脊椎動物の眼の進化に重要な革新をもたらすバクテリアの起源の解明

2023年4月17日 11:30

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2214815120

Chinmay A. Kalluraya https://orcid.org/0000-0001-9810-9167, Alexander J. Weitzel https://orcid.org/0000-0002-1713-158X, Brian V. Tsu, and Matthew D. Daugherty https://orcid.org/0000-0002-4879-9603 mddaugherty@ucsd.eduAuthors Info & Affiliations
編集：ジョーン・ストラスマン（ワシントン大学セントルイス校、ミズーリ州セントルイス）；2022年8月31日受領；2023年2月28日受理
2023年4月10日
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意義
チャールズ・ダーウィンの時代から、眼の段階的進化を説明することは課題であった。本論文では、脊椎動物の眼の進化にバクテリアが不可欠であることを説明する。ドメイン間水平遺伝子移動（iHGT）により、脊椎動物特有の視細胞間レチノイド結合タンパク質（IRBP）を生み出したバクテリアの遺伝子が、脊椎動物の眼の進化に寄与した。我々は、高度に保存された必須レチノイドシャトリングタンパク質であるIRBPが、500Maを超える脊椎動物型の眼の発達と同時に獲得、複製、新機能化した細菌遺伝子から生じたことを証明した。この発見は、脊椎動物の眼のような複雑な構造が、既存の遺伝子に手を加えるだけでなく、外来遺伝子を獲得して機能的に統合することによって進化する可能性を示している点で、重要である。
要旨
脊椎動物の眼は、チャールズ・ダーウィンによって、段階的進化過程による自然淘汰の理論に対する最大の潜在的挑戦のひとつとされた。脊椎動物の眼に至る数々の進化的変遷が説明されている一方で、明らかに後生動物の前身がなく、脊椎動物に特有と思われる側面もある。脊椎動物と無脊椎動物の視覚の決定的な違いの一つは、視細胞間レチノイド結合タンパク質（IRBP、別名レチノール結合タンパク質、RBP3）にかかっている。このタンパク質は、細胞タイプ間のレチノイドシャトリングを促進することによって、脊椎動物の視覚サイクルの中で細胞の物理的分離と特殊化を可能にする。IRBPは機能的に説明されているが、その進化的な起源は不明なままであった。今回、我々は、IRBPがドメイン間水平遺伝子移動（iHGT）によりバクテリアから新規遺伝子を獲得することで誕生したことを明らかにした。我々は、現存する脊椎動物の放射化（500万年以上）以前に、細菌のペプチダーゼをコードする遺伝子が獲得され、その後ドメインの重複と新機能化を経て、脊椎動物のIRBPが誕生したことを証明した。生命樹上の900以上の高品質ゲノムを用いた系統解析により、ゲノム集合体の汚染とIRBPの水平獲得の真の事例を区別する解像度が得られ、同じ細菌ペプチダーゼ遺伝子ファミリーが異なる真核生物系統に独立に移行することを発見した。この研究は、脊椎動物の視覚サイクルにつながる重要な変遷の進化的基盤を明らかにし、細菌遺伝子の獲得が脊椎動物の進化に及ぼした顕著な影響を浮き彫りにするものである。
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脊椎動物は、正確で空間的に解像した視覚を可能にするカメラのような眼球を持ち、複数の進化的変遷の結果、進化してきた(1)。無脊椎動物型の眼から脊椎動物型の眼への進化の中で、光を感知する細胞と、光を感知したレチノイドを酵素的にリサイクルする細胞が物理的に分離された（図1A）。ロドプシンに結合した11-cisレチナールからオールトランスレチナールへの光誘導異性化による光感知は視細胞（PR）細胞で起こり、11-cisレチナールの酵素的再生は網膜色素上皮（RPE）細胞として知られる物理的に分離した細胞で起こる (1, 2) 。(図1A)。脊椎動物において、光の感知とレチノイドの再生が分離していることは、脊椎動物が低照度下で見ることができる手段として示唆されている（3）。
図1.
IRBPホモログが生命樹上で不連続に分布している。(A）脊椎動物の視覚サイクルの模式図。光受容体（PR）細胞におけるレチノイドを介した光の感知と網膜色素上皮（RPE）細胞におけるレチノイド再生が物理的に分離していることがわかる。光受容体間レチノイド結合タンパク質（IRBP、別名レチノール結合タンパク質、RBP3）は、2つの細胞タイプ間でレチノイドをシャトルするのに必要である。(B) IRBPのホモログをRefSeqタンパク質データベースで検索して得られたBLASTp e-valueのヒストグラム（データセットS1およびSI Appendix, Extended Methods）。非脊椎動物である真核生物のシングルドメインホモログは、種名または種群によってラベル付けされ、色分けされている。上図は、本研究でゲノムを照会した真核生物の種樹である。灰色に着色された枝を持つ種は、ゲノム上で検出可能なIRBPホモログを持たない。IRBPに最も近い10種の細菌ホモログのe値を左側に示す。(C) ヒトIRBPの各ドメインとトップスコアの細菌ホモログとの配列比較（完全アライメントはSI Appendix, Fig.S1）。(D) ウシIRBP (PDB: 7JTI) (4) のD4とAlphaFold2 (5) で作成した細菌ホモログの予測構造との比較。
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脊椎動物において、光の感知とレチノイドの再生を物理的に分離することを促進するタンパク質は、視細胞間レチノイド結合タンパク質（IRBP、別名レチノール結合タンパク質3、RBP3）である。IRBPは視細胞間マトリックスに局在する主要な可溶性タンパク質で、PR細胞とRPE細胞間でレチノイドをシャトルリングするという重要な機能を担っています（2、3、6）。視覚系における中心的な役割のため、ヒトIRBPの変異は網膜色素変性症や網膜ジストロフィーなど様々な網膜疾患の原因となる(6)。さらに、IRBPの配列と4つの繰り返しドメイン構造は、いずれも脊椎動物で高度に保存されており、脊椎動物の進化の特徴を明らかにするために利用されている(7-9)。興味深いことに、他のほとんどの真核生物にはIRBPのホモログが存在せず、脊椎動物の眼の進化におけるこの重要なイノベーションの起源は未解決のままである。
本研究では、IRBPがバクテリアから現存する脊椎動物の祖先へのドメイン間水平遺伝子転移（iHGT）イベントによって生じたことを系統学的手法によって明らかにした。その結果、脊椎動物のIRBPタンパク質配列は、複数の系統的再構成法に基づき、細菌のS41ファミリーペプチダーゼに最も類似する単一の単系統クレードを形成していることがわかった。さらに、脊椎動物のIRBPの特徴である4ドメインタンパク質構造と3つのイントロンを含む遺伝子構造、およびプロテアーゼ触媒残基の消失は、細菌から単一ドメインのペプチダーゼ遺伝子を獲得した後すぐに進化したことを明らかにした。さらに、真核生物ゲノムからいくつかのIRBPホモログを同定したが、いずれも系統解析の結果、脊椎動物のIRBPとは進化的に距離があることが判明した。このうち2つは真核生物ゲノムに細菌が混入したためと考えられるが、さらに2つの独立した真核生物への細菌性S41ペプチダーゼ遺伝子のiHGTの例を確認した。1つは真菌、1つは両生類（すなわち、蛞蝓）である。このように、真核生物への細菌性ペプチダーゼ遺伝子のiHGTが繰り返し起こることを明らかにし、そのような細菌性遺伝子の獲得が脊椎動物の眼の進化に句読点を打つのに重要な影響を与えたことを立証した。
研究成果
脊椎動物のIRBPの起源は細菌である。
脊椎動物におけるIRBPの進化的起源を理解するために、ヒトIRBPタンパク質配列（アクセッションNP_002891.1）をRefSeqデータベースから検索した。ほとんどの脊椎動物種のゲノムにある4ドメインIRBPホモログ以外では、BLASTpのビットスコア（S）と確率（e-value）スコアでランク付けした次に近縁なタンパク質が細菌ゲノムに見出された（図1B、データセットS1、SI Appendix, Extended Methods）。S41ペプチダーゼと命名されたこれらの細菌ホモログは、ヒトIRBPの4つのドメインそれぞれに配列および構造の類似性を持つシングルドメインタンパク質である（図1のCおよびD、Dataset S1、およびSI Appendix, 図S1）。無脊椎動物では、685のゲノムのうち、9つのゲノムでIRBPのホモログが確認された（図1B、データセットS1）だけだった。
IRBPは、以前から細菌性タンパク質との類似性が指摘されていた(10)。実際、IRBPはヒトゲノムの初期配列決定時に223のiHGT候補のうちの一つであり（11）、その後、ヒトにおける128の推定iHGT候補のリスト（12）にも含まれている。しかし、両論文で主張されたiHGTの多くは、ヒトゲノムのアセンブリにおける細菌汚染、あるいは、細菌と真核生物の最後の普遍的共通祖先（LUCA）からの垂直継承を誤って割り当て、特定の系統で遺伝子が失われたことによると、後に主張されました（13-16）。IRBPの具体的な事例では、植物ゲノムであるRicinus communisにホモログが存在することが、IRBPがLUCAに存在したことの証拠として用いられ、遺伝子消失と配列分岐によってiHGTの評価が誤って行われた（16）。これらの結果は、脊椎動物のIRBPの進化的起源、ひいては脊椎動物の視覚系における重要な革新性を未解決のままにしてしまった。
真核生物のゲノム集合体において、iHGTの真の事例と垂直遺伝や細菌の混入の事例とを区別するために用いることができるためである(17)。最尤法による系統復元法（SI Appendix, Extended Methods）を用いると、脊椎動物のIRBPタンパク質は、細菌タンパク質の大きな系統の中で、強い枝支持（100%）をもつ単一の単系統クレードを形成することがわかった（図2A）。重要なことは、脊椎動物のIRBPタンパク質は、R. communisを含む他の真核生物のIRBPホモログと系統的に離れていることである（図2A）。このことは、現存する脊椎動物の放射が500Myaを超える前にiHGTが起こったことと一致しており（18）、脊椎動物のIRBP配列は、脊椎動物種の既知の系統樹に沿ったものとなっている。例えば、顎のある脊椎動物から500Mya以上分岐した顎のない脊椎動物の系統に属するウミヤツメPetromyzon marinusは、顎のある脊椎動物のIRBP配列と姉妹グループに存在するIRBP配列をコードすることが確認された（図2B）。さらに、脊椎動物のIRBPが細菌由来であるという系統推定は、系統解析ソフトウェア、置換モデル、配列番号の選択に対して頑健であることを確認した（表1、SI Appendix, Extended Methods、分岐サポート付き完全木はすべてデータセットS5で確認）。すべての場合において、脊椎動物のIRBP配列は、強い枝支持を持つ細菌配列の中に入れ子になった明確な単系統クレードを形成する（図2Aおよび表1）が、最も近縁な細菌配列はパラメータの選択によって異なる（Dataset S5）。図2Aに示すようなある系統樹の中でも、脊椎動物のIRBPに最も近いクレード内では、様々な細菌目が表現されている（SI Appendix, Fig. S2）。このiHGT事象に貢献した正確な細菌種または細菌目をめぐるこの曖昧さは、この転送事象が500Maを超える脊椎動物の放射前に発生し、系統推定を複雑にする細菌タンパク質進化の十分な機会を提供したという我々の推測を考えれば、驚くべきことではない。しかし、このように遺伝子を導入した細菌種が不明確であるにもかかわらず、今回の系統解析では、脊椎動物のIRBPは500Myaを超える時期に細菌遺伝子のiHGTによって生じたという推論を強固に支持することができました。
図2.
脊椎動物のIRBPは、バクテリアから水平移動した遺伝子として誕生した。(A) 真核生物と細菌のIRBPタンパク質のホモログの最尤系統樹。関連するブートストラップ枝支持値を示す。真核生物の配列は、図1Bのような色を使って斜線のボックスで示されている。残りの配列は細菌性S41ファミリーペプチダーゼである。(B) 図2Aに示した系統樹の拡大図。(上）脊椎動物のIRBPタンパク質の系統樹、主要な脊椎動物の系統を示す。(下) 最も近い細菌IRBPホモログの系統樹。アスタリスクはブートストラップによる枝の支持を示す（>80%支持、**100%支持）。(C）ヒト10番染色体とウミヤツメ41番染色体のIRBPをコードする遺伝子（遺伝子名RBP3）を含む領域の模式的な比較です。IRBPタンパク質ドメイン（D1〜D4）境界の位置を示す。ヒトとウミヤツメの間で保存されているD4の3つのイントロンの位置を示している。また、ヒトとウミヤツメの間で保存されている3′隣接遺伝子として、ZNF488の存在を示している。(D）個々の脊椎動物IRBPドメインと細菌および非脊椎動物真核生物IRBPホモログとの系統樹を示す。脊椎動物のIRBPの枝はドメインごとに、またはD4の場合は脊椎動物の主要なクレードごとに折りたたまれている。関連するブートストラップ分岐支持値を示す。(A-D) 種およびアクセッション番号の完全なリストはデータセットS1に、配列アラインメントはデータセットS2およびS3に、ブートストラップサポート値を持つすべての系統樹はデータセットS5に記載されています。(E) 図2Aに示した細菌IRBPホモログ（S41ペプチダーゼ）のコンセンサス配列で、触媒セリン残基を示した。(F) 脊椎動物のIRBPドメインからのコンセンサス配列。ほとんどのIRBPドメインで触媒セリンが失われていることがわかる。以下は、4つのヒトIRBPドメインからのアラインメント配列である。
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表1.
系統推論は、異なるソフトウェア、配列番号、置換モデルに対して頑健である。
脊椎動物からの系統距離生物特異的クレードサポートノード数to:パトリスティック距離to:ソフトウェア配列置換モデル脊椎動物AmphioxusFungiBacteriaAmphioxus IQ-TREE972JTT+I+G4 ()1001001003122. 363.25IQ-TREE972JTT100100100282.023.02IQ-TREE972LG+I+G41001001003162. 53.89IQ-TREE972LG100100100482.213.18IQ-TREE972WAG+I+G41001001002221.993.49IQ-TREE972WAG100100100461.92.76IQ-TREE587WAG+F+I+G4 ()1001001003141.793. 05RAxML587WAG+Gamma ()1001001005182.073.49IQ-TREE794 (domains)Q.pfam+G4 ()100100100492.043.08IQ-TREE524 (domain)Q.pfam+I+G4 ()1001001004131.953.15
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真核生物と細菌のIRBPタンパク質ホモログの系統樹を、異なる指示パラメータで作成した（SI Appendix, Extended Methods）。アスタリスクは、最も適合する置換モデルを示す。各解析について、単系統のクレードの枝支持値を、ノードの数および最も近い脊椎動物のIRBPから最も近い細菌または両生類のIRBPホモログまでのパトリスティック距離（置換/サイト）と共に示す。最後の2行は、全長の脊椎動物IRBPではなく、個々の脊椎動物IRBPドメインを用いて行われた系統解析を示す。すべての解析のブートストラップサポート値を持つ完全な系統樹は、データセットS5にある。
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バクテリアのS41ペプチダーゼから生まれたIRBPの新機能化。
ヒトIRBPは、その起源となった単一ドメインのS41ペプチダーゼとは対照的に、4ドメインのタンデムリピートタンパク質であることがわかった。IRBPの系統樹の拡大から、IRBPの遺伝子構造は、バクテリアからのiHGTイベントの後、脊椎動物の進化の初期に生じた可能性が高いと推論される。この推論と一致するように、顎のある脊椎動物から500Ma以上分岐した古代の顎なし系統の現存メンバーであるウミヤツメのIRBPホモログは、ヒトIRBPと同様の4ドメインリピートからなり、ドメイン4（D4）内のヒトIRBPと同じ位置に3つのイントロンを含み、ヒトIRBPと同じ遺伝子（ZNF488）に隣接して発見されています（図2c）。同様に、すべての脊椎動物の個々のドメインを解析した結果、すべての個々のドメインが系統的にグループ化されており、4ドメイン構造はIRBPの進化の過程で一度生じ、おそらくiHGT獲得後すぐに生じたことが示された（図2DおよびデータセットS5）。
脊椎動物で保存されているIRBPタンパク質の4ドメイン構造に対する顕著な例外が、魚類に属するテレオスト属の動物にある。この魚類は、他の脊椎動物でよく見られる4ドメインのIRBPタンパク質に加えて、2ドメイン、3ドメイン、または5ドメインのIRBPタンパク質を散発的にコードしている（Dataset S1）。このように脊椎動物のIRBPがよく保存されているにもかかわらず、このような矛盾が生じるのは、電気泳動動物がゲノム重複を起こし、遺伝子が変換され、そして遺伝子が失われるという一連の進化的事象に起因すると考えられているが（7）、電気泳動動物に複数のIRBPバージョンがある正確な起源は依然として不明である。しかし、これらのドメインでさえも、大きなドメインツリー内で一貫したパターンでグループ化されていることがわかり（SI Appendix, 図S3）、ステレオタイプの4ドメイン構造が、2回の遺伝子・ドメイン重複と、それに続く系統特異的な遺伝子再配列を経て、電気魚で生まれたことが示された。
また、IRBPの起源となったS41ペプチダーゼとは対照的に、ヒトIRBPにはタンパク質分解活性がない(19)。バクテリアのS41ペプチダーゼは、C末端を処理するペプチダーゼを含み、活性部位のαヘリックスの始点に触媒となるセリンが保存されている（20）（図2E）。脊椎動物のIRBPと細菌のS41ペプチダーゼの全体構造は似ているが（21）（図1D）、脊椎動物のIRBPドメインの大部分では、近くのアミノ酸はよく保存されているにもかかわらず、触媒セリンは保存されていない（図2F）。脊椎動物のIRBPドメインと、細菌および非脊椎動物のIRBPホモログを用いた祖先配列再構築（SI Appendix, Extended Methods）から、脊椎動物IRBPの単一ドメイン祖先は触媒セリンを含むことが示唆された（SI Appendix, Figure S4）．しかし、iHGTの獲得とドメイン重複の後、現存する脊椎動物の放射線照射前に、ほとんどのIRBPドメインでセリンは非触媒残基で置き換えられ（SI Appendix, 図S4）、結果としてヒトIRBPドメインに見られる現在の残基となった（図2F）。これらの解析から、細菌のペプチダーゼの単一ドメイン遺伝子が最初に獲得されてから、脊椎動物のIRBPが機能的になるまでの進化の過程で、新機能化が起こったことが明らかになりました。
細菌性S41ペプチダーゼ遺伝子の独立した真核生物系統へのiHGT。
以上の進化的解析により、脊椎動物のIRBPが細菌由来であることが明らかになった。また、真核生物ゲノムには他にもいくつかのIRBPホモログが存在することが明らかになったが、これらはすべて系統解析の結果、脊椎動物のIRBPとは異なっていた（図2 AとD、表1、Dataset S5）。そこで次に、これらの真核生物IRBPホモログの起源を解明し、多くのゲノムアセンブリで知られている真核生物ゲノムの細菌汚染で説明できるのか（22）、独立したiHGT事象なのかを明らかにしたいと考えた。先に発表されたR. communisのゲノムにおけるIRBPホモログの例(16)では、このタンパク質は系統樹の中で脊椎動物のIRBPも他の真核生物のIRBPホモログも含まない領域に存在することがわかった（図2A）。さらに、このタンパク質は細菌性タンパク質と98%以上同一である一方、他の真核生物タンパク質とは40%未満であり、細菌性染色体と97%以上同一である1,600塩基対未満のゲノム足場に存在するイントロンを持たない遺伝子によってコードされている（図3A）。これらの特徴から、この例はごく最近発生したiHGTか、あるいはR. communisゲノムアセンブリに細菌が混入した可能性が高いことが強く示唆される。同様に、甲殻類H. aztecaのゲノムにあるIRBPホモログ（XP_018028457.1）も、細菌汚染の結果であると推測される。IRBPホモログとその周辺遺伝子はすべてイントロンが少なく、細菌タンパク質と90%以上同一であるから（図3B）。また、細菌ゲノムに真核生物が混入していると、iHGTの解析が複雑になることも指摘されています。例えば、我々はキュレーションされたRefSeqデータベース(23)に対して一次検索を行ったが、ヒトIRBPと84%の配列同一性を持つBartonella細菌由来のIRBPホモログ（アクセッションAMR68920.1）をNCBI NRデータベースで見つけることができた。しかし、このバルトネラ菌のタンパク質は、バルトネラ菌が分離されたマウスと同属のMastomys couchaのIRBPホモログと100％同一であり（24）、真核生物の宿主DNAがバルトネラ菌ゲノムの一部として誤って割り当てられたことが示唆された。これらの例は、ゲノムの汚染がいかにiHGTの推論を複雑にし、iHGTの主張を評価する際に慎重な系統解析が重要であることを強調しています。
図3.
真核生物の異なる系統における細菌性S41ペプチダーゼの独立したiHGT。(A）以前IRBPの細菌起源を否定する証拠として用いられたIRBPホモログの遺伝子を含むR. communisゲノムアセンブリの未配置スキャフォールドの模式図（16)。このスカフォールド（NW_002999638）には他の予測されるタンパク質は存在せず、遺伝子（LOC8272865）にはイントロンがない。R. communis DNA scaffold全体はMassilia sp. PDC64ゲノムの示された領域と97%以上同一であり、R. communis IRBP homologは示されたM. sp. PDC64タンパク質と98%以上同一である。(B）IRBPホモログ（タンパク質アクセッションXP_018028457.1）を含むH. aztecaゲノムアセンブリの未配置スカフォールドの模式図。R. communisの場合と同様に、この遺伝子にはイントロンがない。また、隣接する2つの遺伝子もイントロンを持たない。3つのタンパク質はすべて同一またはそれに近いホモログがイデオネラ菌で見つかっており、タンパク質配列の同一性が示されている。(C）IRBPホモログ（タンパク質アクセッションXP_041555295.1）を含むA. puulaauensisの染色体領域の模式図。イントロンを含むフランキング遺伝子が示されている。最も近いタンパク質ホモログは、タンパク質同一性を示した近縁真菌種のシンテニック領域に見出される。(D) 図2Aに示した系統樹のうち、真菌ゲノムで見つかったIRBPホモログを含む部分。関連する枝のサポートが示されている。すべての解析（表1およびデータセットS5）において、すべての真菌ホモログは100%のブランチサポートでグループ化されており、追加のiHGTイベントが真菌ゲノムのIRBPホモログを生じさせたというさらなる証拠が得られた。(E) IRBPホモログ（タンパク質アクセッションXP_019634665.1）を含むBuccinum belcheriの染色体領域の模式図です。IRBPホモログ遺伝子とその脇の遺伝子はイントロンを含み、B. floridaeのシンテニック領域にあるタンパク質と非常に類似している。アマゾンのIRBPホモログ（脊椎動物のBCORまたはSULT1A1に最も類似したタンパク質をコードする）を挟む遺伝子は、いずれも脊椎動物のIRBPを挟む遺伝子と相同性がない。(F) 図2Aに示した系統樹のうち、両生類ゲノムで見つかったIRBPホモログを含む部分。関連する枝の支持を示す。すべての解析（表1およびデータセットS5）において、両生類ホモログは脊椎動物のIRBPと離れた位置にあり、両生類IRBPホモログを生み出した別のiHGT事例を示唆している。(G) B. belcheri由来IRBPホモログの遺伝子構造。IRBPホモログコード配列の7つのイントロンの位置を示し、脊椎動物のIRBPイントロンの位置と重なるものはない（SI Appendix, Fig. S5）。予測されるN末端シグナルペプチド[SignalP 6.0 (25) probability = 0.9996]が存在することを示す。以下は、細菌のS41ペプチダーゼの触媒セリンを含む領域に整列する、両生類と細菌のタンパク質からの配列である。(H）脊椎動物のIRBPを生み出したものを含む、細菌のS41ペプチダーゼ遺伝子からの3つの独立したiHGT事象のまとめ。
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興味深いことに、真菌類と両生類のIRBPホモログは、真核生物への細菌のS41ペプチダーゼ遺伝子のiHGTの善意の追加例と思われる。真菌類のIRBPホモログは、近縁の真菌類に見られるイントロンを含む遺伝子と保存されたシンテニーを持ち（図3C）、すべての解析で単一の単系統クレードを形成している（図3Dと表1）。これは、ゲノム汚染ではなく、iHGTを裏付ける特徴だ。これらのタンパク質は触媒セリンを保持しており（データセットS2およびS3、SI Appendix, 図S4）、真菌類ではまだペプチダーゼとして機能している可能性が示唆されるが、その真の機能を明らかにするにはさらなる調査が必要である。同様に、両生類のIRBPホモログは、いくつかのイントロンを含み、両生類種間でシンテニーが保存され、単一の単系統のタンパク質群を形成するなど、真の真核生物の遺伝子の特徴を備えている（図3 EおよびF）。さらに、Branchiostoma floridae (accession GESZ01046803.1) (26) やBranchiostoma lanceolatum (SI Appendix, Fig. S5) (27) の幼生発生後期において、両生類のIRBPの遺伝子発現が観察されている。両生類は脊椎動物や脊索動物と同じ脊索動物であることから（28）、両生類の遺伝子は別のHGT事例であるのか、それとも脊椎動物のIRBPを生み出したのと同じiHGT事象に由来しているのかを検討した。いくつかの特徴から、これは実際には別のiHGTイベントであったと考えられる。第一に、脊椎動物の500万年以上にわたる進化において、4ドメイン構造と遺伝子のシンテニーが保存されているにもかかわらず、脊椎動物のIRBPと両生類のIRBPにはどちらの特徴もない（図2Cと図3E）。第二に、脊椎動物のIRBPのイントロンの位置は500Mya以上保存されているが（図2C）、脊椎動物のIRBPのイントロンの位置と両生類のIRBPのイントロンの位置は重なっていない（SI Appendix, 図S6)。第三に、両生類と脊椎動物のIRBPが祖先を共有しているということは、脊索動物が両生類よりも脊椎動物と最近の共通祖先を共有していることから、脊索動物のゲノムにIRBPホモログが見つかる可能性を示唆している（SI Appendix, Figure S7）（28）。しかし、これらのゲノムには、レチノイドリサイクル酵素であるレチノール脱水素酵素RDH5のホモログが明確に存在するにもかかわらず、IRBPのホモログをそのままあるいは偽遺伝子化した証拠は見つからなかった（SI Appendix, Fig.S7）。第四に、最も説得力があるのは、脊椎動物のIRBPは、入力アライメントや系統解析のパラメータ選択にかかわらず、両生類のIRBPホモログよりも細菌のIRBPホモログに系統的に関連していることが一貫してわかったことである（表1）。単一のiHGTイベントによって脊椎動物のIRBPと両生類のIRBPホモログが生まれたと完全に否定することは難しいが、上記の証拠は、別々のiHGTイベントによって両生類のIRBPホモログが生まれたことを示唆している。興味深いことに、両生類のIRBPホモログは、脊椎動物のIRBPと並行する細菌からのiHGT後にタンパク質の変化を起こしている。脊椎動物のIRBPと同様に、両生類のIRBPホモログはタンパク質分泌のためのN末端シグナルペプチドを持つことが予測され（図3G）、異なる真核生物系統へのいくつかのiHGTイベント後にシグナルペプチドが独立して獲得される別の例（29）を連想させる。さらに、両生類のIRBPホモログは、S41ペプチダーゼの触媒作用に必要なセリンを欠いている（図3G）。これらの特徴から、両生類のIRBPホモログはタンパク質分解活性を持たない分泌タンパク質であることが示唆されるが、これらのタンパク質の正確な機能については両生類での追加研究が必要であると考えられる。これらのデータを総合すると、バクテリアのS41ペプチダーゼ遺伝子は、真核生物の進化の過程で少なくとも3回独立して獲得され（図3H）、そのうちの1回は、脊椎動物のIRBPと脊椎動物の視覚サイクルにおけるそのユニークな役割をもたらしたことが示された。
考察
細菌から真核生物への糖鎖遺伝子が、後生動物を含む特定の真核生物系統に新しい機能を提供する上で果たした役割について、評価が高まっている（30, 31）。ここでは、進化生物学の長年の謎の一つである脊椎動物の眼の進化において、細菌遺伝子が果たした驚くべき役割について説明する。真核生物と細菌のゲノムが多数存在することから、ある細菌遺伝子が脊椎動物の祖先によって獲得され、新機能化され、脊椎動物の眼の特徴である光感知とレチノイド再生を分離するための重要なレチノイドシャトリングタンパク質IRBPをコードする遺伝子となったことを明確に証明することができました。このように、IRBPは、遺伝子重複と機能低下から生じた脊椎動物の視覚サイクルの他の多くの遺伝子とは異なり（3）、脊椎動物の新規視覚系機能の進化を促進するためには、バクテリアからの遺伝物質の水平獲得が必要だった。
今回の解析により、バクテリアのS41ペプチダーゼ遺伝子が真核生物に獲得された事例が2つ追加されたことがわかった。これらの例は、系統的に脊椎動物のIRBPとは異なっており（図2Aおよび表1）、同じ細菌遺伝子ファミリーの異なるメンバーの収束的獲得が示唆された。真菌のIRBPホモログは、祖先である細菌のS41ペプチダーゼ機能と一致する特徴を保持しているが、両生類のIRBPホモログはN末端のシグナルペプチドを獲得し、脊椎動物のIRBPと同様にペプチダーゼ触媒残基を失っている。したがって、脊椎動物のIRBPと同様に、両生類のIRBPが機能的に両生類の視覚サイクルに組み込まれていると推測したくなる。幼生期に発達し、成体になっても持続する両生類の前眼は、脊椎動物の眼構造の祖先の状態を表していると考えられてきた（32, 33）が、多くの脊椎動物の視覚サイクルタンパク質は、両生類に明らかな相互ベストヒットオルソログを持たない（3）。しかし、B. lanceolatumでは、15 hpfから36 hpfの間に発現が大きく増加しており（SI Appendix, Fig. S5）、これは両生類の前眼部の発達のタイミングを反映している（33）。両生類におけるIRBPホモログの役割を解明するためには、機能的な研究が必要である。
以上のことから、私たちの研究は、細菌遺伝子が他の細菌種だけでなく、真核生物にも進化的な新しさを提供する豊かな源であることをさらに明らかにするものである。既存の遺伝子の進化、いわゆる「いじり」とは異なり、外来遺伝子の獲得は、即座に機能的な新しさを提供することで、真核生物の進化に句読点を打つ可能性を持っています。具体的には、脊椎動物の眼の進化にバクテリアの遺伝子が寄与することで、ダーウィンの時代から生物学者を魅了してきた複雑で多面的な進化の道筋に、さらに拍車がかかるのである。脊椎動物の複雑な器官に必要なタンパク質であるIRBPの微生物起源は、哺乳類の胎盤形成に必要なタンパク質であるSyncytinのレトロウイルス起源を彷彿とさせる（34）。実際、真核生物の機能で細菌やウイルスの遺伝子に由来するものは増えており、抗ウイルス・抗菌免疫の構成要素、代謝機能、環境ストレスへの適応、そして今や脊椎動物の視覚に不可欠な構成要素も含まれている（31、35、36）。真核生物や原核生物のゲノムが増え続けるにつれ、真核生物の系統特異的な機能が、バクテリアからのiHGTによって進化的に起源を持つことが、今後も発見される可能性が高まっています。
材料と方法
ヒトIRBP（RBP3としても知られる、アクセッションNP_002891.1）を用いて、BLASTp（37）を用いてRefSeqタンパク質データベースを検索し、脊椎動物、非脊椎動物真核生物、細菌IRBPホモログを取得しました。その結果得られた配列をデータセットS1に示す。指示された場合、同一またはそれに近い配列はCD-HIT (38)を用いて除去された。配列はClustal Omega (39)を用いて整列し、データセットS2-S4に示す整列を作成した。最尤系統解析は、表1およびデータセットS5に示すように、IQ-TREE（40）またはRAxML（41）を用いて実施した。枝の支持値を含む完全な系統樹は、データセットS5にある。データベース検索、系統解析、構造比較、祖先配列再構築の詳細については、SI Appendix, Extended Methodsを参照されたい。
データ、材料、およびソフトウェアの利用可能性
すべての研究データは、論文および/またはSI Appendixに含まれています。
謝辞
Daugherty研究室のメンバー、Mark Kunitomi、Michael Perry、Alistair Russell、Barry Grantの提案や原稿のコメントに感謝する。この研究は、NIH（R35 GM133633）、Pew Biomedical Scholarsプログラム、Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Infectious Diseaseプログラムの支援をM.D.Dに、Halıcıoğlu Data Science InstituteとUC TRELSプログラムの学部研究奨学金をC.A.Kに、NIH T32 GM007240をA.J.WとB.V.Tに提供しました。
著者貢献
C.A.K.、A.J.W.、M.D.D.が研究を計画し、C.A.K.、A.J.W.、B.V.T、M.D.が研究を実行し、C.A.K.、A.J.W、B.V.Tが新しい試薬/分析ツール提供に貢献、C.A.K.、B.V.T、M.D.がデータを分析、そしてC.A.K.とM.D.が記事を書きました。
競合する利益
著者は競合する利害関係がないことを宣言しています。
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