非昆虫食による食肉類の酸性キチナーゼの構造的・機能的変化

非昆虫食による食肉類の酸性キチナーゼの構造的・機能的変化

https://academic.oup.com/mbe/article/39/1/msab331/6432054?login=false

田畑恵理、糸魚川晃弘、鯉沼巧、田山宏、樫村明徳、坂口正義、ヴァクラヴ・マトスカ、ペーター・オ・バウアー、大山史貴
Molecular Biology and Evolution, Volume 39, Issue 1, January 2022, msab331, https://doi.org/10.1093/molbev/msab331
公開日：2021年11月19日
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要旨
酸性キチナーゼ（Chia）は雑食性の胃の中で昆虫のキチンを消化し、肉食性のChiaのキチナーゼ活性は雑食性の酵素の活性より著しく低くなる。しかし、Chiaの機能変化に関する機構的・進化的な知見は不明なままである。ここでは、食肉目における進化の過程で、非昆虫食がキアに構造的・機能的変化をもたらしたことを明らかにする。マウスと犬のキメラChiaタンパク質を作り、アミノ酸配列を変更することで、F214LとA216Gの置換が犬の酵素活性化につながることを明らかにした。31の食肉目では、Chiaはオープンリーディングフレーム（ORF）領域に停止コドンを持つ偽遺伝子として存在した。重要なことは、昆虫食の種であるスカンク、ミーアキャット、マングース、ハイエナのChiaタンパク質が高いキチン分解活性を示したことである。猫のキア偽遺伝子産物は、ORFを復元してもなお不活性であった。しかし、Cys残基の数と位置を活性型に合わせ、ミーアキャットのChia残基を5個導入することにより、酵素を活性化することができた。擬似遺伝子化後のChiaのコンフォメーションと活性に影響を与える変異は、機能的な制約により、ネコ科の共通祖先に蓄積された。進化解析の結果、イヌ科を除く非昆虫食の種では、Chia遺伝子は緩やかな選択的制約を受けていることが示された。これらの結果は、食肉目には2種類の不活性化プロセスが存在し、食餌の変化がChiaの構造と活性に影響を与えることを示唆している。

消化酵素、食虫類、肉食動物、遺伝子消失、酸性キチナーゼ、キアヌ
課題区分 ディスカバリー
アソシエイト・エディター エマ・ティーリング
はじめに
すべての胎盤哺乳類の祖先は、恐竜の大量絶滅後すぐに進化した小さな昆虫食の生き物だった（O'Leary et al.2013）。この出来事により、肉食から草食、雑食まで多種多様な哺乳類の出現につながる食性を持つ種のニッチが開かれた。このような食性の変化は、哺乳類の変異を形成する重要な適応力となり、時にはタンパク質をコードする遺伝子の喪失を引き起こした（Zhao et al.2010; Hecker et al.2019 ）。遺伝情報に加えて、翻訳された産物の機能も進化的に重要な側面である。しかし、どのように、そしてなぜ機能を失ったのかについての知識はまだ限られている。

酸性キチナーゼ（Chia；酸性哺乳類キチナーゼ、「AMCase」とも呼ばれる；Bootら2001、2005）は、昆虫の主要構造多糖であるキチンのβ-1、4グリコシド結合を加水分解する（Bueterら2013；Wysokowskiら2015；Van DykenとLocksley2018）。チャは、コウモリ（Strobel et al. 2013）、マウス（Ohno et al. 2016）、センザンコウ（Ma et al. 2018）、カニクイザル（Uehara et al. 2018, 2021）、コモンマーモセット（Tabata, Kashimura, et al. 2019）などの食虫性・雑食性動物の胃に発現しています。また、鶏や豚などの雑食性畜産動物は、胃内でチアを高発現し、通常の消化管条件下でエビ殻やミールワーム幼虫殻などのキチンおよびキチン含有物を分解することができる（Tabata, Kashimura, Wakita, Ohno, Sakaguchi, Sugahara, Imamura, et al. 2017; 田畑、樫村、脇田、大野、坂口、菅原、木野、他 2017; 田畑、樫村、脇田、他 2018; 田畑、脇田、他 2019)がある。一方、イヌやウシなど特定の動物では、キチン分解活性の著しい低下を伴う低レベルのChia mRNAおよびタンパク質を発現する（Tabata, Kashimura, Kikuchi, et al.2018）。これらの結果から、食餌性キチン非存在下では、Chia遺伝子の機能的制約が緩和され、変異の蓄積が可能になり、結果としてキチン分解活性が低下した可能性があると考えた。

最近のゲノム研究により、食虫性の胎生哺乳類の祖先は5つのChia遺伝子を持ち、食餌に含まれる無脊椎動物の量が限られた哺乳類では、これらの遺伝子の損失が繰り返されることが明らかになった（Emerling et al.2018）。さらに、ヒト以外の霊長類におけるパラロガスChia遺伝子の数は、昆虫の消費量や体の大きさに関連している（Janiak et al.2018）。したがって、機能喪失につながるChia遺伝子の改変は、昆虫食の祖先から進化した遺伝子の分子記録を提供する（Emerling et al.2018）。

ここでは、昆虫食以外の食性を持つ種において、肉食性のChiaの構造と活性が変化していることを報告する。その結果、イヌ科では2つのアミノ酸置換によりChiaの活性が低下していることがわかった。同時に、これらの種（イヌ科を除く）ではキアの偽遺伝子化が進み、機能的制約の緩和により、機能部位のCys変異やアミノ酸置換が起こった。一方、昆虫を餌とする食肉目では、高活性なChiaが保持されている。今回紹介したデータは、昆虫以外の食餌に伴う遺伝子進化の変化をより深く理解するのに役立つと思われる。

研究成果
犬用チャのF214LとA216Gが高いキチン分解活性に重要であること
最近、雑食動物では、これらの酵素のレベルや活性が低い肉食動物や草食動物と比較して、十分なレベルのChia mRNAや活性タンパク質の発現によりキチンがよく消化されることを報告した（Tabata, Kashimura, Kikuchi, et al. 2018）。犬チャの活性は、配列の相同性が約80%であるにもかかわらず、マウスの数倍低い。

イヌチャのキチン分解活性低下の原因領域を特定するため、マウスとイヌのキメラ酵素をEscherichiacoliで発現させ（図1A；補足図S1-S3、補足資料オンライン）、合成発蛍光性基質4-methyl umbelliferyl β-D-N, N'-diacetyl chitobioside [4-MU-(GlcNAc)2] を用いて各キモラのキチン分解活性を分析した。

図1.
2つのアミノ酸置換で犬キノコを活性化できる。(A)大腸菌で発現させたキアキメラタンパク質の模式図。アミノ酸配列は以下のように色分けされている：ピンク：マウス配列、青：イヌ配列。(B）（A）で概説したキア蛋白質のキチン・リリース活性の比較。(C)大腸菌で発現させたChia変異体タンパク質の模式図。(D）パネルCの変異体タンパク質のキチン分解活性を、マウスおよびイヌのキアと比較した。(E) CatDのホモロジーモデルにより、同定されたアミノ酸置換（マウスでは左のピンク、イヌでは右の青）が、糖鎖と相互作用する残基（灰色）に近いことがわかる。
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2つのアミノ酸置換がイヌのキアを活性化する。(A）大腸菌で発現させたChiaキメラタンパク質の模式図。アミノ酸配列は以下のように色分けされている：ピンク：マウス配列、青：イヌ配列。(B）（A）で概説したキア蛋白質のキチン・リリース活性の比較。(C)大腸菌で発現させたChia変異体タンパク質の模式図。(D）パネルCの変異体タンパク質のキチン分解活性を、マウスおよびイヌのキアと比較した。(E) CatDのホモロジーモデルによると、同定されたアミノ酸置換（マウスでは左のピンク、イヌでは右の青）は、糖鎖と相互作用する残基（グレー）に近いことがわかる。

キメラC1（マウスエクソン3-10/イヌエクソン11でコードされる）およびC2（マウスエクソン3-7/イヌエクソン8-11でコードされる）は野生型（WT）マウスキアと同等の強いキチン分解活性を示した（図1B）。しかし、イヌのエクソン6-11が存在すると、活性は低下した（キメラC3；図1B）。また、キメラC4、C5では、キチン分解活性はマウスChiaのそれと比較して非常に低いものであった。一方、キメラC6は強い活性を示し、そのレベルはマウス酵素のそれと同程度であった（図1B）。これらの結果は、エクソン6と7がChiaのキチン分解活性決定に必須であり、マウス配列は酵素を活性化し、イヌ配列は酵素を不活性化することを示している。

2つの酵素の間でエクソン6と7によってコードされる領域のみを入れ替えた場合、マウス酵素はイヌ由来のエクソン6と7によって不活性化された（キメラC7）。逆に、マウスのエクソン6と7を持つイヌの酵素は活性化された（キメラC8）（補足図S4、補足資料オンライン）。これらの結果から、エクソン6と7がイヌとマウスのChia活性を制御していることが確認された。

さらに、キメラタンパク質と変異タンパク質（キメラC9-C12、イヌFLG、イヌTE変異体）の解析から、エクソン7領域のN末端の3つのアミノ酸がイヌChiaの不活性化に強く関与していることがわかった（補足図S4、Supplemental Material online）。そこで、この活性化に関与するアミノ酸を絞り込むために、F214LとA216Gを犬Chiaに導入した（犬LG変異体；図1C；supplement figs. S2 and S3, Supplementary Material online)に導入した。この2つのアミノ酸置換により、酵素の活性化が9倍増加することがわかった（図1D）。逆に、L214FとG216AをマウスChia（マウスFA変異体；図1C;補足図. S2 and S3, Supplementary Material online)に導入した。その結果、マウスFA変異体は、WTマウスChiaよりも有意にキチナーゼ活性が低いことがわかった（図1D）。興味深いことに、1つのアミノ酸の置換は酵素活性に大きな影響を与えなかった（ドッグ214Lまたは216G変異体；補足図S4, オンライン補足資料）。S4, Supplementary Material online)。このことから、ドッグチアの活性化には両方のアミノ酸が必要であることが確認された。

ヒトCHIA CatDの同領域のX線結晶構造に基づいて、マウスとイヌのChia触媒ドメイン（CatD）のホモロジーモデルを作成した（Olland et al.） L214とG216残基（マウス型）は、触媒反応に必須なY212とD213の近くに並んでいる（Olland et al.2009；図1E、左）。犬キアでは、これらの残基はF214とA216に変更されており、前者はかさ高い芳香族側鎖を持ち、糖基質のコンフォメーションの障害になっていると思われる（図1E, 右）。

イヌ科と食虫植物種にのみ維持されているチャのORF
イヌのChiaの活性はF214LとA216Gの置換によって回復した。前述のように、マウスは雑食性でキチン含有昆虫を餌としている。一方、イヌは肉食性であり、その食餌はキチン含有生物をほとんど含まない。昆虫食でないことと2つのアミノ酸置換の関係をさらに明らかにするために、イヌのChiaで同定された2つの不活性化アミノ酸置換に関して、40種の肉食動物の食性とChia open reading frame (ORF) integritiesを解析した。これらの肉食獣のキア塩基配列はNCBIゲノムデータベースから入手した（補足表S1、データファイル1、補足資料オンライン）。コード配列のアラインメントから作成した系統樹は、確立された系統関係を反映していなかったため（補足図S5、補足資料オンライン）、食肉目の公開系統樹を用いて、食習慣とチアのタンパク質コード領域の関係を調べた（図2A-D）。

図2.
食肉目におけるチア遺伝子の消失。(A)食肉目40種の系統樹。系統関係と分岐時間はTimeTree version 3.0 (http://www.timetree.org/)から取得した。太字の学名は、犬チアcDNA配列を用いたBLASTにより、ゲノムからチア配列を手動でアノテーションし、遺伝子などを組み上げたことを意味する。星印は偽遺伝子化イベントを示すが、その時期は不明である。(B）各生物種における主な食餌を図に示した。ピンクは肉類、紫は昆虫または甲殻類、黄色は果物または蜜、緑は植物である。(C）Chiaのタンパク質コード領域。X、機能喪失変異の位置と各ファミリーに共通する変異をボックスで示した。(D）タンパク質コード遺伝子であるかどうかを閉じた円で示し、ピンクは214Lと216Gを持つタンパク質コード遺伝子（活性型）、青は214Fと216Aを持つタンパク質コード遺伝子（不活性型）、黒は全長のタンパク質コード領域がない（偽遺伝子）である。(A)、(B)の図版（著作権は株式会社ACワークスに帰属）は、許可を得て使用しています。
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食肉目におけるチア遺伝子の消失。(A)食肉目40種の系統樹。系統関係と分岐時間はTimeTree version 3.0 (http://www.timetree.org/)から取得した。太字の学名は、犬チアcDNA配列を用いたBLASTにより、ゲノムからチア配列を手動でアノテーションし、遺伝子などを組み上げたことを意味する。星印は偽遺伝子化イベントを示すが、その時期は不明である。(B）各生物種における主な食餌を図に示した。ピンクは肉類、紫は昆虫または甲殻類、黄色は果物または蜜、緑は植物である。(C）Chiaのタンパク質コード領域。X、機能喪失変異の位置と各ファミリーに共通する変異をボックスで示した。(D）タンパク質コード遺伝子であるかどうかを閉じた円で示し、ピンクは214Lと216Gを持つタンパク質コード遺伝子（活性型）、青は214Fと216Aを持つタンパク質コード遺伝子（不活性型）、黒は全長のタンパク質コード領域がない（偽遺伝子）である。(A)と(B)の図版（著作権は株式会社ACワークスに帰属）は許可を得て使用しています。

F214とA216のアミノ酸は、Lycaon pictus, Vulpes vulpes, Vulpes lagopusなどのイヌ科にのみ保存されており、それ以外はマウスチャの配列に近かった。このことは、イヌで観察されたキアの不活性化現象がイヌ科のみで起こったことを示唆している（図2A）。

昆虫を主食としない種（肉、魚、果物、葉）では、コード領域に欠失、挿入、置換による早発停止コドンが存在する（図2A-D）。ネコ科動物では、エキソン3にフレームシフトを引き起こす欠失があり、これが早発停止コドンにつながっている（図2C；補足図S6およびS7、オンライン版補足資料）。また、イタチ科のエキソン10にもアミノ酸置換による早発停止コドンが見つかっている。Phocoidea科ではエキソン11に2bpの置換と11-13bpの挿入があることが共通している。ウシ科のChiaはエキソン1に1-2bpの欠失、エキソン7に1bpの欠失と置換、エキソン10に2bpの置換、エキソン11に1bpの置換により5つの早発停止コドンが存在する。これらの変異はCryptoprocta ferox, Crocuta crocuta, Paradoxurus hermaphroditus, Ailurus fulgensでは保存されていない。Chiaのエクソン1はMustelidaeとAiluridaeのゲノムには見つからなかったので、両グループの共通祖先は開始コドンを含む部分配列がないために偽遺伝子化した可能性がある。このように、チャの偽遺伝子化は食肉目では少なくとも7回独立して進化してきたと考えられる（図2A）。

一方、昆虫をよく食べるスカンク、ハイエナ、マングース、ミーアキャットを含むメフィト科、ハイエナ科、ヘルペスト科では、214Lと216Gの残基を持つ完全長キアORFを保存していた（図2A-D）。これらのことから、昆虫を食べない種はキアORFの一部を失い、昆虫を食べる種は全長のORFを維持し、高いキチン分解活性を持つ遺伝子産物をもたらしていることが強く示唆された（図2A-D）。

キアは昆虫食種で強いキチナーゼ活性を示す
上記では、肉食動物におけるキア遺伝子の保存性と摂食行動の関係を示した（図2）。タンパク質コード領域を持たないChia配列には、活性部位やCys残基の挿入、欠失、変異が見られた（補足図S7, Supplementary Material online）。

昆虫食の種では、Chiaタンパク質に保存された触媒モチーフ（DXXDXDXE）と12個の保存されたCys残基がある。さらに、これらの酵素は214位と216位にそれぞれLとG残基を持つ（マウス型）（図3A；補足図S2、S3、補足資料オンライン）。これまでの知見（Tabata, Kashimura, Kikuchi, et al. 2018）とチャの遺伝子構造から、食虫性チャのタンパク質は高いキチン分解活性を有すると予想された。この仮説を検証するため、5つの食虫性キアcDNA（バンドマングース、ミーアキャット、コモンコビトマングース、シマハイエナ、スカンク）を合成し、上記のように発現させた。すべての酵素はpH2.0で最も高い活性を示し、犬キタの4〜9倍の活性を示した（図3B）。これらの結果から、チャのキチン分解活性は食肉目グループの摂食行動と強く関係していることがさらに示唆された。

図3.
昆虫食の種は全長キチナーゼをコードしており、高いキチナーゼ活性を示す。(A)大腸菌で発現させたイヌと食虫植物のキアの模式図。C、活性型キア蛋白質に保存されているCys残基；FAまたはLG、キアの活性を制御したアミノ酸を以下のように色分けした：ピンク、マウス配列；青、イヌ配列。(B) 4-MU-(GlcNAc)2を用いたイヌ、バンドマングース、ミーアキャット、コモンモモンガ、シマハイエナ、スカンクのキア蛋白質のキチン・リリース活性を比較したもの。エラーバーは、3回行った実験の平均値±SDを表す。
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昆虫食の種は全長キチナーゼをコードしており、高いキチナーゼ活性を示す。(A）大腸菌で発現させたイヌと食虫植物チャの模式図。C、活性型キア蛋白質に保存されているCys残基；FAまたはLG、キアの活性を制御したアミノ酸を以下のように色分けした：ピンク、マウス配列；青、イヌ配列。(B) 4-MU-(GlcNAc)2を用いたイヌ、バンドマングース、ミーアキャット、コモンモモンガ、シマハイエナ、スカンクのキア蛋白質のキチン・リリース活性を比較したもの。エラーバーは3重で行った1回の実験の平均±SDを表す。

イヌ科におけるL214FおよびA216Gの置換時期の推定
イヌ科のチャでいつ不活性化置換が起こったかを推定するために、イヌ科の種から合計10個のチャの配列を分析した（図4A）。これらの配列はNCBI Geneデータベースから同定されたか、あるいはイヌアカを参照遺伝子としてNCBI GenomeデータベースまたはNCBI Sequence Read Archive (SRA) データベースから推定した（補足表S2およびデータファイル1、補足資料オンライン）。

図4.
イヌ科におけるChiaの不活性化置換イベントのタイミング。 (A)アウトグループ種を含む10種のイヌ科動物の系統樹。スケールバーはTimeTree version 3.0 (http://www.timetree.org/)から得た分岐時間（20Mya）を示す。(B)イヌ科動物とアウトグループChiaのエクソン7領域のアミノ酸配列。Chiaの活性を制御する214位と216位のアミノ酸を以下のように色分けしている：ピンクはマウス配列、青はイヌ配列。(C) WTリカオンキヤノン（WT-lycaon）とCys-lycaonと名付けられたキヤノン変異体タンパク質の模式図。(D) (C)で概説したキア蛋白質のキチン分解活性の比較。pH2.0におけるWT lycaon Chia活性レベルを100％としたときの相対活性を示す。エラーバーは、3連で行った1回の実験の平均値±SDを示す。イラストは田畑恵理氏に描いていただいた。
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イヌ科におけるChiaの不活性化置換イベントのタイミング (A)アウトグループ種を含む10種のイヌ科動物の系統樹。スケールバーはTimeTree version 3.0 (http://www.timetree.org/)から得た分岐時間（20Mya）を示す。(B)イヌ科動物とアウトグループChiaのエクソン7領域のアミノ酸配列。Chiaの活性を制御する214位と216位のアミノ酸を以下のように色分けしている：ピンクはマウス配列、青はイヌ配列。(C) WTリカオンキヤノン（WT-lycaon）とCys-lycaonと名付けられたキヤノン変異体タンパク質の模式図。(D) (C)で概説したキア蛋白質のキチン分解活性の比較。pH2.0におけるWT lycaon Chia活性レベルを100％としたときの相対活性を示す。エラーバーは、3連で行った1回の実験の平均値±SDを示す。イラストは田畑恵理氏に描いていただいた。

不活性化置換（F214とA216）は、灰色キツネ（Urocyon cinereoargenteus）を除くほぼ全てのイヌ科で保存されていることがわかった。灰色キツネでは216位にGlyが保存されていたが（活性型）、1つの置換で酵素活性が著しく低下したことから（補足図S4、補足資料オンライン）、現存のイヌ科の種ではチャが不活性であることが示された（図4B）。Urocyon属は現存するイヌ科動物の中で最も底辺に位置すると考えられている（Lindblad-Toh et al.2005）。したがって、Chiaはイヌ科の共通祖先において不活性化され、それは少なくとも13Ma前に起こったと考えられる。

また、我々はlycaon Chiaにおいて、上記のChiaの12個の保存されたCysに対する置換を見出した。最初のCysはSerに置き換わっており、酵素活性に影響を与えていた（図4C）。この可能性を検証するために、リカオン・キア（WT-lycaon）とCysに変異させた酵素（Cys-lycaon）を大腸菌で発現させ、上記のように酵素活性を測定した（図4C、補足図S1、S2、補足資料online）。WT-リカオンキアがキチナーゼ活性を示さなかったのに対し、Cys-リカオン酵素はWT-犬キアと同等の活性を示した（図4D, 補足図S3, Supplemental Material online）。この結果は、リカオンキアが以前の2つのアミノ酸置換の後にCysへの変異を受け、活性が低下していることを示唆している。

Cat Chia偽遺伝子の活性化により、キチナーゼ活性に必要な構造が明らかになった
Chiaがどのように偽遺伝子化されたかを明らかにするために、我々はcat Chiaの活性化を試みた。対応する Chia 偽遺伝子の ORF を、分子を「不正確な」塩基で工学的に復元した（我々はこれを created-cat または Cre-Cat Chia と名付けた）（図 5A；補足図 S2 および S3, オンライン補足資料）。Cre-Cat Chiaは可溶性タンパク質として発現したが、活性は示さなかった（図5B、左）。

図5.
祖先の活性を持つタンパク質からネコ型Chia偽遺伝子が進化した過程。(A）猫チャのコーディング領域と不活性化変異の位置を図式化したもの。ATG、開始コドン；indel、上の数字は削除された塩基の数を示す；X、停止コドン。Cre-cat、その遺伝子からORFを復元した機能的なChiaタンパク質の作成。C（黒）、哺乳類キチナーゼの中で保存されているCysの位置、C（青）、哺乳類キチナーゼの中で保存されている位置とは異なるCysの位置。FA、Chiaの活性を制御するアミノ酸であり、マウスの配列と同じである。Cys-cat、Cysの位置と数を復元した機能性Chiaタンパク質の創製。(B）（A）と（E）で概説したChiaタンパク質のキチン・リリース活性の比較。pH2.0におけるミーアキャットのキア活性レベルを100％としたときの相対的な活性を示した。エラーバーは、3連で行った1回の実験の平均値±SDを示す。(C) Chiaキメラタンパク質の責任領域の絞り込みの模式図。アミノ酸配列は以下のように色分けされている：ピンク、ミーアキャット配列；青、シスキャット配列。(D) (C)で概説したキア蛋白質のキチン分解活性と、ミーアキャットとCys-catキアとの比較。(E) Cys-cat-5 Mutと名付けられたChia変異タンパク質の模式図。(F) 猫のChia変異体タンパク質のホモロジーモデルは、先祖から活性のある酵素からのChia偽遺伝子の進化を示す。同定されたアミノ酸置換は赤色で色分けされている。
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猫用Chia偽遺伝子の先祖代々の活性型タンパク質からの進化過程。(A）猫チャのコード領域と不活性化変異の位置のグラフ表示。ATG、開始コドン；indel、上の数字は削除された塩基の数を示す；X、停止コドン。Cre-cat、その遺伝子からORFを復元した機能的なChiaタンパク質の作成。C（黒）、哺乳類キチナーゼで保存されているCysの位置、C（青）、哺乳類キチナーゼの間で保存されている位置とは異なるCys。FA、Chiaの活性を制御するアミノ酸であり、マウスの配列と同じである。Cys-cat、Cysの位置と数を復元した機能性Chiaタンパク質の創製。(B）（A）と（E）で概説したChiaタンパク質のキチン・リリース活性の比較。pH2.0におけるミーアキャットのキア活性レベルを100％としたときの相対的な活性を示した。エラーバーは、3連で行った1回の実験の平均値±SDを示す。(C) Chiaキメラタンパク質の責任領域の絞り込みの模式図。アミノ酸配列は以下のように色分けされている：ピンク、ミーアキャット配列；青、シスキャット配列。(D) (C)で概説したキア蛋白質のキチン分解活性と、ミーアキャットとCys-catキアとの比較。(E) Cys-cat-5 Mutと名付けられたChia変異タンパク質の模式図。(F) 猫のChia変異体タンパク質のホモロジーモデルは、先祖から活性のある酵素からのChia偽遺伝子の進化を示す。同定されたアミノ酸置換は赤で色分けされている。

次に、Chia分子におけるCys残基の保存性に注目した。マウス、ニワトリ、ブタ、マーモセットなどの雑食性動物のキアミノストロフィー酵素は高いキチン分解活性を示す。これらは、CatDとキチン結合ドメインに6つのCys残基を持つ。そこで、Chiaで保存されているこれら12個のCys残基が、キチン分解活性の回復に必須であると仮定した。Cysに対する4つの変異を補正し、Cys-Cat Chiaとして発現させたが、酵素は不活性のままであった（図5B、中）。この結果は、ジスルフィド結合を構成するCys残基だけでなく、タンパク質の構造や機能に関わるいくつかの未知のアミノ酸位置においても、機能的制約が緩和されていることを示している。

次に、ミーアキャットと猫のキメラ酵素を作り（図5C；補足図S2、S3、補足資料オンライン）、それぞれのキメラのキチン分解活性を解析し、猫チャのキチン分解活性消失の原因となる領域を上記と同様の方法で同定した。ミーアキャットのエクソン3-7と猫のエクソン8-11でコードされるキメラC1およびC2は、WTミーアキャットキアと同等の強いキチン分解活性を示した（図5D）。しかし、ネコのエクソン6-11では活性が低下した（キメラC3；図5D）。一方、キメラC4、C5、C6ではキチン分解活性は検出されなかった（fig. 5D）。これらの結果から、ネコジャラシのキチン分解活性を獲得するためには、エクソン3〜7をコードするN末端領域が必須であることが明らかとなった。

各エキソンの活性調節への寄与を明らかにするため、さらにミーアキャット-ネコキメラC7-C10を作製し（補足図S2、S3、S8、補足資料オンライン）、ミーアキャットのエクソン5および7領域がネコ酵素の活性化に関与していることを示した（補足図S8、補足資料オンライン）。次に、この活性化に関与するアミノ酸を絞り込むために変異体を構築した（補足図S2、S3、補足資料オンライン）。Cys-Cat-5 Mutと名付けた5つのアミノ酸置換体（エキソン5ではN118T、D143G、P158L、エキソン7ではP215H、G223A）（図5E、補足図S7、補足資料オンライン）は、pH2.0で最高の活性を示し、ミーアキャットの酵素の50％の活性を達成した（図5B、右）。この結果は、ORF破壊後に、タンパク質の構造や機能に関わるアミノ酸位置の機能的制約が緩和されたことを実験的に証明するものであった（fig. 5F）。

チア偽遺伝子では選択的制約が緩和されていた
以上の酵素実験から、食肉類は、1）昆虫を食べ、キアを維持している種（スカンク、ミーアキャット、マングース、ハイエナ）、2）昆虫を食べないが全長のキアを維持している種（犬）、3）昆虫を食べないがキアを失った種（フェレット、セイウチ、熊、猫など）に分けることができる。

上記3つのグループ間でChia遺伝子に対する選択的制約が異なるかどうかを検証するため、PAMLパッケージのCODEMLプログラム（Yang 2007）を用いて解析を行い、異なる枝に対するdN/dS比（ω）を推定した。以下の枝のモデルのデータへの適合性を評価した。1) ヌル1比率モデル（すべての枝で同じω値を仮定）、2) 2比率モデル（M2）、これは仮性遺伝子を持つ種（ωforeground）と機能性遺伝子を持つ種（ωbackground）について2つの別々のω値を推定したもの、3) 3比率モデル（M3）は、仮性遺伝子（ω1）、イヌ科（ω2）、食虫性枝（ωbackground）には異なるωが存在するとするもので、データへの適合性を評価しました。次に、尤度比検定（LRT）を用いてモデルの適合度を比較したところ、M2は尤度比検定（LRT）よりも有意に適合度が高かった。M2はM0よりも有意に適合度が高かった(χ2 = 94.7, P < 0.001)。偽遺伝子は機能遺伝子を持つ種のバックグラウンドω(ωbackground = 0.236)よりも3倍近く高いω(ωforeground = 0.711)を示し、純化選択の緩和が示唆された(表1)。しかし、M3はM2よりも優れた適応度を示さず（χ2 = 0.329, P = 0.566）、イヌ科と食虫科の間で機能的制約の強さに有意差がないことが示された（表1）。

表1.CODEMLの枝モデルによる緩和選択検定の推定パラメータ。
モデル ωバックグランド ωフォアグランド κ TL np log L LR P
M0(null):一枝モデル 0.507 0.507 2.96 4.06 94 -11,481 - -
M2:2枝クラス 0.236 0.711 2.97 4.08 95 -11,434 94.7 0.000
M3:3分岐クラス 0.221 ω1:0.711 2.97 4.05 96 -11,434 0.329 0.566
- ω2:0.260 - - - - - -
ω、非同義置換と同義置換の比率、ω1、偽遺伝子枝の前景、ω2、イヌ科枝の前景、κ、遷移・転移率、TL、木の長さ、np、パラメータ数、log L、log likelihood、P、M0対M2、M2対M3モデルにおけるLRTのP値。

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次に、RELAXに実装されている別のアプローチで、枝サイトモデルを用いて3つのωの値と分布を計算した（Wertheim et al.2015）。RELAXは、進化の過程で試験枝が基準枝に比べて淘汰が緩和されたか強化されたかを検定する。収束の大きさはパラメータkに依存し、これは選択が完全な緩和に向かうにつれてゼロになる傾向がある。予想に反して、この検定は、遺伝子が偽遺伝子化した種では、選択が緩和されたという仮説を支持しなかった（k = 1.02, P = 0.811, LR = 0.06, table 2, supplemental fig. S9, Supplementary Material online)。イヌ科と食虫科を比較した2番目の検定でも、イヌ科の枝に作用する選択制約に有意な変化は見られなかった（k = 1.18, P = 0.265, LR = 1.24, table 2, supplemental fig. S9, Supplementary Material online)。これらの結果から、イヌ科と食虫科の間では、チア遺伝子に対する選択強度に大きな差はないことが示唆された。

表2.RELAXを用いたリラックスセレクションの推定パラメータ
テストブランチ リファレンスブランチ モデル log L np k AICc LR P
偽遺伝子 機能性遺伝子 Null -11,250 115 1 - - - 0
Alternative -11,250 116 1.02 - 0.06 0.811
イヌ科 食虫類 Null -11,242 115 1 - - ・・・。
代替案 -11,242 116 1.18 - 1.24 0.265
k, 選択強度; AICc, サンプルサイズ補正した赤池情報量規準; P, 各検定におけるヌルに対する代替案の尤度比のP値。

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チア分子は食肉類の昆虫食の祖先から進化した
これまでの報告で、哺乳類の祖先は食虫類であることが明らかになっている。恐竜時代の終わりを告げる白亜紀-古第三紀境界∼65 Ma以降、これらの哺乳類は非昆虫食になった（O'Leary et al.2013; Emerling et al.2018 ）。この結果を踏まえて、昆虫食の祖先哺乳類から肉食動物へ、Chia遺伝子の構造と機能がどのように変化したかを推測した（図6）。スカンクやミーアキャットのような昆虫食の種は、昆虫由来のキチンを消化できる活性型のキアをまだ保持している（図6、上）。昆虫を餌とする種は、この遺伝子に強い機能的制約がある（Active-type Chia）。一方、昆虫を主食としない種では、Chiaは不活性化され、2つのグループに分かれた。無傷のChiaを持つ系統でも、イヌ科などの肉食系統では不活性型Chiaが存在し、食肉目におけるChiaの機能と食性との強い関連性が示唆された（不活性型Chia）（図6、中）。昆虫食以外の食性を持つ系統の多くでは、Chia遺伝子の機能的制約が緩和され、偽遺伝子化した（機能喪失型Chia；図6、下）。

図6.
食肉目におけるChia遺伝子の進化を説明するモデル。食虫類の祖先から食性の変化とともにChia遺伝子が進化していく様子を模式的に示したもの。昆虫を食べる種は、キチン分解活性の高いキアを保持する（活性型キア）。昆虫を食べない種では、遺伝子の構造や活性が変化している。イヌ科のキアの活性は、2つのアミノ酸の置換によって低下した（Inactive-type Chia）。イヌ科以外のキアヌは、機能的な制約が緩和され、停止コドンや活性を失う変異が蓄積することで、非機能的な遺伝子（機能喪失型キアヌ）へと進化してきた。
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食肉目におけるChia遺伝子の進化を説明するモデル。食肉目の祖先から食性の変化とともにChia遺伝子が進化していく様子を模式的に示したもの。昆虫を食べる種は、キチン分解活性の高いキア（活性型キア）を保持する。昆虫を食べない種では、遺伝子の構造や活性が変化している。イヌ科のキアの活性は、2つのアミノ酸の置換によって低下した（Inactive-type Chia）。イヌ科以外の種では、機能的な制約が緩和され、ストップコドンや活性の低下を引き起こす変異が蓄積し、非機能的な遺伝子へと進化した（機能喪失型Chia）。

考察
本研究では、マウスとイヌの配列からなるキメラタンパク質と変異型キアタンパク質を作成した。その結果、イヌのChiaを不活性化させる2つの重要なアミノ酸置換を見出した。31種の肉食動物において、キアはコード領域全体に変異が蓄積され偽性化した。また、スカンク、ミーアキャット、マングース、ハイエナなどの昆虫食の種では、高活性な酵素が保存されたシステイン残基を持つ完全なORFが保存されていることが確認された。

犬は最初に家畜化された動物の一つであり、少なくとも15,000年前から存在している（Pang et al.2009、Skoglund et al.2011）。高レベルのデンプン摂取につながる食事の変化は、犬のゲノム署名（Axelsson et al. 2013）および腸内細菌叢の組成（Lyu et al. 2018）に大きな影響を与えたが、活性を失った犬チャのタンパク質配列は、キツネおよびオオカミのものとそれぞれ98%および100%の同一性を依然として示している。これは、犬の家畜化によって昆虫の摂取量が増えず、食性が肉食から雑食に変化したためと考えられる。しかし、昆虫の消化に依存しないのであれば、なぜチア遺伝子の配列が保存されているのだろうか。dN/dS比に基づく進化解析では、イヌ科（ω2 = 0.260）と食虫科（ωbackground = 0.221）の間でチア遺伝子に対する選択の強さに差は見られなかった。これらの結果から、我々は2つの可能性を考えた。1つ目は、Chiaの消失が生存に不利になるシナリオである。イヌ科は他の肉食動物と異なり、別の活性型キチナーゼ遺伝子（キトトリオシダーゼ、Chit1）を完全に失っており、消化以外の目的でもChiaの活性維持が不可欠であった。キチンはダニやカビなどの病原体にも存在するため、キアは生体防御に関与している可能性がある（Van Dyken et al.2017）。もう一つのシナリオは、この系統ではChiaの進化は比較的最近起こったもので、ORFの劣化はまだ起こっていない、というものである。イヌ科Chiaの機能的制約が緩和されていないにもかかわらず、遺伝子の機能部位に変異が発生したのである。特にリカオン（L.pictus）にはCysからSerへの変異があり、酵素活性が失われている。これらの結果は、この系統でチャの機能的制約が緩和されたことを示しているのかもしれない。

食肉目では、進化の初期に肉食性の歯を進化させ、雑食性を可能にした。その後、食肉目はイヌ科（スカンクなど）とネコ科（ミーアキャットなど）の2つのグループに分かれた。スカンクとミーアキャットはともに昆虫食で、活性型キアヌを持つことから、初期の肉食動物ではキアヌは活性型を維持していたことが示唆される。その後、食性のニッチを昆虫に拡大した種は、現在に至るまでキアの活性型を保持するための強い選択圧を受け続けている。

特定の食餌や環境変化に関連した遺伝子の損失に関する報告は多く発表されている（Koike et al. 2007; SharMa et al. 2018; Hecker et al. 2019）。しかし、これらの遺伝子がどのように機能を失ったかを理解するために、その機能を回復させることを試みた研究はほとんどない。私たちは以前、ヒトCHIAの不活性化因子を機能回復させることで同定しました（Okawa et al.2016）。また、別の研究では、機能的に復元されたヒト特異的苦味受容体偽遺伝子がチンパンジーの機能的オルソログと異なることを示しました（Risso et al.） さらに、ペチュニアセクレタ転写因子AN2偽遺伝子の活性化により、ペチュニアの色彩進化における役割が明らかになりました（Esfeld et al.2018）。ここでは、猫チア偽遺伝子を復元し、ORFの破壊に加えて、Cys-変異と5つのアミノ酸置換により、酵素が活性を失っていることを明らかにした。これらの変異のいくつかはネコ科に共通していたことから、この系統ではまずORFやCys残基が失われ、その後、機能的制約の関係からChia活性に影響を与える残基がさらに変異を蓄積していった可能性がある。本アプローチは、遺伝子欠損が遺伝的変化の広範なソースであり、進化の多様性を促進する大きな可能性を持つという新たな視点を提供するものである。

Chiaの発現および／または活性レベルは、喘息やアレルギー性炎症などの様々な疾患において顕著に変化している（Zhu et al.） キア欠損マウスは、環境由来のキチンを気道に自発的に蓄積し、加齢に伴う肺線維症を発症するが、キチナーゼ活性の回復により改善することができる（Van Dyken et al.2017; Van Dyken and Locksley 2018）。一方、ヒトは肺のキアレベルと活性が著しく低い（Ohno et al.2013; Okawa et al.2016）。Chiaの特定の多型およびハプロタイプは、ヒトの気管支喘息と関連している（Bierbaum et al. 2005; Seibold et al. 2009; Okawa et al. 2016）。このような観点から、キチンの蓄積を防ぐ、あるいは肺の炎症を抑えるためには、活性型Chiaの作製が不可欠である。近年、肺キチナーゼ活性の補充を目的とした高活性マウスChiaが誤りやすいPCRを用いて作製されている（Barad et al.2020）。我々は、マウスで保存されている2つのアミノ酸残基を置換することで、犬Chiaを活性化することに成功した。このような遺伝子活性化のアプローチは、一部の医療分野にも応用できる可能性がある。

肉食動物キアの解析から、食虫性の種では機能的なキアが保持され、食虫のいない種では酵素が不活性な分子に分解されることが明らかになった。さらに、この不活性化プロセスには2つのモードがあることを明らかにした。第一に、アミノ酸の置換によってChiaが不活性化される（イヌ科型）。第二に、Chiaの機能的制約が緩和され、より劇的な遺伝子改変によってタンパク質コード領域が破壊される（非イヌ科型）。本研究で得られたコンセプトは、哺乳類の進化史の理解に不可欠な情報を提供するものである。

材料と方法
発現ベクター、キメラタンパク質、変異タンパク質cDNAの調製
大腸菌 BL21 (DE3) (Merck Millipore, Tokyo, Japan) において Staphylococcus aureus Protein A promoter によって駆動される pEZZ18 を用いて、Chia を Protein A-Chia-V5-His との融合タンパク質として発現させた。今回、T7プロモーターシステムを用いてpEZZ18からpET22bにプロモーター系を変更し、マウスおよびイヌChiaタンパク質、キメラタンパク質、変異タンパク質を発現させた。

イヌChiaをpre-Protein A（PA）とV5-Hisとの組換え融合タンパク質（pEZZ18/PA-dog Chia-V5-His; Tabata, Kashimura, Kikuchi, et al.2018 ）として発現させた。本報告では、PA-dog Chia-V5-Hisおよびその誘導体のキメラあるいは変異タンパク質をT7プロモーターシステムを用いてpET22bで発現させた（pET22b/PA-Chia-V5-Hisとする）。pET22b/PA-Chia-V5-Hisを以下のように構築した。Protein A-dog Chia-V5-Hisをコードする領域は、KOD Plus DNA polymerase (Toyobo, Kyoto, Japan) とNdeIとSalIの制限サイトを持つプライマー (Eurofins Genomics, Tokyo, Japan) によるPCRによってpEZZ18/PA-Chia-V5-Hisから増幅された。フォワードプライマー（5′-GGAGATACATGAAAAAACATTTATTCAAT-3′）にはEcoRI認識配列（下線）と24塩基長のプロテインA領域とその細胞外分泌用シグナル配列が含まれている。リバースプライマー（5′-CATGCCTGCAGGTCGACTAGAAAGTCGAGGCTGATCA-3′）は、SalI制限部位（下線）を含み、pcDNA3.1/V5-His C vector（http://tools.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pcdna3_1v5hisc_seq.txt、最終アクセス2021年11月24日）の1，080-1，106ヌクレオチドに相補的である。どちらのプライマーも、アンプリコンの末端近くで効率的に切断するために、9または11塩基長の余分なヌクレオチド（太字）を含んでいる。PCR産物はWizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, USA)を用いて精製し、NdeIとSalIで消化した。切断されたDNA断片を1.5%アガロースゲルから精製し、pET22b発現ベクターのNdeIおよびXhoI部位にサブクローニングした。得られたpET22b/PA-dog Chia-V5-Hisの全塩基配列はシークエンス（Eurofins Genomics社）により確認された。

pEZZ18/PA-mouse Chia-V5-HisをEcoRIおよびXhoIで消化した。切断されたDNA断片を精製し、同様に消化したpET22b/PA-dog Chia-V5-Hisにサブクローニングし、pET22b/PA-mouse Chia-V5-Hisを作製した。他のプロテインA-マウスChia-V5-His DNAも以下に述べるように、同様にクローニングした。

キメラタンパク質の構築
マウス/イヌのキメラタンパク質を構築した。両分子はヌクレオチドレベルで類似したエクソン構造を持っているので、エクソン3-5、エクソン6-7、エクソン8-10、エクソン11間の接合部で2ユニット融合した（補足図S1、表S3、S4、補足資料オンライン版）。

キメラC1、C2、C3の構築は以下のように行った：C1、C2、C3の5′-部分は、プロテインA_Fw_2533とMu_Dog_C1_Rv（C1）、Mu_Dog_C2_Rv（C2）、またはMu_Dog_C3_Rv（C3）を用いてpEZZ18/プロテインA-マウスキアV5-his（マウスバージョン）より増幅されたものであった。3′部は、pEZZ18/Protein A-dog Chia-V5-His (犬バージョン)から、Mu_Dog_C1_Fw (C1)、Mu_Dog_C2_Fw (C2) or Mu_Dog_C3_Fw (C3), Sal_BGH_Rvとした。得られた断片を精製、混合し、プロテインA_Fw_2533とSal_BGH_Rvを用いたPCRにより増幅した。増幅されたcDNAをEcoRIとXhoIで消化し、pET22b-Protein A-V5-Hisベクターにクローニングし、pET22b/PA-Chimera-V5-Hisを作製した。

その他のキメラも鋳型とプライマーの組み合わせにより（補足表S3、S4、補足資料オンライン）、基本的に上記のように作製した。

キア変異体タンパク質の調製
Chia変異体タンパク質を、既述のプライマーを用いたPCRにより調製した（Okawa et al.2016）。まず、塩基置換を行ったフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、最終産物の5′-と3′-からなる2つの断片を増幅した（補足表S3およびS4、補足資料オンライン）。この断片をゲル精製し、混合し、プロテインA_Fw_2533とSal_BGH_Rvを用いたPCRにより増幅した。増幅されたcDNAをEcoRIとXhoIで消化し、上記のようにpET22b/PA-V5-Hisベクターにクローニングした。

このプラスミドDNA（pET22b/PA-Chia-V5-His）を用いて、大腸菌BL21（DE3）を形質転換し、PA-Chia-V5-Hisタンパク質を発現させた。形質転換した大腸菌を100μg/mLアンピシリンを含む250mLのLB培地で37℃、18時間培養した。0.1mMイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドで誘導後、更にLB培地で2時間培養した。6,500 × g、4 ℃、20 分間の遠心分離により細胞を回収した。組換えタンパク質を大腸菌から調製し、先に記載したようにIgGセファロース（GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA）クロマトグラフィーによって精製した（Kashimura et al.2013）。タンパク質含有画分を、TS緩衝液（20 mM Tris-HCl（pH 7.6）、150 mM NaClおよびプロテアーゼ阻害剤［Complete、Roche、Basel、スイス］）で平衡化したPD MidiTrap G-25（GE Healthcare）を用いて脱塩した。組換え産物は、抗V5-HRPモノクローナル抗体（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いたウェスタンブロットにより検出した。

キチナーゼ酵素アッセイ
キチン分解活性は、合成蛍光基質である4-MU-(GlcNAc)2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) を用いて、先に述べたように測定した (Kashimura et al. 2013)。遊離した4-メチルウンベリフェロンの蛍光は、GloMax Discover Multimode Microplate Reader (Promega) を用いて、励起波長365 nm、発光波長445 nmで測定した。

至適 pH の決定には、0.1 M Gly-HCl バッファー (pH 1.0-3.0) または McIlvaine's buffer (0.1 M citric acid and 0.2 M Na2HPO4; pH 2.0-8.0) 中で酵素と 4-MU-(GlcNAc)2 基質を 37℃で 30 分インキュベートしてキチナーゼ活性を評価し た。

塩基配列の解析
NCBI Genome Databaseの肉食動物36種の全ゲノムアセンブリとSRA databaseのイヌ科6種の塩基配列データに対して、犬のChia遺伝子配列（XM_038667732.1）をクエリとしてBLAST検索を実施した。これらの配列に加えて、GenBankで公開されているV.vulpes、Suricata suricatta、Hyaena hyaenaの注釈付き遺伝子配列も使用した。GenBankのアクセッション番号と推論されたChiaの塩基配列は、補足表S1、S2およびデータファイル1、補足材料オンラインに記載されている。アウトグループとして非肉食哺乳類（Mus musculus, Callithrix jacchus, Sus scrofa, Bos taurus）から追加の遺伝子モデルを入手し、すべての配列をMEGA X (Kumar et al. 2018) に取り込み、MUSCLEアルゴリズム (Edgar 2004) でアライメントを実施した。食肉目におけるChia遺伝子の進化関係を最尤法で推定したが、この木は確立された木と不整合であった（補足図S5、補足資料オンライン）。

分子進化解析
PAMLのCODEMLプログラム（Yang 2007）とHyPhy version 2.22 (Wertheim et al. 2015)に実装されたRELAXを用いて、非同義と同義の塩基置換比（dN/DSまたはω）の変動に基づく遺伝子の選択的強度解析を実施した。これらの解析では、挿入、欠失、または置換を切除することにより、偽遺伝子配列から早発停止コドンを除去した（補足データファイル2、補足資料オンライン）。46種の肉食動物とマウス（アウトグループ）の系統関係は、TimeTree（http://www.timetree.org/、最終アクセス2021年11月24日；Kumar et al. 2017）を用いて推論した。

CODEML解析では、フォアグラウンドブランチとバックグラウンドブランチでωが異なると仮定したブランチモデルを使用した。テストしたブランチを以下のようにラベル付けした。1）ヌル1比率モデル（M0）、これはすべてのブランチで同じω値を仮定する、2）2比率モデル（M2）、ここでは2つの別々のω値が、偽遺伝子を持つ種（前景ブランチ）と機能遺伝子を持つ種（背景ブランチ）について推定される、3）3比率モデル。3）3比率モデル（M3）。偽遺伝子を持つ種（前景枝_1）、イヌ科の機能性遺伝子を持つ種（前景枝_2）、食虫類の機能性遺伝子を持つ種（背景枝）は、異なるωを持つことが許される。その適合度は、LRTを用いて解析した。

また、RELAXを用いて、コドンベースの系統樹の枠組みでChia遺伝子に対する弛緩した選択を検出した。RELAXは一方の集合と他方の集合を比較して選択強度を検定する。この解析では、枝の2つのカテゴリーを以下のように設定した。1) 偽遺伝子の枝とそれ以外の枝、2) イヌ科の枝と食虫科の枝である。RELAXは各セットについて、ωの分布をランダム効果枝サイトモデルを用いて推定し、選択パラメータkを当てはめる。k > 1で選択が強まり、k < 1で選択が緩和されることを示す。2つのモデルの適合度は、kパラメータを1に拘束したヌルモデルと比較して、LRTで解析した。

補足資料
補足資料はMolecular Biology and Evolution onlineに掲載されています。

謝辞
澤晃、石井一浩、大川和明、木村昌宏、上原麻衣子、鈴木英俊、鈴木啓太、佐孝巧、菊池梓、澤村直也、南雲信治、佐藤光信、今村康忠に貴重なご指摘とご鞭撻をいただきました。

本研究は，日本私立学校振興・共済事業団科学研究振興費補助金（F.O.），日本学術振興会科学研究費補助金（課題番号21J30001），工学院大学科学技術研究所プロジェクト研究助成（F.O.）の支援を受けて行われた．

筆者らの貢献
プロジェクトの設計、調整。E.T.、P.O.B.、F.O.、研究実施。E.T.、T.K.、H.T.、A.K.、F.O. データ解析。E.T., A.I., and M.S. Wrote the paper: 論文執筆：E.T., V.M., P.O.B., F.O. 論文の批評に貢献し、最終版を承認した。E.T.，A.I.，T.K.，H.T.，A.K.，M.S.，V.M，P.O.B，および F.O.

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