宿主特異的微生物叢は食事特異的代謝恒常性に必要である

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宿主特異的微生物叢は食事特異的代謝恒常性に必要である

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.11.05.565654v1.full


ナ・フェイ, 謝炳慶, タイラー・J・ロング, マリッサ・セントジョージ, アラン・タン, スミード・マンズール, アシュリー・M・サイドボトム, メラニー・スペデール, ベティ・テリオー, ディナナス・スラケ, ユージン・B・チャン
doi: https://doi.org/10.1101/2023.11.05.565654
この論文はプレプリントであり、査読認証を受けていません。
0001009
要約全文情報/履歴メトリクスプレビューPDF
要旨
複雑な哺乳類において、微生物群集の重要性と宿主特異性は、宿主の免疫フィットネスやパフォーマンスに好影響を与えることで実証されてきた。しかし、宿主の代謝生理の恒常性が、宿主固有の細菌群集に依存しているかどうかは依然として不明である。ここでは、共進化した宿主特異的微生物群が、高いコロニー形成率、腸内代謝産物の調節、および関連する標的を通じて、食餌特異的で柔軟かつ十分な代謝恒常性を維持するために必要であることを示す。無菌（GF）マウスを用いて、微生物叢の宿主代謝表現型に恩恵をもたらすフィットネスが宿主特異的であるかどうかを検証した。その結果、外来性の微生物叢（ヒト微生物叢（HM））と関連したGFマウスでは、腸内微生物の種の多様性が異なり減少し、代謝率が有意に上昇し、代謝不全を示すという、GFマウスのすべての特徴を示した。驚くべきことに、宿主特異的マイクロバイオームが存在しないと、高脂肪食特異的な代謝の特徴が減弱した。また、宿主特異的微生物叢が存在するマウスのみで、宿主と微生物叢が不一致のマウスでは、異なる食餌が異なる代謝変化を引き起こした。RNAシークエンシングの結果、肝臓の遺伝子発現には微妙な変化が見られたが、GFマウスとHMマウスでは、宿主特異的微生物叢に関連するGFマウスと比較して、代謝生理に関連する遺伝子の発現がかなり変化していた。肝臓のトランスクリプトームでは、食事の影響が微生物叢を上回った。これらの変化は、HMおよびGFマウスにおいて、管腔内短鎖脂肪酸（SCFAs）および二次胆汁酸（BAs）プールと下流の腸内シグナル伝達標的が減少し、全身の代謝に影響を及ぼすという状況下で生じた。これらのデータは、コロニー形成の選択圧と微生物叢由来の代謝産物の機能障害により、宿主特異的微生物叢と比較した場合、外来微生物叢は宿主に代謝上の利益をほとんどもたらさないことを示している。全体として、宿主の代謝表現型に対するマイクロバイオームのフィットネス効果は、宿主特異的であった。マイクロバイオームの宿主特異性が代謝ホメオスタシスに及ぼす影響を理解することは、より優れたプロバイオティクスを構築するための重要な知見を提供する可能性がある。

ハイライト

哺乳類において、マイクロバイオームが宿主の代謝表現型に及ぼす影響は宿主特異的であった。

ヒトのマイクロバイオーム関連マウスは、宿主の代謝フィットネスやパフォーマンスが低く、GFマウスでは同様の機能的コストを示した。

異なる食餌は、宿主特異的微生物叢関連マウスにおいてのみ異なる代謝変化を引き起こし、宿主と微生物叢のミスマッチマウスでは引き起こさない。

宿主特異的微生物叢、微生物代謝産物、および関連する標的における腸内細菌叢の欠陥が、代謝のホメオスタシスを駆動している可能性が高い。

図
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はじめに
宿主とその腸内に生息する微生物群集との間の系統的共生関係は、哺乳類で記録されている1-3。哺乳類では、腸内の膨大な微生物が、発育、免疫、栄養など、宿主の健康状態にとって重要かつポジティブな機能を司っている可能性がある4。腸内マイクロバイオームが宿主のパフォーマンスや体力に特異的に寄与していることは、ますます明らかになってきている。例えば、宿主特異的な腸内微生物群集は、宿主の免疫系の成熟を変化させることで、哺乳類の宿主にポジティブな影響を与えることが証明されている5。しかし、ある哺乳類宿主種に通常コロニー形成している群集が、宿主の代謝成熟の特定のプログラムを優先的に刺激するかどうかは不明である。

蓄積された証拠から、宿主の代謝と関連する微生物群集の間には一致した関係があることが示されている6。宿主の腸内生態系と食餌の栄養組成は、宿主固有の常在腸内細菌叢組成と代謝活性の変動を決定する7。実際、無菌（GF）マウスや抗生物質投与マウスは、宿主の栄養吸収異常や代謝不全の発生欠陥を示し、その結果、健康関連マウス常在細菌叢でコロニー形成されたマウスと比較して、高脂肪食誘発性肥満に対する抵抗性を示した8-10。GFマウスや抗生物質投与マウスの肝臓や腸管における代謝生理学的遺伝子発現パターンは、従来の飼育マウスとは異なっている8-10。しかし、宿主と微生物叢のミスマッチが宿主の代謝に及ぼす影響については、まだ解明されていない。健康に関連した代謝の発達が、宿主専用の特定の細菌群集に依存しているのか、またどの程度依存しているのかは、依然として不明である。本研究では、哺乳類の代謝ホメオスタシスが、代謝シグナルを刺激するユニークな能力を持つ共進化した宿主特異的微生物叢の存在に依存しているかどうかを調べることで、宿主特異的微生物叢のフィットネス効果に関する更なる知見を得ることを目的とした。宿主特異的微生物叢が宿主の代謝生理に及ぼす影響についてより深く理解することで、外因性微生物叢に関連したマウスを動物実験でより効果的に使用することができ、より優れたプロバイオティクスを構築するための重要な知見を提供することができる。

腸内微生物の代謝産物は、宿主の代謝生理の恒常性維持に重要な役割を果たしている11。GFマウスや抗生物質投与マウスは、従来のコロニー形成マウスと比較して、管腔および血清中の短鎖脂肪酸（SCFA）および二次胆汁酸（BA）プールの減少などの微生物代謝異常を示した12,13。このような腸内代謝産物の変化は、宿主におけるグルコースと代謝のホメオスタシスの変化にメカニズム的につながる12,13。第一に、腸内微生物は、SCFA受容体であるGタンパク質共役型受容体（GPR41、GPR43、GPR109A）を介して、難消化性炭水化物をSCFAに発酵させ、大腸細胞の必須燃料として機能させることにより、さらなるカロリー抽出を行う14。第二に、微生物叢はBAプールを変化させることにより、代謝ホメオスタシスにも影響を与えることができる15。腸内細菌叢はBAを脱共役し、グルコース代謝のメディエーターとして知られる一次BAを二次BAに変換することができる15。BAは、ファルネソイドX受容体（FXR）やGタンパク質共役型BA受容体（TGR5）を介したシグナル伝達により、宿主の代謝に影響を及ぼす可能性がある15。したがって、宿主と微生物叢のミスマッチマウスが、GFマウスに見られるような管腔代謝異常の状態にあるかどうか、したがって代謝調節に著しい影響を及ぼすかどうかを調べることは極めて重要である。

先のマウス研究では、食事誘発性肥満の場合、GFマウスは同じ食事条件下で代謝異常から保護されることが示された8。すなわち、(a)外来微生物関連マウスは腸内細菌叢が完全に枯渇していないこと、(b)外来微生物叢自体が宿主の代謝恒常性に直接的な影響を及ぼすことである。プロバイオティクス、特定細菌種のターゲティング、あるいは糞便微生物移植が疾患に対する治療アプローチであるならば、宿主に関連するマイクロバイオームがそれらの外因性特定細菌種でマイクロバイオームを再構成するための原理が必要となる。したがって、外因性微生物叢が正常な代謝に及ぼす生理学的影響を知ることは、これらの潜在的治療法を実施するための必須条件である。

本研究では、ヒト（HM）またはマウス（MM）の微生物叢を、対照としてGFマウス（GF）を用い、普通食または高脂肪食のGFマウスに導入することで、宿主特異的微生物叢が宿主の代謝ホメオスタシスに及ぼすフィットネス効果を調べることを目的とした。代謝ケージ、肝臓トランスクリプトーム（RNA-seq）、腸内メタボロームを用いて、MMマウス、HMマウス、GFマウスの宿主代謝状態に対するマイクロバイオータの影響を比較した。その結果、宿主の代謝表現型に対するマイクロバイオームのフィットネス効果は宿主特異的であることが示された。HMマウスでは、代謝率が全体的に影響を受け、重要なプロセスに関与する肝遺伝子の発現プロファイルが変化した。驚くべきことに、HM系雄性マウスとGF系雄性マウスの代謝状態は類似しており、これらのマウスでは高脂肪食下での代謝活性の減衰が確認された。さらに、HM関連マウスでは微生物叢が著しく減少していた。代謝ホメオスタシスにおけるこれらの変化は、腸管内腔のBAおよびSCFAプロファイルの変化と関連している。HMおよびGFマウスの腸内微生物の成熟不全によると思われる、代謝シグナル伝達の変化が結果として見られた。最後に、宿主の代謝生理に及ぼす微生物の宿主特異性に影響を与える食餌の違いが観察された。これらの観察から、哺乳類の宿主は、代謝の恒常性を刺激することのできる特定の細菌種のコンソーシアムと共進化してきたことが示唆された。

研究結果
宿主と微生物叢のミスマッチが宿主の代謝障害の発症に関与する
宿主特異的微生物コロニー形成が宿主の代謝恒常性に及ぼす影響を調べるため、無菌（GF）C57Bl/6J雌雄マウスに、健常人（HM）または特異的病原体フリー（SPF）C57Bl/6Jマウス（MM）のどちらかから採取した糞便検体を経口摂取させた。その後、レシピエントマウスを別々のgnotobioticアイソレーターで、普通食（NCD）または高脂肪食（HFD）投与下で8週間維持した（図1A）。異なる微生物叢が宿主の代謝状態に及ぼす影響を調べるため、代謝パラメータを評価した。ヒトまたはマウスの微生物叢を保有するNCD飼育雄性マウスは、GF飼育雄性マウスと比較して、体重、肝臓重量、脂肪組織重量に有意差は認められなかった（p>0.05、図1B～H）。しかし、体重の有意差はHFD飼育雄マウス群間で観察された；HFD飼育MM雄マウスはHFD飼育HMまたはGF雄マウスと比較して有意に高い体重を示した（p<0.05、図1B）。HFDで飼育したMM雄マウスは、HFDで飼育したHM雄マウスと比較して6%以上、GF雄マウスと比較して約10%体重が増加した。さらに、HFDで飼育したHM雄マウスとGF雄マウスの間に体重の有意差は観察されなかった（p>0.05、図1B）ことから、外来微生物群集（HM）は雄マウスのHFD処理下でも体重に土着微生物群集ほどの有害な影響を及ぼさないことが示された。並行して、HFDでMMを与えた雄マウスは、HMまたはGFを与えた対照マウスと比較して肝臓重量が増加した（図1C）。HFDを投与したHM雄マウスはHFDを投与したGF対照マウスと比較して肝臓重量が高かったが、それでもHFDを投与したMM雄マウスより有意に低かった。同様に、脂肪組織(後腹膜、生殖腺、鼠径および腸間膜脂肪)は、NCD飼育下でGF、HMおよびMM雄マウス群間で同程度の重量を示したが、HFD飼育のMM雄マウスでは、HMまたはGF雄マウスと比較して後腹膜脂肪および鼠径脂肪の有意な増加が観察された(p<0.05、図1D-G)。総脂肪組織も同様の結果を示した。HFD飼育MM雄性マウスでは、GF雄性マウスと比較して総脂肪沈着量の有意な増加が観察されたが（p<0.05、図1H）、HFD飼育HM雄性マウスとGF雄性マウスの間に差は認められなかった（p>0.05、図1H）。

図1：
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図1：
宿主特異的微生物叢は雄マウスの食事特異的メタボリックシンドロームに必要である
A. 実験スキーム。野生型GF雄マウスに3週齢でヒト、マウス糞便内容物、PBSのいずれかを与え、普通食（NCD）または高脂肪食（HFD）で8週間飼育した。B. NCDまたはHFDで飼育したHM、MMおよびGFマウスの8週間後の体重。C.NCD飼育またはHFD飼育HM、MM、GF雄マウスの肝臓重量。D-H. HM、MMおよびGF雄性マウスの脂肪組織重量、後腹膜脂肪(D)、生殖腺脂肪(E)、鼠径部脂肪(F)、腸間膜脂肪(G)および総脂肪(H)。I.HM、MM、GF雄マウスのホルマリン固定肝臓ヘマトキシリン・エオジン染色（H&E、上）とNAFLD活性スコア（NAS、下）の対応グラフ。スケールバー、100μm。(各群の肝臓の代表画像を示す。J.HM、MM、GF雄マウスのホルマリン固定生殖腺脂肪ヘマトキシリン・エオジン染色（H&E、上）とNAFLD活性スコア（NAS、下）の対応グラフ。スケールバーは100μm。(各群の生殖腺脂肪の代表画像を示す。顕微鏡画像はすべて100倍率である）。顕微鏡画像はすべて100倍率、スケールバー＝100μm。結果は平均値±SEMで表した。統計的比較は、Kolmogorov-Smirnov検定を用いて正規性を検定し、ANOVAまたはKruskal-Wallis検定とTurkeyのpost hoc検定を用いて行った。*p < 0.05. p≦0.05、***p≦0.01、***p≦0.001。灰色は12時間の暗期を表す。

宿主特異的微生物に関連した雄マウスでは、肝臓組織学が変化し、同じ食餌を与えたHMまたはGFマウスと比較して、HFDを与えたMMマウスではNAFLD活性スコアが有意に高いことが特徴であった（p<0.05、図1I）。宿主特異的な微生物ミスマッチの特徴は、HFD下では肝脂肪症を有意に抑制しなかった（図1I）。脂肪細胞効果に関しては、HFD処理したHMまたはGF雄マウスはMMマウスと比較して脂肪細胞サイズが有意に低下し、肥満促進における宿主特異的微生物叢の重要性が強調された（p<0.05、図1J）。ヒトまたはマウスの微生物叢を保有するNCD飼育雄性マウスでは、GF飼育雄性マウスと比較して、肝臓や脂肪細胞の組織学的な有意差は観察されなかった（p>0.05、図1I〜J）。しかし、雄マウスにおける代謝の変化にかかわらず、宿主ミスマッチの微生物の特徴は、HFDで飼育した雌マウスの代謝ホメオスタシスには影響を与えなかった（図S1）。このことは、性特異的な現象を示している。宿主特異的微生物関連マウスは、雌雄ともに盲腸の大きさと結腸の長さが規則的であった（図S2）。しかし、HMおよびGF雄性マウスは、MM同腹子よりも盲腸の大きさが拡大し、結腸の長さが長くなった（図S2）。これらの結果は、宿主特異的な微生物叢がマウスの盲腸と結腸の形態形成に必要であることを示している。これらの結果を総合すると、宿主特異的微生物叢はHFD誘発宿主の代謝機能障害を増強し、代謝ホメオスタシスと肝機能の著しい調節不全を伴うことが示された。宿主特異的微生物群のミスマッチは、雄マウスにおけるHFDの宿主への代謝への悪影響を部分的に覆い隠していた。

宿主-微生物叢ミスマッチの特徴は、より高いエネルギー消費と著しい代謝不全および柔軟性の欠如をもたらす
次に、異なる微生物叢に関連したこれらのマウスを、24時間、周囲温度の代謝室（Promethion SABLEシステム）に入れて代謝速度を評価した。その結果、HFD処理下では、宿主特異的微生物叢に関連した雄マウス（MM）は、明暗両サイクルにおいてO2消費量（VO2）、CO2産生量（VCO2）、および夜間のエネルギー消費量が減少することが示された（図2B、D、F）。NCDあるいはHFD投与下では、これらの代謝パラメータについてHM雄マウスとGF雄マウスの間に差は認められなかった（図2A-F）。HM雄性群ではGF群に比べVO2とエネルギー消費量がわずかに増加したが、有意差は認められなかった（図2B、D、F）。HMおよびGFマウスでは宿主特異的微生物叢が欠如していることから、外因性または欠損した微生物叢が、VO2およびエネルギー消費量の増加という代謝率の大幅な増加をもたらすことが示された。とはいえ、すべてのマウスが、NCD処理下の明暗サイクル間で、同程度のCO2産生量（図2A）、VO2（図2C）、エネルギー消費量（図2E）を示した。次に、栄養基質酸化（炭水化物、脂質、タンパク質のうち、どのエネルギー源が主に酸化されるか）のレベルの違いを評価するために、異なる微生物関連マウスとGFマウスの呼吸交換比（RER）のデータを収集した。宿主特異的微生物群関連雄性マウス（MM）は、HMおよびGF雄性マウスと比較して、NCD処理下の明期サイクルおよびHFD処理下の明期-暗期サイクル全体にわたって高いRERを示し、HMおよびGF雄性マウスではMM雄性マウスと比較して、糖質よりも脂質のエネルギー源としての利用が増加していることが示唆された（図2G-H）。外因性微生物叢（HM）はHFD処理においてGFマウスと同様のRERの減少を引き起こした。HMおよびGFマウスでは、RERが減少し、酸素がより多く消費されたことから、宿主特異的微生物叢の欠如下では、炭水化物発酵が減少し、脂肪酸酸化が増加し、エネルギー源として脂質貯蔵の利用が促進されることが示唆された。さらに、HMおよびGFマウスにおけるエネルギー消費の促進は、摂餌量の有意な変化には起因していない（kcal/日/マウスで表示、図2K-L）。代謝量は運動行動と関連しているため、運動量が各群間で異なるかどうかをさらに調べた。NCD下での明暗サイクルのいずれにおいても、微生物群間で歩行速度に有意差は見られなかった（図2I）。歩数計のデータは、HFD下ではHM群とGF群でMM群に比べ夜間に有意な増加を示した（図2J）。代謝表現型の変化と同様に、宿主とミスマッチした微生物の特徴は、メスマウスのエネルギー消費にも影響を与えなかった（図S3）。これらの実験から、GFマウスと同様の表現型を示す宿主-微生物相不一致マウスにおける3つの主要な代謝形質、すなわち代謝亢進、代謝不全、および柔軟性の欠如が明らかになった。

図2：
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図2：
一致した宿主特異的微生物叢を欠くマウスは、高脂肪食（HFD）を摂取したHM雄マウスにおいて、MM雄マウスと比較してエネルギー消費量の増加を示した
A-B. 明期および暗期の平均酸素消費量（VO2）、およびNCDを与えた雄マウス（A）またはHFDを与えた雄マウス（B）の連続24時間を表すVO2曲線。C-D。NCD群（C）またはHFD群（D）の雄マウスの明期および暗期の平均VCO2および連続24時間のVCO2曲線。E-F. 明期および暗期の平均呼吸交換比（RER = VCO2/VO2、ここでVCO2はCO2産生量）、およびNCD飼育雄マウス（E）またはHFD飼育雄マウス（F）の連続24時間の曲線。G-H。明期および暗期の平均エネルギー消費量と、NCD飼育雄マウス（G）またはHFD飼育雄マウス（H）の連続24時間を表す曲線。I-J. NCD飼育雄性マウス（I）またはHFD飼育雄性マウス（J）の明期および暗期における自発的総活動量（m/3分）。K-L. NCDを与えた雄マウス（K）またはHFDを与えた雄マウス（L）の摂餌量。結果は平均±SEMで表した。n = 各群4-6匹の雄マウス。統計的比較はKolmogorov-Smirnov検定、ANOVAまたはKruskal-Wallis検定とTurkeyのpost hoc検定を用いて正規性を検定することにより行った。*p < 0.05. p≦0.05、***p≦0.01、***p≦0.001。灰色は12時間の暗期を表す。

宿主特異的微生物叢は、外因性微生物叢とは有意に異なる特徴とコロニー形成率を示す
腸内細菌叢の宿主特異的組成と非特異的組成の違い、およびGF雄のレシピエントに導入された後の変化に対する食餌の寄与を評価するために、16S rRNA遺伝子配列決定法を用いて微生物構造を調べた。2つの異なる微生物群のシャノン多様性（α-多様性の指標）評価では、MMマウスの方が多様性が大きく、NCDまたはHFD処理下のHMマウスでは有意な減少が見られた（図3A）。多様性のもう一つの指標であるUniFrac距離の主座標分析では、HMマウスとMMマウスのマイクロバイオームはかなり異なっていた（図3BおよびC、左パネル）。並べ替え検定に基づく一対比較（並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA））では、NCDまたはHFD処理下のHM砂MMマウスサンプル間で、重み付けUniFrac距離が有意に異なることが示された（図3BおよびC、右パネル）。属レベルの相対存在量は、MMマウスとHMマウスの間でかなり異なっていた（図3D〜G）。その結果、NCDまたはHFD処理下では、宿主特異的微生物関連マウス（MM）はBacteroides属とAkkermansia属に支配されていることが観察された。一方、HMマウスでは、S24-7属、Clostridiales属、およびOscillospira属に属する未分類の属がNCDまたはHFD処理下で優勢であった（図3D〜G）。MMマウスとHMマウスのマイクロバイオームはともに、NCDまたはHFD処理によって組成が変化した（図3DおよびE）。これらの結果は、外因性微生物関連マウスは微生物叢を著しく減少させ、特にファーミキューテス属とバクテロイデーテス属の微生物が減少し、微生物叢の多様性が低下することを示している。

図3：
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図3：
MMとHMで有意に異なる微生物叢組成
A. NCDまたはHFDを与えたHMマウスとMMマウスの頭部微生物叢α多様性（Shannon index）。B-C. NCD飼育マウス（B）またはHFD飼育HMマウスとMMマウス（C）の糞便微生物叢のPCoAプロット（Weighted UniFrac distance）。D-E. NCD飼育マウス（D）またはHFD飼育HMおよびMMマウス（E）の属レベルでの細菌量の棒グラフ。F-G。マウスのMMと比較したNCD-fed（F）またはHFD-fed（G）HMで濃縮された細菌分類群。結果は平均値±SEMで表した。統計学的比較は、コルモゴロフ・スミルノフ検定を用いて正規性を検定し、ANOVAまたはクルスカル・ワリス検定とターキーのポストホック検定を用いて行った。*p < 0.05. p≦0.05、***p≦0.01、***p≦0.001。灰色は12時間の暗期を表す。

外因性腸内細菌叢は肝臓のトランスクリプトームに有意な変化をもたらす
宿主特異的な腸内細菌叢と食餌がマウスの肝臓のトランスクリプトームにどのような影響を与えるかをさらに調べるため、RNA-seqを用いて肝臓のトランスクリプトーム・プロファイリングを行った。多次元尺度構成法（MDS）解析の結果、肝臓のトランスクリプトームに対する食餌の影響は、様々な微生物叢に比べてはるかに大きいことが示された（図4A）。様々な微生物叢の影響に関しては、NCDではMMマウス、HMマウス、GFマウスの間で明確な分離が見られ、HFDではこれらのマウスの間で同様のパターンが見られた（図4B）。異なる食餌を与えたHM、MM、GFマウス間の有意な遺伝子発現の違いをlog2 fold changeを用いて同定した。すべてのDEGの階層的クラスタリングおよびペアワイズボルカノプロットにより、HMおよびGF群と比較して、NCDを投与したMM群では肝遺伝子発現パターンが著しく異なることが明らかになり（図4C）、外因性または欠損した腸内細菌叢によって誘導される肝遺伝子発現の大きな変化が確認された。HMマウスをNCDで処理すると、その発現はGFマウスの肝臓で見られるレベルへと変化した。しかし、HFD処理下では、GF雄マウスと比較して、ヒトまたはマウスの微生物叢を保有するマウスの肝臓トランスクリプトームにはわずかな差異しか観察されず、高脂肪食の肝臓トランスクリプトームへの影響が、異なる微生物叢のそれを上回っていることがさらに強調された。ボルケーノプロットは、gnotobioticマウスの肝臓において、外因性腸内細菌叢とHFDによって誘導されたDE RNAのアップレギュレーションとダウンレギュレーションを報告している（図4D）。1816個（MM+NCD vs. HM+NCD (FDR p<0.05)）の遺伝子が調節異常であり、そのうち590個がHM群のマウスでダウンレギュレートされ、1226個がHM群でアップレギュレートされた（図4D）。その他の比較では、181個（MM_NCD vs. GF_NCD）、14個（HM_HFD vs. GF_HFD）、および2個（MM_HFD vs. GF_HFD）の遺伝子が調節異常であった（図4D）。MM対照群と比較して、HFD下でHMによって誘導された調節異常遺伝子は見つからなかった（図4D、図5AおよびB）。MM、HM対GFマウスで発現が異なる遺伝子のリストをクロス比較したところ、これら2つの比較（MM_NCD対HM_NCD）およびDEG（MM_NCD対GF_NCD）で共通する遺伝子は134個で、2つのデータセットに共通しない遺伝子は1729個であった（図4D、図5AおよびB）。

図4：
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図4：
非一致微生物叢は肝臓のトランスクリプトームに大きな変化を引き起こす
A-B. NCD食（A）またはHFD食（B）のHM、MM、GFマウスの肝臓RNAシーケンスデータのデータシート解析。C. 教師なし階層的クラスタリングを用いて作成した、NCD食またはHFD食HM、MM、GFマウスの肝臓における発現差遺伝子のヒートマップ。D. NCD-fedマウス、HFD-fedマウス、HMマウス、MMマウス、GFマウスの有意な発現差遺伝子の数と各遺伝子セット間のオーバーラップを示すベン図。E. NCD食またはHFD食HM、MM、GFマウスのDE RNAのアップレギュレートおよびダウンレギュレートを示すボルケーノプロット。F. KEGGパスウェイによって同定されたNCD-fedまたはHFD-fed HM、MM、GFマウスの肝臓における発現差遺伝子の機能アノテーション。上位10個のKEGG機能を示す。KEGG、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes。調整p値（Benjamin-Hochberg法による多重仮説検定で補正）<0.05。プロット内のグレーの点は、KEGGパスウェイの重要性のない（FDR p値カットオフ= 0.05）濃縮を示す。

図5：
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図5：
一致しない微生物叢は肝臓の代謝機能障害を誘発する
AおよびB. NCD食（A）またはHFD食（B）のHM、MM、GFマウスのDE RNAのアップレギュレートおよびダウンレギュレートを示すボルケーノプロット。C.KEGGパスウェイによって同定された、NCD食またはHFD食HM、MM、GFマウスの肝臓における発現差遺伝子の機能アノテーション。上位10個のKEGG機能を示す。KEGG、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes。調整p値（Benjamin-Hochberg法による多重仮説検定で補正）<0.05。プロット内のグレーの点は、KEGGパスウェイの重要性のない（FDR p値カットオフ= 0.05）濃縮を示す。

宿主特異的な微生物叢のメンバーは、基本的な生物学的プロセスの維持において深い役割を担っている可能性がある。次に、生物学的プロセス、細胞構成要素、分子機能の3つの部分からなるDEG（UpまたはDown生物学的プロセスとして指定）のGO濃縮解析を行った（図S4-6）。バックグラウンドマウスゲノムから、DEGヒット率でソートしたバブルプロットで上位10個の濃縮カテゴリーを選択した。HMマウスでは、NCD処理下のMMマウスと比較して、解析したすべてのカテゴリーで有意な調節異常が観察された（図S4）。特に、NCDを投与したHMマウスの肝臓で障害された生物学的プロセスおよび細胞成分の中で、最も多くの遺伝子が関与するパスウェイのほとんどが、主にミトコンドリア機能障害に関与しているように見えた（図S4AおよびB）。最後に、GO分子機能解析で出現した有意な用語は、NCD処理下のHMマウスとMMマウスの間でも検出され、上位10位を補足図4に示した。また、NCDで飼育したMMマウスではGFの同腹子と比較して（図S5）、HFDで飼育したHMマウスではGFの同腹子と比較して（図S6）、基礎生物学的プロセスの顕著なシフトが観察された。より高次の全身機能に対する宿主特異的微生物叢の寄与を明らかにするために、HMマウス、MMマウス、GFマウスのDEGから濃縮KEGGパスウェイを算出した（図5C）。上位10位までのKEGGパスウェイでは、酸化的リン酸化、リボソーム、非アルコール性脂肪性肝疾患、パーキンソン病、熱発生、糖尿病性心筋症、プリオン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、代謝パスウェイが、NCD飼育HMマウスとMMマウスで有意に濃縮されていた。対照的に、HMマウスの肝臓では生物学的プロセスのダウンは検出されなかった（図5C）。注目すべきことに、NCDを与えたHMマウスとGFマウスの間では、DEGからKEGGパスウェイの有意な増加は観察されなかった。NCD飼育HMマウスと同様に、HFD飼育HMマウスで発現が増加したDEGに基づく有意に濃縮されたKEGGパスウェイのトップ10のほとんどは、HFD飼育GFマウスと比較して免疫関連機能であった（図5C）。KEGGパスウェイもまた、NCD-fed MMマウスと比較して、NCD-fed GFマウスで上昇したDEGに基づいて有意に濃縮され、宿主特異的微生物叢の存在なしに、重大な転写調節異常が示唆された（図5C）。

これらのRNA-seq結果は、外因性微生物叢のコロニー形成によるHMマウスの肝遺伝子転写、ミトコンドリア機能障害、酸化的リン酸化、細胞内シグナル伝達、および代謝の顕著なシフトを示し、重篤な転写調節異常が明らかになった。これらの結果を総合すると、特にNCD食餌条件下では、宿主特異的微生物叢と外来性微生物叢に関連するマウスレシピエント間で、肝臓における深遠な転写産物の大きなセットが識別可能であること、宿主特異的微生物叢の存在が肝臓の代謝恒常性を深く維持できることが示された。

宿主と微生物叢のミスマッチは、宿主特異的微生物叢と比較して微生物叢の代謝異常をもたらす。
腸内微生物群集による短鎖脂肪酸（SCFAs）と二次胆汁酸（BAs）の無秩序な産生は、宿主の代謝異常と関連していた16。宿主と微生物叢のミスマッチによって誘発されるこれらの組成および多様性の変化が、微生物代謝の機能的意味を持つかどうかを評価するために、宿主特異的または非特異的な微生物叢を持つモデルマウスをGFマウスと比較して、糞便管腔サンプル中のSCFAsおよび二次BAs濃度を評価した。主成分分析（PCA）の結果、SCFAsおよび二次BA生合成を含む糖質および脂質代謝経路は、宿主特異的微生物叢を有するマウス（MM）または非特異的微生物叢を有するマウス（HM）の間で有意に異なることが示された（図6A）。HMマウスの糞便管腔サンプル中の酪酸および酢酸は、NCD上のMMマウスよりも有意に低かった（図6B）。特に、宿主-微生物叢のミスマッチは、GFマウスと同様に、NCD処理下で酪酸をほぼ検出できないレベルまで減少させることにより、SCFAプールを変化させる。NCD処理時の代謝物と同様に、HM群ではMM群に比べ、HFD群では酪酸および酢酸が有意に減少したが、同じ飼料を与えたGFマウスでは同様のパターンを示した（図6B）。特に、コハク酸は、NCDを与えたMM群と比較して、HM群の糞便管腔サンプルで有意に増加した。両者とも、NCDまたはHFDを与えたGFマウスのそれよりも有意に高かった（図6B）。

図6：
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図6：
宿主特異的微生物叢は盲腸のSCFAおよびBAプロファイルに影響を及ぼす
A. NCD飼育またはHFD飼育のHM、MM、GFマウスの盲腸のSCFAとBAのPCA分析。B. NCD飼育またはHFD飼育HM、MM、GFマウスの盲腸内容物中の各種SCFAレベルの絶対定量。C-F. HM、MMおよびGFマウスのNCD食またはHFD食の糞便中の一次BA（D）、共役一次BA（E）、二次BA（F）およびマウスBA（G）の絶対定量。結果は平均値±SEMで表した。n = 各群3-6匹の雄マウス。統計学的比較は、コルモゴロフ・スミルノフ検定を用いて正規性を検定し、ANOVAまたはクルスカル・ワリス検定とターキーのポストホック検定を用いて行った。*p < 0.05. *p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001。nsは有意ではない。

宿主特異的または非特異的な腸内細菌叢を保有するマウスの管腔胆汁酸プロファイルに関しては、宿主と微生物叢のミスマッチが盲腸の胆汁酸組成に顕著な変化をもたらすことがわかった；これらの変化は、二次的な抱合体とは対照的に、一次的な胆汁酸抱合体の濃度が有意に上昇することによって特徴付けられた（図6C-F）。特に、HMマウスの盲腸胆汁酸は、コール酸やその誘導体であるタウロコール酸など、多くの一次胆汁酸の割合が増加しており、同じ餌を与えたGFマウスと同様のパターンを示した（図6CおよびD）。さらに、HMは盲腸の胆汁酸組成をさらに調節する傾向があり、HMレシピエントの盲腸管腔サンプル中の二次BA（リトコール酸、デオキシコール酸、イソデオキシコール酸、3-オキソリトコール酸など）の量は、同じ食餌を与えたMMと比較して有意に少なかった（図6EおよびF）。HMとMMのこれらの違いは、食餌成分と関連していた。注目すべきことに、HMマウスは、NCDまたはHFD処置のいずれにおいても、GF対照と同様の胆汁酸代謝異常を示した（図6C-F）。このように、宿主-微生物叢のミスマッチは、管腔SCFAsおよびBAsの有意な変化を伴い、管腔微生物の代謝産物の調節を通じて宿主シグナル伝達に影響を及ぼし、全身の代謝恒常性機能不全につながる可能性がある。

宿主-微生物叢ミスマッチの特徴により、宿主特異的微生物叢と比較して腸内代謝産物シグナル伝達の機能不全が生じる
宿主-微生物叢ミスマッチ機能によって誘導されるこれらの腸内二次代謝産物の変化が機能的な意味を持つかどうかを評価するために、宿主特異的または非特異的微生物叢を持つモデルマウスの腸内サンプルにおける宿主シグナル伝達を、GFの対応するものと比較して評価した。HMはSCFA受容体と胆汁酸受容体の両方を活性化することにより、腸内代謝産物シグナル伝達に影響を与えた。例えば、GPR109およびGPR41の転写産物は、NCDまたはHFD食条件下のMMマウスにおいて、HMまたはGFマウスと比較して有意に高かった（図7A）。しかし、これらのSCFA受容体は、NCD食条件下ではGF対照マウスと比較してHMマウスでも有意に高く、HFD食条件下ではGFマウスと変わらないレベルを示した（図7A）ことから、HMマウスはNCD条件下で軽度のSCFAシグナル伝達を示すことが示された。さらに、HMマウスはMMマウスと比較してBA受容体FXRの発現レベルが有意に低かった（図7B）。興味深いことに、NCDマウスではFXR発現レベルに有意差は認められなかった（図7B）。これらの盲腸遺伝子発現の変化は、HMが腸内細菌叢の代謝不全を誘導し、代謝産物シグナル伝達を変化させ、その結果、宿主の腸内細菌叢の不一致に起因して、肝および全身の代謝に影響を及ぼすことを示唆している。

図7：
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図7：
宿主特異的微生物叢は盲腸のSCFAおよびBA受容体に影響を及ぼす
A. 8週間のNCDまたはHFD後の盲腸におけるGPR109およびGPR41遺伝子の発現。B. 8週間のNCDまたはHFD後の盲腸におけるFXR遺伝子の発現。結果は平均値±SEMで表した。n = 1群あたり3-6匹の雄マウス。統計学的比較は、コルモゴロフ・スミルノフ検定を用いて正規性を検定し、次にANOVAまたはクルスカル・ワリス検定とターキーのポストホック検定を用いて行った。*p < 0.05. *p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001。nsは有意ではない。

考察
哺乳類宿主の代謝恒常性は、食事、宿主の遺伝、腸内細菌叢のバランスによって成り立っている。本研究では、宿主の代謝恒常性の維持には宿主特異的な微生物叢が必要であり、宿主と微生物叢のミスマッチは代謝不全をもたらすことを見出した。興味深いことに、この代謝不全はマウスの腸内における外来微生物のコロニー形成率が低いことに起因しており、コロニー形成に成功した少数の外来微生物を介した代謝産物の機能不全によってさらに誘導される可能性があった。本研究は、哺乳類のマイクロバイオームが宿主の生理学に及ぼすフィットネス効果や、マイクロバイオームを標的とした治療におけるより良いプロバイオティクスの構築に関する、最も関連性の高い研究課題を統合的に捉えたものである。

本研究では、宿主特異的微生物叢（マウス微生物叢（MM））または外来性微生物叢（ヒト微生物叢（HM））と関連づけたGFマウスモデルを用い、GFマウスを対照として、宿主が食事と外来微生物叢にどのように反応するかを検討した。その結果、MMとHMでは、観察された代謝現象や代謝速度によって、宿主の代謝プロファイルに与える影響が大きく異なることがわかった。外来微生物群集（HM）は、雄マウスにおいてHFD処理下でも体重に対して、内在微生物群集（MM）ほど有害な影響を示さなかった。HMは雄マウスにおいてHFDの宿主への有害な代謝効果を部分的に覆い隠し、GFマウスと同様の表現型傾向（すなわち、代謝亢進、代謝不全、柔軟性の欠如）を示した。その理由はおそらく、MMの方が食事から栄養素を採取する効率が高かったため、ミスマッチ群よりも体重が増加したからであろう。その結果、宿主特異的マイクロバイオームは、高脂肪食下で体重増加と宿主の代謝異常を促進し、肥満を促進するフィード・フォワード・ループを作り出した。さらに、通常食と高脂肪食の両方の条件下で、試験終了時にマイクロバイオームの状態が異なるマウスの代謝ケージ解析を行ったところ、宿主特異的マイクロバイオータの存在が、宿主のグローバルな代謝プロファイルの形成に支配的な役割を果たしていることが明らかになった。宿主特異的微生物叢を持つGFマウスを高脂肪食で飼育したところ、マウスに相当する肥満の発症と一致し、極度の肥満に見られるようなプロファイルに向かう代謝速度が観察された。しかし、雌マウスは雄マウスよりも食餌への反応が遅く、代謝率のパターンも異なっており、代謝機能に対するホルモンの影響と一致していた17。今後の研究では、オスと比較してメスでは、両方の食餌に対する長期的な適応が必要である。宿主特異的な微生物叢は、代謝恒常性（例えば代謝率）をより厳しく制御することを可能にし、それが腸内生態系の再確立とともに、初期の微生物叢組成の回復を支えていると推測できる1,2。

このような微生物ミスマッチにおける代謝不全は、マウス腸内における外来微生物のコロニー形成率が低いことに起因しているのかもしれない。異なる宿主におけるマイクロバイオームの経時的な進化を動力学的に解析した結果、腸内生態系と進化が宿主細菌プロファイルの形成に支配的な役割を果たすことが明らかになった1,2。宿主と微生物叢のミスマッチにより、特定の細菌群（特にファーミキューテス属とバクテロイデーテス属）の多様性の低下や存在量の減少など、微生物叢の著しい欠陥が生じ、宿主に対する有益な作用が失われることが観察された。ナイーブなマウス腸内におけるヒト微生物叢のコロニー形成率の低下は、先行研究と一致している18,19。有益な」細菌叢の減少は、代謝異常の素因となる代謝亢進、代謝不全、柔軟性の欠如の発症と関連している。この線に沿って、ヒトドナーからの外来微生物叢で再構成された無菌動物は、代謝系の代謝変化を悪化させ、局所的に代謝機能障害に関連した。哺乳類の腸内細菌叢は、おそらく有益微生物、常在微生物、病原性微生物の混合物から構成されている20。宿主特異的マイクロバイオームは、個体が食物源を有効に利用することを約束し、マイクロバイオータの相互作用（共代謝と相互摂食ループ）を促進し、食物資源の利用を改善するゲノム適応への道を開くかもしれない21。宿主とこれらのユニークで特異的な宿主特異的コミュニティメンバーとの間の一致した関係は、マイクロバイオームが宿主のパフォーマンスとフィットネスに効率的にプラスの影響を与えることによって維持されていると考えられる。

宿主と微生物のミスマッチが宿主の代謝に局所的に影響を与えるメカニズム的な基礎をさらに明らかにするために、我々は宿主の肝臓トランスクリプトーム解析と微生物叢の代謝物解析を行った。その結果、宿主特異的な微生物叢が、肝臓における食餌と宿主遺伝の相互作用の調整において重要な役割を果たしている可能性が示された。遺伝子発現と代謝は、GFマウスとヒト化マウスで変化した。実際、宿主と微生物のミスマッチによって有意に変調をきたした肝臓の遺伝子経路の中には、ミトコンドリア機能障害、酸化的リン酸化、細胞内シグナル伝達、代謝に関与する経路が含まれていた。特に、最も多くの遺伝子が関与するパスウェイのほとんどが、NCDを与えたHMマウスの肝臓では、主にミトコンドリア機能障害に関与しているようであった。細胞の発電所であるミトコンドリアは、健康、病気、老化のプロセスにおいて重要な役割を果たしており、ミトコンドリアの機能不全は、ほとんどすべての病理学的および毒性学的状態に関与している22,23。ミトコンドリア活性の亢進やミトコンドリア機能障害は、GFマウスやヒト化マウスにおける代謝的特徴のひとつとして広く受け入れられている24,25。これらの疾患で観察された免疫プロファイルの調節異常と一致して、濃縮KEGGパスウェイでも、宿主特異的微生物群の存在なしに、酸化的リン酸化、リボソーム、非アルコール性脂肪肝疾患、パーキンソン病、熱発生、糖尿病性心筋症、プリオン病、ハンチントン病、アルツハイマー病パスウェイの増加など、免疫に関連した転写調節異常が深く関わっていることが確認された。宿主特異的微生物群集の存在は、肝臓の代謝ホメオスタシスを深く維持することができるが、一方、実験的に媒介された系統共生の崩壊は、肝臓における宿主のフィットネスやパフォーマンスを低下させる機能的コストをもたらす。全体として、宿主と微生物叢のミスマッチは、代謝機能障害のために肝臓の転写において有害な結果をもたらした。驚くべきことに、高脂肪食はどちらの微生物叢よりも肝臓のトランスクリプトームに大きな影響を与えた。我々は、宿主特異的な微生物叢のコロニー形成過程において、微生物叢由来の分子による細胞シグナル伝達経路の活性化が、宿主の生理学的成熟と下流の代謝に極めて重要であるという仮説を立てた。今後の研究では、この現象を引き起こす微生物叢由来のシグナルを明らかにする必要がある。

不一致のマイクロバイオームが提供する代謝産物分子メカニズムは、代謝機能不全をもたらす宿主に寄与する可能性がある12,13。最近、腸内微生物の代謝産物が、SCFAと胆汁酸のシグナル伝達を介して、宿主の脂肪酸と脂質代謝のホメオスタシスを制御していることが示唆された11,15。本研究では、外因性微生物は大腸の主燃料源である酪酸に対する宿主の代謝ニーズを満たすことができず、その結果、盲腸のSCFAシグナル伝達GPR109およびGPR41を低下させることにより、全身の代謝ホメオスタシスにさらに影響を及ぼした。我々の研究は、宿主と微生物叢のミスマッチによって、大腸の主要なエネルギー源であるSCFAsのレベルが低下し、大腸によるエネルギー需要が促進される可能性が高いことを明らかにすることで、この一連の知見に新たな一面を加えるものである14。SCFAに加えて、宿主-微生物叢のミスマッチは盲腸における胆汁酸代謝異常とその下流標的（例えばFXR）も引き起こした。胆汁酸は腸内を循環し、一次胆汁酸は微生物叢によってさらに脱共役され、二次胆汁酸に変換され、グルコース代謝のさらなるメディエーターとなる15。本研究では、宿主と微生物叢のミスマッチが、盲腸においてタウリン共役胆汁酸の濃度を有意に増加させ7,26、二次胆汁酸の割合を減少させることが観察された。さらに、コール酸やチェノデオキシコール酸などの非共役胆汁酸は、FXRシグナルを含む胆汁酸受容体に対する強力なアゴニストであり、これらの受容体は、コレステロールや脂質の代謝、グルコースの維持、肝ホメオスタシスに関連する転写ネットワークやシグナル伝達カスケードを活性化する17。我々の知見によると、HFD条件下で宿主と微生物叢がミスマッチしたマウスでは、FXRの発現が盲腸で低下しており、これはGFマウスや抗生物質投与マウスで報告されているすべての特徴であった12,13。さらに、腸におけるFXRの不活性化は、BAsの取り込みが増加し、その結果、肝細胞における一次BAsのde novo合成が増加することを示唆している。さらに、一次胆汁酸の炎症促進作用も報告されている15,27。したがって、宿主と微生物叢の不一致は胆汁酸の生理学的変化を引き起こし、様々な方法を通じて宿主の代謝に影響を及ぼす可能性がある。最後に、HM関連マウスの代謝異常の特徴のいくつかは、MMマウスとGFマウスの中間レベルで観察された。このことは、これらのコロニー形成された外来微生物は、非常に限定されたレベルではあるが、依然として代謝機能を発揮できることを示唆している。これらのデータを総合すると、宿主と微生物のミスマッチがSCFAおよび胆汁酸代謝に与える影響は、外因性マイクロバイオームがHFD誘発肝・全身代謝障害および宿主機能障害を増強するメカニズムのひとつである可能性が示唆された。これらの結果は、宿主特異的マイクロバイオームが微生物代謝産物によって宿主の代謝ホメオスタシスを制御する新たなメカニズムを定義した。

宿主に関連するマイクロバイオームは、食餌シフトに対応する宿主の可塑的応答を生み出し、それに寄与することができる28。我々の研究では、宿主特異的微生物群集の中で、食餌がマイクロバイオームの組成と存在量の大きな変動を特徴づける可能性があることを示した。これらの微生物の動態は、微生物のフィットネスによってもたらされるものから、宿主の表現型の多くの側面に影響を与える可能性がある。このような宿主特異的な微生物が介在する変化は、環境（すなわち食餌）によって誘発されるため、従来宿主の表現型の可塑性と考えられてきたものと同等の効果をもたらす可能性がある。対照的に、外来性マイクロバイオーム（すなわちヒトマイクロバイオーム）の場合、食餌シフトに反応する宿主とマイクロバイオータの可塑的反応はいずれもかなり限定的である。宿主-微生物間の分子シグナル伝達（ポジティブシグナルもネガティブシグナルも）は、同じような言語を通して一致させた方がうまくいくように思われるが、一方、GFマウスは環境シグナルを全く伝達しておらず、HMは十分な、あるいは同じシグナルを伝達していない。

宿主と微生物叢のミスマッチは、微生物ディスバイオシスと同様に、複数の標的（すなわち、腸内微生物の多様性と機能的可能性の変化、代謝速度の増加）を改変することによって、宿主の代謝に及ぼす有害な影響の一部を増大させ、機能障害、肝臓における免疫反応の亢進、腸管内腔におけるSCFAと胆汁酸濃度の不均衡を促進することを示した。これらすべての経路は最終的に収束し、特にHFD環境では宿主の代謝機能をさらに阻害する。まとめると、宿主と微生物のミスマッチは代謝に重大な結果をもたらす。宿主と微生物のミスマッチがもたらすこれらの代謝的影響が、マイクロバイオームのコロニー形成選択によるものなのか、メタボロミクスの不十分さによるものなのか、あるいはそれらの組み合わせによるものなのかは不明であるが、宿主の生理学的プロセスに重大な影響を及ぼす可能性は非常に高い。総合すると、本研究は、この仮説を他の哺乳類宿主でさらに検証するための概念的枠組みを提供し、微生物ディスバイオシス関連疾患を抑制する際のプロバイオティクス使用などの予防戦略の評価を保証するものである。

結論
我々の研究は、宿主特異的微生物叢が宿主の代謝恒常性の維持に重要であり、疾患治療において操作される腸内細菌叢は、これまで理解されていたよりも宿主特異的であることを示唆している。我々が発見した宿主特異的微生物叢の重要なシグネチャーは、コロニー形成におけるホームサイトの優位性と、それが供給する十分かつ適切な代謝産物である。全体として、我々のマルチオミクス研究は、代謝ホメオスタシスにおける宿主特異的微生物叢に関する最初の報告である。宿主のフィットネスにおける宿主特異的微生物叢の相互機能が複雑かつ多面的であることを考えると、本研究は、腸内細菌叢に関わる正確なメカニズムのさらなる解明と、疾患に対する微生物叢治療薬の開発に向けて、確かな基礎を築いたと考えられる。今後の重要な研究課題は、管理された実験的アプローチとバイオインフォマティック・アプローチの一貫したセットで、腸内共生細菌が宿主のフィットネスにどのように寄与しているのかを解明し、その複合的な寄与を理解することである。もう一つの難問は、環境が腸内細菌叢の構成や動態・進化にどの程度寄与しているのか、そしてそれが宿主のフィットネスにどのように影響しているのかということである。マウスモデルは比較的低コストでバックグラウンドコントロールが容易であるため、宿主微生物叢-代謝疾患研究において人気があるが、マウスモデルを用いた研究はその結果を慎重に解釈する必要がある。トランスレーショナルなマイクロバイオーム研究や治療法の開発には、糞便微生物叢移植やプロバイオティクスにおける宿主特異的生着が考慮されなければならない。このような目標を達成するためには、生態学的・進化学的視点に基づいた標準化された研究手法と解析が必要であり、また、異なる研究からの情報を統合する共同リソースが必要であると我々は主張する。

研究方法
動物飼育
すべての動物実験は、シカゴ大学の施設動物飼育使用委員会の承認を得ている。これらの研究に使用されたマウスはすべてC57Bl/6J遺伝的背景を持つ。無胚芽（GF）マウス（シカゴ大学GF動物施設）は、シカゴ大学のGFげっ歯類飼育条件下で飼育された。マウスのGF状態は、好気性および嫌気性培養とマウス糞便の16S PCRを用いて1週間ごとに評価し、実験期間中、細菌、カビ、酵母が存在しないことを確認した。特異的病原体フリー（SPF）マウスは、シカゴ大学のSPFバリア施設内で飼育した。特に指示がない限り、動物にはオートクレーブ滅菌した低脂肪で植物性多糖類を豊富に含む標準食を自由摂取させた。マウスは3～4週齢で微生物叢移植を受けた。すべての実験において、寝具は7日ごとに交換した。すべてのマウスは12：12時間の明暗サイクルで飼育された。マウスにHMまたはMMを単回経口投与した。マウスは安楽死させ、試験終了時に組織サンプルを採取した。糞便内容物は新鮮なまま凍結し、-80℃で保存した。本試験で使用した高脂肪食（ヒト乳脂肪分18%）は、Envigo社（TD.97222）からカスタマイズして購入した。

代謝表現型解析
エネルギー代謝解析のため、マウスは個々に飼育され、食餌処理後は無菌のPromethion代謝ケージシステム（Sable Systems International社、米国ラスベガス）でモニターされた。代謝ケージは、温度と光が制御された環境エンクロージャー内に設置された。マウスは12時間の明暗サイクルと22℃の周囲温度にさらされた。マウスはマツチップの寝床に入れ、NCDまたはHFDと水を自由に摂取できるようにした。代謝ケージに1週間収容し、元の食餌処理下で、ガス交換、エネルギー消費、総活動量（全メーター/歩数計）を連続的に測定した。酸素消費量（VO2）、二酸化炭素発生量（VCO2）、呼吸交換比（RQ）、エネルギー消費量（EE）は、5分間隔で30秒間測定し、分析に用いた（12時間の明暗相比較）。呼吸交換商（RQ）は、O2消費量に対するCO2生成量の比として計算され、基質利用の指標として用いられた。RQが0.8以上であれば主に炭水化物代謝、0.8であれば炭水化物と脂肪の混合代謝、0.8未満であれば主に脂肪代謝を示す。エネルギー消費量はWeir式29を用いて計算した：Kcal/h = 60 × (0.003941 × VO2 + 0.001106 × VCO2)、ここでVO2は酸素消費量、VCO2は二酸化炭素排出量である。食物摂取量と水分摂取量は、体重計で測定される。歩行活動は、熱量測定データの収集と同時に1秒ごとに測定される。歩行活動と位置は、XYZビームアレイ（BXYZ-R; Sable Systems, Las Vegas, NV）で検出され、ビーム間隔は1.0cm、重心分解能は0.25cm。MetaScreen v2.2.18がデータ収集と装置制御を調整し、ExpeData v1.7.30（Sable Systems）を用いて生データを処理した。

肝臓組織学
各マウスの肝臓サンプルをホルマリン固定し、パラフィンに包埋し、切片化した（5μm）。その後、標準化されたプロトコルを用いてヘマトキシリン-エオシン（H&E）染色を行い、実験と盲検化された経験豊富な病理学者が脂肪症と炎症の重症度をスコア化した。ルーチン染色による組織学的評価に基づいて、NAFLD活動性スコア（NAS）と呼ばれる非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の特徴をスコア化する半定量的システムが開発された。NASの合計は、脂肪症（0-3）、小葉の炎症（0-3）、バルーニング（0-2）のスコアの合計であり、0-8の範囲である。脂肪腫のスコア：低〜中出力検査で評価した脂肪腫の表面積の割合；0（0〜5％）、1（5〜33％）、2（33〜66％）、3（66％以上）。大葉の炎症スコア： 0 (なし)、1 (< 2 焦点 / 200倍)、2 (2-4 焦点 / 200倍)、3 (> 4 焦点 / 200倍)。肝細胞バルーンスコア： 0（なし）、1（少数のバルーン細胞）、2（多数の細胞／顕著なバルーン形成） 30.

精巣上体脂肪組織学
脂肪組織の形態分析は、ヘマトキシリン-エオシン-サフラン（HES染色）で染色した切片で行った。スライドはPanoramic digital slide scanner (3DHistech Ltd., Budapest, Hungary)を用いてデジタル化し、3DHistech社のPanoramic Viewerソフトウェアを用いて脂肪細胞形態の解析、定量化、写真撮影を行った。顕微鏡視野（各組織につき少なくとも5視野）あたりの脂肪細胞数を200倍の倍率で決定し、脂肪細胞の平均表面積（平方マイクロメートル）を算出した。

DNA単離および16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子配列決定
DNA は QIAamp PowerFecal Pro DNA kit（Qiagen）を用いて抽出した。抽出の前に、サンプルをビーズビート法で機械的に破砕した。簡単に説明すると、サンプルを溶解バッファーとともにビーズチューブ（Qiagen）に懸濁し、ビーズミルホモジナイザー（Fisherブランド）に負荷した。次にサンプルを遠心分離し、上清を阻害物質を効果的に除去する試薬に懸濁した。その後、スピンカラムフィルター膜を用いてDNAをルーチンで精製し、Qubitを用いて定量した。16S rRNA遺伝子内のV4-V5領域を、ユニバーサル細菌プライマー-563F（5'-nnnnnnn-NNNNN-AYTGGGYDTAAA-GNG-3'）および926R（5'-nnnnnnn-NNNNN-CCGTCAATTYHT-TTRAGT-3'）を使用して増幅した、 ここで、'N'はバーコードを表し、'n'はオフセットプライマー配列決定のために追加されたヌクレオチドである。約412bp領域のアンプリコンをスピンカラムベースの方法（Minelute, Qiagen）で精製し、定量し、等モル濃度でプールした。QIAseq 1-stepアンプリコンライブラリーキット（Qiagen）を用いて、イルミナシーケンス対応のUnique Dual Index（UDI）アダプターをプールにライゲーションした。QubitとTapestationを用いてライブラリーQCを行い、Illumina MiSeqプラットフォームでシーケンスして2×250bpリードを生成した。

16S rRNA遺伝子パイロシーケンスデータの前処理と解析
MiSeq 16S rRNAリードを処理するためのデフォルトのパイプラインとして、DADA2アルゴリズム（v1.18.0）31を使用し、R（v4.0.3）で若干の修正を加えた。具体的には、まずリードをフォワードリード、リバースリードともに180 bpでトリミングし、低品質ヌクレオチドを除去した。キメラはdada2パイプラインのデフォルトのコンセンサスメソッドで検出、除去した。次に、長さが300 bpから360 bpの正確な配列変異（ASV）を残し、高品質のASVとみなした。得られたASVの分類は、RDPデータベースを用いて、ブートストラップ信頼度スコア50以上で属レベルに割り当てた。Rパッケージ "MSA"(v1.22.0)と "ape"(v5.6.1)を用いて、全ASVの多重配列アライメントを行い、近傍結合系統樹を作成した。アルファ多様性とベータ多様性の解析は、Rでphyloseqパッケージ32を用いて行った。アルファ多様性はシャノン多様性指数33で計算した。主座標分析（PCoA）は、系統情報に基づく微生物群集間の差異を計算する手法である、重み付けおよび非重み付けUniFrac距離に基づいて行った34。加重UniFrancはASVの有無と存在量距離の両方を考慮し、非加重UniFracはASVの存在量のみを考慮した。Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA, R function adonis (vegan, 999 permutations))を用いて、β多様性の一対の統計的差異を分析した35。Benjamini-Hochberg偽発見率（FDR）補正は多重仮説検定の補正に使用した36。有意差のあるASVはSTAMPの解析プラットフォームを用いて決定した。

肝臓RNA配列決定とデータの前処理、処理、正規化、および差次的発現解析
マウスの肝臓サンプルは、MMおよびHM関連マウスから8週間の食餌曝露後に採取した。それぞれの条件について、5～6個の複製を採取した。凍結肝組織は、既述のように全RNAを単離するために処理された37。RNAサンプルは、シカゴ大学のゲノミクス施設を通じてIllumina NovaSEQ6000プラットフォームで配列決定した。サンプルはRNA-seq技術によって配列決定され、fastq形式の生リードが得られた。RNA-seq解析から生成された生のfastqファイルは、品質を評価するためにfastqcで検査された。RライブラリSVAのComBat-Seq 38を使用してバッチ補正を行い、2回のシーケンス実行によるデータセットから不要な技術的ばらつきを除去した。STAR 39 (version 2.4.2a, Stanford University, CA)アライナーを用いて、生リードをリファレンスマウスゲノム(GRCm38 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc)にマッピングした。最大ミスマッチのSTARデフォルトパラメーターは10で、これは哺乳類ゲノムと最近のRNA-seqデータに基づいて最適化されている。Gencode 40 vM23の遺伝的特徴は、STARによって生成された結果のbamファイルから抽出された。次に、featureCounts 41 (version subread-1.4.6-p1)を用いて生の遺伝子発現数行列を作成した。EdgeRパッケージ（バージョン3.22.5）を用いて低発現遺伝子をフィルタリングし、4サンプルで10counts-per-million（CPM）以下に発現した遺伝子を除去した。Limma-Voom 43パイプライン（バージョン3.38.3）を適用して、フィルタリングしたカウント行列を正規化し、一対比較のための差次的遺伝子発現解析を行った。さらに、食事の変化と経時的変動による遺伝子発現プロファイルへの影響に注目した。差次的発現遺伝子（DEG）は、FDRで調整したP値のカットオフ値0.05を用いて同定した。Lynx enrichment 44を用いて、有意なDEGとマウス特有のGO用語およびKEGGパスウェイの濃縮解析を行った。有意に濃縮されたカテゴリは、FDR調整P値<0.05を用いて選択された。

正規化されたRNA-seqデータに基づくサンプル間のばらつきを示すために、多次元尺度法（MDS）プロットが用いられた。各ポイントは1サンプルを表し、2ポイント間の距離は対応するサンプルの主要logFC（フォルダ変化）を反映している。先行logFCは、各サンプルペア間の最大絶対logFCの平均である。サンプルはマイクロバイオームと食事群ごとにラベル付けし、色分けした。様々な対照群におけるDEGのボルケーノプロットを適用した。各遺伝子のlogFCをFDR調整P値に対してプロットした。水平の赤線は有意閾値0.05を表している。色分けされた点は、コントラストグループ内で負または正のlogFCを区別した。ベン図は、2つの関連する対照群で発現が増加した重複するDEGを示すために使用した。ヒートマップはComplexHeatmap 45,46、ベン図はVennDiagram 47、データシートはedgeR 42から作成した。上位10位までの濃縮カテゴリーと上位10位までのKEGGパスウェイを、バックグラウンドマウスゲノムからのDEGヒット率でソートしたバブルプロットで示した。濃縮カテゴリーについては、3つのサブオントロジーカテゴリー（BPはBiological Process、MFはMolecular Function、CCはCellular Component）を全て考慮した。

メタボロミクス
シカゴ大学のDFI Host-Microbe Metabolomics Facility (DFI-HMMF)により、提案された方法および解析パイプラインを用いて、疎水性、サイズ、電荷などの物理化学的特性が異なる腸由来代謝物の定量的および定性的レベルを捕捉するために、3つの質量分析プラットフォームにわたって糞便メタボロームを解析した。

セカル物質からのSCFAsおよび胆汁酸の抽出
ビーズラプターチューブ（Fisherbrand; 15-340-154）中で、あらかじめ秤量した糞便/膀胱サンプルに抽出溶媒（内部標準物質を添加し、-80℃で保存した80%メタノール）を100 mg/mLの割合で添加した。サンプルは、ビーズミル24ホモジナイザー（Fisher；15-340-163）を用い、1.6m/sに設定し、30秒サイクルを6回、1サイクルあたり5秒停止し、4℃でホモジナイズした。その後、サンプルを-10℃、20,000 x g で 15 分間遠心し、上清をその後のメタボローム解析に使用した。

GC-nCI-MSおよび誘導体化を用いたSCFA分析
短鎖脂肪酸の誘導体化は、Haakらの記載に以下の修正を加えた方法で行った1。代謝物抽出液（100 µL）を、キャップ付き質量分析用オートサンプラーバイアル（Microliter; 09-1200）に入れた 100 mM ホウ酸緩衝液（pH 10）（Thermo Fisher, 28341）、アセトニトリル（Fisher; A955-4）中の 100 mM 臭化ペンタフルオロベンジル（Millipore Sigma; 90257）400µL、および n-ヘキサン（Acros Organics; 160780010）400µLに加えた。試料をサーモミキサーC（エッペンドルフ社製）で1300rpmで振とうしながら65℃まで1時間加熱した。RTまで冷却後、サンプルを4℃、2000 x gで5分間遠心分離し、相分離させた。ヘキサン相（100 µL）（上層）をガラスインサートの入ったオートサンプラーバイアルに移し、バイアルを密封した。さらに100 µLのヘキサン相を900 µLのn-ヘキサンで希釈し、オートサンプラーバイアルに入れた。濃縮および希釈サンプルを、HP-5MSUI カラム (30 m x 0.25 mm、0.25 µm; Agilent Technologies 19091S-433UI)、試薬ガスとしてメタン (純度 99.999%)、1 µL スプリットインジェクション (1:10 スプリット比) を使用し、負イオン化モードで動作する GC-MS (Agilent 7890A GC システム、Agilent 5975C MS 検出器) を使用して分析しました。オーブンランプパラメーター： 60 °Cで1分保持、300 °Cまで毎分25 °C、300 °Cで2.5分保持。酢酸塩（100 mM）、プロピオン酸塩（25 mM）、酪酸塩（12.5 mM）、コハク酸塩（50 mM）の10点検量線を作成し、9回の2倍連続希釈を行った。データ解析は、MassHunter Quantitative Analysis ソフトウェア（バージョン B.10、Agilent Technologies）を用いて行い、真正標準物質との比較によって確認しました。正規化ピーク面積は、標的分析物の生ピーク面積を内部標準物質の平均生ピーク面積で割ることにより算出した。

胆汁酸分析
胆汁酸はLCMSを用いて分析した。代謝物抽出液 (75 μL) を標識済み質量分析オートサンプラーバイアル (Microliter; 09-1200) に加え、窒素気流下、30 L/min (上) 1 L/min (下) 30 °C で完全に乾燥させた (Biotage SPE Dry 96 Dual; 3579M)。サンプルを50:50の水に懸濁した： メタノール（750μL）。バイアルをサーモミキサーC（エッペンドルフ社製）に加え、4℃、1000rpm、15分間で分析物を懸濁し、4℃で無限保持した。その後、試料をあらかじめ標識した微量遠心チューブに移し、4℃、20,000 x gで15分間遠心して不溶性の残渣を除去した。上清（700μL）を新しいラベル付き質量分析オートサンプラーバイアルに移した。サンプルは、液体クロマトグラフィーシステム (Agilent 1290 infinity II) と、Agilent Jet Stream エレクトロスプレーイオン源を備えたネガティブモードで動作する四重極飛行時間 (QTOF) 質量分析計 (Agilent 6546) を組み合わせて分析しました。サンプル (5 μL) を、XBridge© BEH C18 ガード (Waters Corporation, PN) を装着した XBridge© BEH C18 カラム (3.5 μm, 2.1 x 100 mm; Waters Corporation, PN) に 45 °C で注入しました。72%A(水、0.1%ギ酸)と28%B(アセトン、0.1%ギ酸)を0.4mL/minの流速で1分間かけて溶出を開始し、5分間かけて33%Bまで直線的に増加させた後、14分間かけて65%Bまで直線的に増加させた。次に流速を0.6 mL/minに上げ、Bを0.5分かけて98%まで上昇させ、これらの条件を3.5分間一定に保った。最後に、流速0.4 mL/分の28%Bで3分間再平衡化を行った。エレクトロスプレーイオン化条件は、キャピラリー電圧3.5 kV、ノズル電圧2 kV、検出窓100-1700 m/zに設定し、質量較正用にリファレンス質量（Agilent ESI TOF Biopolymer Analysis Reference Mix）を連続注入しました。定量には 10 点検量線を使用しました。データ解析は、MassHunter Profinder Analysis ソフトウェア (バージョン B.10、Agilent Technologies) を使用して行い、真正標準物質との比較によって確認しました。正規化ピーク面積は、標的分析物の生ピーク面積を内部標準物質の平均生ピーク面積で割ることにより算出した。

RNA単離と定量的RT-PCR
凍結肝臓および盲腸掻爬組織を処理し、既述のTrizol抽出法を用いて全RNAを単離した37。Roche Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kitを用い、SuperScript II（invitrogen）とランダムヘキサマーを用いてcDNAへの逆転写を行った（各サンプル1ug total RNA）。フォワードおよびリバースプライマーをiQSYBR Green PCR Supermix（Bio-rad）に加え、gpr109を増幅した（Fwd: GGCGTGGTGCAGTGAGCAGT; Rev： GGCCCACGGACAGGCTAGGT）、gpr41（Fwd：TTCTGAGCGTGGCCTATCCA；Rev：AGACTACTGACCAGACCAG）、およびfxr（Fwd：CTTGATGTGCTACAAAAGCTGTG；Rev：ACTCTCCAAGACATCAGCATCTC）を増幅した。リアルタイム定量PCRはBio-Rad CFX Maestro Systemで行った。リアルタイム定量PCRはBiorad CFX Maestro qPCRシステムを用いて行った。遺伝子発現はハウスキーピング遺伝子gapdhで正規化した。データは各食餌条件下でのMMマウスと比較した倍数変化で示した。

統計解析
統計解析は、PRISM統計ソフトウエアパッケージ48を用いて行った。データは平均値+/-平均値の標準誤差（SEM）で示し、統計的有意性はp<0.05、0.01、0.001とした。統計的有意性はノンパラメトリックのKruskal-Wallis検定とTurkeyの多重比較により決定され、p<0.05を有意とした。

貢献
N.F.およびE.C.が研究の指示および設計を行い、N.F.、M.S.、B.T.、T.L.、A.T.およびS.M.がマウス作業の管理および実行を行い、N.F.およびT.L.がサンプルの解析および解釈を行った。A.M.S.はメタボローム解析を行った。M.G.はRNA単離と定量的RT-PCRを行い、B.X.、N.F.、D.S.はRNAシーケンスデータの解析と解釈を行い、N.F.はメタゲノムシーケンスデータの解析を行った。

競合利益
著者らは、競合する金銭的利害関係はないことを表明している。

謝辞
SPFマウスとGFマウスの系統を管理してくださったシカゴ大学動物資源センター（The University of Chicago, Chicago, IL 60637, USA）に感謝する。本研究はNIHからの助成金（RC2DK122394）によって行われた。

参考文献
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2023年11月06日掲載
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