腸管GCN2は、r/tRNAオペロンがコードするLactiplantibacillus plantarum共生の合図に応答してショウジョウバエの全身成長を制御する

2023年7月10日 09:45

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テオドール・グルニエ
ジェシカ・コンスエグラ
マリアナ・G・フェラリーニ
フーサム・アヘラズ
白龍偉
イヴ・デュサビーネマ
イザベル・ラヒウイ
ペドロ・ダ・シルヴァ
ベンジャミン・ジレ
サンドリーヌ・ヒューズ
キャシー・I・ラモス
レナータ・C・マトス
フランソワ・ルリエ
他著者リストを展開する
フランス、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン遺伝子機能研究所
リヨン大学、INSAリヨン、INRAE、BF2I、UMR 203、69621、フランス
フランス、リヨン第一大学、リヨン大学、UMR 5558、進化生物学・生物学研究所
他、著者リストを展開
2023年6月9日
https://doi.org/10.7554/eLife.76584
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ジェシカ・コンスエグラ
マリアナ・G・フェラリーニ
ホウサム・アヘラズ
白龍偉
イヴ・デュサバイネマ
イザベル・ラヒウイ
ペドロ・ダ・シルヴァ
ベンジャミン・ジレ
サンドリーヌ・ヒューズ
キャシー・I・ラモス
レナータ・C・マトス
フランソワ・ルリエ

(2023)
腸管GCN2は、r/tRNAオペロンがコードするLactiplantibacillus plantarum共生の合図に応答してショウジョウバエの全身成長を制御する

eLife 12:e76584.
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2023年6月22日（本バージョン）
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概要
共生細菌は共生を手がかりに宿主と相互作用する。ここでは、ショウジョウバエとLactiplantibacillus plantarum（Lp）の相互作用を利用して、宿主と共生細菌の新たな相互作用のメカニズムを調べた。化学的に定義された飼料を用い、Lpが制限アミノ酸を生産できないにもかかわらず、Lpと共生することでアミノ酸不均衡飼料を与えられた幼虫の成長が改善されることを発見した。このような状況において、Lpは宿主の成長を、LpのリボソームRNAとトランスファーRNA（r/tRNA）をコードする機能的なオペロンと、ショウジョウバエの腸細胞のgeneral control nonderepressible 2（GCN2）キナーゼを必要とする分子対話を通じてサポートしていることを示した。我々のデータは、Lpのr/tRNAが細胞外小胞にパッケージされ、幼虫の腸細胞のサブセットにおいてGCN2を活性化すること、これは腸のトランスクリプトームをリモデリングし、最終的に同化成長をサポートするのに必要なメカニズムであることを示している。この知見に基づき、我々は、r/tRNAオペロンがコードする非栄養的な共生キューのメディエーターとしてのGCN2の非正規的な役割に依存する、宿主と微生物の間の新たな有益な分子対話を提案する。
編集部の評価
これまでの研究で、微生物叢の一成分であるラクトバチルス・プランタラムが、宿主であるショウジョウバエの発生をサポートすることが明らかにされている。今回著者らは、定義された飼料を用いてこの相互作用をさらに探索し、いくつかの必須アミノ酸のレベルが低い条件下では、細菌がアミノ酸を合成していないにもかかわらず、細菌が生存を促進できることを発見した。細菌トランスポゾン挿入変異体のスクリーニングを通じて、著者らはこの効果に必要なものとして細菌のトランスファーRNAとリボソームRNAを同定し、ハエを用いた研究では、腸細胞において宿主のtRNAと会合することが知られているタンパク質である宿主キナーゼGCN2がこの応答のメディエーターであることを実証した。この原稿は、腸内細菌叢と宿主の防御反応とを結びつけ、これらの相互作用に関する重要な洞察を提供するものである。
https://doi.org/10.7554/eLife.76584.sa0
決定書
サイエティのレビュー
イーライフのレビュープロセス
はじめに
動物は多様な微生物と共生しながら進化してきた。共生微生物は宿主の生理、代謝、行動の様々な側面に強い影響を与える。キイロショウジョウバエ（以下、ショウジョウバエ）は、宿主と共生微生物の相互作用の根底にあるメカニズムを研究するための強力なモデルである。実際、ショウジョウバエは単純な細菌群集を保有しており、個々の構成要素を好気的に培養することができる。さらに、ショウジョウバエは軸性繁殖が容易であるため、異種生物学的研究が可能である。最後に、ショウジョウバエの主な共生細菌は遺伝子工学的に操作することが可能であり、宿主側と微生物側の双方で深いメカニズム研究を行うことができる。過去10年間で、ショウジョウバエの共生微生物が宿主の胚発生後の成長（Shin et al., 2011; Storelli et al、 2015）、代謝（Gnainskyら、2021；Kamareddineら、2018；Newell and Douglas、2014）、免疫（Iatsenkoら、2018）、社会行動（Chenら、2019；Sharonら、2010）、食物嗜好（Kimら、2021；Leitão-Gonçalvesら、2017）。これらの現象を支えるメカニズムは、多くの場合、宿主のシグナル伝達経路と相互作用する共生微生物が産生する分子である共生キューに依存している。例えば、共生細菌が産生するアミノ酸（AA）は、腸内の神経ペプチドCNMamideの産生を阻害し、AAへの選好を抑制する（Kim et al.）さらに、共生細菌の合図は非栄養的な場合もある。腸細胞による共生細菌の細胞壁成分の感知は消化酵素の産生につながり、幼虫の食餌ポリペプチドの消化を助け、全身の成長を改善する（Erkosarら、2015；Matosら、2017）。共生微生物が産生する酢酸は腸内分泌細胞のエピゲノムを変化させ、タキキニンというホルモンの分泌を刺激する（Jugderら、2021年）。タキキニンはその後、近傍の腸細胞における脂質の利用を促進する（Kamareddine et al.）これらの例にとどまらず、ショウジョウバエと微生物の共生には共生キューが広く存在している可能性があるが、その性質はいまだ解明されていない。したがって、それらを同定することは、宿主-共生生物相互作用の分野における重要な目標である（Selosse et al.）
本研究では、ショウジョウバエの共生細菌が宿主の生理機能に影響を与えるための、非栄養的な共生キューをさらに同定することを目指した。その手がかりとして、ショウジョウバエの胚発生後の全身性成長を用いた。ショウジョウバエの成長段階（幼虫期）は、栄養環境に大きく左右される。幼虫は、最適な栄養条件下では4～5日で変態（蛹化）に達するが、厳しい栄養不良条件下では最大15～20日かかる（Erkosar et al.）栄養は、栄養感知調節経路、特にAA感知経路の作用を通じて、幼虫の全身成長を調節する。主なAA感知経路は、ターゲット-オブ-ラパマイシン（TOR）キナーゼ経路と、general control nonderepressible 2（GCN2）キナーゼである（Gallinetti et al. 両キナーゼは酵母で初めて報告され（Dever et al., 1992; Heitman et al., 1991）、ショウジョウバエを含むほぼ全ての真核生物でオルソログ経路が見つかった（Olsen et al., 1998; Zhang et al., 2002）。TORキナーゼはmTORC1とmTORC2という2つのタンパク質複合体を形成しており、多くの合図によって活性化される（Laplante and Sabatini, 2009）。特にmTORC1は、AAトランスポーターとAA結合性細胞質タンパク質の作用を通じて、細胞内のAA濃度が高い場合に反応し、逆にAAが不足するとTOR活性が抑制される（Goberdhan et al.）いったん活性化されると、TORは4E-BPとS6Kのリン酸化を通じて翻訳を増加させ（Ma and Blenis, 2009）、ショウジョウバエ幼虫の全身成長を促進する（Colombani et al.） GCN2はいくつかの合図によって活性化される(Donnelly et al., 2013, p.2)。最もよく知られている手がかりは、細胞内AAの欠乏を反映してタンパク質合成が妨げられていることを示す、荷電していないtRNAの量である（Masson, 2019）。GCN2の活性化は、翻訳が増加するmRNAのサブセットを除き、真核開始因子2（eIF2）のリン酸化を通じてグローバルな翻訳抑制を引き起こす（Teske et al. これらのmRNAのうち、ATF4などの転写因子がストレスへの適応を促進する（Harding et al.）細胞自律的な作用に加えて、GCN2経路はショウジョウバエにおいて全身的な作用を持っている。ショウジョウバエの幼虫でGCN2をユビキタスにノックダウンすると、発育遅延が起こる（Malzer et al.）さらに、GCN2は他の生理学的プロセスの制御にも関与している。幼虫の脳のドーパミン作動性ニューロンにおけるGCN2の活性化（Bjordalら、2014年）や成虫のハエの腸細胞におけるGCN2の活性化（Kimら、2021年）は、アンバランスなAA組成の食餌を回避する顕著な行動反応を引き起こす。さらに、成虫の腸管細胞におけるGCN2は、AA/糖の不均衡に応答する腸の可塑性を制御している（Bonfini et al.）さらに、中腸や脂肪体におけるGCN2は、食事制限下での寿命延長に必要である（Kimら、2020）。最後に、脂肪体のGCN2は、AA欠乏下で生殖を抑制する（Armstrongら、2014）。
栄養不足は無菌（GF）ショウジョウバエ幼虫（すなわち微生物叢を欠く幼虫）の発育を大きく遅らせるが、このような遅れはGF幼虫が特定の菌株の共生微生物と会合することで緩衝される（Gould et al.）成長促進は部分的に栄養供給に依存している。例えば、共生細菌Lactiplantibacillus plantarum（旧名Lactobacillus plantarum [Zheng et al., 2020]、以下Lpと略す）は特定のAAを供給することができ、これにより幼虫はこれらの特定のAAがなくても成長することができる（Consuegra et al., 2020b）。我々は、AAの供給に頼らない成長促進メカニズムを明らかにしようとした。そこで、ホリディック食（HD、精製された栄養素で構成された食餌）（Piper et al. 興味深いことに、この条件下でもLpは幼虫の成長を促進できることがわかった。HDには遊離AAしか含まれていないため、このメカニズムはAAの供給や腸内プロテアーゼの刺激（Erkosar et al. その代わりに、LpがリボソームRNAとトランスファーRNA（r/tRNA）を産生し、それが細胞外小胞に放出され、腸細胞でGCN2の活性化につながることがわかった。GCN2の活性化は、上皮の成熟と代謝活性の変化に向けた腸内トランスクリプトームのリモデリングをもたらし、全身的な成長をサポートすると考えられる。我々の研究から、GCN2は、電荷を帯びない真核生物のtRNAの細胞内センサーとしての正統的な役割に加えて、細菌のr/tRNAオペロンによってコードされる非栄養的共生キューのメディエーターでもあることが示唆された。
研究結果
Lpとの結合はAA不均衡を救う
ショウジョウバエのエクソームに基づいてAA組成を決定したHD（FLY AA diet, Piper et al.）この餌はAAのバランスがよく、最適な繁殖、寿命、成長を可能にする。AAのアンバランスは、必須AA（EAA）の濃度を低下させることで生じる。不均衡な食餌はショウジョウバエの成長、繁殖、寿命に欠陥を引き起こす（Piper et al.）以前の研究で、我々はHDを用いて、どのAAがLpによって合成され、ショウジョウバエの幼虫に供給されるかを同定した。Lpは、イソロイシン、ロイシン、バリンなど、Lpが合成できないEAAを完全に欠いた餌では、幼虫の発育を助けることができない（Consuegra et al.）ここで我々は、LpがEAAの制限によるAA不均衡の影響を救済できるかどうかを考えた。この目的のため、各AAAの濃度をFLY AA飼料から選択的に70％低下させ、幼虫の発育時間（D50、すなわち変態に入る時間の中央値で表される）を測定した。予想通り、どのEAA濃度を減少させても、GF幼虫の成長遅延を引き起こした。特定のEAA（Ile、Lys、Thr、Trp、Val）の量を減少させると、GF幼虫の発育は完全に阻害され、L2またはL3ステージで停止した。その他のEAA（Arg、His、Met、Leu、Phe）の量を減らすと、GF幼虫の発育はFLY AA飼料に比べて著しく遅れた（図1A）。異なる条件を比較するために、我々はGF幼虫が強い発育遅延を伴いながら蛹化に達することができる設定を見つけることを目指した。そのため、各EAAの濃度を60％減少させるだけで、AAの不均衡をそれほど深刻にしないようにした。同様の傾向が観察された：Ile、Lys、Thr、Trp、またはValの量を減少させると、GF幼虫の発達に重要な遅れが生じるのに対し、Arg、His、Met、Leu、またはPheの量を減少させると、発達の遅れはわずかであった（図1B）。このことから、GF幼虫の発育にはいくつかのEAAが他のEAAよりも重要であることが確認された。あるいは、FLY AA飼料にはこれらのEAA（Ile、Lys、Thr、Trp、Val）が十分に含まれておらず、他のEAA（Arg、His、Met、Leu、Phe）が多すぎる可能性もある。
図1と1つの補足
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L.plantarum（Lp）は、アミノ酸（AA）の不均衡による発育遅延を救う。
(A,B）各必須アミノ酸（EAA）を-70％（A）または-60％（B）減少させたFLY AA飼料を与えた無菌（GF）幼虫（灰色）とLp添加幼虫（緑色）の発育時期。箱ひげ図は最大値、... もっと見る
図1-ソースデータ1
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図1-図の補足1
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AAバランス飼料におけるL. plantarumの成長促進効果の特徴。
(A-D）発育時期と生存率：グラフは5反復（平均値と標準偏差）を示す。各レプリケートは40匹の幼虫を含む1本のチューブで構成されている。(A) 幼虫の発育時期。
図1-図1-ソースデータ1
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Lpとの結合は、いずれのEAAにおける制限の影響をも救った（図1AおよびB）。Lpのゲノムは分岐鎖AA（BCAA：ロイシン、イソロイシン、バリン）の合成に必要な酵素をコードしておらず（Martino et al., 2016; Saguir and de Nadra, 2007; Teusink et al., 2005）、したがってLpはショウジョウバエにこれらを提供できない（Consuegra et al.）したがって、BCAAの制限による発育遅延をLpが救済できるという事実に興味を持った。Lpが宿主の成長に及ぼすこのような有益な効果の根底にあるメカニズムを解明するため、バリン（Val）を制限した飼料に焦点を当てることにした。以後、FLY AA飼料を「バランス飼料」、FLY AA -60％Val飼料を「アンバランス飼料」と呼ぶことにする。Valを60％減少させると、GF幼虫の成長に強い遅れが生じたが、これはLpとの会合によってほぼ完全に回復した（図1C）。欠損したValを同量の他のEAA（LeuまたはHis）で置換しても、GF幼虫の発育は改善しなかった（図1D）。このことは、不均衡飼料で観察された遅延は、全AA欠乏というよりもむしろAA不均衡によるものであることを示している。注目すべきことに、Val濃度をさらに低下させると（-80％、-90％）、GF幼虫は致死したが、Lp関連幼虫は致死しなかった（図1-図1A）。LpはVal補助栄養体であるため（Consuegraら、2020b）、飼料からValを完全に除去すると、GF幼虫とLp共生幼虫の両方が致死する。逆に、Valを初期レベルより100％増加させても、GF幼虫やLp共生幼虫の発育には影響しなかった（図1-図1B）。さらに、卵から蛹までの生存率はAAの不均衡によってもLpとの会合によっても影響を受けなかった（図1-図1C）。最後に、GF幼虫に熱殺（HK）Lpを補充しても、幼虫成長に対する不均衡食の影響は回復しなかった。このことは、実験開始時にLpを接種することによってもたらされるValは、幼虫成長に必要なValレベルを回復させるのに十分ではないことを示している（図1-図1D）。これらの結果を総合すると、Lpは単回食餌EAA制限によるAA不均衡の幼虫成長への影響を、AAの供給とは独立したメカニズムで救済できることを示している。
ショウジョウバエは、内部からの合図（Bjordal et al., 2014; Gu et al., 2022）や微生物叢（Leitão-Gonçalves et al., 2017）に応じて摂食行動を適応させることができる。そこで我々は、GF幼虫とLpとの会合が幼虫の摂餌量を変化させるかどうかを実験条件下で検証した。その結果、不均衡食（図1-図1E）または均衡食（図1-図1F）では、Lpとの会合は摂餌量を変化させなかった。酵母ベースの食餌では、Lpは幼虫の腸内プロテアーゼの発現を刺激し、食餌ポリペプチドからのAAの放出を増加させることによってAA吸収を改善する（Erkosarら、2015）。しかし、我々が使用したHDにはポリペプチドは含まれておらず、AAの唯一の供給源は遊離AAである。このような条件下で、LpがValの吸収を促進するかどうかを検証した。高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて、幼虫の血球中のVal濃度を測定した。バランスの悪い飼料（FLYAA -60% Val）を与えたGF幼虫は、バランスの良い飼料を与えたGF幼虫と比較して、血液リンパ中のVal含量が減少した。この減少は、Lpとの会合によって補われた（図1E）。したがって、Lpは、幼虫の成長をサポートするAA吸収の増加を通じて、AA不均衡に対する宿主の生理的適応を促進すると考えられる。
LpによるAA不均衡の救済には、Lpの機能的なr/tRNAオペロンが必要である。
Lpが宿主の成長に対するAA不均衡の影響をどのように救うかを解明するため、Lpのトランスポゾン挿入ライブラリーを用いて遺伝子スクリーニングを行った（図2A）。このライブラリーは、オープンリーディングフレーム内に挿入された1218個のトランスポゾンを含む、染色体中にランダムに挿入された2091個の変異体で構成されている（Matos et al.）我々はGF幼虫とライブラリーの各変異体を単一交配させ、Lpのゲノムにトランスポゾンが挿入され、Lpが著しく不均衡な餌（FLY AA -80% Val、図1-図1A）上で幼虫の発育をサポートする能力が変化しているかどうかを調べた。各変異体について、D50（変態に入る時間の中央値）を計算し、zスコアに正規化した。zスコア＞2.5の閾値を適用し、32の挿入変異体を同定した。したがって、これらの変異体との関連は、著しく不均衡な食餌で幼虫の発育時期が遅れるという結果となった（図2B）。これらの32の候補を検証するため、個々に複数（5）反復で再試験を行った。32の候補に関連した幼虫の発育を、WT様表現型（Lp:Tncontrol、z-score=0.65）を示すライブラリーの遺伝子間領域挿入変異体に関連した幼虫と比較した。こうして、23の偽陽性を捨て、9の候補のみを残した。この候補は、関連づけの際、不均衡食での有意かつ強固な発育遅延をもたらした（図2C）。
図2 1つの補足
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L.plantarum（Lp）のリボソームおよび転移RNA（r/tRNA）をコードするオペロンは、Lpがアミノ酸（AA）不均衡による遅延をレスキューするのに必要である。
(A）遺伝子スクリーニングの図。(B）スクリーニングの結果：各Lp変異体（X軸）について、重度の不均衡食（FLY ... 詳しく見る
図2-ソースデータ1
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図2-図1
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L.plantarumのr/tRNAオペロン変異体は、r/tRNAの存在量の減少を示すが、増殖や宿主のコロニー形成には影響を及ぼさない。
(A,B）Lp:TncontrolおよびLp:Tnr/tRNAの16S（A）および23S（B）rRNAの発現。発現は2Cq(gyrB)-Cq(rRNA)の式を用いてgyrBの発現で正規化した。スチューデントの... もっと見る
図2-図1-ソースデータ1
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ショウジョウバエの幼虫と会合すると、Lpはハエの餌上で増殖し、幼虫の腸内を絶えず繰り返し通過する（Storelli et al.）餌に存在する生きた細菌の量は、Lpの成長促進能力に大きく影響する（Consuegraら、2020a; Keebaughら、2018）。その結果、餌マトリックス上での生育が悪いLp株は幼虫の成長をサポートしない。そのような候補を除外したかったので、幼虫の存在下で、不均衡なHD上での9つの候補の生育を試験した（図2D）。その結果、3つの候補（B08.06、F09.11、H04.06）はこの餌で成長不良を示したため、さらなる解析には残さなかった。一方、残りの6つの候補（B12.11、C08.20、C09.09、D12.09、D12.16、F07.08）には成長障害が見られなかった。さらに、幼虫の腸への定着にも障害は見られなかった（図2E）。さらに特徴を明らかにするために、変異の影響が中程度の不均衡な食餌（-60％Val）でも観察されるかどうかを試験した。このような食餌では、変異B12.11とC08.20は、幼虫の発育遅延を救うLpの能力に有意な影響を与えなかった。それどころか、変異体C09.09、D12.09、D12.16、F07.08に関連した幼虫は、WT様変異体Lp:Tncontrolに関連した幼虫と比較して、やはり遅れていた（図2F）が、その差は著しく不均衡な食餌（-80％Val、図2C）よりも重要ではなかった。
次に、トランスポゾンがどのゲノム領域に挿入されたかを調べるため、選んだ6つの候補のゲノムの塩基配列を決定した。興味深いことに、6つの候補のうち4つ（変異体C09.09、D12.09、D12.16、F07.08）は、tRNAおよび／またはrRNAをコードする遺伝子を含むオペロンに、独立したトランスポゾンの挿入を示した（図2G）。これら4つの変異体はまた、不均衡食で幼虫の発育に最も影響を与えると思われるものである（図2F）。Lpのゲノムにはr/tRNAをコードする5つのオペロンが存在する。C09.09とF07.08は同じオペロンに独立した挿入が見られるが、位置は異なる（C09.09は16S rRNAの上流、F07.08は23S rRNAの内側、図2G）。さらに、F07.08（以下、Lp:Tnr/tRNAと呼ぶ）の特徴を明らかにした。液体HD中で培養したLpから全RNAを抽出したところ、Lpのゲノムにはr/tRNAオペロンが冗長であるにもかかわらず、Lp:Tncontrolと比較して、Lp:Tnr/tRNAでは16S（図2-図1A）および23S（図2-図1B）rRNAが約3～4倍減少していた。
幼虫の成長を支えるr/tRNAオペロンの重要性を確認するため、挿入変異体C09.09とLp:Tnr/tRNAで同定されたオペロン全体の欠失変異体を、相同性に基づく組換えによって作製した（Matos et al.）欠失変異体（以下、LpΔopr/tRNAと呼ぶ）は、AA不均衡のレスキューの欠如という点で、挿入変異体と同じ表現型を示した（-60% Val、図2-図1C； -70％Leu、図2-図1D）、幼虫存在下での不均衡HD上での増殖（図2-図1E）、幼虫の腸内コロニー形成（図2-図1F）、16S（図2-図1G）および23S（図2-図1H）rRNAの発現低下（～3倍低下）の点で、挿入変異体と同じ表現型を示した。
大腸菌では、r/tRNAをコードするオペロンは、低分子RNA（sRNA）もコードすることができる（Stenum et al.）細菌のsRNAは、一般的なノンコーディングRNA（ncRNA）に属する制御RNAである。例えば、イカの共生生物Vibrio fischeriは、宿主からの免疫寛容を促進するsRNA SsrAを産生する（Moriano-Gutierrez et al.）そこで、LpWTとLpΔopr/tRNAが培養中に発現するncRNAを精製し、塩基配列を決定した。その結果、r/tRNA以外の13種類のncRNAが同定された（補足ファイル1）。そのうち10個はmRNAの5'-UTR内の先行配列にコードされており、翻訳制御因子としてアノテーションされている。残りの3つのncRNA（RNAseP、SRP4.5S、SsrAのホモログであるtmRNA）は正真正銘のsRNAであるが、r/tRNAオペロンにはコードされていない。さらに、sRNAseqデータセットを用いて、各tRNAの量を定量した。tRNA量のプロキシとして、我々はThr-tRNAに注目した。Lpのゲノムには、LpΔopr/tRNAで欠失したオペロンの内側にあるtRNA05（図2G）と、オペロンの外側にあるtRNA15、tRNA57、tRNA69の4つのThr-tRNAのコピーがある。これら4つのコピーの配列は非常によく似ているが、一塩基多型とフランキング領域を用いて、データセットから特定の一意にマップされたリードを各コピーに割り当てることができた。予想通り、LpΔopr/tRNAでは、Thr-tRNA5（オペロン内部）に特異的にマッピングされたリードの数が、Lpに比べて99%以上減少した。一方、欠失したオペロンの外側にある3つのThr-tRNAには発現の差は見られなかった（図2-図1I）。このことは、Thr-tRNAの1コピーの欠失は、他のコピーの代償的な増加を誘導しなかったことを示している。Lpの染色体には、rRNAをコードする5つのオペロンと、各tRNAの複数のコピーが存在するという事実は、1つのr/tRNAオペロンを欠失させても、細菌のフィットネスに大きな影響を与えない理由を説明するかもしれない（図2DとE；図2-図1EとF）。しかし、これらのオペロンからのr/tRNAの産生は、AAの不均衡時にショウジョウバエの成長を支えるための速度制限であるようだ。
Lpはr/tRNAを含む細胞外小胞を産生する
バクテリアによって産生されたRNAは、真核生物の宿主細胞によって感知され、宿主の免疫シグナルを調節することができる（Oldenburg et al.）我々は、r/tRNA遺伝子座の産物は、宿主細胞が感知する微生物の手がかりとなり、生理的適応を促進する可能性があるという仮説を立てた。Lpは腸管内栄養腔に存在し、腸細胞と直接接触していない（Storelli et al.）緑膿菌（Koeppen et al., 2016）とV. fischeri（Moriano-Gutierrez et al., 2020）のsRNAは、細胞外小胞内で見つかった。Lacticaseibacillus caseiは、r/tRNAを含む細胞外小胞を産生する（Domínguez Rubio et al., 2017）。さらに、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）由来の細胞外小胞は、マウスの腸の運動性に影響を与え（West et al.）そこで我々は、細胞外小胞は細菌から宿主細胞へのLpのr/tRNAの移行を可能にする「ビークル」として働くのではないかと考えた。Lpの上清から細胞外小胞を単離し、電子顕微鏡で観察したところ、70～200 nmの大きさの球状構造物が存在することが明らかになった（図3A）。これはLpの細胞外小胞の予想されるサイズに相当する（Li et al.）次に、小胞と細菌細胞からRNAを抽出し、RT-qPCRによってrRNAとtRNAの量を定量した。細胞内では、以前の研究（Giannoukos et al.）精製小胞では、Thr-tRNAの濃縮が観察された（図3C）。上清から潜在的な汚染物質を除去し、小胞内に存在するRNAのみを保持するため、RNAを抽出する前に精製小胞をRNAseで処理した。ほとんどのrRNAはRNAse処理によって枯渇し、上清からの混入物であることが示唆された。逆に、Thr-tRNAはRNAse処理後に濃縮された（図3C）。これらの結果から、Lpの細胞外小胞には主にtRNAが含まれており、これが宿主細胞への移行を可能にしている可能性が示唆された。
図3
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L.plantarum（Lp）はリボソームRNAと転移RNA（r/tRNA）を含む細胞外小胞を産生する。
(A）Lpの上清から精製した細胞外小胞の代表的な透過型電子顕微鏡像。赤字は直径（nm）。スケールバーは200 nmを示す。(B-D) ... もっと見る
図3-ソースデータ1
図3に表示されている生データ。
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Lpは前中腸でGCN2シグナルを活性化する
次に、Lpのr/tRNAが宿主細胞に感知されるかどうかを調べた。GCN2キナーゼは、負荷のかかっていないtRNA（Masson, 2019, p.2）やrRNA（Zhu and Wek, 1998）に結合し、活性化することができる。さらにGCN2経路は、真核細胞がAAの不均衡に適応するための主要な経路の一つである（Gallinetti et al.）最後に、GCN2はショウジョウバエの腸で活性を示し（Bonfini et al., 2021; Kim et al. そこで我々は、GCN2がLpからのr/tRNAと宿主のAA偏食に対する生理的適応との間のセンサーでありシグナル伝達の仲介役であるのではないかと考えた。
我々はまず、Lpの結合が幼虫の腸内でGCN2の活性化を制御しているかどうかを調べた。ショウジョウバエでは、転写因子ATF4がGCN2の下流で働き、遺伝子4E-BP（ショウジョウバエではThor）の第1イントロンにある認識部位に結合してその転写を活性化する（Kang et al.） Kangたちは以前、4E-BPの第1イントロンの転写制御下に蛍光色素を持つトランスジェニック系統（4E-BPintrondsRed）を作製した。このレポーターにより、GCN2活性化の下流におけるATF4の活性パターンを可視化することができる（Kang et al.） 4E-BPintrondsRedレポーターを分子的読み出しとして用いて、Lp会合に応答する幼生中腸のGCN2活性をプローブした。図4-図1Bは、アンバランス食（上のパネル）またはバランス食（下のパネル）を与えた幼虫の解剖した腸における4E-BPintrondsRedレポーターの発現パターンを示しており、GF（左のパネル）またはLp会合（右のパネル）のいずれかであった。以前に報告されたものと同様に（Kang et al., 2017）、胃カイコ、挑心嚢、および中腸の酸性帯として知られる領域で4E-BPintrondsRedレポーター発現が観察された（Overend et al.）このパターンはGF幼虫とLp関連幼虫の間で保存されていた。逆に、4E-BPintrondsRedレポーターは、Lp共生幼虫では前中腸に特異的に発現していたが、GF幼虫ではこのシグナルは見られなかった（図4-図1B、赤四角、および図4A）。我々はRT-qPCRによって、Lpと共生する前中腸で内因性GCN2依存性の4E-BP発現が誘導されることを確認した（図4-図1C）。興味深いことに、この領域における4E-BPintrondsRedレポーターの発現は、Lpとの会合に依存するが、不均衡食（図4A、上段）または均衡食（図4A、下段）のいずれかで飼育した幼虫で観察されたように、AAの不均衡には依存しない（シグナルの定量化は図4Bに示す）。このようにLpは、食餌のAA不均衡とは無関係に、前中腸で特異的に4E-BPintrondsRedレポーターを活性化することができる。
図4と1つの補足
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L.plantarum（Lp）との会合により、幼生前中腸のgeneral control nonderepressible 2（GCN2）が活性化される。
(A,C,E)4E-BPintrondsRed幼虫の前中腸の代表写真。シアン：DAPI。マゼンタ： 4E-BPintrondsRedレポーター。スケールバー：200μm。(B,D,F)シグナルの定量化：割合... もっと見る。
図4-ソースデータ1
図4の生データ。
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図4-図1
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L.plantarumは幼虫の前中腸でGCN2を活性化する。
(A）LpGFPに関連した幼虫の全腸の代表的な写真。シアン：DAPI。黄色： GFP。スケールバー： 500 µm。(B）無菌（GF）幼虫の腸全体の代表的な写真（左...続きを見る
図4-図1-ソースデータ1
図4-図1-ソースデータ1。
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ATF4はeIF2によって活性化され、eIF2はGCN2によってリン酸化されるが、PERKのような他のキナーゼによってもリン酸化される（Teske et al.） 4E-BPintrondsRedレポーターが本当にGCN2活性を反映しているかどうかを調べるため、GCN2ノックダウンバックグラウンドでの発現パターンを調べた。組織特異的in vivo RNAi（Dietzlら、2007）を用いてGCN2の発現を阻害すると、不均衡食（図4CとD）または均衡食（図4EとF）で飼育した幼虫の前部中腸で、Lpによる4E-BPintrondsRedレポーターの活性化が完全に消失した。したがって、この結果は、Lpが幼虫の前中腸において、AAの不均衡とは無関係にGCN2活性を促進することを立証した。
r/tRNAオペロンのLp変異体は前中腸でGCN2を活性化できない
次に、LpによるGCN2の活性化がr/tRNA遺伝子座に依存するかどうかを調べた。この目的のために、LpΔopr/tRNAと結合した幼虫とLp WTと結合した幼虫における4E-BPintrondsRedレポーターの誘導を比較した。アンバランス食では、LpΔopr/tRNAに関連した幼虫はWTに関連した幼虫に比べてGCN2の活性化が減少したが、この減少は統計学的有意差には達しなかった（図5AおよびB）。バランス食では、LpΔopr/tRNA会合幼虫のGCN2活性化はGF幼虫のGCN2活性化と同程度であり、Lp WT会合幼虫のGCN2活性化と比べて有意に減少した（図5CおよびD）。同様に、Lp:Tnr/tRNAとの会合により、LpΔopr/tRNAで観察されたものに匹敵するGCN2活性化の減少が観察された（不均衡食にて）：図5-図1AおよびB；バランス食：図5-図1CおよびD）。Lp:Tncontrolと結合した幼虫とLp:Tnr/tRNAと結合した幼虫の間で、不均衡食で観察された差が少ないのは、幼虫がLp:Tnr/tRNAとより長く結合しているためかもしれない。実際、幼虫のサイズを一致させるため、最初の蛹が出現する24時間前に採集した。2つの変異体との会合時間を同等にするため、GF幼虫をLp:TncontrolまたはLp:Tnr/tRNAと短期間会合させた。幼虫はGFで飼育し、D8 AELでLp:TncontrolまたはLp:Tnr/tRNAと会合させ、D10 AELで解剖のために回収した。アンバランス食で短期間飼育した場合、GCN2の活性化はLp:Tnr/tRNAに関連している幼虫ではLp:Tncontrolに関連している幼虫に比べて有意に減少した（図5の図1EとF）。
図5と1つの補足
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L.plantarum（Lp）のリボソームおよびトランスファーRNA（r/tRNA）オペロン変異体は、前中腸でgeneral control nonderepressible 2（GCN2）を活性化できない。
(A,C)4E-BPintrondsRed幼虫の無菌状態（左パネル）、LpΔopr/tRNAとの関連（中パネル）、またはLp ... 続きを見る
図5-ソースデータ1
図5に表示されている生データ。
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図5-図1
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遺伝子スクリーニングで同定されたL. plantarum（Lp）のリボソームおよび転移RNA（r/tRNA）オペロン挿入変異体は、前中腸で一般制御非抑制性2（GCN2）を活性化できない。
(A,C,E)無菌状態（左パネル）、Lp:Tnr/tRNAとの結合状態（中パネル）、または...との結合状態における4E-BPintrondsRed幼虫の前中腸の代表的な写真。
図5-図1-ソースデータ1
図5-図1-ソースデータ1。
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真核細胞由来の非荷電tRNAおよびrRNAは、GCN2キナーゼの正統的活性化因子である（Masson, 2019, p. 2; Zhu and Wek, 1998）。細菌のr/tRNAも同様にGCN2を活性化できるかどうかは今のところ不明である。そこで、4E-BPintrondsRedレポーターを持つGF幼虫に精製バクテリアtRNAを与えて、この仮説を検証した。試験した最高用量（625μg）では、バクテリアtRNAは前中腸におけるレポーターの発現を有意に増加させた（図5EおよびF）。この増加は、わずかに劣るものの、真核生物の tRNA をこれらの幼虫に与えた場合の効果に匹敵した。しかし、この効果は幼虫とLpの会合に比べるとわずかであった（図5-図1G）。注目すべきは、LpはHD中で最大～2.5×109 CFU-mL-1に達することである（図2D）。他の細菌での観察に基づくと、これは10 mLバイアル瓶中に約225 µgのtRNAを産生する可能性がある(Battley, 1988)。tRNAはLpの定常期に蓄積される可能性があるため、この値はおそらく過小評価であろう。したがって、625μgという値は幼虫が暴露される生理的範囲内にあると思われる。したがってこれらの結果は、LpのtRNAが腸細胞においてGCN2を直接活性化する可能性を示唆している。しかしながら、Lp's rRNAあるいは機能的なLp r/tRNAオペロンに依存する間接的なメカニズムが作用している可能性も否定できない。
LpによるAA不均衡の救済には、幼生中腸におけるGCN2が必要である。
我々は、Lpとの会合が幼虫の前部中腸においてr/tRNA遺伝子座依存的にGCN2を活性化することを示した。そこで我々は、腸細胞におけるGCN2の活性化が、LpによるAA不均衡による発育遅延の救済に必要であるかどうかを検証しようとした。この目的のため、腸管細胞でGCN2を特異的にノックダウンし、AA不均衡条件下でGFまたはLpに関連した幼虫の発育時期を追跡した。アンバランス食（-60％Val）において、腸管細胞のGCN2ノックダウンは、コントロール幼虫と比較してLp関連幼虫に有意な発育遅延を引き起こした（図6A）。この表現型は、他の2つのGCN2 RNAi株を用い（図6-図1AおよびB）、中腸におけるGCN2発現に対するRNA干渉の有効性を測定することによって確認した（図6-図1C、D）。注目すべきは、腸管細胞におけるGCN2のノックダウンは、Lpによる腸のコロニー形成を変化させないことである（図6-図1E）。腸内のGCN2をノックダウンしても、AAバランス食で発育する幼生には影響がなかった（図6B）。以上の結果から、GCN2はLpがVal制限による発育遅延を救うのに必要であることが示された。我々は、GCN2が他のAAの制限によるAAの不均衡をレスキューするのに必要であるかどうかを考えた。図1でGF幼生にとって最も重要であると同定された各EAA（Ile、Lys、Thr、Trp）の量を60％減少させ、GCN2をノックダウンした幼生の成長を測定した。その結果、GCN2はLpがIleやThrの欠乏時に発育をレスキューするのに必要であるが、TrpやLysでは必要ないことがわかった（図6C-F）。LpはLysとTrpを合成できるが、Ileは合成できない（Consuegra et al. LpはThrを産生できるが、その量は限られている（Consuegra et al.
図6と2つの補足
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L.plantarum（Lp）がアミノ酸（AA）不均衡による遅延をレスキューするためには、腸内でのgeneral control nonderepressible 2（GCN2）の発現が必要である。
(A-I）発生タイミング実験。グラフは1条件につき5反復を示す（平均値と標準偏差）。各レプリケートは40頭の幼虫を含む1本のチューブで構成されている。(A-G) 発生... 詳細
図6-ソースデータ1
図6に表示した生データ。
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図6-図2
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L. plantarumとは異なり、共生細菌Acetobacter pomorumは宿主の腸細胞においてGCN2を活性化しない。
(A）無菌（GF）条件下（灰色の円）、Acetobacter pomorum（Ap）共生条件下（紫色の円）、またはL. plantarum（Lp）共生条件下で飼育した幼虫の発育時期。
図6-図2-ソースデータ1
図6-図2中の生データ。
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図6-補足1
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L.plantarumがAA不均衡食で成長を促進するためには、腸でのGCN2の発現が必要であるが、脂肪体での発現やTORの発現は必要ではない。
(A-B）コントロールバックグラウンド（Mex>mCherryRNAi、塗りつぶした円）またはGCN2ノックダウン幼虫（Mex>GC...さらに詳しく見る）の無菌（GF）幼虫（灰色）またはL. plantarum（Lp）関連幼虫（緑色）の発生時期。
図6-図1-ソースデータ1
図6-図1-ソースデータ1。
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実験室で飼育されたショウジョウバエは、そのほとんどがラクトバチルス科とアセトバクター科に属する細菌と関連している（Staubach et al.）我々は、乏栄養食（Shin et al., 2011）および完全HD（Consuegra et al., 2020a）上で幼虫の成長を促進する代表的な酢酸菌A. pomorumWJL（Ap）株が、AA不均衡HD上でLpと同じ性質を示すかどうかを検証した。ApはLpと同程度に、AA不均衡による発育遅延を救った（図6-図2A）。しかしLpとは逆に、ApによるVal制限時の幼生発生への支援は、腸内のGCN2発現とは無関係であった（図6-図2B）。これは、ApがValを産生し、宿主のValに対する補助栄養をレスキューする能力によって説明されると思われる（Consuegra et al.）興味深いことに、Apは不均衡食（図6-図2CおよびD）または均衡食（図6-図2EおよびF）の幼虫の前中腸でGCN2を活性化しなかった。したがって、前中腸でGCN2を活性化する能力は、すべての共生細菌に共通するものではなく、Lpを介した利益に特有の属性である。
ショウジョウバエでは、AAの欠乏が中腸の腸細胞でGCN2経路に関与すること（Bonfiniら、2021；Kimら、2021）だけでなく、脂肪体細胞でも関与することが以前に報告された（Armstrongら、2014）。我々はC564-Gal4ドライバーを用いて、脂肪体だけでなく、唾液腺や血球などの他の組織でもGCN2発現をノックダウンした（Takehana et al.）このことは、我々が観察した表現型が、他の組織ではなく腸管細胞でGCN2に関与していることを示唆している。注目すべきことに、TOR経路は脂肪体（Colombani et al., 2003）および腸細胞（Redhai et al., 2020）において全身の宿主増殖を支えるもう一つの主要因子であるが、LpがAA不均衡を救うためには、脂肪体（図6-図1G）でも腸細胞（図6-図1H）でも必要ではなかった。しかし、GF動物の成長を支えるためには重要であった（図6-図1GおよびH）。
活性化すると、GCN2は真核細胞の翻訳開始因子の主要サブユニットであるeIF2をリン酸化する（Donnelly et al.） eIF2のリン酸化は、翻訳が増加する転写因子ATF4を含むmRNAのサブセットを除き、翻訳を阻害する（B'chir et al.） ATF4はその後、ストレス応答に関与する遺伝子の転写を活性化する。ショウジョウバエでは、これらの遺伝子の一つがeIF4E結合タンパク質4E-BPである（Kang et al.） 4E-BPの活性化は、キャップ非依存性翻訳を促進し、脂肪体における抗微生物ペプチド（AMP）産生を後押しし（Vasudevan et al., 2017, p. 2039-2047）、微生物叢の組成を変化させることができる（Vandehoef et al.）そこで、GCN2の下流で働くATF4と4E-BPが、食餌性AA不均衡時にLpが幼生発生をサポートするために必要であるかどうかを検証した。その結果、腸管細胞内のATF4または4E-BPをノックダウンすると、不均衡食を与えたGF幼虫の発育が遅延することが観察された。しかし、このようなノックダウンは、GCN2ノックダウンのようなLp関連幼虫の発育には影響しなかった。したがって、ATF4と4E-BPは、Lpが食餌AAの不均衡下で幼虫の発育をサポートするのに必要ではない（図6G）。同様に、4E-BPを欠損させた幼虫はLpの存在下でも遅延しなかった。それどころか、Lpを持つyw幼虫よりもわずかに早く成長した（図6-図1I）。
以上の結果から、腸管細胞におけるGCN2経路は、TORやATF4とは独立して、食餌性AAの不均衡にもかかわらず、Lpによる幼虫の発育支援を媒介する特異的な役割を果たすことが明らかになった。
次に、GCN2ノックダウンとLp r/tRNA遺伝子挿入変異体との相互作用を調べた。予想されたように、Lp:Tnr/tRNAに関連して不均衡な食餌で飼育された対照幼虫は、Lp:Tncontrolに関連して飼育された幼虫に比べて発育遅延を示した（図6H）。一方、腸管細胞内のGCN2をノックダウンした幼虫は、Lp:Tnr/tRNAとの会合とLp:Tncontrolとの会合との間に差を示さなかった（図6I）。言い換えれば、r/tRNAオペロン変異の影響は、GCN2が完全に発現している場合にのみ観察された。このことは、幼虫の腸内でLpのr/tRNAとGCN2が機能的に相互作用していることを示唆しており、LpがAAの不均衡に対する宿主の適応に及ぼす影響は、共生生物のr/tRNAと宿主のGCN2キナーゼが関与する分子対話に依存しているという考えを支持している。
Lp共生幼虫の前部中腸は、GCN2依存的、ATF4非依存的、r/tRNA依存的に、上皮成熟の亢進と代謝活性の変化を示すトランスクリプトームシグネチャーを示す。
次に我々は、Lpのr/tRNAオペロンの産物によるGCN2の活性化が、AAバランスの悪い食餌での幼虫の成長をどのようにサポートするのかを考えた。この現象の分子的な根源を知るために、不均衡食で育った3齢幼虫の前中腸のトランスクリプトームを調べた。この表現型の特異性を利用して、分析対象を絞り込んだ。実際、Lpはコントロール背景（図1）ではAAの不均衡を救うが、腸細胞特異的GCN2ノックダウン背景（図6）では救わない。さらに、ATF4はGCN2の下流標的の一つであるが、腸管細胞におけるATF4ノックダウンは、AA不均衡のレスキューを妨げなかった（図6G）。最後に、AA不均衡のレスキューは、Lpにおけるr/tRNAオペロンの存在に依存する（図2および図6H、I）。そこで、主要なメディエーターに関する情報を提供するこの一連の表現型結果を利用して、6つの異なる生物学的背景を比較した： (1）GFまたは（2）Lpに関連した対照幼虫、（3）Lpに関連したMex>GCN2RNAi幼虫、（4）Lpに関連したMex>ATF4RNAi幼虫、および（5）Lp:Tnr/tRNAまたは（6）Lp:Tncontrolに関連した対照幼虫である。次に、以下の条件を満たすトランスクリプトームシグネチャー（すなわち、差次的に発現する遺伝子[DE]）を検索した： (1)Lp関連コントロール幼虫とGFコントロール幼虫の間のDE、(2)Lp関連コントロール幼虫とLp関連GCN2ノックダウン幼虫の間のDE（1と同じ方向）、(3)Lp関連コントロール幼虫とLp関連ATF4ノックダウン幼虫の間のNOT DEまたは1と逆の発現方向、(4)Lp： Tncontrol関連幼虫とLp:Tnr/tRNA関連幼虫の間のDE（1と同じ方向）（図7A）。
図7 1の補足
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L.plantarum（Lp）関連幼虫の前部中腸は、リモデリングと代謝スイッチのトランスクリプトームシグネチャーを示す。
(A）RNAseq戦略の実験デザイン。我々は、Lp-plantarum（Lp-plantarum）関連幼虫の間で差次的に発現している遺伝子（DE、赤、オレンジ、黄色の線）、または差次的に発現していない遺伝子（DEでない、灰色の線）を探索した。
図7-ソースデータ1
主成分分析により、細菌との会合およびGCN2/ATF4サイレンシングが腸内トランスクリプトームに重要な影響を及ぼすことが示された。
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図7-図1
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DESeq2からの正規化カウントを分散安定化変換して計算した最初の3成分を示す3次元主成分分析（PCA）プロット。
(A) 条件のMex>対照RNAi無菌（GF）（灰色の円）およびL. plantarum（Lp）（緑色の塗りつぶしの円）、Mex>GCN2RNAi Lp（空の緑色の円）およびMex>ATF4RNAi Lp（緑色の四角）のPCA。(B) ... もっと見る
主成分分析により、遺伝子型にかかわらず、Lp関連サンプルはGFサンプルのより遠いことが示された（図7-図1A）。このように微生物の状態は、トランスクリプトームの変異を説明する主要な因子である。さらに、Lp関連幼虫のうち、コントロール幼虫はATF4ノックダウン幼虫やGCN2ノックダウン幼虫より遠い。ATF4はGCN2の下流にあり、ATF4によって制御される遺伝子はGCN2によっても制御されるはずなので、このパターンは予想された。しかし、ATF4ノックダウンサンプルとGCN2ノックダウンサンプルは明確に分離しており、このことは、我々のデータセットがGCN2依存的なATF4非依存的遺伝子制御のシグネチャーを同定できる可能性を示している（図7-図1A）。Lp:TncontrolとLp:Tnr/tRNAに関連する対照幼虫はより近かったにもかかわらず、ほとんどのサンプルはPC2によって互いに分離された（図7-図1B）。前述の4つの選択フィルター（図7A）をデータセットに適用したところ、GCN2依存的、ATF4非依存的、r/tRNAオペロン依存的に、Lpによって一貫してDEされる104個の遺伝子（25個が発現上昇、79個が発現低下）が見つかった（図7BおよびC）。これらの遺伝子を補足ファイル2に示す。
次に我々は、GCN2依存的、ATF4非依存的、およびr/tRNAオペロン依存的にLpとの結合によって抑制される生物学的機能を検索するために、ジーンオントロジー（GO）濃縮解析を行い、ダウンレギュレートされた79遺伝子内に濃縮された生物学的機能を検索した。その結果、ミトコンドリア呼吸、酸化ストレスに対する抵抗性、細胞増殖の負の制御に関連するGO用語に有意な濃縮が見られた（図7D）。がん細胞、増殖酵母、胚細胞などの増殖細胞は、ミトコンドリア呼吸よりも酸化的解糖や発酵を好む傾向がある（がん細胞では、この現象はワールブルグ効果として知られている；ワールブルグ、1956）。実際、ミトコンドリア呼吸の方がATP産生には効果的であるが、発酵によって、同化作用や細胞増殖に必要なNADPHやリボース-5-リン酸などの中間体の合成が可能になる。さらに、発酵はより速い速度でATPを生産することができる（Lunt and Vander Heiden, 2011）。したがって、Lpに関連した幼虫の前部中腸で観察されたミトコンドリア呼吸を担う遺伝子の減少は、この器官がリモデリングと増殖を続けていることを示唆している。次に同じ方法で、Lp関連幼虫でアップレギュレートされた25遺伝子を調べた。その結果、器官の形態形成、細胞分化（異なる細胞タイプ：神経細胞または上皮細胞）、および細胞増殖（特に上皮成長因子受容体［EGFR］経路のメンバー）に関連するGO用語の有意な濃縮が検出された（図7E）。これらのシグネチャーから、LpはGCN2依存的、ATF4非依存的、r/tRNAオペロン依存的に、前中腸の成長と成熟を促進することが示唆される。以上のことから、アンバランス食で成長した幼虫の前部中腸のトランスクリプトーム解析から、GCN2依存性、ATF4非依存性、Lp r/tRNAオペロン依存性のシグネチャーを同定することができた。我々は、この現象が動物の全身的な成長もサポートするだろうと推測している。
LpはGCN2依存的に全身の成長抑制因子fezzikの発現を阻害する。
fezzik（fiz）が、GCN2依存的、ATF4非依存的、r/tRNAオペロン依存的にLpによって発現が抑制される遺伝子の上位にあることに注目した（図7Fおよび図8A）。fezzikは酸化還元酵素であると予測され（Iidaら、2007）、おそらくエクダイソン代謝に関与している（McQuiltonら、2012）。重要なことに、fezzikのhypomorphic alleleを持つ幼虫やfezzikをユビキタスにノックダウンした幼虫は発生が促進されることから（Glaser-Schmitt and Parsch, 2018）、fezzikが全身的な成長抑制因子であることが示唆された。腸細胞で特異的にfezzikをノックダウンし（図8-図1）、不均衡食を与えた幼虫の発育をモニターしたところ、腸細胞でfezzikをノックダウンすると、GF幼虫、Lp関連幼虫、LpΔopr/tRNA関連幼虫の発育が促進された（図8B）。これらの結果は、GCN2の活性化とr/tRNAを介したfezzik阻害が、不均衡食によるLpの発育遅延のレスキューに寄与していることを示唆している。
図8と1つの補足
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L.plantarum（Lp）はgeneral control nonderepressible 2（GCN2）依存的に成長抑制因子fezzikの発現を抑制する。
(A）無菌（GF）幼虫（灰色）、またはLp WT（濃緑色）、Lp:Tnr/tRNA（黒色）、Lp:Tncontrol（淡緑色）と関連した幼虫におけるfezzikの発現。
図8-ソースデータ1
L. plantarumとは異なり、共生細菌Acetobacter pomorumは腸細胞においてGCN2を活性化しない。
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図8-ソースデータ2
RNAiによるfizzサイレンシングの効果を示すRT-qPCR。
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図8-図1
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fezzik RNAiは腸細胞におけるfezzikの発現を効率的に抑制する。
アンバランス食（FLY AA -60% Val）を与えた無菌（GF）幼虫の前部中腸におけるfezzikの発現を、コントロールバックグラウンド（Mex>mCherryRNAi、塗りつぶした丸印）またはfezzikノックダウン... 詳細表示
ディスカッション
共生微生物は、宿主のシグナル伝達経路と機能的に相互作用し、宿主の生理学の様々な側面に影響を与える共生生物によって産生される分子（共生キュー）を通して、宿主と相互作用することができる。ここでは、ショウジョウバエとその細菌パートナーであるLpとの共生を支える新たなメカニズムを明らかにする。Lpは、制限的なAAを供給することなく、AA不均衡による宿主の発育遅延を救うことができる。Lpがどのようにして宿主のこのような食餌条件への適応を促進するのかを理解するために、偏りのない遺伝子スクリーニングを行い、r/tRNAをコードするLpオペロンが宿主の成長をサポートするのに必要であることを示した。さらに我々は、Lpが前中腸の腸細胞においてGCN2シグナル伝達経路を活性化することを示した。GCN2の活性化は、Lp中にr/tRNAをコードするオペロンが無傷で存在することに依存し、組織の成長と成熟を示唆する腸管トランスクリプトームのリモデリングをもたらす。中腸におけるGCN2の活性化は、アンバランスな食餌での成長を支えるために必要であるが、バランスのとれた食餌や共生細菌が制限的なAAを合成できる場合には必要ない（例えば、リジンが不足した場合のLpや、バリンが不足した場合のAp）。したがって、これらの結果は、共生細菌が腸細胞において宿主キナーゼGCN2に関与することによって、最適でない栄養環境に対する宿主の生理的適応をサポートするメカニズムを明らかにするものである。
LpによるGCN2シグナル伝達はどのように行われるのか？
我々は、LpによるGCN2の活性化は、r/tRNAオペロンの存在に依存することを示した。GCN2は、二次および三次構造を形成するいくつかのタイプのRNAによって活性化されることが知られている：いくつかのAAに認識される真核生物tRNA（Dongら、2000）、遊離リボソーム真核生物RNA（ZhuとWek、1998）、およびウイルスRNA（Berlangaら、2006）。今回の結果は、精製されたバクテリアtRNAがGCN2を活性化することを示しており、LpのtRNAが興味深い候補であることを示している。注目すべきは、変異体の1つ（D12.16）が、rRNAのみをコードするオペロンの破壊を示していることである。しかし、tRNAの合成はリボソームの活性によって制御されている可能性がある（Gourse et al. 我々が同定した変異がr/tRNAの各ファミリーの合成にどのような影響を与えるかを評価し、r/tRNAオペロン依存的なLpによるGCN2の活性化の原因がr/tRNAオペロン、tRNA、またはr/tRNAオペロンの間接的な影響（例えば、r/tRNA変異によって影響を受ける可能性のあるLpの翻訳速度を介して）のどれにあるのかを決定するためには、さらなる研究が必要である。注目すべきは、遺伝子スクリーニングで同定した他の2つの候補も、r/tRNA産生に関連している可能性があることである： C08.20には、ペントースリン酸経路（PPP）のホスホグルコネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gnd2がトランスポゾンで挿入されている。PPPの産物の一つは5-ホスホリボシル-α-1-ピロリン酸であり、これはヌクレオチドの生合成の前駆体である（Kilstrup et al.）したがって、C08.20におけるgnd2の破壊が、細胞によるr/tRNAの産生を変化させる可能性がある。B12.11では、rsmC、lp_0696、lp_sRNA01をコードするオペロンの末端に挿入が見られる。lp_0696はシチジン／デオキシシチジル酸デアミナーゼをコードし、シチジンのウリジンへの変換を触媒する。lp_sRBA01はシグナル認識粒子（SRP）をコードし、小さなncRNAで、膜タンパク質が翻訳される際に膜に結合する（Kuhn et al. したがって、このオペロンの破壊は、RNA産生および／またはリボソーム機能を直接変化させ、r/tRNA合成を負に制御する可能性がある（Gourseら、1985）。細菌由来のsRNAは、宿主細胞が感知する手がかりとして機能することがいくつかの研究で示されている。細菌由来のtRNA遺伝子座由来のsRNAは、植物の共生根粒において宿主遺伝子の発現を制御することができる（Ren et al.） sRNA SsrAは共生生物V. fischeriから分泌され、宿主であるイカEuprymna scolopesの免疫寛容を促進する（Moriano-Gutierrez et al.）緑膿菌は、培養ヒト細胞やマウス肺において免疫反応を阻害するtRNA由来のsRNAを分泌する（Koeppen et al.）ここで我々は、Lpが主にtRNAを含む細胞外小胞を産生することを示す。細胞外小胞は細菌分子を輸送することにより、宿主と微生物のコミュニケーションを仲介することができる（Ñahui Palomino et al.）そこで我々は、Lpが細胞外小胞を介してショウジョウバエの腸細胞にr/tRNAを送達するというモデルを提案する。このモデルであれば、精製tRNAを幼虫に直接投与してもGCN2活性化に対するLpの効果が完全には再現されない理由を説明できるだろう。Lpによるr/tRNA産生が、未同定の間接的なメカニズムによってGCN2を活性化する可能性はある。LpのsRNAの塩基配列を決定したところ、Lpのr/tRNAオペロンには追加のsRNAはコードされていなかった。特にLpΔopr/tRNAでは、遺伝子スクリーニングで同定したSRP（上記参照）と、LpのSsrAのホモログであるtmRNAの発現低下が見られた（Moriano-Gutierrez et al.）これらのncRNAがショウジョウバエとLpの共生関係に関与しているかどうか、さらなる研究が期待される。
我々は、Lpが前中腸の腸細胞においてGCN2シグナルを活性化することを示した。中腸のこの領域は、通過時にLp細胞の大部分を死滅させる酸性領域の前方に位置するため、特に興味深い。したがって、腸細胞が生きたLp細胞と相互作用できる主な領域である（Storelli et al.） 4E-BPintrondsRedレポーターの発現パターンは、Kangら（2017年）が観察したパターンとは若干異なっている：AA欠乏時に、彼らは私たちが行ったように、胃のカイカ、酸性領域、および胸腺でレポーターの活性化を観察したが、前中腸では観察しなかった。これらの実験は、動物の微生物状態が報告されていない従来飼育の幼虫で行われた。われわれは、前中腸でのGCN2活性化が共生細菌依存的であることを示した。したがって、われわれの知見とのこの違いは、Kangらの実験の幼虫が、Apのような前中腸でのGCN2活性化を促進しない細菌と共生していたことを示唆している。別の説明としては、頻繁に裏返される従来のハエ株や交配種が、非常に低い微生物力価を持ち、そのためGF様の表現型を示す可能性がある。注目すべきことに、GCN2をノックダウンしても、4E-BPintrondsRedレポーターの発現を胃の噴門、酸性領域、および胸腺で観察することができた（一方、GCN2をノックダウンすると、前中腸での4E-BPintrondsRed発現は完全に消失する、図4C-F）。このことは、PERKのような他のATF4活性化因子が、胃の噴門部、酸性領域および腸管で活性化していることを示唆している。重要なことは、LpによるGCN2の活性化が、不均衡食と均衡食の両方の状況で観察されたことである（図4AおよびB）。こうして我々は、AA非依存的だが細菌依存的なGCN2シグナル活性化メカニズムを同定した。これは、AA不足時に真核生物の負荷されていないtRNAを感知することに依存する、正規のGCN2活性化とは異なる。これまでの研究では、ショウジョウバエ幼虫の腸内で飢餓時（Kang et al., 2017）、成虫のEAA欠乏時（Kim et al., 2021）、成虫の高糖・低タンパク食曝露時（Bonfini et al.）これらの観察はハエの微生物叢を制御せずに行われたため、これらの状況で細菌が関与しているかどうかを結論づけるのは難しい（特に微生物の組成は食餌組成に大きく依存するため；Lesperance and Broderick, 2020）。研究により、病原微生物によるGCN2の活性化が報告されている：感染により腸内のGCN2が刺激され、翻訳ブロックが引き起こされ（Chakrabartiら、2012）、ATF4-4E-BP軸を介して免疫応答が促進される（Vasudevanら、2017）。感染によるGCN2の活性化のメカニズムは、これらの研究では明らかにされていない。注目すべきは、赤痢菌の感染がHeLa細胞でGCN2の活性化を引き起こし、細胞内感染によるAAの枯渇によってGCN2が活性化されると提唱されたことである（Tattoli et al.）しかし、Lpは細胞内には存在せず、またLpとの会合が実際にAA欠乏の生理的救済を促進することから、このメカニズムは我々の状況では考えにくいと思われる。今回の結果を踏まえると、GCN2は病原性細菌が感染時に産生するr/tRNAによっても活性化される可能性が示唆される。これらの研究とわれわれの研究は、病原性細菌あるいは共生細菌の感知におけるGCN2の役割を強調するものであり（Donnelly et al.
栄養バランスが崩れているにもかかわらず、腸内でGCN2が活性化されると、どのようにして全身の成長が改善されるのだろうか？
我々の研究から、腸管細胞におけるGCN2の発現が、AAバランスの悪い食餌で幼生を成長させるLpのサポートに必要であることが示された。しかし、ドーパミン作動性ニューロンにおけるGCN2の構成的活性型の過剰発現は、食物摂取を阻害することにより、AAバランスの悪い食餌での成長を抑制する（Bjordal et al.）これらの一見矛盾する結果は、GCN2の作用が器官特異的であることを示唆している。ドーパミン作動性ニューロンでは、GCN2は幼虫によりよい餌を見つけるように促すことで、不均衡な食餌への適応を促進するのかもしれない。一方、中腸では、GCN2は腸細胞の生理的変化を通して不均衡な食餌への適応を可能にするのかもしれない。
酵母やショウジョウバエのGCN2経路の研究では、GCN2によるeIF2のリン酸化によって翻訳が増加するエフェクターATF4に焦点が当てられてきた。特にVasudevanたちは、GCN2-ATF4-4E-BPカスケードが、ショウジョウバエが感染と闘うのを助けるAMPの産生をもたらすことを示した（Vasudevan et al.）ここで、Lpとの会合に伴うATF4（図4）と4E-BP（図4-図1C）の活性化を間接的に観察したが、この活性化はLpがAA不均衡の影響を救済するためには必要ではなかった（図6G）。AA不均衡への適応は、eIF2とは無関係に、GCN2の他の基質を通して起こる可能性がある。eIF2は今のところGCN2の唯一の基質として知られているが、Dang Doたちは、マウスの肝臓において、GCN2はもう一つのeIF2キナーゼであるPERKと同じ遺伝子群を制御しないことを示した。このことは、GCN2とPERKは、共通の基質であるeIF2に加えて、異なる基質を持っていることを示唆している（Dang Do et al. あるいは、LpによるAAの不均衡にもかかわらず成長を支えるのは、ATF4以外のeIF2標的に依存しているのかもしれない。eIF2による遺伝子発現のATF4非依存的制御は、ショウジョウバエ（Malzerら、2018）、マウス（GuoとCavener、2007）、培養哺乳類細胞（Hardingら、2003；WekとCavener、2007）で報告されている。興味深いことに、マウスのロイシン欠乏食への適応には、ATF4ではなくGCN2が必要である（Zhangら、2002）。我々は、報告された表現型の特異性を利用し、LpがGCN2依存的、ATF4非依存的、r/tRNA依存的に前中腸の生理機能にどのような影響を与えるかを調べた。われわれのトランスクリプトミクスのデータから、Lpに関連した幼虫の前部中腸は、組織の成長と成熟が亢進し、ミトコンドリア呼吸が減少していることが示唆された。細胞分化、細胞増殖（EGFRシグナルなど）、形態形成に関連するGO用語は、Lpに関連した状態で濃縮されている。これは、EGFRシグナル伝達と細胞増殖が腸内細菌叢によって刺激されることを示した、成虫ハエの中腸における以前のトランスクリプトーム解析と一致している（Broderick et al.）さらに、成長阻害因子fezzikの発現は、Lpに関連した状態では抑制されている。我々は、中腸に特異的にfezzikを阻害することが、幼虫の成長を促進するのに十分であることを示した。最後に、ミトコンドリア呼吸に関連する遺伝子は、Lp関連幼虫と比較して、GF条件下でより多く発現している。このことは、LpによるGCN2活性化によって、呼吸から発酵へと代謝が切り替わり、宿主の同化が促進されて、細胞構成要素（AA、脂質、ヌクレオチドなど）の宿主組織への取り込みが増加する可能性を示唆している（Lunt and Vander Heiden, 2011）。注目すべきは、GCN2の活性化は、哺乳類において呼吸から発酵への代謝スイッチの引き金となることである（Longchamp et al.）重要なことは、LpによるGCN2活性化に伴うトランスクリプトームのリモデリングは、Lp中のr/tRNAの存在に依存し、腸細胞におけるATF4の発現には依存しないようである。これらの特徴は、LpによるAA不均衡のレスキューという表現型の説明に役立つかもしれない。成体では、生殖中の中腸のリモデリングが栄養吸収を促進し、最適な繁殖力を可能にする（Ahmedら、2020；Reiffら、2015）。我々は、Lpとの会合下にある幼虫においても、r/tRNAオペロンに依存するGCN2の活性化を通じて、同様のメカニズムが生じることを提案する。同化と成熟を介した中腸のリモデリングにより、バリンを含む栄養吸収が改善され、食餌性バリン不足が是正され、全身の成長が促進されるであろう。野生のD. melanogasterの幼虫は、乳酸菌などの微生物によって処理された腐敗果実のみで成長する（Flatt, 2020）。したがって、ショウジョウバエは細菌の存在に栄養を適応させ、共生微生物によって生産される必須栄養素から利益を得る能力を最適化したと推測される。GCN2は共生の合図を感知するセンサーとして進化し、幼虫の成長と環境に存在する微生物の豊富さを連動させることができるようになったのかもしれない。微生物が豊富な場合、共生の合図によって腸内のGCN2が活性化され、腸の成長、最適な栄養吸収、生物の急速な成長が引き起こされるのかもしれない。
結論として、我々は、共生細菌Lpが、おそらく共生の合図であるr/tRNAを直接感知することを通して、腸細胞においてGCN2を活性化できることを示した。腸細胞におけるGCN2の活性化は、成長抑制因子fezzikの転写を減少させ、AA吸収を改善し、幼生成長に対するAA不均衡の影響を救済する可能性のある代謝スイッチを誘発する。GCN2は真核生物全体で高度に保存されており（Donnelly et al., 2013）、AA不均衡食へのマウスの適応に重要である（Anthony et al., 2004; Guo and Cavener, 2007; Laeger et al.）したがって、本研究は、ここで述べた共生細菌とGCN2の分子対話が昆虫以外の動物界でも保存されているかどうかを検証する道を開くものである。
材料と方法
ショウジョウバエ系統と育種
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ショウジョウバエ株は、50g-L-1の不活性化酵母、80g-L-1のコーンミール、4mL-L-1のプロピオン酸、5.2g-L-1のニパジン、7.14g-L-1の寒天からなる酵母／コーンミール培地上で、12：12時間の明暗サイクルで25℃に維持した。実験はすべて、GFストックから得たgnotobioticハエで行った。GF株は前述のように樹立し（Erkosar et al., 2014）、抗生物質（カナマイシン50 µg-mL-1、アンピシリン50 µg-mL-1、テトラサイクリン10 µg-mL-1、エリスロマイシン5 µg-mL-1）を添加した酵母／コーンミール培地で維持した。Precellys 24 tissue homogeniser（Bertin Technologies、Montigny-le-Bretonneux、フランス）を用いてGFハエを粉砕し、その溶解液をMan-Rogosa-Sharp（MRS）寒天培地（Carl Roth、Karlsruhe、ドイツ）およびLB寒天培地（Carl Roth、Karlsruhe、ドイツ）にプレーティングして軸性を確認した。参照株としてywハエ（BDSC #1495 ）を用いた。以下の系統を用いた： UAS-mCherryRNAi（BDSC＃35785）、UAS-TORRNAi（BDSC＃33951）、UAS-GCN2RNAi-1（P. Leopoldの研究室から入手したVRDC＃103976）。Leopoldの研究室から入手；この株は特に指定がない限り、すべてのGCN2ノックダウンに使用された）、UAS-GCN2RNAi-2（BDSC #35355 ）、UAS-GCN2RNAi-3（BDSC 67215）、UAS-ATF4RNAi（VDRC #109014 ）、 UAS-4E-BPRNAi (VDRC #36667 )、4E-BPdel-1 (BDSC #9558 )、4E-BPdel-2 (BDSC #9559 )、UAS-fezzikRNAi (VDRC #107089 )、4E-BPintrondsRed (H. D. Ryooの研究室から入手)。 D.Ryooの研究室から入手）、Mex1-Gal4およびC564-Gal4はアウトストックから入手した。4E-BPintrondsRed系統とUAS-GCN2RNAi-1系統を組換え、4E-BPintrondsRed, UAS-GCN2RNAi系統を作製した。RNA配列決定には、VDRCのKK系統であるUAS-GCN2RNAi-1とUAS-ATF4RNAiを用いた。転写ノイズを減らすため、Mex1-Gal4と交配したKK株VDRC-60100を対照条件として用いた。
ホリディック食
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HDはPiper, 2017のプロトコールに従い、全AA濃度10.7 g-L-1で調製した。我々はPiperらのプロトコールに2つの変更を加えた：低濃度のスクロース（5 g-L-1）を使用したのは、この濃度がGF幼虫に最適であることに注目したからである：高濃度のスクロースは毒性があり、GF幼虫の発育をわずかに遅らせる（データは示さず）。さらに、保存料（プロピオン酸またはニパジン）は細菌の増殖を変化させる可能性があるため、使用しなかった。チューブおよび産卵ケージはUV処理またはオートクレーブ滅菌し、溶液はオートクレーブ滅菌（寒天、Leu、Ile、Tyr、スクロース、コレステロール、痕跡、および酢酸緩衝液を含む最初の部分）またはフィルター滅菌（EAA、NEAA、Glu、Cys、ビタミン、核酸、脂質前駆体、葉酸のストック溶液）した。トランスポゾン変異体を含むすべての実験では、HDにエリスロマイシン（5μg-mL-1）を補充した。HDは使用前に4℃で最大1週間保存した。
細菌と培養条件
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LPのLpNC8株とAPのApWJL株を使用した。なお、Lactiplantibacillus plantarumは、以前はLactobacillus plantarumとして知られていた種の新名称である（Zheng et al.、2020）。他のLP株とは逆に、LpNC8はハエからではなく牧草サイレージから分離された（Axelsson et al. LpNC8はMRSブロス培地（Carl Roth, Karlsruhe, Germany）中、37℃で一晩攪拌せずに培養した。Lp変異体ライブラリーは、LpNC8からのランダムトランスポゾン挿入により作製した（Matos et al.）すべてのLpトランスポゾン挿入変異体は、5μg-mL-1のエリスロマイシンを添加したMRSで24時間増殖させた。LpGFP株はLpWJL（Ryuら、2008；Storelliら、2018）から作製した。LpGFPは、クロラムフェニコール10 µg-mL-1を添加したMRSで24時間培養した。ApWJLはハエの腸から単離した（Ryu et al.） ApWJLは、3g-L-1のBacto peptone（Becton Dickinson）、5g-L-1の酵母エキス（Becton Dickinson）、および25g-L-1のD-マンニトール（Carl Roth）からなるマンニトールブロス中で、30℃、180rpmの攪拌下で24時間培養した。
発生タイミング実験
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GFハエを無菌飼育ケージに一晩入れ、実験に用いたHDと同様のHDの皿に産卵させた。d0で卵を回収し、HDの入ったチューブに入れた。特に断りのない限り、各実験条件は40個の卵が入った5つのチューブで構成されていた。その後、卵に100μLの滅菌PBS 1×（GF条件）または100μLのPBS 1×に懸濁した細菌培養液（チューブあたりLpは約2×108 CFU、Apは約107 CFU）を接種した。HK条件では、PBSに懸濁したLpを65℃で3時間培養した。接種後、幼虫は25℃で12:12時間の明暗サイクルで飼育した。新たに出現した蛹の数を、すべての蛹が出現するまで毎日記録した。データは経時的な蛹化曲線として、またはRStudio上のカスタムスクリプトを用いて計算した蛹化時間の中央値（D50）として表した。RパッケージのCoxme (Therneau and Grambsch, 2000)を用いて、経時的な蛹化曲線に適応したCox比例ハザード・モデルを作成し、イベント「死亡」をイベント「蛹化」に置き換えた（Rodrigues et al., 2021）。各実験は独立した5反復で行った（1反復は上記で説明したように40個の卵を入れたチューブで構成）。異なる食餌（例えばバランスHD vs アンバランスHD）間での発生に対するLpの影響を比較するため、蛹化~Lpの有無 * 食餌 + (1|Replicate) (1|Replicateはランダム因子として複製を考慮)というモデルを用いて、Lpの有無と食餌の間の交互作用が有意であるかどうかを検定した。必要な場合は、FDR法を用いて多重比較を補正した。ある処理と他の処理を比較するために（例えば、Lp:Tncontrol関連幼虫とGF幼虫およびLp:Tnr/tRNA関連幼虫の発生時期を比較するために）、Tukeyポストホック一対比較を用いて、multcompパッケージ（Hothorn et al.
血精液中のバリンの測定
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yw幼虫は、発生時期実験と同様にHDで飼育した。最初の蛹が出現する1日前（通常、バランス食のLp関連幼虫はD5 AEL、アンバランス食のLp関連幼虫またはバランス食のGF幼虫はD6 AEL、アンバランス食のGF幼虫はD10 AEL）のL3前中期に採集した。各レプリケートについて、10匹の幼虫をPBSで洗浄し、ティッシュで乾燥させた。その後、幼虫をスライドグラスの上に置き、鉗子で裂いた。各幼虫について、ピペットチップで1 µLの血リンパを採取し、10サンプルを90 µLのPBSにプールした。その後、Consuegraら、2020bのプロトコールに従ってAA濃度を測定した。サンプルはミリQ水で希釈し、内部標準物質として既知量のノルバリンを用いた。各試料は、テフロンライニングのスクリューキャップ付き密閉ガラス管でタンパク質加水分解に供した（6N HCl、115℃、22時間）。空気真空除去後、チューブを窒素でパージした。すべてのサンプルを50μLの超純水と混合し、pH10.2のホウ酸塩で緩衝化し、室温でAgilent 1313Aオートサンプラーを用いてオルト-フタルアルデヒドで誘導体化した。AA分析は、ガードカートリッジと逆相C18カラム（Zorbax Eclipse-AAA 3.5 μm, 150×4.6 mm; Agilent Technologies）を用いたHPLC（Agilent 1100; Agilent Technologies, Massy, France）で行った。極性相として40 mM NaH2PO4（溶離液A [pH 7.8]、NaOHで調整）、非極性相（溶離液B）としてアセトニトリル/メタノール/水混合溶媒（45:45:10、vol/vol/vol）を用い、40℃、流速2 mL-min-1で分離を行った。クロマトグラフィー中は、Bの0%から開始し、最後に100%まで増加するグラジエントを適用した。検出は、励起波長340nmと発光波長450nmに設定した蛍光検出器で行った。この定量には、内部標準としてノルバリンを用い、Valの応答係数は250pmol-μL-1のAA標準混合物を用いて決定した。解析にはChemStation for LC 3D Systems（Agilent Technologies社製）を使用。
遺伝子スクリーニング
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遺伝学的スクリーニングは、他の発生タイミング実験と同じ条件で行ったが、小型チューブに1条件につき20個の卵を用い、1条件につき1レプリケートとした。各条件とも、1個のトランスポゾン挿入変異体を接種した。スクリーンは4つのバッチに分けた。各バッチについて、各変異体のD50と関連するzスコアを計算した。そして4つのバッチからzスコアをプールし、閾値2.5以上のものを選んだ。この32の候補を、5反復の発生タイミング実験で再テストした。これらの候補を、ライブラリーのWT様トランスポゾン挿入変異体Lp:Tncontrol（B02.04）（dnaJ下流の遺伝子間領域に挿入されたトランスポゾン）と比較した。
全ゲノムシーケンスによる挿入のマッピング
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変異体のゲノムに挿入されたトランスポゾンはバーコード化されていない。それらをマッピングするために、UltraClean Microbial DNA isolation (MoBio, Jefferson City, MO, USA)というキットを用いて各候補のゲノムDNAを抽出した。サンプルはQubit 4.0 HS DNAを用いて品質チェックを行った。ゲノム細菌DNAの塩基配列を決定するために、500 ngのDNA（350 ngと280 ngを用いた2つのサンプルを除く）からNextera DNA Flex Library Prep（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）を用いて、プロバイダーの推奨に従ってライブラリーを構築した。17のデュアルインデックスライブラリーを等モルでプールし、NextSeq500イルミナシーケンサーとミッドアウトプットランを用いてペアエンドモード（2×75 bp）でシーケンスした。155M以上のリードが得られ、サンプルごとに7Mから12Mのリードが得られた。データはGalaxy (Afgan et al., 2016)を用いて解析した。簡単に説明すると、各変異体について、トランスポゾン配列上にマッピングされた2つのリードのうち1つを持つリードのペアをすべてフィルターした。ペアとなったリードを集め、LpNC8のゲノム（Axelsson et al. LpNC8のゲノムには、高い配列類似性を共有するr/tRNAをコードする5つのオペロンが存在する。そのため、塩基配列の決定では、どのオペロンに挿入されたかを特定することはできなかった。そこで、各変異体について、どのオペロンにトランスポゾンが挿入されたかを同定するために、オペロン特異的PCRを用いた。各変異体について、トランスポゾンに特異的な2つのプライマー（OLB215とOLB221）と、各r/tRNAオペロン（op1、op2、op3、op4、op5）に特異的な1つのプライマーを用いた。本研究で使用したすべてのプライマーの配列はSupplementary file 3にある。
LpΔopr/tRNAの構築
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遺伝学的スクリーニングから得られた2つの挿入変異体（C09.09とF07.08/Lp:Tnr/tRNA、図2G参照）で独立に同定された、rRNA 5S、16S、23S、およびAla、Ile、Asn、ThrのtRNAをコードするオペロンを欠失させた。Matos et al., 2017に記載されているように、ダブルクロスオーバーによる相同性ベースの組換えを用いた。簡単に説明すると、LpNC8の染色体DNAをキットUltraClean Microbial DNA isolation（MoBio, Jefferson City, MO, USA）を用いて精製した。次に、オペロンの上流と下流の領域を、Q5 High-Fidelity 2× Master Mix（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）を用いて、ギブソンアセンブリーを可能にするためにプラスミドpG+host9（Maguin et al., 1996）と重複する領域を含む以下のプライマーで増幅した：tRNAop_1、tRNAop_2、tRNAop_3、およびtRNAop_4（補足ファイル3）。PCR断片をギブソンアセンブリー（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）によりPstIで消化したプラスミドpG+host9に挿入し、大腸菌TG1に形質転換した。このプラスミドを精製し、大腸菌GM1674 dam-dcm- (Palmer and Marinus, 1994)に形質転換してDNAを脱メチル化した。次にプラスミドを精製し、エレクトロポレーションによってLpNC8に形質転換した。形質転換体はエリスロマイシンを5μg-mL-1添加したMRS中で、プラスミドの複製を許さない42℃で培養し、クロスオーバーによるプラスミドの染色体への統合を選択した。次に、エリスロマイシン非存在下でLpを継代培養することにより、2回目のクロスオーバーイベントによるオペロンの欠失を伴うプラスミド切除を得た。欠失はコロニーPCRでスクリーニングし、プライマーtRNAop_5とtRNAop_6を用いた塩基配列決定で確認した（補足ファイル3）。
顕微鏡観察
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4E-BPintrondsRed幼虫は、発生時期実験に記載したようにHD上で飼育した。最初の蛹が出現する1日前のL3中期（通常、バランス食のLp関連幼虫はD5 AEL、不均衡食のLp関連幼虫またはバランス食のGF幼虫はD6 AEL、不均衡食のGCN2ノックダウンLp関連幼虫はD7 AEL、不均衡食のGF幼虫はD10 AEL、Lp： Lp:Tnr/tRNA関連幼虫のD8 AEL）。短期的な会合については、GF幼虫をD8 AELまで不均衡食で飼育し、前述のようにLp:TncontrolおよびLp:Tnr/tRNAと会合させ、D10 AELで回収した。幼虫はPBS 1×で解剖した。腸をパラホルムアルデヒド（PFA）4％、PBS 1×中、室温で1時間固定し、PBS 1×で洗浄し、PBS Triton 0.2％で3回洗浄し、PBS1Xで洗浄し、ROTIMount FluorCare DAPI（Carl Roth, Karlsruhe, Germany）でマウントした。共焦点顕微鏡Zeiss LSM 780（Zeiss, Oberkochen, Germany）で画像を取得した。カスタムマクロを用いてFiji（Schindelin et al.、2012）で画像を解析した：マクロは、前中腸で定義された閾値以上のレポーター陽性領域を特定し、これらの領域内のDAPI陽性粒子の数をカウントする。その後、前中腸のDAPI陽性粒子の総数を数え、正規化に使用する。
HD上での細菌増殖
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400μLの不均衡HDを入れたマイクロチューブに、各候補変異体の～106CFUを接種した。各チューブに5匹のL1 GF幼虫を加え、25℃でインキュベートした。毎日、各条件につき3つのサンプルを採取し、CFUをカウントした：600μLの滅菌PBS 1×を加え、Precellys 24 tissue homogeniser（Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France）を用いて粉砕した。設定：設定：6000rpm、2×30秒、30秒休止）。ホモジネートを適切な濃度に希釈し、Easyspiral automatic plater（Interscience, Saint-Nom-la-Breteche, France）を用いてMRS寒天培地にプレーティングした。プレートを37℃で48時間培養し、自動コロニーカウンター Scan1200（Interscience, Saint-Nom-la-Breteche、フランス）とその計数ソフトウェアを用いてCFU数を評価した。
幼虫の腸内コロニー形成
詳細なプロトコールを請求する
幼虫は発生時期実験と同様に不均衡飼料で飼育した。AEL6日目に幼虫を回収し、70％エタノールで表面殺菌後、Precellys 24組織ホモジナイザー（Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France）を用いて粉砕した。設定：設定：6000rpm、2×30秒、30秒休止）。その後、上記の方法で CFU をカウントした。
tRNAの供給
詳細プロトコールはこちら
4E-BPintrondsRed幼虫を発育タイミング実験と同様にバランス飼料で飼育した。d0, d2, d4, d5 AELに、チューブ内の総濃度が5, 25, 125 µg-mL-1になるように、ミリポア水に溶解したtRNA溶液を50µL添加した。GF コントロールには同量のミリポア水を添加した。精製tRNAはSigma-Aldricht社（米国ミズーリ州セントルイス；大腸菌由来細菌tRNA 10109541001、酵母由来真核生物tRNA 10109517001）で購入した。幼虫はAEL6日目に解剖し、上記のように処理した。
食物摂取実験
詳細なプロトコールはこちら
幼虫は発育時期実験の説明と同様にHDで飼育した。幼虫は最初の蛹が出現する1日前に集め、エリオグラウシン二ナトリウム塩（Sigma-Aldrich, St. 1時間ごとに、各条件5反復で幼虫を5頭ずつ集め、PBSですすぎ、ビーズと500μLのPBSを入れたマイクロチューブに入れた。幼虫はPrecellys 24 tissue homogeniser（Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France）を用いて粉砕した。設定：設定：6000rpm、2×30秒、30秒休止）。分光光度計SPECTROstarNano（BMG Labtech GmbH, Ortenberg, Germany）を用いて0.629 nmの光学濃度を測定した。
幼生中腸のRNA抽出
詳細なプロトコールを請求する
幼虫は発生時期実験と同様に飼育し、最初の蛹が出現する1日前に回収した。幼虫をPBS中で解剖し、解剖した前部中腸をRNAlater（Thermo Fisher, Waltham, MA, USA）に保存した後、マイクロチューブに移し、瞬間冷凍した。各レプリケートには10個の腸を用い、各条件で5レプリケート作成した。サンプルはPrecellys 24 tissue homogeniser（Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux、フランス）を用いて粉砕した。設定設定：6500rpm、2×30秒、30秒ポーズ）、RNeasyキット（Macherey-Nagel, Hoerdt, France）を用いて、製造元の指示に従って全RNAを抽出した。
Lp培養物のRNA抽出
詳しいプロトコールはこちら
Lpを液体平衡HD（Val -60%）で5日間培養した（Consuegra et al.） RNAはNakashima et al. 簡単に説明すると、細胞をPBS 1×で洗浄し、ガラスビーズを加えた500μLのTRI試薬（QIAGEN, Hilden, Germany）に懸濁した。細胞を3分間ボルテックスし、55℃で30分間インキュベートした後、12,000×g、4℃で10分間遠心した。100μLのクロロホルムを加え、チューブを3分間ボルテックスし、12,000×g、10分間、4℃で遠心した。上層を回収し、160μLの絶対エタノールを加え、miRNeasy MiniKit（QIAGEN、ドイツ、ヒルデン）のスピンカラムにかけた。RNAはmiRNeasy MiniKitを用い、製造元の指示に従って精製した。
RT-qPCR
詳細プロトコールを請求する
RNA濃度を調整し、SuperScript II RT kit（Thermo Fisher, Waltham, MA, USA）とランダムプライマー（Invitrogen, Waltham, MA, USA）を用いて、抽出したRNAの逆転写（RT）をメーカーの指示に従って行った。次に、ショウジョウバエについてはGCN2-forward、GCN2-reverse、4E-BP-forward、4E-BP-reverse、rp49-forward、rp49-reverse、16S-forward、16S-reverseのプライマーを用いて定量的PCRを行った、 Lpについては、SYBR GreenER qPCR Supermix（Invitrogen, Waltham, MA, USA）を用いて、23S-forward、23S-reverse、Thr-tRNA-forward、Thr-tRNA-reverse、gyrB-forward、gyrB-reverseを解析した（補足ファイル3）。
幼生前中腸のRNA配列決定
プロトコールの詳細
前述の方法で単離したトータルRNAの30サンプル（各条件につき5反復）を用いて、Lexogen社のSENSE mRNA-Seq Library Prep Kit V2を使用し、RTSプロトコルに従ってライブラリーを構築した。NextSeq500イルミナシーケンサーを用いたシングルエンドモード（1×86 bp）の高出力ランで一度に20ライブラリーをシーケンスするために、ライブラリーはシングルインデックス化され、等モルでプールされた。2回のランでそれぞれ535 M以上のリードが生成され、サンプルあたりの平均リード数は約26～27 Mとなった。シーケンスの統計はSupplementary file 4にある。
幼生前中腸のRNAシーケンス解析
詳細なプロトコルのリクエスト
MultiQC on Galaxy (Afgan et al., 2016)を用いてサンプルの品質を確認した。アダプターおよび低品質リードは、Galaxy上のCutadapt（Martin, 2011）の助けを借りて除去した。クリーンリードは、D. melanogasterのゲノム（BDGP6.32.104）に対して、デフォルトパラメータ（Dobin et al.） SARTools (Varet et al., 2016)を生リードおよび正規化リードの品質チェックに使用した。遺伝子数は正規化し、RのDESEq2パッケージ（Love et al.） BH調整p値（p-adj）が0.05より低い場合、遺伝子はDEとみなされた。複数の条件下で共通して有意に発現した遺伝子は、RのclusterProfilerパッケージ（Yu et al.、2012）を用いてGO濃縮についてテストし、冗長でないGO用語はREVIGO（Supek et al.、2011）を用いて削減した。
sRNAのシーケンスと処理
詳細プロトコールはこちら
Lp WTおよびLp Δopr/tRNAを、液平衡HD（Val -60%）で5日間、3連で増殖させた（Consuegra et al.） RNAは上記のように抽出した。NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illuminaを用いて、250 ngの全RNAから製造者の推奨に従ってライブラリーを構築した（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）。13回のPCRサイクルを行い、ライブラリー調製を終了した。得られたインデックス化ライブラリーは、SPRIビーズ（Beckman-Coulter）を用いて1×比でサイズ選択および精製した。各ライブラリーの定量と品質評価は、それぞれQubit 4.0 (HS DNA kit, Thermo Fisher)と4150 Tapestation analyser (D5000 ScreenTape kit, Agilent)を用いて行った。ライブラリーは等モルでプールし、HighOutput試薬を用いてIllumina NextSeq 500シーケンサーでシーケンスした。サンプルあたり63M～73Mのリードで、合計420Mのシーケンスリードが得られた。生リードはCutadapt v1.18（Martin, 2011）を用いて処理し、アダプターと短いリード（長さ<14）を除去した。Bowtie v1.13 (Langmead et al., 2009)を用い、特定のパラメータ(-n 0 -e 80 l 18 -best)でLp NC8のゲノムに対してマップし、rRNA、tRNA、ncRNA、コーディング領域の異なるアノテーションクラスに対してフィルターをかけた。シーケンスリードはfeatureCounts v2.0.1 (Liao et al., 2014)でカウントした。遺伝子数とともにncRNAの全セットを用いて、DESeq2パッケージv1.34.0（Love et al., 2014）でリード数を正規化した。選択されたtRNAは、Prism GraphPadで存在量の差異についても個別に分析された。
Lp NC8からの新規ncRNAのアノテーション
詳細プロトコールをリクエストする
Lp NC8の全ゲノム（Axelsson et al. Lp NC8の全ゲノム配列は、prokka v1.13 (Seemann, 2014)と、BSRD (Li et al., 2013; Nakashima et al., 2020)とPRESRAT (Kumar et al., 2021)を組み合わせた包括的な細菌ncRNAデータベースを用いて、新規ncRNAを検索するために再注釈された。このLp NC8における新規注釈付きncRNAの最終リスト（補足ファイル1）は、その後のマッピングステップで使用された。
図と統計
詳細なプロトコルはこちら
図は、Prism GraphPadソフトウェア、Biorender（BioRender.com）、RstudioパッケージclusterProfiler（Yu et al.、2012）、ggplot2、plotlyを用いて作成した。統計解析はPrism GraphPadソフトウェアとRStudioを用いて行った。
細胞外小胞の単離
詳細なプロトコルのリクエスト
Li et al., 2017から適応したプロトコルを用いた。MRSにおけるLpの一晩培養からの上清は、培養物を5000×gで10分間遠心分離することにより生成した。その後、上清を0.22 µmフィルターに通して大きな粒子を除去した。マイクロベシクルは、ExoQuick-TCキット（System Biosciences, Palo Alto, CA, USA）を用いて、製造元の指示に従って単離した。陰性対照として、無菌のMRSにも同様の操作を行った。
透過型電子顕微鏡観察
詳細プロトコールはこちら
Lpから単離した細胞外小胞を、エッチング処理により親水化した後、1分間ホルムバールを塗布したグリッド上に置いた。サンプルを2％ウラニル酢酸水溶液で3分間造影した。混合物を蒸留水で洗浄した。その後、細胞外小胞をTEM Jeol 1400 Flashで観察し、Gatan camera ultrascan 1000で画像を得た。
細胞外小胞からのRNAse処理、RNA抽出、RT-qPCR
詳細プロトコールを請求する
RNAse処理では、沈殿前に上清をRNase 4 mg-mL-1 (Sigma-Aldricht, St. Louis, MO, USA)で37℃、10分間処理した。RNaseは、Moriano-Gutierrezら, 2020に記載されているように、Murine RNase inhibitor（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）1μLの添加により阻害した。RNA抽出とRT-qPCRは、Lp培養と同じプロトコルを用いて細胞外小胞で行った。細胞外小胞からのRNAレベルを、同じ手順を経た無菌の非接種MRSからなるベースラインと比較した。
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データの利用可能性
RNAseq生データはNCBI Sequence Read ArchiveにSUB10970982およびPRJNA799161の番号で寄託されている。図の生成に使用したすべての数値データを含むソースデータファイルは各図に提供されている。
以下のデータセットが作成された
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Dusabyinema Y
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ヒューズ S
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(2023) NCBI Sequence Read Archive
ID PRJNA799161。バイオプロジェクトPRJNA799161。
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決定書
サラ・チェリー
査読編集者; ペンシルバニア大学、米国
ウトパル・バネルジー
シニアエディター、カリフォルニア大学ロサンゼルス校、ロサンゼルス、アメリカ合衆国
(i)読者の便宜のためにプレプリントと一緒に掲載されるようにデザインされた公開レビュー、(ii)以下に示す修正依頼を含む著者への原稿に対するフィードバック。また、編集者がその論文のどこを興味深く、あるいは重要だと感じたかを説明するアクセプトサマリーも含まれる。
査読後の決定通知
この度は、論文「Intestinal GCN2 controls Drosophila systemic growth in response to Lactiplantibacillus plantarum symbiotic cues encoded by r/tRNA operons」をご投稿いただき、誠にありがとうございます。あなたの論文は、3名の査読者（うち1名は査読編集委員会のメンバー）によって査読され、シニアエディターであるUtpal Banerjeeによって評価が監督されました。査読者は匿名を選択した。
査読者は互いの査読について議論し、査読編集委員は、あなたが修正投稿を準備するのに役立つよう、これを起草した。
重要な修正点
3人の査読者全員がこの研究を興味深いと認めたが、宿主細胞へのRNA転移の証明が不十分であると判断した。なぜそのようなメカニズムが不明なままなのか。例えば、FISH（RNAとDNA）を用いて宿主細胞内の細菌RNAを証明することができる。結論を支持するためには、この転移を証明する研究が必要である。
もう一つの疑問は、GCN2によって幼虫がアミノ酸の不均衡をどのように修正するのか、あるいはどのように対処するのかということである。ここでの追加的な洞察があれば、聴衆にとっても有益であろう。
査読者1（著者への提言）：
この論文は、ショウジョウバエの力を使って、生物が共生生物とどのように協力して環境の変化に適応しているのかを探る興味深い論文である。著者らは、「共生生物」である乳酸菌が生産できない非必須アミノ酸を減らしても、乳酸菌の存在によって救済されることを示している。なぜロイシンではないのか？バリンとイソロイシンは何が違うのか？そして、その適応はどのように行われるのだろうか？熱死菌を使って菌から供給するのではないことを示唆している。従って、動物の総バリンは全体的に減少しているはずである。そうなのだろうか？もしそうなら、何がその遅れを克服させるのでしょうか？作られるタンパク質が少なくなっているのでしょうか（異なる食餌のタンパク質中の総バリンを測定する）。ここでいう適応とは何か？
この相互作用を探るために、彼らはバクテリアの保護に必要な条件を遺伝子学的に解剖し始めた。ロイシン濃度の減少に対する経時的な遅延を示し、これがロイシンに特異的であるかどうかを決定するために、細菌変異体のさらなる特性解析がここで有用であろう。図2Fは％および他のaaを変更して行った。棒グラフではなく時間経過を示す。そして変異体がr/tRNA遺伝子座にトランスポゾンを挿入し、rRNAレベルが減少していることを示している。そのタンパク質濃度はどの程度ですか？これらのバクテリアでは違うのか？また、これらのRNAは細胞外に放出されるのか？その半減期は？また、どのようにして膜を通過するのでしょうか？核酸は受動的に通過することはできない。異なる菌株の培地で測定できる。これらの種の量の計算は、細菌内部の核酸がすべて腸細胞内部にアクセス可能であると仮定している。
次に、Lpによるコロニー形成が、食餌とは無関係にATF4レポーターの誘導をもたらすことを実験で証明した。しかし、変異型Lpのコロニー形成は、バランスの取れた食事では活性が低下するが、バランスの悪い食事では低下しない。これはスクリーニングで同定された変異体でも同様であった。この表現型は不均衡食時のものなので、これが何を意味するのかはよくわからない。さらに、ハエにtRNAを与えるとレポーターが誘導されますが、Lpのオペロン欠失株と比べても減少しています。これはD50や蛹化率に影響するのでしょうか？アンバランスな食餌でもレポーターを誘導するのか？tRNA実験に関するデータをもっと示す必要がある。これは大きな結論である。
図5の実験は、食餌とaaの不均衡によってGNC2に選択的な要求があることを示している。これは非常に複雑である。5aにおけるGCN2の枯渇は、アンバランスな食餌におけるGFの蛹化には影響しないが、S5A-Bにおける他の対立遺伝子には影響する。これは驚くべきことであり、いくつかの結論に影響を与える。これらの対立遺伝子では、バランスのとれた食餌ではどうなのだろうか？さらに、50％蛹化までの日数にはばらつきがある（例えばAのコントロールとGのコントロールは異なる）。試験したLp変異体は1つだけで、グラフはHとIの間にばらつきがある。興味深いことに、APはGCN2とは無関係にレスキューできる。このように、この問題には異なる解決策がある。さらに著者らは、ATF4と4EBPは不要であることを見出した。ではGCN2について重要なのは何かというと、それはeiF2aのリン酸化である。腸管細胞において翻訳が影響を受けるのか、ターンオーバーが影響するのか？そのメカニズムは？tRNAの摂食はGCN2に依存した蛹化の変化に影響を与えるのか？腸細胞、ISC、ターンオーバー、生理学の特性評価（例えば、aaレベルと取り込みをモニターするためのメタボロミクス）彼らはRNAseqを実行し、一連のGOカテゴリを記述する。これらの遺伝子の重要性を検証する実験も探索する実験もない。
Lpが発生にどのような影響を与えるのか、RNAがシグナルなのか、生存プログラムを誘導するためにどのように感知されるのかについては、不完全な理解のままである。
実験的解釈：
各図に含まれる独立した実験数と実験ごとの動物数が不明確である。集計値は何を表しているのか？それぞれの数は？蛹化率実験や共焦点実験を含むすべての実験について詳細に記述すべきである。
査読者2（著者への提言）：

理解しやすくするために、L. plantarumの変異体を、中断されたtRNA/rRNAや、コントロール変異体の場合は「コントロール」のような説明的な呼称で呼ぶとよい。番号表記の意味を覚えておくのは難しい。
図4EとF：ここで著者らは、GFショウジョウバエに精製した細菌のt-RNAを与え、腸細胞で4E-BPの転写が増加することを示している。同様の長さの無関係なRNAを与えると、特にtRNAがこの反応に必要であることが証明される。
図S4G：原核生物と真核生物の両方のtRNAを与えると、4E-BPの発現が増加する。ここで使用された真核生物と原核生物のtRNAの配列のアラインメントを示し、それらの類似性や欠如についてコメントすることは有益であろう。原核生物の tRNA は真核生物の tRNA と十分に類似しており、GCN2 に取り込まれたとしても相互作用するのでしょうか？
精製 tRNA は、L. plantarum よりも 4E-BP 発現に及ぼす影響がはるかに小さい。腸管細胞への取り込みにはOMVのような細菌キャリアが必要であるという可能性もあるが、もう一つの可能性は、反応にはさらに細菌成分が必要であるということである。加熱死菌と精製tRNAの混合物は、より強い反応をもたらすのだろうか？この実験には新しい試薬が必要であるが、原核生物のtRNAを直接腸細胞に条件付きで発現させ、GCN2が活性化されることを示せば、輸送が必要であることを証明できるであろう。
L.plantarumが食物摂取量を変化させないことを示す図5SEのデータは、tRNAやGCN2のデータに依存しない重要な対照であるため、原稿の早い段階で位置付けた方がよいかもしれない。
本論文の興味深い発見のひとつは、発育の減速は必須アミノ酸にアクセスできないことが直接の原因ではなく、むしろ栄養状態が最適でない場合に起こる制御されたプロセスであるが、実際には速い発育をサポートするのに十分であるということである。なぜこれが適応的反応なのかを推測するのは興味深い。
査読者3（著者への提言）：
上記のいくつかの具体的な問題点を除けば、基本的にこのままでよい。
以下のコメントは、追加実験の提案とともに、論文のインパクトを向上させることを目的としている。

バリン吸収：パルスチェイス実験において、放射性標識バリンを用いて腸からのバリン摂取をモニターすることは可能だろうか？
細菌のr/tRNAの放出：著者らはEVを介した放出の可能性に言及している。簡単な実験としては、EVを調製し、精製したEV中のr/tRNAの存在をPCRで確認する方法がある。この実験によって、細菌が培養液中のアミノ酸の不均衡に反応してr/tRNAを放出するのか（言い換えれば、不均衡な食餌に対する反応は、共生生物、宿主、あるいはその両方のレベルで起こっているのか）という疑問にも答えられるかもしれない。より困難なのは、幼虫に、wt型Lp菌と変異型Lp菌のEVを与えることだろう。難しいのは、十分な量の材料を得ることかもしれない。幼虫用のCAFEに似たアッセイは存在するのだろうか？
[編集者注：受理される前に、以下のようにさらなる修正が提案された。］
このたびは、「Intestinal GCN2 controls Drosophila systemic growth in response to Lactiplantibacillus plantarum symbiotic cues encoded by r/tRNA operons」と題するご著作を、eLife誌に再投稿いただき、誠にありがとうございます。あなたの修正された論文は、Utpal Banerjee (Senior Editor)と査読編集者によって評価されました。
原稿は改善されましたが、以下のように対処すべき問題が残っています：
査読者 2 による小胞に関する特異性に関する疑問への対応をお願いします。
査読者2（著者への提言）：
著者らは、すべての査読者のコメントに対して、驚くほど徹底的に回答している。腸内の小胞を観察する努力は賞賛に値するが、これを含めるには十分な説得力がないという点では著者と同意見である。膜小胞のqRT-PCRに関して、ひとつだけ懸念がある。選択性を示すような陰性対照／不在のRNAを見てみたい。期待されるRNAは存在する。これらは細菌と同じ比率で存在するのでしょうか？もしそうなら、細菌と小胞で異なるレベルで見出されるRNAはありますか？もしすべてのRNAが小胞内で細菌内と同じ比率で検出されるのであれば、これらが汚染RNAでないことを証明するにはどうすればよいのだろうか？結局のところ、これらのRNAは細菌内で最も多く存在するRNAの一部なのです。また、リボソームがOMVと共沈している可能性も懸念されます。もう一つの可能性は、膜小胞をRNaseで処理することかもしれない。小胞内のRNAはこのような酵素の作用に耐性があると考えられているからだ。もちろん、OMVがrRNAやtRNAを運んでいることを証明するのが難しいことは十分理解しています。
査読者3（著者への提言）：
著者らは、査読者から提起された問題に対処するための妥当な試みを行った。注目すべきは、RNAScopeプローブを使用することで、腸管細胞内の細菌RNAを検出するのに必要な感度が得られたかもしれないことである。
https://doi.org/10.7554/eLife.76584.sa1
著者からの回答
本質的な修正：
しかし、宿主細胞へのRNA転移の証明が不十分であった。このような現象の例は他にもある。例えば、FISH（RNAとDNA）を用いて宿主細胞内の細菌RNAを証明することができる。結論を支持するためには、この転移を実証する研究が必要である。
もう一つの疑問は、GCN2によって幼虫がアミノ酸の不均衡をどのように修正するのか、あるいはどのように対処するのかということである。ここでの追加的な洞察があれば、聴衆にとっても有益であろう。
編集者および査読者に感謝する。編集者と査読者の示唆に従い、我々は追加実験を行い、査読者から指摘された主要な点に（少なくとも部分的に）対処したと思われるいくつかの変更を原稿に加えた。
最初の原稿の議論の中で、我々はL. plantarum（Lp）からのr/tRNAの細胞外小胞を介した放出を提案した。今回、この仮説を直接検証し、その結果を更新原稿の新しい図3に示した。その結果、Lpは細胞外小胞を産生し、その中には研究対象のr/tRNAオペロンがコードするrRNAとtRNAが含まれていることが明らかになった。この観察は、細胞外小胞が、宿主細胞が細菌のr/tRNAのような共生の合図を獲得し感知するための一つの手段である可能性を示している。
さらに編集者は、宿主細胞内のLpのr/tRNAを可視化するためにFISHを行うことを提案した。我々は、Lpの16S rRNAに特異的なプローブを用いて、GF幼虫とLp共生幼虫の腸でHCR-FISHを行った（Akhtarら、PLOS ONE 2021）。Lp関連幼虫では、細胞外小胞と思われる大きな陽性粒子が検出された（著者回答画像1および著者回答画像2参照）。GFの腸内ではシグナルは見られなかった。さらに、バックグラウンドの可能性を考慮し、二次蛍光プローブを用いずにヘアピンプローブのみで実験を行ったネガティブコントロールでは、シグナルは検出されなかった。
著者回答画像1
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Lpの16S rRNA（黄色）とDAPI（シアン）で染色した幼虫の前中腸の代表的な画像。
スケールバー： 50 µm。
rRNAシグナルは内腔にあるように見えるが、腸細胞にもあるかどうかは不明。以下の写真は、腸管細胞にあるかもしれないLp関連幼虫の腸管内の陽性点を示している。
著者回答画像2
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Lp関連幼虫の前中腸の代表的な共焦点写真。
腸細胞内のLpのrRNAの推定封入体を示す平面を選択した。スケールバー： 50 µm。右の写真：赤い線は、内腔（上側、... さらに表示
さらに、Lpの16S rRNA（黄色）とDAPI（シアン）をHCR-FISHで染色したLp関連幼生の前部中腸のZスタックを示す著者回答ビデオ1をご覧ください。
著者回答ビデオ1
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これらの画像は宿主の腸管細胞にLp's rRNAが存在することを裏付けるものであるが、HCR-FISHを実施できたのは数個の中腸のみであり、系統的な方法ではなかったため、原稿に含めるには十分な証拠レベルとは考えていない。そのため、これらのデータは査読者への回答（発表された論文と一緒にアクセスできる）のみに掲載し、考察（642-647行目）ではこの点について推測にとどめておくことにする。さらに、GCN2がAAの不均衡時に幼虫の成長を促進するメカニズムについて、さらなる洞察を得た。この目的のために、最初の原稿で報告した機能的トランスクリプトミクス・アプローチを活用した。GCN2依存的にLpが結合すると発現が低下する遺伝子の中から、成長抑制因子で推定Ecdysone-oxydaseのfezzikを興味深い候補として同定した。RNAiを用いて、GF動物の腸細胞でfezzikの発現を抑制すると、それだけで成長が改善することを示した。このことは、Lpが介在するGCN2依存的なfezzikのダウンレギュレーションが、Lp会合に伴う幼虫の成長に寄与していることを示している。これらのデータは、新しい図8と新しい図8-図1にて示した。
さらに、いくつかの査読者のコメントに対応するため、追加実験を行った：

Lpはバリンを奪われた幼虫の血液リンパ中のバリンレベルを回復させる（新しい図1E）。これは、Lpの会合が腸の機能と栄養吸収を改善するという我々の仮説に沿ったものであり、我々の機能的トランスクリプトーム解析によって示されたように、腸の成熟をサポートすることによって、その可能性が高い。
次に、他のGCN2-RNAi株をRT-qPCRで試験し、GCN2を効率的にノックダウンすることを示した（新しい図6-図1D）。
我々は今回、thor（4E-BP）の機能喪失変異を持つ2つのショウジョウバエ系統を用いて、4E-BPはLpが幼虫の成長を促進するのに必要ではないという、RNAiに基づく以前の観察を確認した（新しい図6-図1I）。
我々は今回、r/tRNAオペロンのLp欠失変異体は、低バリン時だけでなく、ロイシンが制限された状況下でも成長を促進することができないことを示した（新しい図2-補足1D）。この結果は、Lpの会合が、バリンの取り込みだけでなく、腸の機能と栄養吸収を改善するという考え方を補強するものである。
さらに、他の細菌で報告されているように、r/tRNAオペロンがリボソームRNAや転移RNAの上に小さなノンコーディング（nc）RNAをコードしているのではないかと考えた（Stenumら、Frontiers in Microbiology 2021）。我々はLpが培養中に発現するncRNAの塩基配列を決定し、これらの条件下で発現する13のncRNAを同定した。これらのsncRNAのリストをここに示す（新しい補足ファイル1）。これらのncRNAはいずれもr/tRNAオペロンにコードされていないことから、我々が記述したような表現型には関与しておらず、欠失した遺伝子座からのr/tRNAが観察された表現型の原因であるという考えを補強するものである。さらに、このデータセットを用いて、予想通り、r/tRNAオペロンのLp変異体ではtRNAの発現が低下していることを示した（新しい図2-補足1I）。
最後に、査読者のご指摘に従い、本文および図表を一部修正しました。
以下に査読者のコメントに対する回答を一点ずつ示す。
査読者1（著者への提言）：
この論文は、ショウジョウバエの力を使って、生物が共生生物とどのように協力して環境の変化に適応していくかを探る興味深い論文である。著者らは、「共生生物」である乳酸菌が生産できない非必須アミノ酸を減らしても、乳酸菌の存在によって救済されることを示している。なぜロイシンではないのか？バリンとイソロイシンは何が違うのか？
査読者のご好意に感謝する。我々は必須アミノ酸にのみ注目した。これらのアミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン...）のいずれかが飼料から完全に除去されると、幼虫は発育できなくなる（Consuegra et al.）ロイシン濃度を低下させるとGF幼虫の発育遅延が起こるが、これはLpによって補われることが観察された（新しい図1A-B）。査読者が指摘するように、ロイシンを減らすよりもバリンやイソロイシンを減らした方がGF幼虫の発育遅延が大きくなることから、バリンやイソロイシンは「より必須」であると思われる。我々は、ロイシンが幼虫の成長にそれほど重要でないか、あるいはホリディック食のレシピがロイシンの過剰摂取に偏っているかのどちらかであると仮説を立てている。
その適応はどのように行われるのだろうか？熱で死滅させたバクテリアを使用することで、バクテリアから供給されるのではないとしている。したがって、動物の総バリンは全体的に減少しているはずである。そうなのだろうか？もしそうなら、何がその遅れを克服させるのでしょうか？作られるタンパク質が少なくなっているのでしょうか（異なる食餌のタンパク質中の総バリンを測定する）。ここでは何が適応なのでしょうか？
査読者の質問に答えるために、我々は異なる条件下でサイズを一致させた幼虫の血液リンパ中のバリン量を測定した（新しい図1E）。バランスの悪い餌を与えたGF幼虫では、総バリン量の減少が観察された。この減少はLpとの関連によって回復した。これはLpが腸の機能とバリンを含む栄養吸収を改善するという我々の主要な仮説を支持するものである。
この相互作用を探求するために、彼らは細菌における保護の必要条件を遺伝子学的に解剖し始めた。ロイシン濃度の低下に対する経時的な遅延を示し、これがロイシンに特異的なものであるかどうかを決定するためには、ここでさらに細菌変異体の特徴を明らかにすることが有用であろう。図2Fは％および他のaaを変更して行った。棒グラフではなく時間経過を示す。
この変異体の特徴をさらに明らかにするために、ロイシン濃度を減少させた（-70%）餌で、Lp r/tRNA変異体（Lp Δopr/tRNA）に関連する幼虫の発育時間を評価した。その結果、バリン制限時に観察されたのと同様に、LpΔopr/tRNAはロイシン制限時に幼虫の成長を促進しないことが観察された（新しい図2-補足1D）。
そして、この変異体はr/tRNA遺伝子座にトランスポゾンが挿入され、rRNAレベルが減少していることが示された。そのタンパク質濃度はどの程度なのだろうか？これらの細菌では違うのだろうか？また、これらのRNAは細胞外に放出されるのか？その半減期は？また、どのようにして膜を通過するのでしょうか？核酸は受動的に通過することはできない。異なる菌株の培地で測定できる。これらの種の量の計算は、細菌内部の核酸がすべて腸管細胞内部にアクセス可能であると仮定している。
この興味深い質問をしてくれた査読者に感謝する。腸を通過する際、Lp細胞の大部分は酸性領域を通過する際に死滅し（Storelli et al. しかし、遊離したr/tRNAが膜を通過できるかどうかは不明である。他の研究では、細菌が産生する細胞外小胞に細菌RNAが含まれる可能性があることが報告されている。宿主細胞は細胞外小胞の内容物を取り込むことができる（Brown et al.）我々は今回、Lpが細胞外小胞を産生し、これらの小胞がr/tRNAを含むことを示した（新しい図3）。従って、Lpのr/tRNAは細胞外小胞を通して宿主の細胞内に輸送される可能性がある。
次に、Lpによるコロニー形成が、食餌とは無関係にATF4レポーターを誘導することを実験で証明した。しかし、変異型Lpのコロニー形成は、バランスの取れた食事では活性化が減少するが、バランスの悪い食事では減少しない。これはスクリーニングで同定された変異体でも同様であった。この表現型は不均衡食時のものなので、これが何を意味するのかはよくわからない。さらに、ハエにtRNAを与えるとレポーターが誘導されますが、Lpのオペロン欠失株と比べても減少しています。これはD50や蛹化率に影響するのでしょうか？アンバランスな食餌でもレポーターを誘導するのか？tRNA実験に関するデータをもっと示す必要がある。これは大きな結論である。
Lp Δopr/tRNAによるコロニー形成時のATF4誘導の減少は有意ではない（p値=0.069）が、Lp:Tnr/tRNAによるコロニー形成時および短期間の会合時にも観察された（減少は統計的に有意になる、図5-補足1E,F）。このことは、Lp Δopr/tRNAが、バランスのとれた食事でもバランスの悪い食事でも、GCN2の活性化を低下させることを示唆している。精製tRNAが発生タイミングに影響を与えるかどうかを調べたところ、影響はないことがわかった。このことは、GF幼虫のGCN2活性化が低くても成長を促進するには十分ではないことを示唆しているのかもしれない。しかし、査読者が指摘するように、精製tRNAによるGCN2レポーターの誘導は非常に低い。特にLpによる誘導よりはるかに低い。従って、精製tRNAは、成長に大きな影響を与えるほどGCN2を活性化しないだけかもしれない。
図5の実験は、食餌とaaの不均衡によって、GNC2に対する選択的な要求があることを示している。これは非常に複雑である。5aにおけるGCN2の枯渇は、不均衡な食餌におけるGFの蛹化に影響を与えないが、S5A-Bにおける他の対立遺伝子では影響を与える。これは驚くべきことであり、結論の一部に影響を与える。
他の2つのRNAi系統（GCN2-2およびGCN2-3）の効率を測定したところ、干渉効率はGCN2-RNAi-1に比べて低下するものの、GCN2を効果的にノックダウンすることがわかった（新しい図6-図1D）。これら3つの系統のいずれかを用いてGCN2をノックダウンしたLp会合幼虫は、コントロールのLp会合幼虫に比べて遅延した。したがって、腸細胞でGCN2の発現が変化すると、Lpは成長を促進しないと結論した。GCN2-1を用いたノックダウンはGF幼虫の蛹化のタイミングに影響を与えないが、GCN2-2またはGCN2-3を用いたノックダウンは蛹化のタイミングに影響を与える。新しい図4は、GFの腸細胞ではGCN2活性が非常に低いことを示している。GCN2-2株とGCN2-3株を用いた結果から示唆されるように、GCN2活性は低いにもかかわらず、GF幼虫の発育に重要である可能性がある。LpはさらにGCN2の発現を誘導し、図7に記載したメカニズムによって幼虫の成長を改善すると考えられる。一方、GCN2-1系統は文献で一般的に用いられている系統（KK系統VDRC#103976）であるため、より信頼性が高いと思われる。GCN2-2およびGCN2-3は、RNA干渉に対して一般的に感受性が高いと思われるGF幼虫に対して、毒性またはオフターゲット効果を引き起こす可能性がある（図6および図6-図1における、それぞれATF4、4E-BPまたはTORのノックダウンによるGF幼虫の成長遅延を参照）。したがって、GF幼虫の成長におけるGCN2の重要性は不明である。それとは逆に、我々のデータはLp関連幼虫におけるGCN2の重要性を明確に示している。
これらの対立遺伝子がバランスのとれた餌を食べた場合、どのようになるのだろうか？さらに、50％蛹化までの日数にはばらつきがある（例えばAのコントロールとGのコントロールは異なる）。試験したLp変異体は1つだけで、グラフはHとIの間で分割されているが、Aでは全体が示されている。
わかりやすくするためにH-Iパネルを2つに分けることにしましたが、これらのデータは同じ実験で得られたものなので、データはグループ化できます。図6HとIを組み合わせたグラフを示す著者回答画像3を掲載する。コントロール幼虫-WT細菌とGCN2ノックダウン-WT幼虫の差は有意である。
著者回答画像3
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興味深いことに、APはGCN2とは無関係にレスキューできる。このように、この問題にはさまざまな解決策がある。さらに、著者らは、ATF4と4EBPは不要であることを見出した。腸管細胞において翻訳が影響を受けるのか、ターンオーバーが影響するのか？そのメカニズムは？tRNAの摂食はGCN2に依存した蛹化の変化に影響を与えるのか？腸細胞、ISC、ターンオーバー、生理学の特性評価（例えばメタボロミクスによるaaレベルや取り込みのモニタリングなど）
これらは取り組むべき非常に重要な問題である。しかし、これらはLpによるGCN2の活性化を中心とした研究の範囲を超えていると我々は考えている。
...彼らはRNAseqを行い、一連のGOカテゴリーを記述している。これらの遺伝子の重要性を検証する実験も探索する実験もない。
レビュアーのこの疑問に答えるため、我々はfezzikという遺伝子に注目した：fezzikは成長抑制因子であり、GCN2依存的、ATF4非依存的、r/tRNA依存的にLp会合時にダウンレギュレートされることが観察された（新しい図8A）。腸管細胞でfezzikをノックダウンすると、不均衡食での幼虫の成長が改善することが示された（新しい図8B）。したがって、Lpによるr/tRNAとGCN2の活性化を介したfezzikの抑制が、不均衡食での幼生成長の改善に関与していると考えられる。
我々は、Lpがどのように発生に影響を与えるのか、RNAがシグナルなのかどうか、そして生存プログラムを誘導するためにこれをどのように感知するのかについて、不完全な理解を残している。
パブリックレビューへの回答で述べたように、Lpが発生にどのような影響を与えるのか、そしてそのシグナルは何なのかについての理解が不完全なままであることに同意する。今回の結果は、r/tRNAを介したシグナル伝達、あるいは成長に影響を与えるGCN2活性化の下流の事象のいずれかに焦点を当てた、さらなる研究への道を開くものと期待している。バリン吸収、細胞外小胞、fezzikに関する我々の新しいデータが、Lpがどのように発生に影響を与えるのか、そしてr/tRNAがどのように感知されるのかについての不完全な理解を埋めるのに役立つことを、査読者が同意してくれることを願っている。
実験的解釈：
各図に含まれる独立した実験数と実験ごとの動物数が不明である。集計値は何を表しているのか？それぞれの数は？蛹化率実験や共焦点実験を含むすべての実験について詳細に記述すべきである。
この提案をいただいた査読者に感謝する。蛹化実験と共焦点イメージングに何匹の幼虫が含まれたかを各凡例の図に追加した。これにより、図がよりわかりやすくなることを期待しています。
査読者2（著者への提言）

理解しやすくするために、L. plantarumの変異体を、中断されたtRNA/rRNAや、コントロール変異体の場合は「コントロール」のような説明的な呼称で呼ぶとよいでしょう。番号指定の意味を覚えておくのは難しい。
この提案をいただいた査読者に感謝する。B02.04」をLp:Tncontrolに、「F07.08」をLp:Tnr/tRNAに置き換えた。
2）図4EおよびF：ここで著者らは、GFショウジョウバエに精製細菌t-RNAを与え、腸細胞で4E-BPの転写が増加することを示している。同様の長さの無関係なRNAを与えると、特にtRNAがこの反応に必要であることが証明される。
図S4G：原核生物と真核生物の両方のtRNAを与えると、4E-BPの発現が増加する。ここで使用された真核生物と原核生物のtRNAの配列のアラインメントを示し、それらの類似性や欠如についてコメントすることは有益であろう。原核生物の tRNA は真核生物の tRNA と十分に似ていて、GCN2 に取り込まれることができれば相互作用するのでしょうか？
(2)と(3)について： GCN2は各アミノ酸の同族tRNAと相互作用することができるが（Masson 2019）、これらのtRNAは配列が大きく異なっている。したがって、GCN2はtRNAの配列よりもむしろtRNAの構造を認識している可能性が高いと思われる。
精製tRNAは、L. plantarumよりも4E-BP発現に対する影響がはるかに小さい。腸管細胞への取り込みには、OMVのような細菌キャリアが必要であるという可能性もあるが、もう一つの可能性は、反応にはさらに細菌成分が必要であるということである。加熱死菌と精製tRNAの混合物は、より強い反応をもたらすのだろうか？この実験には新たな試薬が必要であるが、原核生物のtRNAを直接腸細胞に条件付きで発現させ、GCN2が活性化されることを示せば、輸送が必要であることを証明できるであろう。
細菌性tRNAを腸細胞に異所性発現させることは非常に興味深いことであるが、我々の研究の範囲を超えていると思う。上記のように、我々は現在、Lpが細胞外小胞を産生し、これらの小胞がr/tRNAを含むことを実証している（新しい図3）。
L.plantarumが食物摂取量を変化させないことを示す図5SEのデータは、tRNAやGCN2のデータに依存しない重要なコントロールであるため、原稿のもっと前の方に配置した方がよいかもしれない。
この提案をいただいた査読者に感謝する。食物摂取量のデータを新しい図1-補足1E-Fに移動した。
本論文の興味深い知見のひとつは、発育の減速は必須アミノ酸にアクセスできないことが直接の原因ではなく、むしろ栄養状態が最適ではないが実際には発育の速さを支えるには十分である場合に起こる制御されたプロセスであるということである。なぜこれが適応的反応なのかを推測するのは興味深い。
我々は評者の興味を共有している。ショウジョウバエの腸管細胞による共生の手がかりの感知が、栄養吸収と基質上の共生細菌の豊富さとの結合を可能にする適応的形質である可能性について、現在議論している（L758-765）。
査読者3（著者への提言）：
上記のいくつかの具体的な問題点を除けば、基本的にこのままでよい。
以下のコメントは、追加実験の提案とともに、論文のインパクトを改善することを目的としている。

バリン吸収：パルスチェイス実験において、放射性標識バリンを用いて腸からのバリン摂取をモニターすることは可能だろうか？
上述したように、我々は現在、Lpとの会合がバリン吸収と血リンパ中のバリン濃度を改善することを示している。Lpも幼虫もde novoでバリンを産生することはできないので、バリンが食餌由来であることを証明するために放射性バリンを使用する必要はないと考える。
細菌のr/tRNAの放出：著者らはEVを介した放出の可能性に言及している。簡単な実験としては、EVを調製し、精製したEV中のr/tRNAの存在をPCRで確認する方法がある。この実験によって、細菌が培養液中のアミノ酸の不均衡に反応してr/tRNAを放出するのか（言い換えれば、不均衡な食餌に対する反応は、共生生物、宿主、あるいはその両方のレベルで起こっているのか）という疑問に答えることもできるだろう。より困難なのは、幼虫に、wt型Lp菌と変異型Lp菌のEVを与えることだろう。難しいのは、十分な量の材料を得ることかもしれない。幼虫用のCAFE様アッセイは存在するのか？
この提案をいただいた査読者に感謝する。上記のように、我々はLpから細胞外小胞を単離し、その中にr/tRNAを検出しました（新しい図3）。精製した小胞を飼料に添加することも可能ですが、腸内で放出される可能性のある小胞の濃度と比較すると、希釈されすぎてしまうでしょう。CAFÉ-アッセイを用いれば、より高濃度に達することができるが、我々の知る限り、このようなアッセイは口吻を通して液体基質を「飲む」ことができる成虫に限られており、幼虫には適用できない。
[編集部注：受理される前に、以下のようにさらなる修正が提案された。］
原稿は改善されたが、以下に示すように対処すべき問題が残っている：
査読者2が小胞について提起した特異性に関する疑問を解決してください。
査読者2（著者への提言）：
著者らは、すべての査読者のコメントに対して、驚くほど徹底的に回答している。腸内の小胞を観察する努力は賞賛に値するが、これを含めるには説得力に欠けるという点では著者と同意見である。膜小胞のqRT-PCRに関して、ひとつだけ懸念がある。選択性を示すような陰性対照／不在のRNAを見てみたい。期待されるRNAは存在する。これらは細菌と同じ比率で存在するのでしょうか？もしそうなら、細菌と小胞で異なるレベルで見出されるRNAはありますか？もしすべてのRNAが小胞内で細菌内と同じ比率で検出されるのであれば、これらが汚染RNAでないことを証明するにはどうすればよいのだろうか？結局のところ、これらのRNAは細菌内で最も多く存在するRNAの一部なのです。また、リボソームがOMVと共沈している可能性も懸念されます。もう一つの可能性は、膜小胞をRNaseで処理することかもしれない。小胞内のRNAはこのような酵素の作用に耐性があると考えられているからだ。もちろん、OMVがrRNAやtRNAを運んでいることを証明することの難しさは十分に理解している。
査読者2には、我々の研究を評価していただき、また我々の結果を改善する示唆をいただいたことに感謝する。細菌細胞と細胞外小胞における 16S rRNA、23S rRNA、Thr-tRNA の存在量を比較しました。新しい図3では、我々がテストしたr/tRNAの比率が、細胞と細胞外小胞の間で強く異なっていることを示しています。細胞内では、どちらのrRNAもThr-tRNAよりもかなり豊富でしたが、細胞外小胞では、それらは同レベルでした（新しい図3B, C）。さらに、Lpの細胞外小胞をRNAseで処理し、潜在的な汚染物質を除去した。その結果、rRNAのさらなる減少が観察され、そのレベルはThr-tRNAよりも低くなった（新しい図3C、D）。これらの新しい結果は、Lpの細胞外小胞にはtRNAは含まれているが、rRNAは含まれていない、あるいは少ないことを強く示唆している。これらの新しい結果を考慮し、考察（L964）と方法（L1468）を修正した。
査読者3（著者への提言）：
著者らは、査読者から提起された問題に対処するための妥当な試みを行っており、この論文は現在、些細な問題に対処しているに過ぎないように思われる。特筆すべきは、RNAScopeプローブを使用することで、腸管細胞内の細菌RNAを検出するのに必要な感度が得られたかもしれないということである。
査読者3名の我々の研究に対する評価と示唆に感謝する。今後、宿主細胞への細菌RNAの移行についてさらに研究を進める予定である。
https://doi.org/10.7554/eLife.76584.sa2
論文および著者情報
著者詳細
テオドール・グルニエ
フランス、リヨン、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン機能生物学研究所
現住所
フブレヒト研究所、オランダ王立芸術科学アカデミー（KNAW）、ユトレヒト大学医療センター、3584 CT Utrecht, the Netherlands, Utrecht, Netherlands
貢献
概念化、形式分析、調査、方法論、原案執筆
コレスポンデンス
t.grenier@hubrecht.eu
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです。
ジェシカ・コンスエグラ
リヨン人口機能研究所、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン、フランス
貢献
調査、方法論
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです。
マリアナ・G・フェラリーニ
リヨン大学、INSAリヨン、INRAE、BF2I、UMR 203、69621、ヴィルアルバンヌ、フランス
リヨン第1大学生物学・進化生物学研究室、UMR 5558、リヨン大学、ヴィルアルバンヌ、フランス
貢献
調査、方法論
競合利益
競合利益なし
Houssam Akherraz
リヨン人口機能研究所、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン、フランス
貢献
方法論
利益相反
競合利益なし
白龍偉
フランス、リヨン、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン機能解剖学研究所
貢献
調査
競合利益
競合利益なし
イヴ・デュサビーネマ
リヨン基礎生物学研究所、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン、フランス
貢献
方法論
利益相反
競合利益なし
イザベル・ラヒウイ
リヨン大学、INSAリヨン、INRAE、BF2I、UMR 203、69621、ヴィルアルバンヌ、フランス
貢献
方法論
利益相反
競合利益なし
ペドロ・ダ・シルヴァ
リヨン大学、INSAリヨン、INRAE、BF2I、UMR 203、69621、ヴィルアルバンヌ、フランス
貢献
調査
競合利益
競合利益なし
ベンジャミン・ジレ
リヨン人口機能研究所、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン、フランス
貢献
方法論
利益相反
競合利益なし
サンドリーヌ・ヒューズ
リヨン人口機能研究所、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン、フランス
貢献
方法論
利益相反
競合利益なし
キャシー・I・ラモス
リヨン人口機能研究所、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン、フランス
貢献
監修、調査
競合利益
競合利益なし
レナータ・C・マトス
リヨン基礎生物学研究所、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン、フランス
貢献
監修、調査
競合利益
このORCID iDは本論文の著者を特定するものである: "0000-0001-7480-6099
フランソワ・ルリエ
リヨン人口機能研究所、リヨン高等師範学校、クロード・ベルナール大学、リヨン、フランス
貢献
概念化、監修、資金獲得、検証、プロジェクト管理、執筆 - 査読と編集
コレスポンデンス
francois.leulier@ens-lyon.fr
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです：0000-0002-4542-3053」。
資金提供
医学研究財団 (DEQ20180339196)
テオドール・グルニエ
ジェシカ・コンスエグラ
Houssam Akherraz
白龍偉
イザベル・ラヒウイ
ペドロ・ダ・シルヴァ
ベンジャミン・ジレ
サンドリーヌ・ヒューズ
キャシー・I・ラモス
レナータ・C・マトス
フランソワ・ルリエ
医学研究財団 (SPF20170938612)
ジェシカ・コンスエグラ
資金提供者は、研究デザイン、データ収集、解釈、論文投稿の決定には関与していない。
謝辞
Hyung Don Ryoo教授、Pierre Leopold博士、Nathalie Arquier博士、Vienna Drosophila Resource CenterおよびBloomington Stock Centerのハエ系統の提供、David Duneau博士の統計解析への協力、Gilles Storelli博士の原稿の批評的読解、Filipe de Vadder博士およびAnna. Dr. Filipe de VadderとAnne Lambertには校正の過程で協力してもらった； ArthroToolsプラットフォームとSFR Biosciences (UAR3444/US8)のPLATIMプラットフォーム：フライ設備と顕微鏡装置、Institut de Biologie et Chimie des Protéines (IBCP)：小胞解析の協力、Centre Technologique des Microstructures (Villeurbanne)：TEMイメージングの協力。F Leulierの研究室での研究は、'Fondation pour la Recherche Medicale' （'Equipe FRM DEQ20180339196' ）およびリヨン大学'Microbehave'のScientific Breakthrough Projectの支援を受けている。T GrenierはENS de Lyonより博士研究員として研究助成を受けた。J ConsuegraはFondation pour la Recherche Médicale（FRM、SPF20170938612）のポスドク研究助成金を受けた。
シニアエディター
Utpal Banerjee, カリフォルニア大学ロサンゼルス校, ロサンゼルス, アメリカ合衆国
査読エディター
サラ・チェリー（米国、ペンシルバニア大学
出版履歴
プレプリント掲載 2021年10月31日（プレプリントを見る）
受理 2021年12月21日
受理受理：2023年6月8日
受理原稿公開 2023年6月9日（第1版）
記録版発行 2023年6月22日（第2版）
著作権
© 2023, Grenier et al.
この記事はクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されています。このライセンスは、原著者と出典のクレジットを条件として、無制限の使用と再配布を許可するものです。
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© 2023 eLife Sciences Publications Ltd. 特に断りのない限り、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンスに従う。ISBN: 2050-084x

腸管GCN2は、r/tRNAオペロンがコードするLactiplantibacillus plantarum共生の合図に応答してショウジョウバエの全身成長を制御する

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