢などの他の人口統計学的因子も、CDI病態におけるSNSの役割に関与している可能性がある。年齢が高いほど、ベースラインの交感神経駆動が増加し、CDI病態の重症度が増悪する。

本研究は、神経系がCDIに及ぼす広範な影響の理解に貢献し、CDI管理の潜在的な標的およびバイオマーカーの範囲を広げるものである。この研究以前にも、CDI発症における神経系の影響は示唆されていたが、中心となる神経細胞や分子は不明であった。CDIの転帰に影響を及ぼすストレスや抗うつ薬は、様々な神経系や構成要素に関与しており、リスク評価や分子標的化を複雑にしている。さらに、これまでのメカニズム研究はCDIモデルではなく毒素注射モデルで行われることが多く、C. difficileの挙動（例えば、増殖、コロニー形成、毒素産生）やC. difficile抗原に対する宿主応答（例えば、細菌クリアランスと過剰応答のリスクとのバランス）への影響など、感染経過に対する神経細胞の影響の重要な側面を見逃している可能性があった。以上のことから、本研究の結果は、SNSの活性化がCDIによる炎症亢進と腸管障害を媒介することを示し、神経系またはその下流のエフェクターを標的とすることで、CDI病態の重症度を改善できる可能性を示唆している。

研究の限界

本研究の主な限界は、CDIを引き起こすα2ARの下流のメカニズムがまだ明らかにされていないことである。今後の研究では、CDIにおける免疫ARと非免疫ARの相対的な寄与を検証し、それらの細胞特異的作用が腸に局所的であるかどうかを明らかにすべきである。もう一つの限界は、6-OHDAが感覚ニューロンや内在性ドーパミン作動性ニューロンに標的外作用を及ぼす可能性があることである。この研究の中心的な強みは、神経終末の破壊から酵素阻害、受容体拮抗まで、さまざまなアプローチを用いて、神経細胞から受容体まで、アドレナリン作動性経路の複数のレベルを、遺伝学的に確認しながら試験したことであり、CDIマウスに一貫した大きな影響を観察したことである。今後、どの細胞型がCDI中にAdra2aを発現するかを明らかにし、SNSのどの直接的な細胞標的が免疫反応や病理学に対する介入の効果を説明できるかを明らかにする必要がある。

リソース

連絡先

さらなる情報および試薬のリクエストは、対応する著者であるWilliamPetri（wap3g@virginia.edu ）までお願いします。

試薬の入手可能性

本研究では新たな試薬は使用していない。

データおよびコードの利用可能性

本論文で報告されたデータは、要請があれば筆頭責任者が共有する。

本論文ではオリジナルのコードは報告していない。

本論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求があればリード・コンタクトから入手可能である。

謝辞

著者らは、専門知識を提供してくれたバージニア大学のフローサイトメトリーおよび研究組織学コアに感謝する。A.Donlan、M.Simpson、M.Young、R.Boon、A.Brown、Gilchrist研究室およびRamakrishnan研究室の研修と有益な議論に感謝する。本研究は、D.T.へのNIH助成金T32 AI007046およびF31AI161787-04t、W.A.P.J.へのR01 AI152477およびR01 AI124214の支援を受けている。

著者貢献

D.T.は実験の着想、設計、実施および原稿執筆を行った。.L.L.はプロジェクトのアイデアの発案に協力した。F.N.、J.U.、B.T.は貴重な助言を提供し、原稿をレビューし、組織処理を手伝った。.A.P.J.は本研究の全側面をサポートした。

利益申告

.A.P.J.は、C. difficileの診断検査を製造するTECHLAB, Inc.のコンサルタントである。.A.P.J.とD.T.は、バージニア大学が出願したC. difficile大腸炎治療のためのα2アドレナリン受容体遮断に関する米国特許出願PCT/US2023/062958の発明者として記載されている。

TAR★メソッド

EYリソース表

EAGENTまたはRESOURCE SOURCE IDENTIFIER

抗体

nti-mouse CD3ε Antibody BioLegend Cat# 100328; RRID:AB_893318 (145-2C11)

抗マウス CD11c 抗体 BioLegend Cat# 117327; RRID:AB_2129642

nti マウス CD11c 抗体 BioLegend Cat#117330; RRID:AB_11219593(N418)

nti マウス/ヒト CD11b 抗体 BioLegend Cat# 101212; RRID:AB_312795 (M1/70)

抗マウス Ly6c 抗体 BioLegend Cat#128005; RRID:AB_1186134 (HK1.4)

nti マウス CD45 抗体 BioLegend Cat#103116; RRID:AB_312981 (30-F11)

nti-mouse Ly6g Antibody BioLegend Cat#127618; RRID:AB_1877261 (1A8)

nti-mouse SiglecF Antibody BD Cat#552126; RRID:AB_394341 (E50 2440)

細菌およびウイルス株

difficileR20291 株 Frisbee et al.6 N/A

difficileVPI 10643 Strain Frisbee et al.6 N/A

化学物質、ペプチド、組換えタンパク質

-ヒドロキシドーパミン塩酸塩シグマ H4381

エシプラミン塩酸塩 Sigma D3900

ラゾシン塩酸塩メドケムエクスプレス HY-B0193A

X 821002 塩酸塩シグマ R9525

塩酸ロプラノロールシグマ P0884

R 59230A トクリス 1511

RL 44408 マレイン酸塩シグマ B4559

ミロキサン塩酸塩トクリス 0986

P 1302 塩酸メドケムエクスプレス HY-103213

エピカスタット塩酸塩 Medchem Express 13289A

市販アッセイ

ディフィシルTOX A/B II テックラボ社 5015

. IFF CHEK - 60 テックラボ社 L5025

実験モデル 器官/系統

57 Bl/6 マウス（WT） Jackson Cat#000664; RRID:IMSR_JAX:000664

dra2a 変異マウス Jackson Cat# 004367; RRID:IMSR_JAX:004367

リゴヌクレオチド

rimer: tcdA_F: GGT AAT AAT TCA AAA GCG GCT Integrated DNA Technologies N/A

プライマー：tcdA_R：AGC ATC CGT ATT AGC AGG TG Integrated DNA Technologies N/A

プライマー：tcdA_probe_FAM：6FAM-AGC CTA ATA CAG CTA TGG GTG CGA A-BHQ1 Integrated DNA Technologies N/A

rimer: tcdB_F: GAA AGT CCA AGT TTA CGC TCA AT Integrated DNA Technologies N/A

プライマー：tcdB_R：GCT GCA CCT AAA CTT ACA CCA Integrated DNA Technologies N/A

rimer: tcdB_probe_Hex: Hex-ACA GAT GCA GCC AAA GTT GTT GAA TT-BHQ1 Integrated DNA Technologies N/A

ソフトウェアとアルゴリズム

raphPad Prism N/A RRID:SCR_002798

ペンの表を新しいタブで表示

実験モデルと被験者の詳細

氷

マウスの実験は、動物を用いた試験および研究に関する倫理的ガイドラインおよび規制を遵守し、バージニア大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）により承認されたプロトコールを用いた。実験には、雌雄を一致させた10〜15週齢のC57BL6マウスとAdra2a変異マウスを用いた。57BL6マウスはJackson Laboratoryから、Adra2a変異体凍結胚（004367）103はJackson Laboratoryから入手した。Adra2a変異体の同腹子を用いたn回の実験をコントロールとして用いた。Adra2a遺伝子および遺伝子破壊のためのネオマイシンカセット挿入（Transnetyx, Cordova, TN）用に設計された特異的プローブを用いたリアルタイムPCRを用いて、尾の生検から得られたヒツジの遺伝子型を決定した（図S5B）。llの動物はバージニア大学の動物施設の特定の病原体を含まない環境で飼育された。

ディフィシル菌感染

この確立されたプロトコールでは、モデルマウスにC. difficile感受性を付与するために抗生物質が投与された（マイクロバイオームに対する抗生物質の影響についてはMoreau et al 2024を参照）104： 5mg/Lバンコマイシン（Mylan）、35mg/Lコリスチン（Sigma）、35mg/Lゲンタマイシン（Sigma）、215mg/Lメトロニダゾール（Hospira）。その後、マウスを通常の水に移し、-1日目にクリンダマイシン（Hospira社製）を腹腔内注射（0.016mg/g）した。0日目にC. difficileの芽胞を経口投与した。

氷を1日2回チェックし、体重減少、被毛の外観、活動レベル、下痢、姿勢、目の状態などの臨床的スコアリングにより健康状態を評価した。各パラメーターは観察によって採点され、1から20までの累積臨床スコアに加算された。体重減少および活動性のスコアは0～4で、4は0日目のベースライン体重から25％以上の体重減少を示す。被毛の外観、下痢のタイプ、姿勢、目の状態などのパラメーターは0～3のスコアで評価した。重症であることを示す臨床スコアが14以上のマウスは、プロトコルに従って安楽死させた。ll 実験は、特に指定のない限り、C. difficile感染マウスを用いて行った。

菌株および培養

C.difficile株は以前の研究7と同様に調製した。C.difficile株を調製するために、凍結ストックからの株をBHI寒天プレートを用いて嫌気室で37℃で一晩培養して増殖させた。シングルコロニーをBHI培地に接種し、37℃で一晩嫌気培養した。翌日、培養液を6000×gで1分間遠心し、嫌気性PBSで2回洗浄した。各マウスに100μL（R20291は1×102～103CFU、VPI 10643は1×104～105 CFU）の接種液を経口投与した。感染 2 日目の糞便内容物から difficile負荷を定量した。簡便に、糞便内容物をPBSに懸濁した。difficile負荷は、QIAamp fast DNA stool mini キットを用いて、製造業者の指示に従って、糞便内容物から分離した DNA を用いて、毒素A（tcdA ）および毒素B（tcdB ）特異的 qPCR により測定した。またはqPCR反応では、サンプル間の総DNA（100ng/uLの総DNA）を正規化するために入力DNAを希釈した。qPCR 定量には、tcdAおよびtcdBiQ マルチプレキシングおよび標的特異的プローブ（FAM/HEX）を使用した。difficiletoxins A/BおよびGDHは、TechLabから提供されたC. difficileTOX A/B IIおよびC. DIFF CHEK - 60 (TL5025)キットを用いて定量した。またはコロニー数を測定するために、糞便内容物または糞便ペレットを再懸濁し、連続希釈して、1％タウロコール酸ナトリウム、1 mg/mL D-シクロセリン、0.032 mg/mL セフォキシチン（シグマ社製）を添加したBHI寒天培地にプレーティングし、37℃で一晩嫌気培養した6。

方法の詳細

有害作用物質

-OHDA処理：シグマ・ケミカル社（ミズーリ州セントルイス）の-OHDAを、酸化防止剤として0.02％のL-アスコルビン酸を加えた滅菌生理食塩水に溶解した。tを、感染-7、-6、-5日目に1日1回、80mg/kgの用量で腹腔内投与した。Sigmaの塩酸エシプラミンをPBSに溶解した。特定の実験では、デシプラミンを10mg/kgの用量で、各6-OHDA注射の30分前に腹腔内注射した41。

ドレナリン受容体遮断薬：アドレナリン受容体遮断薬：ラゾシン塩酸塩（Medchem Express; HY-B0193A）をPBSで希釈し、対照には同濃度で希釈したDMSOを用いた。X 821002 hydrochloride (Sigma; R9525)、propranolol hydrochloride (Sigma; P0884)、SR 59230A (Tocris; #1511 )をPBSに溶解した。ropranolol（10mg/kg）、RX821002塩酸塩（10mg/kg）およびプラゾシン（2mg/kg）を、10mg/kgの用量で、感染0日目に1回、感染1日目に2回（AM、PM）腹腔内注射した。

α2アドレナリン作動性サブタイプ遮断薬：BRL 44408 maleate（Sigma; B4559; 10 mg/kg）、Imiloxan hydrochloride（Tocris; 0986; 3 mg/kg）、JP 1302 hydrochloride（Medchem Express; HY-103213; 3 mg/kg）をPBSに溶解し、感染0日目に1回、感染1日目に2回（AM、PM）腹腔内注射した。

ドパミンβ水酸化酵素の阻害：エピカスタット塩酸塩（Medchem Express; HY-13289A）は、メチルセルロースベースのビヒクルORA-Plus中で化合物を粉砕することにより調製した。エピカスタットは、30 mg/kgを感染0日目に1回、感染1日目に2回（AM、PM）経口経口投与した。

大腸細胞の分離とフローサイトメトリー

オロンを縦に開き、Buffer A（HBSS, 25 mM HEPES, 5% FBS）で洗浄した。大腸を解離バッファー（HBSS、15 mM HEPES、5 mM EDTA、10% FBS、1 mM DTT）中、37 ℃、40 分間、振盪インキュベーターでインキュベートすることにより、上皮層を固有層から分離した。薄層前膜画分（無傷のまま残した組織）をはさみでさいの目に切り、さらにRPMI1640中で、0.17 mg/mL Liberase TL（Roche）と30 μg/mL DNase（Sigma）を用いて消化した。サンプルを37℃の振盪インキュベーターで40分間消化した。各サンプルを100μMのセルストレイナーに通した後、40μMのセルストレイナー（いずれもFisher Scientific社製）に通すことにより、単細胞懸濁液を得た。フローサイトメトリーでは、単細胞懸濁液を前述のように調製し、サンプルを以下のモノクローナル抗体で染色した： D3（145-2C11、BioLegend Cat No.100328、希釈度1/100）、CD11c（BioLegend Cat No.117327、希釈度1/50）、CD11c（N418、BioLegend Cat No.117330、希釈度1/50）、CD11b（M1/70、BioLegend Cat No.101212、希釈度1/200）、Ly6C（HK1.4 BioLegend Cat No.128005、希釈度1/100）、CD45（30-F11、BioLegend Cat No.103116、希釈度1/200）、Ly6G（1A8、BioLegend Cat No.127618、希釈度1/100）、SiglecF（E50 2440、BD Cat No.552126、希釈度1/100）。または表面染色を行い、1×106細胞/サンプルをTruStain fcX（93,BioLegend、#101320、1/200）を用いてFcブロックを10分間RTで行った後、LIVE/DEAD Fixable Aqua（Life Technologies）に30分間4℃で懸濁した。FACSバッファー（PBS+2%FBS）で2回洗浄し、モノクローナル抗体で4℃で30分間染色した。ローサイトメトリーはCytek Aurora Full Spectralサイトメーターを用いて行い、すべてのデータ解析はOMIQを介して行った。

マウスの組織学と免疫組織化学

マウスのecal snipsをBouin溶液で固定し、24時間固定後に70％エタノールに切り替えた。切り取った黄漿はパラフィン包埋し、University of Virginia Research Histology Coreでヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色した。H&E組織病理標本は2名の盲検観察者によって採点された。上皮破壊、粘膜下浮腫、炎症性浸潤、および出血（0～1）の複数のパラメータについて、0～3の尺度を用いてスコア化した。

Ki67の定量は、マウスの糞便組織切片を4％PFAで固定し、24時間後に70％エタノールに移した。切片はUniversity of Virginia Research Histology Coreでパラフィンに包埋し、Biorepository and Tissue Research FacilityでKi67（Abcam Cat #Ab16667 ）を染色した。

解析と統計解析

マウスでは、Kaplan-Meier推定を用いて生存曲線を作成し、Mantel-Cox検定を用いて2群間の生存の統計的有意性を確認した。他の実験における2群間の比較は、両側t検定、ANOVA、混合効果モデルを用いて行った。感染後7日目まで生存群の8匹欠損と臨床スコアをモニターしたが、対照群で生存するマウスが2匹以下である場合が多いため、統計解析は3日目（またはそれ以前）まで行った。n-値はマウスの生物学的複製を示す。統計解析はGraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software Inc.）

本論文の作成中、著者らは原稿の読みやすさを向上させるためにChatGPTを使用した。このツール/サービスを使用した後、著者らは必要に応じて内容を見直し、編集した。

補足情報(2)

DF (14.72 MB)

S1. 図S1-S5、表S1、S2

DF (17.39 MB)

資料S2. 論文＋補足情報

参考文献

Uh, A.Y. ∙ Mu, Y. ∙ Winston, L.G. ...

米国におけるクロストリジオイデス・ディフィシル（clostridioides difficile）感染負荷と転帰の推移

. ngl. J. Med. 020;382:1320-1330

交感神経系はClostridioides difficile感染に対する炎症反応を促進する

交感神経系はClostridioides difficile感染に対する炎症反応を促進する

ハイライト

概要

抄録

キーワード

はじめに

結果

化学的交感神経切除はC. difficile感染マウスの腸管障害と死亡率を軽減した。

ノルアドレナリン作動性シグナル伝達の阻害はCDIの重症度を改善する

α2ARのロックアウトはサブタイプ特異的にCDIを介した病態を予防する。

Adra2aの遺伝子破壊は雄性CDIマウスの死亡率を減少させる

化学的交感神経切除とα2AR遮断はCDIマウスの腸の炎症を抑える

考察

研究の限界

リソース

連絡先

試薬の入手可能性

データおよびコードの利用可能性

謝辞

著者貢献

利益申告

TAR★メソッド

EYリソース表

実験モデルと被験者の詳細

方法の詳細

解析と統計解析

補足情報(2)

参考文献

記事メトリクス

関連記事

いいなと思ったら応援しよう！