ユビキタス海洋細菌の超高親和性輸送タンパク質

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ユビキタス海洋細菌の超高親和性輸送タンパク質



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概要

SAR11細菌は表層海洋で最も豊富な微生物1であり、地球規模の生物地球化学的重要性を持っている2,3,4。競争の激しい貧栄養環境で繁栄するために、これらの細菌は、膜輸送体を介して特定の基質の取り込みを促進する溶質結合タンパク質に大きく依存している5,6。これらの輸送タンパク質の機能と特性は、海洋における溶存有機物の同化と栄養塩の生物地球化学的循環における重要な因子であるが、これまで実験的な研究はほとんど行われてこなかった。本研究では、SAR11細菌の原型となる溶質結合タンパク質のゲノムワイドな実験的解析を行い、SAR11細菌の貧栄養環境での成功に寄与する特異的な機能とその特性の一般的傾向を明らかにした。その結果、SAR11細菌の溶質結合タンパク質は、極めて高い結合親和性（解離定数＞20 pM）と高い結合特異性を持つことがわかり、貧栄養環境適応の分子メカニズムが明らかになった。我々の機能データは、SAR11バクテリアの新たな炭素源を発見し、海洋全域におけるSAR11バクテリアの基質取り込み能力の正確な生物地理学的解析を可能にした。本研究により、ユビキタス海洋細菌の基質取り込み能力を包括的に把握することができ、海洋生態系における溶存有機物の同化への貢献を理解する上で必要な基盤が得られた。

主な内容

太陽光が降り注ぐ表層海洋は従属栄養細菌プランクトン、特にアルファプロテオバクテリア（Pelagibacterales）のSAR11クレードに属する細菌プランクトンによって支配されている2。SAR11細菌は世界的に分布し、表層海洋の原核細胞の20-45％、バイオマスの約18％を占め、世界的な個体数は2.4×1028個と推定されている1,7。貧栄養環境に適応した他の細菌と同様、SAR11細菌はサイズが小さく（細胞体積は0.02-0.06 µm3）8、ゲノムが極めてスリム（1.2-1.4 Mb）で、代謝の多様性は限られている2,9,10。SAR11細菌は、炭素、窒素、硫黄、リンの要求量を満たすために、主に溶存有機物（DOM）の取り込みに依存しており、低分子量のDOMを非常に活発に消費し、表層海洋におけるアミノ酸、タウリン、グルコース、ジメチルスルホニオプロピオン酸（DMSP）の同化の30〜60％を占めている3,11,12,13,14,15。例えば、メタン3やジメチルスルフィド4などの気候活性ガスを生成したり、溶存有機炭素16（DOC）の呼吸を通じて生物学的炭素ポンプから炭素を迂回させたりする。このように、SAR11細菌の生理学と代謝能力を理解することは、海洋生態系を理解する上で極めて重要である。

図1: ユビキタスSAR11細菌は、SBP依存性トランスポーターを用いて海洋からDOMを取り込み、海洋循環において重要な役割を担っている。

CaのSBP依存性トランスポーターを示すSAR11細菌の模式図。P. ubique HTCC1062のSBP依存性トランスポーターと炭素、窒素、硫黄代謝の主要経路との関係を示す。SBPリガンドとして同定された代謝物は、青、アミノ酸およびその誘導体、赤、炭素源、黄、含硫代謝物、オレンジ、C1源、紫、無機イオンで色分けされている。代謝経路は、ここで提案した反応（Extended Data Fig. 28,29,42,44,56,57. [C1]は、THF結合酸化経路でCO2に酸化されたC1ユニットを示す。示したABCトランスポーター構造は、大腸菌由来MalEFGK2のX線結晶構造（Protein Data Bank (PDB)2R6G）であり、TRAPおよびTTT構造を代表する構造は、Haemophilusinfluenzae由来TRAPトランスポーターSiaPQMのモデルである58。DMS、ジメチルスルフィド；グルコース-6P、グルコース-6-リン酸；MMPA、メチルメルカプトプロピオン酸；PEP、ホスホエノールピルビン酸；リブロース-5P、リブロース-5-リン酸；THF、テトラヒドロ葉酸；TMAO、トリメチルアミン-N-オキシド。図の一部はBioRender.comで作成。

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SAR11細菌は、貧栄養の海洋環境で栄養素を奪い合うため、特定の成長基質の取り込みを促進する溶質結合タンパク質（SBP）に大きく依存している。SBPは3つの膜輸送系ファミリーに関連している： ATP結合カセット（ABC）トランスポーターは、バクテリアにおいて最も豊富な高親和性基質取り込み系を代表し、また三分割ATP非依存性ペリプラスム（TRAP）トランスポーターや三分割トリカルボン酸トランスポーター（TTTs）17,18もある。グラム陰性菌では、SBPはペリプラスムで基質と高い親和性で結合し（解離定数（Kd）値は通常ナノモルからマイクロモルの範囲）、ATP加水分解（ABCトランスポーター）または電気化学的勾配（TRAPとTTTトランスポーター）との結合によって駆動される濃度勾配に逆らって内膜を横切る基質の移動を促進する膜貫通タンパク質複合体に基質を送達する。高親和性基質取り込みにおけるSBP依存性トランスポーターの生理的重要性と一致して、SAR11細菌は、その流線形のプロテオームの大部分をSBPに費やしている5,6; 例えば、サルガッソー海の環境サンプルのメタプロテオーム解析において、SBPはSAR11由来のスペクトルの約67%を占めていた5。

表層海洋におけるSAR11バクテリアの高い存在量1,7と基質取り込み活性3,11,12,13,14,15、およびこれらのバクテリアにおけるSBP依存性トランスポーターの存在量5,6から、SAR11バクテリアの少数のトランスポートタンパク質が、表層海洋における低分子量DOMの主要成分のグローバルな同化に大きく寄与していることが示唆される。しかし、これらのトランスポーターの特性や特異的な機能（すなわち、輸送される代謝産物）についてはほとんど不明であるため、SAR11細菌が同化できるDOMの全範囲、海洋微生物群集内の栄養交換、高親和性基質取り込みの分子メカニズムに関する知見は限られている。相同性に基づく予測は可能であるが、タンパク質の機能予測は、特にABCトランスポーターやTRAPトランスポーターのような機能的に多様なタンパク質スーパーファミリーについては、精度に限界がある19,20,21。トランスポートタンパク質は、培養細胞における基質取り込みのラジオアッセイによって実験的に特性評価することも可能であり、このアプローチはSAR11細菌'Candidatus(Ca.) Pelagibacter ubique'の広範な特異性を持つ浸透溶質トランスポーターの特性評価に用いられている22。しかし、増殖が遅く、気の早いSAR11細菌の培養は困難であるため、SBP依存性トランスポーターのハイスループットな特性解析には困難なアプローチである。さらに、SAR11菌は遺伝学的に難解であるため、観察された輸送活性を特定のトランスポーター遺伝子と関連付けることができず、得られた生理学的データを既存のマルチオミクスデータセットと統合して、輸送活性の広範な地球化学的・生態学的意義を明らかにすることが制限される。このようなin vivoアプローチの限界を考慮すると、SBPの異種発現、精製、生化学的特性評価に基づく異種アプローチが、SAR11細菌におけるSBP依存性トランスポーターの機能と特性を解明するための効果的な代替戦略であるという仮説を立てた。このアプローチは、SBP依存性トランスポーターによる基質取り込みの特異性と親和性が、主に対応するSBPの結合特異性と親和性によって決定されるという事実に支えられており23、新しい代謝経路を発見するための貴重な方法であることが証明されている24,25。

ここでは、この方法を用いて、SAR11の原型菌であるCa. P.ubiqueのHTCC1062株である。ハイスループット・スクリーニングと厳密な構造および生物物理学的特性解析を併用することで、これらのトランスポーターの大半の機能を同定した。相同性に基づく機能予測の改訂により、グローバルな海洋メタゲノムおよびメタトランススクリプトームデータセットにおけるSAR11トランスポーターの存在量のパターンを正確に解釈し、SAR11バクテリアの新たな輸送能力と潜在的な炭素源を同定することができた。特に、C4およびC5ジカルボン酸に対する高親和性で広範な特異性を持つトランスポーターを同定した。このトランスポーターは、SAR11の生態型間で広く見出され、メタゲノムおよびメタトランススクリプトームデータセットに豊富に分布していることから、これらのジカルボン酸が生理学的に重要な炭素源であることが示唆された。最後に、非常に高い結合親和性、中程度の高い結合特異性、限られた機能的冗長性など、SBPの特性における系統的な傾向を明らかにすることで、貧栄養海洋環境におけるSAR11バクテリアの進化の成功についての知見を得ることができた。

SAR11 SBPsの機能プロファイリング

ゲノム解析により18個のSBPを同定した。P. ubique HTCC1062株のゲノム解析から18のSBPを同定した（Methods, Supplementary Table1）。これらのSBPはSAR11細菌全体に広く見いだされ、逆にSAR11細菌全体に豊富に存在するSBPのほとんどがこの株で発現している（Extended Data Fig.1）。これらのSBPのほとんどが、培養細胞および／または環境中のSAR11細胞で発現していることは、プロテオーム解析5,6によって以前に証明されている（補足表2）。SBPのうち14種類は、大腸菌BL21(DE3)株またはSHuffle T7株での異種発現により可溶性タンパク質を産生し、精製に成功した。残りの2つのSBP（SAR11_0271*およびSAR11_1346*）は、別のSAR11株（'Ca. Pelagibacter' sp. HIMB1321）から発現させ精製することができたが、残りの2つのSBP（SAR11_0266およびSAR11_1290）は、どのような条件下でも可溶性で発現させることができず、不溶性物質からin vitroでリフォールディングすることもできなかった（Methods）。SBPのうち2つ、SAR11_1179とSAR11_1238は、バクテリアに広く存在し、それぞれリン酸塩と鉄(III)という高い特異性で無機溶質と結合するタンパク質であると予測された。したがって、これら2つのタンパク質の機能予測は、ハイスループットスクリーニングではなく、示差走査蛍光測定（DSF）と等温滴定熱量測定（ITC）（SAR11_1179; Extended Data Fig.

残りのケースでは、各SBPの暫定的な機能は、まずDSFによる代謝物ライブラリーのハイスループットスクリーニングによって同定された。まず、一般的な炭素、窒素、リン、硫黄源を含む約330種類のユニークな代謝産物からなる市販の代謝産物ライブラリー（補足表3に全リスト）に対して、DSFで標的タンパク質をスクリーニングした。この代謝物ライブラリーに、Ca. P.ubiqueおよび他の海洋細菌26,27,28,29にとって重要であることが知られている代謝物（例えば、浸透溶質、スルホン酸塩、ビタミン誘導体）、またはSBP機能の計算アノテーションに基づいて潜在的なリガンドであると考えられた代謝物（例えば、オピン）を手作業でキュレーションした。DSFによってタンパク質の融解温度（ΔTM）が少なくとも2℃上昇した代謝物は、潜在的なリガンドであると考えられた（補足表4）。次に、得られたヒットの中から代表的なサブセットを選択し、各リガンドを一定濃度（10 mM）でDSFを繰り返すことにより、このサブセットのリガンドの標的タンパク質への結合を確認し、ランク付けを行った（図2）。最後に、観察されたTMの増加が、非特異的なタンパク質の安定化ではなく、特異的で高親和性のタンパク質-リガンド相互作用の結果であるというさらなる証拠を得るために、様々なリガンド濃度でDSF実験を繰り返した（補足図1）。このワークフローを用いて、15個のSBP、すなわちSAR11_1068を除く、発現と精製が可能なすべてのタンパク質について、暫定的な機能が同定された。我々は以前、SAR11_1068 が注釈付き機能（シクロヘキサジエニルデヒドラターゼ活性）を持たないことを示し、その機能を同定するための広範な努力を報告したが、結局失敗に終わった30。本研究では、このタンパク質をさらにハイスループットスクリーニングにかけたが、リガンド候補は同定されなかった。

図2：Ca. P. ubique HTCC1062は、様々なレベルの結合特異性を持つSBPを持っている。

10mMのリガンド存在下、DSFにより変性温度（ΔTM）の変化を測定した。10mMの濃度でTMの有意な上昇（≥2℃）をもたらしたリガンドを示す。ITCで確認されたタンパク質-リガンド相互作用には、測定された相互作用のKd値を付した。列は個々のデータポイントとして示した2つのテクニカルレプリケートの平均を表す。ITCによって高親和性リガンドが確認されたタンパク質のみが示されている。DSFの結果はin vitroでの有意なタンパク質-リガンド相互作用のみを示す。これらの相互作用が生物学的に重要かどうかは、結合親和性とリガンドの環境濃度に依存する。ダガーは文献31からの値であることを示す。DHPS、2,3-ジヒドロキシプロパン-1-スルホネート；GABA、γ-アミノ酪酸。

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次に、観察されたタンパク質-リガンド相互作用の生理学的妥当性を確立するために重要な結合親和性の正確な定量を可能にするため、各SBPの機能をITCで確認した。通常、各タンパク質に対して2～5個のリガンドについて滴定を行い、合計32個のタンパク質-リガンド相互作用を行った。あるタンパク質のDSF実験で同じようなΔTM値が得られるタンパク質-リガンド相互作用は、結合親和性も似ているという仮定に基づいて、より広い範囲のリガンドについて結合親和性を推定できるように、ΔTM値の範囲のリガンドを選択することを目指した。ITCを用いて、DSFで同定されたタンパク質-リガンド相互作用のほとんどを検証することができ（図2、補足図2、補足表5）、SAR11_0271*とSAR11_0797を除く各SBPについて、少なくとも1つの高親和性リガンド（Kd< 500 nM）を同定することができた（補足注1）。SAR11_1302 と TMAO の相互作用は、本研究の進行中に ITC により確認された31。このように、DSFとITCのデータを総合すると、18個のSAR11 SBPのうち13個がCa. P. ubique HTCC1062の18個のSAR11 SBPのうち、13個のSAR11 SBPが結合機能を持つと確信できた（図1および補足表6）。さらに、X線結晶構造解析やガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）を用いたメタボロームスクリーニングアプローチ24に基づいて、6つのSBPの機能解析を裏付ける証拠を得ることができた（Extended Data Fig.） さらに、既知のCa基質と結合するSBPが同定されたことで、提案された結合機能の生理学的妥当性が強調された。P. ubique HTCC1062の既知の基質であるアミノ酸、d-グルコース、DMSP、タウリンなどと高い親和性で結合するSBPが同定されたこと3,11,12,13,14、また、表層海域で測定されたこれらの基質濃度が、対応するSBPのKd値の測定値を上回ることが多いことである（補足注3および補足表7）。

Ca. P. ubique HTCC1062のSBPは著しく高い結合親和性を示し、複数のSBPのKd値は20-30 pMと低かった（図3a,b）。13個のSBPのうち7個はKd値が5 nM未満であり、直接ITC実験の定量限界以下であった。したがって、これらの相互作用の正確なKd値を得るために、競合的ITC結合実験も行った（補足表5）。SAR11_1210の場合、競合リガンドとしてd-オクトピンの存在下、l-アルギニンとの滴定を行ったところ、l-アルギニンに対するKd値は10 pMから100 pMの間であったが、d-オクトピンの濃度が異なると結果は変動した（補足データ1）。そこで、この相互作用の親和性の高さを確認するために、SAR11_1210を、すでに特徴的なアルギニン結合タンパク質であるSalmonella enterica由来のArgT（Kd= 15 nM）と混合し、l-アルギニンで滴定したタンパク質間競合実験も行った。得られたデータを2-sets-of-sites結合モデルに当てはめると、SAR11_1210とl-アルギニンとの相互作用のKdは32 pMとなった（図3c）。また、SAR11_1210とl-アルギニンとの複合体の結晶構造を解析したところ、リガンドとSBPの2つのα/βドメインをつなぐ柔軟なヒンジ領域との直接相互作用を含む特異な結合様式が示され、高い結合親和性の構造的基盤の可能性が示唆された（図3e、Extended Data Fig.） 最後に、SAR11_0769の場合、d-グルコースとの滴定により、二相性の結合等温線が再現性よく得られた（図3d）。これは、β-d-グルコースと複合体化したSAR11_0769の結晶構造（図3f、Extended Data Fig.） ITCデータを競合結合モデルに当てはめると、高親和性アノマーのKdの上限値（親和性の下限値）は約27 pMと推定された。文献データ（n= 206 SBP）を系統的に調査した結果、有機溶質に対するSBPのKd値の典型的な範囲は10-1,000 nMで、下限は200-400 pMであることが明らかになった（log10Kd値 -6.76±1.15（平均±s.d.）、図3a）。これらの結果から、SAR11細菌に含まれるSBPの一部は、有機溶質に対するSBP親和性のこれまで確立されていた限界値を超えていることが明らかになった。

図3：Ca. P. ubique HTCC1062由来のSBPは超高結合親和性を示す。

a,Ca. P.ubique HTCC1062由来SBPのKd値の比較。P. ubique HTCC1062由来SBPのKd値と、これまでに文献で報告されている細菌由来SBPとの比較（n= 206; Supplementary Data2）。SBPが複数のリガンドと結合する場合は、最も親和性の高いリガンドのデータを示す。Kd< 5 nMのSBPは赤い網掛けで強調表示した。b,Ca.P.ubiqueの各SBPの最高親和性相互作用のKd値。P. ubique HTCC1062から得た各SBPの最高親和性相互作用のKd値。SAR11_0655とSAR11_0769の値はKdの上限（親和性の下限）を表す。棒グラフは2-5テクニカルレプリケート（独立した滴定）の平均を表し、個々のデータポイントとして示されている。c,d,競合ITC実験を用いた高親和性相互作用の結合パラメータの決定。データフィッティングはMicroCal PEAQソフトウェアで行った。c, SAR11_1210とSeArgTのl-アルギニンによる同時滴定。d, SAR11_0769とd-グルコースとの滴定、二相性の結合曲線を示す。データは4反復（別々の滴定）の代表値。e, SAR11_1210の結晶構造におけるl-アルギニンの結合様式（1.32Å分解能）f, SAR11_0769の結晶構造におけるd-グルコースの結合様式（1.86Å分解能）。

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輸送遺伝子の機能の再解釈

各SBPの実験的に決定された機能と相同性に基づいた予測との比較から、予測の精度は低いことが示された（補足表6）。SAR11_0807, SAR11_1179, SAR11_1203, SAR11_1238の4つのタンパク質の結合特異性は、それぞれタウリン、リン酸、クエン酸、鉄(ⅲ)と正しく予測された。SAR11_0769, SAR11_0953, SAR11_1346 の糖結合タンパク質、一般アミノ酸結合タンパク質、分岐鎖アミノ酸結合タンパク質の予測は大まかに正しかったが、実験的な特徴づけにより特定のリガンドを同定することができた。対照的に、検証可能な15個の機能的注釈のうち7個は不正確であった。このうち5個は結合特異性を実験的に決定することができた。例えば、SAR11_1336（potDによってコードされている）は、スペルミジンまたはプトレシン結合タンパク質とアノテーションされていたが、グリシンベタイン、DMSP、その他の浸透溶質に対して幅広い特異性を示した。このタンパク質の結合特異性は、SAR11_0797(proX)22と推定される、in vivoで以前に特徴づけられた広特異性浸透溶質トランスポーターの輸送活性と一致する。これらの結果から、SAR11細菌のSBP依存性トランスポーターは、狭い範囲の窒素源と広い範囲の炭素源を輸送し、予測されたよりも機能的な冗長性が少ないことが示された32。

輸送能力を特定の遺伝子に割り当てることで、機能データを既存のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームデータと統合することができる。例えば、Ca. P. ubique HTCC1062 SBPsの機能割り当てにより、海洋メタゲノムおよびメタトランスクリプトームデータを用いて、SAR11および他の海洋細菌における様々な輸送能力の地理的分布を解析することが可能になった。まず、Ocean Gene Atlasツール33を用いて、Tara Oceansプロジェクトのメタゲノムおよびメタトランススクリプトームデータセットにおける、特徴付けられたSBPのホモログの存在量を分析した（Extended Data Figs6および7）。これにより、DOMの様々な成分の同化に寄与すると考えられる、豊富に転写された輸送遺伝子を同定し、輸送遺伝子の発現が、既知の栄養塩の制限および取り込みのパターンと相関しているかどうかを調べることができた。また、SAR11細菌に限定した別のメタゲノム解析を行い、異なるSAR11ゲノム種34の相対的な存在量に基づいて、各サイトで特定のSBP遺伝子を含むSAR11細菌の割合を推定したところ、SBPの存在量に類似したパターンが得られた（補足図3）。

SAR11細菌の世界的な存在量と、SAR11細菌間で特徴付けられたSBPの広範な分布（Extended Data Fig. P. ubique HTCC1062 SBP遺伝子のホモログは、メタゲノムおよびメタトランスクリプトームデータセットにおいて、表層、深部クロロフィル極大（DCM）、中深層を含むすべてのステーションに高濃度で存在した（Extended Data Fig.） メタトランススクリプトームデータセットでは、これらのSBP遺伝子の平均存在量（マップされたリードの割合）は、表層ステーション間で3×10-5（SAR11_0655）から3×10-3（SAR11_0953）とばらつきがあり、比較のために、表層ステーション間のSBP転写産物の平均総存在量は2.7×10-2と推定された。P. ubique HTCC1062のSBPとその推定上の同機能ホモログは、表層海洋のSBP転写産物のかなりの割合（約40％）を占めている。転写産物量と基質取り込み速度との間には必ずしも定量的な相関関係はないが、これらの結果は、Ca. P. ubique HTCC1062のSBPは、グローバルなDOM同化という広い文脈において重要である可能性がある。例えば、DMSP/グリシンベタイン輸送遺伝子SAR11_1336の平均転写産物量は1.6×10-3であった。SAR11_1336の高存在量は、最近報告された関連性のないDMSP特異的輸送タンパク質36とともに、SAR11_1336と他の細菌におけるそのホモログが、DMSPの世界的な微生物による取り込みに大きく寄与している可能性を示唆している。DMSPは、気候活性ガスであるジメチルスルフィド37への微生物による変換を通じて、海洋硫黄循環と気候調節に重要な役割を果たす代謝産物である。

メタゲノム解析とメタトランスクリプトーム解析の両方で、スルホン酸塩、アミノ酸、TMAO、グリシンベタイン、DMSP、ジカルボン酸塩のトランスポーターは、ほぼ普遍的な分布と特に高い存在量を示したが、l-ピログルタミン酸、リン酸塩、鉄（III）、d-グルコースのトランスポーターは、地理的に限定された分布を示した（Extended Data Fig.） これらの結果は、タウリン、アミノ酸、DMSPの取り込みにSAR11細菌が異なる環境で寄与していることと、d-グルコースの取り込みが生態型特異的で地理的に変動していることとが一致している2。メタゲノムとメタトランスクリプトームのデータセットでは、SBP遺伝子の発現量の類似したパターンが一般的に観察され、SAR11バクテリアのほとんどのSBP遺伝子の構成的発現が高く、転写制御が限定的であることと一致した。例えば、SAR11の浸透質トランスポーターをSAR11_0797と誤同定した場合、DMSPやグリシンベタイン取り込みの役割はより限定的で、SAR11や他の海洋細菌ではポリアミン取り込みの役割がより広いことが示唆される35,40。

SAR11 SBPの新規機能

既知の基質に対するトランスポーターの同定に加え、SBPの機能特性解析により、新たな輸送機能の同定も可能となった。SAR11_0655 (l-pyroglutamate) と SAR11_1361 (C4andC5dicarboxylates) は、新しいクラスのABCトランスポーターであり、SAR11バクテリアのこれまで知られていなかった輸送能力を示している。SAR11_0655にKd< 5 nMで結合するl-pyroglutamateは、DOC16の重要な構成成分であることが知られていない非タンパク性アミノ酸であるため、予想外のリガンドであった。SAR11_0655の出現はSAR11の生態型の中でも限られており、主に高緯度に限定されている（Extended Data Figs1,6and 8）が、他のSAR11細菌は別のトランスポーターを用いてl-ピログルタミン酸の取り込みを実現しているようであり（補足注6 ）、l-ピログルタミン酸が広く利用されていることが示唆された。ゲノムコンテキストの解析から、外因性l-ピログルタミン酸をl-グルタミン酸源として利用する推定経路が示唆された（Extended Data Fig.9）。SAR11細菌が、その極めて合理化されたゲノムにもかかわらず、l-ピログルタミン酸に対する特異的かつ高親和性のトランスポーターを保持しているという事実は、このアミノ酸が海洋において広く利用可能で有用な炭素および／または窒素源であるに違いないことを示している。より一般的には、不均質で希薄かつ変動しやすいDOC16において、環境的に重要な代謝物を同定することは大きな課題であることから、この結果は、貧栄養海洋細菌のSBPの特性解析から新たな輸送能力を同定することが、DOCプールから環境的に重要な海洋代謝物を新たに同定するために有用なアプローチである可能性を示唆している。

SAR11_1361 は、トリカルボン酸（TCA）サイクルに関与する広範なジカルボン酸の結合を示した（図1および2）。この遺伝子はSAR11細菌の炭素飢餓と関連していることが知られており、暗所での炭素制限41（すなわちエネルギー飢餓状態）では転写や発現がアップレギュレートされ、窒素や硫黄の制限ではダウンレギュレートされる42,43。ゲノムコンテキストの解析から、外因性のグルタル酸を利用する推定経路（SAR11_1354を介する）も示唆され、その後、1H-NMRによってSAR11_1354の基質であること、DSFによってSAR11_1361のリガンドであることが確認された（Extended Data Fig.9）。これらの結果は、特異的で高親和性のクエン酸結合タンパク質（SAR11_1203）の同定とともに、Ca. P. ubique HTCC1062は、ジカルボン酸およびTCAサイクル中間体を同化する幅広い能力を持つことが示唆された。ジカルボン酸輸送タンパク質SAR11_1361は、グルコース輸送タンパク質SAR11_0769よりもSAR11ゲノムの中で広く分布しており（図4a,bおよびExtended Data Fig. 1）、またSAR11_1361は細菌間の系統学的分布がより限定的であるにもかかわらず、沿岸と外洋の両方のサンプルを含むTara Oceansメタゲノムとメタトランスクリプトームのデータセットにおいて、より広い地理的分布を示した（図4c-f）（拡張データFig.） SAR11細菌に普遍的な炭素源を取り巻く不確実性44（補足注7）という状況の中で、C4およびC5ジカルボン酸に対して高い親和性（Kd< 10 nM）と幅広い特異性を持つSBPが同定されたことは、厳しいゲノム合理化にもかかわらずSAR11の生態型間で保存されており、海洋全体に広く分布し、高度に転写されていることから、これらのジカルボン酸がSAR11細菌において生理学的に重要な炭素源であるという強力な証拠となる。

図4：ジカルボン酸輸送遺伝子SAR11_1361は表層海洋に豊富に分布している。

a,b, SAR11_0769（a）とSAR11_1361（b）のホモログを含むSAR11バクテリアの、Tara Oceansデータセットからの表層ステーションにおける推定割合。この解析に使用したゲノムの完全性は77±15％（平均±s.d.）34であったため、この値は過小評価である。比較のために、SAR11細菌がCa. P. ubique HTCC1062クレードに属するSAR11バクテリアの割合と、各ロケーションにおけるSAR11バクテリアのサブクレードを補足図7に示す。SAR11_0769とSAR11_1361のホモログはOcean Gene Atlas v2.0から取得し、e-valueの閾値を10-30、配列同一性の閾値を40%としてフィルターをかけた。存在量は各サンプルにマップされたリードの割合として表現され、リニアスケール上の点面積で表される。d, Tara Oceansメタゲノムデータセット中のSAR11_1361ホモログ。e, Tara Oceansメタトランスクリプトームデータセット中のSAR11_0769ホモログ。

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SAR11 SBPの特異性と親和性

SBPの系統的な特性解析により、Ca. P. ubique HTCC1062におけるトランスポーターの特異性と親和性の全体像を明らかにした。SAR11細菌を含む、ゲノムがスリムな貧栄養細菌は、限られた数のトランスポーターで広範囲の基質を輸送できるように、広特異性トランスポーターに依存しているという仮説が長い間信じられてきた9。実際、広特異性浸透溶質トランスポーターは以前に同定されており22、今回の研究ではアミノ酸とジカルボン酸塩に対するさらに3つの広特異性SBPの特徴が明らかにされた。しかしながら、SBPの大部分（13個中少なくとも8個）は高い結合特異性を示し、貧栄養細菌における取り込み特異性のより微妙な見方を示唆している（補足注8）。ゲノムのスリム化によって、トランスポーター遺伝子に加えて代謝遺伝子も減少する。したがって、広い特異性を持つトランスポーターは、特に海洋DOCの組成の複雑さを考えると、利用できない代謝物を無駄に取り込む危険性がある。我々の結果は、Ca. P. ubique HTCC1062は、アミノ酸やTCAサイクルの中間体など、専用の異化経路を通さずに利用できる代謝物を中心に、少数の広特異性トランスポーターを用いて、高度に選択的に基質を取り込むことがわかった。残りのトランスポーターは高い特異性を示し、主に広特異性トランスポーターの特異的ギャップをカバーしている。実際、2つの広特異性アミノ酸結合タンパク質の重複を除けば、SBP間の結合特異性の重複はほとんどない。これらのトランスポーターの高い特異性は、特異性と親和性の間の負のトレードオフから生じるものではない。例えば、SAR11_0953は約15のタンパク質生成アミノ酸に対してナノモルの親和性を持つと推定され（測定されたΔTMと Kd値に基づいて）、l-グルタミン酸に対しては最大550 pMであり、広い特異性が高い親和性と両立することを示している（補足注9）。さらに、4つの広特異性トランスポーターのうち3つ（SAR11_0953、SAR11_1336、SAR11_1346）は、Proteobacteriaの間で広く分布しているようであり、広特異性トランスポーターの使用が貧栄養細菌に特有ではないことを示している（Extended Data Fig.） これらのことから、貧栄養細菌はおそらく、これまで考えられていたよりも基質選択性が高いことが示唆される。

今回の結果から、SBP結合親和性の系統的な増加が、Ca. P. ubique HTCC1062の低栄養環境における低基質濃度への主要な適応であることが明らかになった。また、Ca. P. ubique HTCC1062のSBPの結合親和性は平均して著しく高く、場合によっては既知のSBP結合親和性の範囲を大幅に超えていた（図3a）。ほとんどの場合、ピコモルから低ナノモルの範囲のKd値が観察され、表層貧栄養海45,46で一般的に観察されるピコモルから低ナノモル濃度のアミノ酸や他の基質（補足注3と補足表7）と一致し、ピコモルから低ナノモルの取り込み親和性（具体的には、 Ks+[S]、半飽和定数(Ks)とその場での基質濃度の和)が、表層海洋の環境試料中の様々な代謝物に対して観測されている45,47が、これらに対応する輸送タンパク質は一般的に同定されていない22。SBPのin vitroでの特性は、本来の細胞内環境とは若干異なる可能性があるが、SBPのin vitroでの特性と、対応するトランスポーターのin vivoでの特性との間には、一般に強い相関関係が観察される23。加えて、SBPで観察された結合親和性の生理学的妥当性は、いくつかの考察によって示されている：(1) SAR11_1336とグリシンベタインとの相互作用で観察されたKd2.0nMは、対応するトランスポーター22について以前に測定されたKs値（0. 89nM）、（2）ABCトランスポーター活性の数学的モデルは、（SAR11細菌のように）SBP濃度が高い場合、取り込み親和性はSBP結合親和性よりも大きくなるはずであることを示している48。これまでの研究で、低栄養条件下での大きな個体群サイズによる極端な選択圧が、SAR11細菌のゲノムや細胞レベルでの系統的な適応（例えば、GC含量の減少9やペリプラズム容積の増加8）を促したことが示されているが、今回の研究は、SBPの生物物理学的特性の系統的な適応が、SAR11細菌の進化の成功におけるもう一つの重要な要因であることを示している。我々は、SBPの超高結合親和性の根底にある進化的トレードオフもまた、SAR11や他の貧栄養細菌の生理を形成する重要な要因ではないかと推測している（補足注10）。

Ca.P.ubiqueのゲノム中に、これまでにない結合親和性を持つSBPが同定された。P. ubique HTCC1062のゲノム中に前例のない結合親和性を持つSBPが同定されたことで、海洋の微生物群集による基質取り込みの親和性が観測されたことと、これまでに特徴づけられた基質取り込みトランスポーターの結合親和性との間の不一致に関する不確実性が解消された。この明らかな矛盾を説明するために、貧栄養細菌における高親和性基質取り込みの様々な代替メカニズムが提案されてきた。例えば、最近のモデリング研究では、ABCトランスポーターの取り込み親和性はSBP濃度と結合親和性の両方に依存することが示され、貧栄養細菌はSBP結合親和性を高めることなく高い取り込み親和性を達成するためにSBPの高発現を利用している可能性が示唆された48。対照的に、我々の結果は（このモデルを無効にすることなく）ペリプラスムのSBP濃度を考慮しなくても高い取り込み親和性が説明できることを示している。別の例として、既知のリン酸結合タンパク質の結合親和性（約1 µM）が、リン酸欠乏領域における無機リン酸濃度（5 nM以下）よりもはるかに高いという観察から、貧栄養細菌のペリプラスムにおける無機リン酸蓄積の別のメカニズムが提唱された49,50。注目すべきは、Ca. P. ubique HTCC1062のリン酸結合タンパク質は、確かに結合親和性が比較的低い（133 nM）が、これは海洋中に約28 mMの濃度で存在する硫酸塩とリン酸塩を識別するという課題を反映しているのかもしれない。リン酸結合タンパク質の結合親和性は、リン酸イオンと硫酸イオンの弁別の必要性によって制約を受けているのではないかという仮説と一致して、SAR11_1179は28 mM硫酸イオン存在下で、わずかではあるが有意な結合親和性の減少を示した（6.7倍の890 nMへの減少、P< 0.0001、log10 Kd値に関する両側t検定（Extended Data Fig.2c））。

考察

メタトランスクリプトミクスや関連する手法に基づくシステムレベルのアプローチは、さまざまな環境に存在する複雑な微生物群集の推定生物学的機能をプロファイリングし、その生態学的・生物地球化学的機能に関する知見を得る上で非常に有用である52,53。しかし、これらの手法の限界は、相同性に基づくタンパク質機能の予測に依存していることであり、その精度はタンパク質ファミリー間で著しく異なり、通常は検証されていない19。ここでは、環境中に豊富に存在するタンパク質の標的機能解析を、既存のマルチオミクスや生理学的データと統合することで、分子レベルでの機能適応のメカニズムから、SAR11細菌における基質取り込み能力のグローバルなパターンまで、複数の生物学的スケールにわたる知見が得られることを示した。ますます高解像度化する海洋マイクロバイオームデータセットから最大限の価値を引き出し、微生物遺伝子の機能と海洋生態系生物学を惑星スケールで橋渡しするという微生物生態学における広範な目標を達成するためには、計算アノテーションの改善とタンパク質機能の実験的アノテーションの継続が不可欠であると予想される54,55。

方法

SBP遺伝子の同定

Ca.P.ubique株HTCCゲノムのSBP遺伝子候補19個を同定した。P. ubique HTCC1062株のゲノムに存在する19個のSBP遺伝子候補を、TransportDB 2.0データベース59(http://membranetransport.org; accessed 22 January 2020)の検索により同定した。これらの遺伝子の1つであるSAR11_0371は、UniProtにおいて「膜貫通型受容体の可能性」としてアノテーションされており、短いSBP様ドメイン（170アミノ酸）に続いてコイルドコイルドメインと未同定のC末端ドメインからなる非正規の予測ドメイン構造を示した。さらに、ゲノムコンテキスト解析の結果、Ca. P. ubique HTCC1062の他のABC SBP遺伝子とは異なり、SAR11_0371はABC輸送系の膜透過酵素やATP結合カセット構成要素をコードする遺伝子とはコロカライズしていなかった。従って、SAR11_0371はSBP依存性輸送系のSBPコンポーネントではないと考えられ、解析から除外された。また、UniProtデータベースからCa. P.ubiqueのPfamクランCL0177 (PBP; periplasmic binding protein)およびCL0144 (Periplas_BP; periplasmic binding protein like)に属するタンパク質をUniProtデータベースで検索し、さらなるSBP遺伝子の同定も試みた。

クローニング

Ca.P.ubiqueの各SBPのタンパク質配列は以下の通りである。P. ubique HTCC1062の各SBPのタンパク質配列をUniProtデータベースから取得した。シグナル配列はSignalP 5.0サーバー60を用いて予測し、除去した。その後、タンパク質配列を逆翻訳し、大腸菌での発現にコドン最適化し、得られた遺伝子をTwist Bioscience社またはIntegrated DNA Technologies社から合成DNAとして入手した。この合成遺伝子を、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いたIn-Fusionクローニングにより、pET-28a(+)発現ベクターのNdeI/XhoI部位にクローニングし、N末端にヘキサヒスチジンタグとトロンビンタグを持つ発現コンストラクトを得た。各発現ベクターの正しいアセンブリーは、サンガー配列決定（FASMAC）によって確認された。推定csiD遺伝子であるSAR11_1354とCa. P. ubique HTCC1062 SBP（補足表8）は、SAR11_1354、SAR11_0266（Fub）、SAR11_1290（SAR324）の構築物からトロンビンタグを除去した以外は、同様にpET-28a(+)ベクターにクローニングした。本研究で使用したオリゴヌクレオチドおよび合成遺伝子の配列を補足表9に示す。

タンパク質発現の最適化

タンパク質の発現は、Luria-Bertani（LB）培地およびTerrific Broth（TB）培地で30℃および17℃で培養した大腸菌BL21(DE3)細胞で最初に試験した。SAR11_0655 は 17 °C の LB 培地で、SAR11_1203 は 30 °C の TB 培地で、7 つのタンパク質（SAR11_0797、SAR11_0807、 SAR11_0864、SAR11_1068、SAR11_1179、SAR11_1210、SAR11_1238、SAR11_1361）は 17 °C の TB 培地で最適な可溶性発現を示した。この菌株はジスルフィド結合異性化酵素DsbCを発現しており、ジスルフィド結合の正しい形成を促進することにより、細胞質タンパク質の可溶性組換え発現を増加させることができる。この条件下で、SAR11_0769, SAR11_0953, SAR11_1302, SAR11_1336の可溶性発現が達成された。残りの4つのタンパク質（SAR11_0266, SAR11_0271, SAR11_1290, SAR11_1346）については、可溶性発現が得られなかったため、各タンパク質の1つまたは2つの近傍ホモログについても発現試験を行った（補足表8）。SAR11_0271のホモログは'Ca. Pelagibacter'sp.HIMB1321由来のSAR11_0271ホモログ（SAR11_0271*と表記）は、17 °CのTB培地中のSHuffle T7細胞で可溶性形態で発現させることができ、同じ種由来のSAR11_1346ホモログ（SAR11_1346*と表記）は、17 °CのTB培地中のBL21(DE3)細胞で可溶性形態で発現させることができた。SAR11_0271*およびSAR11_1346*は、それぞれ91.4%および88.9%の配列同一性を有していた。P. ubique HTCC1062由来の対応するタンパク質と、それぞれ91.4%、88.9%の配列同一性を示し、結合部位残基は完全に保存されている（補足図5）。SAR11_0266およびSAR11_1290のホモログは、いずれもBL21(DE3)またはSHuffle T7細胞で可溶性発現できなかった。SAR11_0266およびSAR11_1290をHis6またはトロンビンタグなしで発現させると、不溶性タンパク質が得られた。

タンパク質の発現は、通常、以下のように SDS-PAGE 分析によって評価した。エレクトロポレーションによって関連する発現ベクターで形質転換した細胞を、凍結グリセロールストックから0.2%(w/v)のグルコースと25μgml-1のカナマイシンを含むLB寒天プレート上に広げ、30℃で一晩インキュベートした。その後、細胞を少量のLB培地に掻き取り、OD600が0.05になるように、25μg ml-1カナマイシンを含む3mlの関連増殖培地を10mlの丸底チューブに接種した。OD600が0.5になるまで、37℃で220rpmで振盪培養した。mlのアリコートを清潔な丸底チューブに移し、イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度0.5mMになるように添加した。各培養液の500μlのアリコートを溶解バッファー（20 mM Tris, 0.5 M NaCl, 1% (v/v) Triton X-100, pH 8.0）に懸濁し、室温で10分間インキュベートした。細胞溶解液を21,000gで5分間遠心した（4℃）。細胞溶解液の可溶性画分を、500μlの緩衝液A（8M尿素、20mM Tris、0.5M NaCl、pH8.0）に懸濁した30μlのcOMPLETE His-Tag精製Ni-NTA樹脂（Roche）を含むチューブに移し、一方、細胞溶解液の不溶性画分を500μlの緩衝液Aに溶解し、21,000gで5分間遠心分離した後、500μlの緩衝液Aに懸濁した30μlのNi-NTA樹脂を含むチューブに移した。いずれの場合も、樹脂を室温で10分間インキュベートし、500μlの緩衝液Aで2回洗浄した後、50μlの緩衝液B（8M尿素、20mM Tris、0.5M NaCl、0.5Mイミダゾール、pH8.0）と室温で5分間インキュベートして溶出した。上清15μlを4×SDS-PAGEサンプルローディングバッファー5μlと混合し、90℃で10分間加熱した後、4-15%プレキャストSDS-PAGEゲル（Bio-Rad）にロードした。ゲルは200Vで30分間反応させ、クマシーブルーで可視化した。

タンパク質の大量発現と精製

Ca. P. ubique SBPの発現と精製には、該当する発現ベクターで形質転換した大腸菌BL21(DE3)またはSHuffle T7細胞を、凍結グリセロールストックから0.2%(w/v)グルコースと25μgml-1カナマイシンを含むLB寒天培地プレートにまき、30℃で一晩培養した。その後、細胞を3mlのLB培地に掻き取り、得られた細胞懸濁液500μlを、37℃に予熱した2lまたは3lのフラスコ中で、25μg ml-1カナマイシンを添加した500mlのLBまたはTB培地に接種した。OD600が0.5になるまで220rpmで振盪しながら37℃で培養し、その後、温度が25℃になるまで氷水浴で短時間冷却した。IPTGを0.5 mMの濃度になるように添加し、さらに16時間、220 rpmで振盪しながら17℃で培養した。細胞を遠心分離（3,300g、15分、4℃）でペレット化し、使用するまで-20℃で凍結した。タンパク質を精製するために、細胞を氷上で解凍し、100mlのNi結合バッファー（20mM Tris、500mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.0）に再懸濁し、超音波処理で溶解した。500UのBenzonase Nuclease（Sigma-Aldrich）を加えてDNAを消化した後、細胞溶解液を10,000gで1時間遠心した（4℃）。上清を0.45μmのシリンジフィルターで濾過し、ÄKTA Pure FPLCシステム（Cytiva）を用いてNi洗浄バッファーで平衡化した1mlのHisTrap HPカラム（Cytiva）にロードした。ネイティブ条件下での精製では、カラムを10 mlのNi結合バッファーで洗浄し、続いて10 mlのNi洗浄バッファー（20 mM Tris、500 mM NaCl、44 mM イミダゾール、pH 8.0）で洗浄し、10 mlのNi溶出バッファー（20 mM Tris、500 mM NaCl、500 mM イミダゾール、pH 8.0）で標的タンパク質を溶出した。変性条件下で精製する場合は、清澄化した細胞溶解液をロードした後、カラムを変性Ni結合バッファー（8 M尿素、20 mM Tris、250 mM NaCl、20 mMイミダゾール、pH 8.0）で1 ml min-1で30分間洗浄し、標的タンパク質を10 mlの変性Ni溶出バッファー（8 M尿素、20 mM Tris、250 mM NaCl、250 mMイミダゾール、pH 8.0）で溶出した。ネイティブ条件下で精製したタンパク質は、10 kDa分子量カットオフ（MWCO）のAmicon Ultra-4遠心スピン濃縮器（Merck-Millipore）を用いて400 µlに濃縮し、Superdex 200 Increase 10/300カラム（Cytiva）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、DSFバッファー（20 mM HEPES、0.3 M NaCl、pH 7.50）で溶出した。保存のため、タンパク質を0.5-2mlの容量に濃縮し、グリセロールを10%(v/v)の濃度になるように加えた。その後、タンパク質を100-200μlのアリコートで液体窒素中に瞬間凍結し、使用するまで-80℃で保存した。S.enterica由来のArgTは、pETMCSIIIプラスミドから発現させ、前述のように精製した61。

タンパク質のリフォールディング

ほとんどの場合、変性条件下で精製したタンパク質を、変性Ni結合バッファー（8M尿素、20mM Tris、250mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.0）で0.5mg ml-1の濃度、10-30mlの容量に希釈し、10kDa MWCO SnakeSkin透析チューブ（Thermo Scientific社製）に移した。タンパク質を回収し、10 kDa MWCO Amicon Ultra-15遠心濃縮機を用いてDSFバッファーに交換した後、400 µlに濃縮し、上記のようにサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。SAR11_1346* については、リフォールディングのための迅速希釈法を用いて単量体タンパク質の収率を向上させた： 2mlの変性タンパク質（変性Ni結合バッファー中5 mg ml-1）を40mlのあらかじめ冷やしたリフォールディングバッファー（20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10% (v/v) glycerol, pH 8.0）に攪拌しながら滴下添加し、4℃で20時間攪拌しながらインキュベートした。

示差走査蛍光測定

DSF 実験は、StepOnePlus Real-Time PCR System と StepOne software (Applied Biosystems) を用いて、文献プロトコール62,63 に基づいて行った。反応混合物は twin.tec Real-Time PCR Plates (Eppendorf)で調製し、5×SYPRO Orange (Sigma-Aldrich)、2.5 µM タンパク質、2 µl 10× リガンドを総量20 µl DSF bufferに入れた。プレートを光学的に透明なシールフィルムで密封し、リアルタイムPCR装置にロードする前に2,000gで1分間遠心した。標的タンパク質の融解温度(TM)を中心とした60℃のウインドウで、通常1%(約1.33℃ min-1)の速度で温度を上昇させた。蛍光はROXチャンネルでモニターした。TM値は、温度に対する蛍光強度の導関数をとり、得られたデータをRソフトウェアでTM近傍の6℃ウィンドウで二次方程式にフィットさせることにより決定した。

タンパク質はまず、4 枚の Phenotype MicroArray プレート PM1～PM4（Biolog 社）で代謝物との結合をスクリーニングした。各ウェルの内容物を50 µl（PM1～PM3）または20 µl（PM4）の滅菌濾過水に溶解し、各ウェルに約10～20 mMの濃度を与えた63。その後、プレートをアルミニウムのシールフィルムで密封し、-80℃で保存した。使用前にプレートを室温で解凍し、化合物が再溶解するまで30℃で振盪した。上記のように調製した18μlの反応混合液に、各化合物2μlを加えた。プレート全体の中央値と比較してTMが2℃上昇した場合、結合を示唆するものとした63,64。

個々の化合物のスクリーニングと確認アッセイでは、化合物を100 mMの濃度でリガンドバッファー（0.1 M HEPES pH 7.5）に溶解し、必要に応じてpHを1 M NaOHまたは1 M HClで調整した（具体的には、DSFバッファーで希釈した化合物の10 mM溶液のpHが6.5～8.0の範囲から外れた場合）。これらのストック溶液は-20℃で保存した。各化合物2マイクロリットルを18μlの反応混合液に直接加え、最終濃度を10mMとするか、DSF緩衝液で10倍または100倍に希釈し、最終濃度を1mMまたは0.1mMとしてアッセイに用いた。スクリーニングに使用した化学物質のリスト（供給元とカタログ番号を含む）を補足表3に示す。(R)-および(S)-2,3-ジヒドロキシプロパン-1-スルホン酸ナトリウムは、文献のプロトコール65に従い、(R)-および(S)-3-クロロ-1,2-プロパンジオールから合成し、1Hおよび13CNMRで確認した。

TRAPとTTTのSBP、SAR11_0864とSAR11_1203の場合、Biologのスクリーニング実験でイセチオン酸存在下で観察された二相性の融解曲線から、高親和性結合には金属イオンが必要である可能性が考えられた。そこで、金属イオン（Mg2+、Ca2+、K+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+）の添加が、イセチオン酸のSAR11_0864への結合およびクエン酸のSAR11_1203への結合に及ぼす影響をDSFで調べた（補足図6）。DSF 実験は、1 mM の金属イオンと 1 mM のリガンドを加え、上記のようにリフォールディングしたタンパク質を用いて行った。これらの結果に基づき、また海水中の各金属イオンの濃度66 を考慮して、10 mMCaCl2(SAR11_0864) または 53 mMMgSO4(SAR11_1203) を、これらの SBP のその後の DSF および ITC 結合実験に含めた。

等温滴定カロリメトリー

ITC実験は、MicroCal PEAQ-ITCシステム（Malvern Panalytical）を用いて行った。タンパク質サンプルはリフォールディングし、精製したてのもの（凍結せず）を使用し、タンパク質とリガンドサンプルは希釈熱を最小限に抑えるため、サイズ排除クロマトグラフィーに使用したDSFバッファーと同じバッチで調製した。SAR11_0864とSAR11_1203については、それぞれ塩化カルシウム（最終濃度10.3 mM）または硫酸マグネシウム（最終濃度53 mM）をタンパク質とリガンドサンプルに添加した。実験は25℃で行い、攪拌は700 rpm、基準出力は10 µcals-1で行った。滴定パラメーターは、タンパク質の収量、活性タンパク質の割合、相互作用の親和性とエンタルピーに応じて変化させた。典型的な滴定では、35µMのタンパク質を1×0.4µlおよび19×1.6µlのリガンド注入で滴定し、滴定終了時に活性タンパク質に対して1.5倍以上のリガンドモル過剰が得られるようにリガンド濃度を選択した。ITC実験は通常少なくとも2回行った。

単純な1:1結合相互作用の場合、相互作用の会合定数(Ka)、エンタルピー(ΔH)、化学量論(n)は、MicroCal PEAQ-ITC解析ソフトウェアでデータをone-set-of-sitesモデルにフィットさせることにより決定した。SAR11_0769 + d-グルコース相互作用の場合、熱力学的パラメータは、各アノマー型におけるリガンドの割合を考慮するための追加パラメータを組み込んだ修正競合結合モデル、およびpytcソフトウェアに実装された2-set-of-sitesモデルへのベイズフィッティングによって推定された67。後者のモデルは、各注入の置換体積に関連する熱のマイナー補正を除けば、MicroCalソフトウェアの2-set-of-sitesモデルと同等である（pytcの他のモデルとの一貫性のため）。SAR11_0953 + l-glutamate、SAR11_1203 + citrate、SAR11_1210 + l-arginine、SAR11_1336 + glycine betaine、SAR11_1346* + l-leucine相互作用の熱力学的パラメータは競合置換実験68、 この実験では、l-フェニルアラニン、cis-アコニテート、d-オクトピン、グリシン、またはl-セリン（それぞれ）が細胞内に一定濃度で含まれ、目的のリガンドに対する見かけの結合親和性を低下させた。これらの競合的結合実験のデータは、pytcソフトウェアの競合的結合部位モデルへのベイズフィッティングによって解析された。SAR11_1210 + l-アルギニン相互作用の高い親和性を確認するために、S. enterica由来の SAR11_1210 と ArgT（l-アルギニンに対するKdは 15 nM）を同じ濃度（28 µM）で細胞内に入れ、l-アルギニンで滴定した競合結合実験を行った。同様に、SAR11_1210(E108A) + l-アルギニン相互作用については、SAR11_1210(E108A)とSAR11_1210の混合物（それぞれ35 µM）をl-アルギニンで滴定した。これらの滴定において、データは上記のように2-sets-of-sites結合モデルに当てはめられ、タンパク質-リガンド相互作用の熱力学的パラメータが得られた。すべての解析において、希釈熱は小さな定数値であると仮定し、モデルのフィッティングパラメータに含めた。この仮定の妥当性は、リガンドを DSF バッファーに注入する対照滴定を行うことで、各リガンドについて確認した。

鉄(iii)結合の分光光度分析

SAR11_1238と鉄(ⅲ)の結合は、文献のプロトコール69,70に基づいた分光光度法を用いて分析した。UV-visスペクトルは、Multiskan GO spectrophotometer (Thermo Scientific)を用い、96ウェルプレート中、室温(25 °C)で300 nmから630 nmまで、1 nmのバンド幅で記録した。すべての分光光度アッセイには、初期タンパク質濃度100 µM、初期容量200 µlを用いた。まず、精製した SAR11_1238 を解凍し、遠心濃縮機を用いて 50 mM Tris, 200 mM NaCl buffer (pH 8.0) に交換し、得られたタンパク質サンプルのスペクトルを記録した。鉄結合アッセイ用の非リガンドタンパク質を調製するため、タンパク質を50 mM Tris, 200 mM NaCl, 20 mM クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 8.0）に交換し、30倍希釈と濃縮を3回繰り返し、金属リガンドのキレート化と除去を行った。その後、50 mM Tris, 200 mM NaCl緩衝液（pH 8.0）で30倍希釈と濃縮を4回繰り返し、クエン酸塩を除去した。結合アッセイは、非リガンドタンパク質（100 µM溶液200 µl）を、800 µMの塩化鉄と2.5倍モル過剰のクエン酸三ナトリウム（鉄(III)が溶解性を維持する）から超純水で調製した800 µMの鉄(III)溶液の8倍または10倍の5-µl注入で滴定することにより行った。SAR11_1238が鉄(Ⅲ)-クエン酸複合体ではなく鉄(Ⅲ)と結合していることを確認するため、同じ条件下で800μMの硫酸アンモニウム鉄(Ⅱ)でも滴定した。UV-visスペクトルは、各注入の1分後（鉄(ii)）または15分後（鉄(iii)）に記録した。最後に、SAR11_1238 の鉄(Ⅲ)に対する親和性を推定するために、クエン酸塩を用いた競合的結合アッセイを行った。タンパク質を2倍モル過剰の鉄(ⅲ)溶液で飽和させ、1 mlの容量に希釈し、500 mlの50 mM Tris, 200 mM NaCl緩衝液（pH 8.0）に対して4℃で一晩透析し、過剰の鉄(ⅲ)とクエン酸塩を除去した。その後、タンパク質を100 µMに濃縮し、500 mMクエン酸ナトリウム（50 mM Tris、200 mM NaClバッファーでpH 8.0に調整）の2倍連続希釈液を8回、5µl注入して滴定した。各添加の5分後に440 nmの吸光度を記録した。データは双曲線にあてはめられ、クエン酸塩の見かけのKdは9.0 mMであった。クエン酸塩の鉄(Ⅲ)に対するKdが 10-17 Mであることから、SAR11_1238の鉄(Ⅲ)に対するKdは10-19Mであり、以前に特徴づけられた鉄(Ⅲ)結合タンパク質と同様である70,71。

X線結晶構造解析

SAR11_0769/d-glucose と SAR11_1210/l-arginine の構造については、まずタンパク質を発現させ、上記のようにネイティブな条件下でニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。20倍モル過剰のd-グルコース（SAR11_0769）またはl-アルギニン（SAR11_1210）を添加した後、3×結晶化バッファー（60 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5）で溶出し、HiLoad 26/600 Superdex 75 pgカラム（Cytiva社製）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質をさらに精製した。目的タンパク質を含むフラクションを回収し、d-グルコース（SAR11_0769）またはl-アルギニン（SAR11_1210）を30 µMの濃度になるように添加した。タンパク質を500 µlまで濃縮し、水で3倍希釈してNaCl濃度を50 mMまで下げ、さらに12 mgml-1まで濃縮した。SAR11_0769/d-galactoseおよびSAR11_0655/l-pyroglutamate構造については、リガンドを添加しなかった以外は、同様の方法でタンパク質を発現させ、精製した。タンパク質の結晶は、20℃の吊り下げ滴下で蒸気拡散法を用いて得た後、液体窒素で凍結保護し、瞬間凍結した。各タンパク質の結晶化および凍結保護条件は、Supplementary Methodsに示した。X線回折データは、SPring-8シンクロトロン（日本、播磨）のビームラインBL32XUで、自動データ収集のためのZOOスイートを使用して収集した72。データはKAMO74を用いてXDS73で自動的にインデックス付け、統合、スケーリング、マージされた。構造はPhaser75またはMOLREP76で分子置換により解かれた。SAR11_1210については、Agrobacterium fabrum由来のオピン結合タンパク質（PDB ID5OT8）の構造を検索モデルとして使用し、それ以外のケースではAlphaFold2モデルを使用した77。その後、REFMAC78、Phenix79、COOT80で実空間および逆空間精密化を繰り返し、構造を精密化した。データ収集と精密化の統計はSupplementary Table10とSupplementary Table11に示す。構造はPymolで可視化した。

ガスクロマトグラフィー質量分析

ネイティブ条件下で精製したSBPをPD-10脱塩カラム（Cytiva）を用いて200mM酢酸アンモニウムに交換し、〜1mMに濃縮した。10nmolのタンパク質のアリコートを10μlの300μM α-メチルグルコピラノシド（内部コントロールとして）および200μlのメタノールと混合した。混合物を24℃で1500rpmで10分間撹拌した後、4℃で21,000g、20分間遠心した。上清を真空エバポレーターで蒸発乾固し、20μlの無水ピリジンに再溶解し、1%トリメチルクロロシラン（Supelco）を含む30μlのN-メチル-N -(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド（MSTFA）を添加し、70℃で1時間インキュベートして誘導体化した。SAR11_1361の場合、乾燥サンプルは代わりに無水ピリジン中の20 mgml-1メトキシアミン塩酸塩20 µlに溶解し、MSTFA混合物を添加する前に750 rpmで攪拌しながら37℃で90分間インキュベートした。誘導体化したサンプルを、PAL COMBI-XT オートサンプラー (CTC Analytics) を装備し、一次元モードで動作する PEGASUS 4D GC×GC TOF-MS 装置 (LECO) に接続した Agilent 7890 A GC システム (Agilent Technologies) に直ちに注入しました。GCには、長さ30 m、内径0.25 mm、膜厚0.25 µmのDB-1MSカラム（Agilent Technologies）を装着した。装置は、スプリット比2、注入量1 µlのパルススプリットモードで操作した。注入口温度は250℃であった。ヘリウムをキャリアガスとして使用し、流速は1 ml min-1であった。GCオーブン温度は70 °Cで5分間保持した後、12 °C/min-1で300 °Cまで昇温し、最後に300 °Cで10分間保持した。質量分析データは、6.5分間の溶媒遅延の後、50から500m/zの範囲で収集された。イオン源とトランスファーラインの温度は250 °C、イオン化エネルギーは70 eVであった。データ解析とNISTデータベースに対するスペクトルデータベース検索は、ChromaTOFソフトウェア（LECO）を用いて行った。タンパク質由来のサンプルは、キャリーオーバーを防ぐため、コントロールサンプルの前に分析した。

生物地理学的解析

生物地理学的解析は、Ocean Gene Atlas v2.0 サーバー33 を用いて行った。各SBP遺伝子の存在量データは、Ca. P. ubique HTCC1062の各SBP遺伝子について、Tara Oceans OM-RGC_v2_metaGおよびOM-RGC_v2_metaTデータセットにおける存在量データを、10-30という厳しいe-value閾値でBLAST検索して得た。異なる輸送機能を持つ相同なSBPの混入を避けるため、対応するHTCC1062 SBPと比較して、配列同一性が40%未満（ABC SBPの場合）または55%未満（TRAPおよびTTT SBPの場合）のヒットは解析から除外した。

SBP転写物の総存在量を推定するために、CL0177（PBP；ペリプラズム結合タンパク質）およびCL0144（Periplas_BP； トランスフェリンファミリー（PF00405）、および酵素または転写因子のみを含むファミリー（PF00800、PF01379、PF01634、PF02621、PF03466、PF09084）を除き、OM-RGC_v2_metaTデータセットのhmmer検索を用い、e-valueの閾値を10-10として、CL0177（PBP; periplasmic binding protein like）およびCL0144（Periplas_BP; periplasmic binding protein like）の38のPFAMファミリーの各存在量データを得た。31のPFAMファミリーのうち26でヒットした。各PFAMファミリーについて、対応する隠れマルコフモデル（HMM）をInterProデータベース81から取得した。次に、hmmer検索で得られたタンパク質配列をhmmalignを用いてこのHMMに整列させ、HMMER3.4(http://hmmer.org)のhmmbuildを用いて新しいHMMを構築した。次に、OM-RGC_v2_metaTデータセットの2回目のHMM検索を、e-valueの閾値を10-5と低くして、得られたHMMを使って行った。52の検索からのヒットを組み合わせ、冗長なヒットを除去した結果、合計211,222のユニークなSBP遺伝子が得られた。この2段階の検索により、Ca. P. ubique HTCC10 のホモログとして同定された23,879遺伝子の94%が回収された。P. ubique HTCC1062 SBPのホモログとして同定された23,879遺伝子のうち、配列同一性閾値を適用する前のBLAST解析で94%を回収した。残りの1267遺伝子もSBP遺伝子リストに追加した。最後に、各部位におけるSBP遺伝子の総存在量を算出した。

Ca.P.ubiqueのSBP遺伝子を含むSAR11菌の割合を推定するために、SBP遺伝子を含むSAR11菌の割合を算出した。P. ubique HTCC1062由来SBPを含むサイトにおけるSAR11バクテリアの割合を推定するために、Haro-Morenoら34. 対応する各ゲノムにおける各SBPのホモログの存在は、50%の配列同一性と50%のカバレッジ閾値を用いたBLASTによって決定した。SBPの相同遺伝子を含むSAR11細菌の相対的な存在量は、各ステーションについて計算された。プロットはRとGraphPad Prismを用いて作成した。

系統解析

UniProtKB Reference ProteomesとSwiss-ProtデータベースのBLAST検索により、目的のSBPに相同なタンパク質配列を同定した82。得られた配列は、少数の異常に長い配列（平均長より20%以上長い）を除去するためにフィルターをかけ、MUSCLE v3.8.3183でアライメントした。アライメントはtrimAl v1.2でautomated1オプション84を用いてトリミングし、FastTree v2.1.11で置換モデル85としてLG +Γ20を用いて最尤系統樹を作成した。ツリー内の各タンパク質配列について、保存された結合部位残基の割合を、Ca. P. ubique HTCC1062の対応するタンパク質と比較して、保存された結合部位残基の割合を推定した。結合部位残基は結晶構造（SAR11_0769）から得たか、AlphaFold2モデルから推定した86,87。この解析では、以下の置換を保存的置換として扱った： S/T、I/M、V/L、I/V、L/M、D/E、Q/N、A/V、F/Y、Y/W、F/W。系統樹の図はR88のggtreeパッケージを使って作成した。分類学的分布を示す図（拡張データ図8b）はKrona89を用いて作成した。

報告概要

研究デザインに関する詳しい情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性

各結晶構造の座標と構造因子は、以下のアクセッションコードでProtein Data Bankに寄託されている： SAR11_0655-l-pyroglutamate (8WCH), SAR11_0769-d-glucose (8HQQ), SAR11_0769-d-galactose (8KD0), SAR11_1210-l-arginine (8HQR). 本文中で参照した実験的タンパク質構造は、Protein Data Bankからアクセッションコード1EU8,1GLG,2B3B,2B3F,2FVY,2PFY,2PFZ,2Q2A,3OO6,3ZKK,4R2B,4UAB,4UA8,5DVI,5DVJ,6WGMで入手可能。構造モデルはAlphaFold Protein Structure Databaseから以下のUniProtionsを使用して入手可能： SAR11_0266、Q4FP02; SAR11_0271、Q4FNZ7; SAR11_0655、Q4FMW4; SAR11_0769、Q4FMK2; SAR11_0953、Q4FM26; SAR11_1290、Q4FL44； SAR11_1336、Q4FKZ8; SAR11_1346、Q4FKY9; SAR11_1361、Q4FKX4; SAR11_0271*、A0A1X7H7N5; SAR11_1346*、A0A1X7H1Y9; A2cp1_3084、B8JG16。生のITCデータ、BiologアッセイのDSFデータ、GC-MSデータ、系統学的および生物地理学的データ、図のソースデータは、Open Science Framework(https://doi.org/10.17605/OSF.IO/47TR5)から入手可能。

コードの利用可能性

データ解析に使用したスクリプトはOpen Science Framework(https://doi.org/10.17605/OSF.IO/47TR5)から入手可能。

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参考文献のダウンロード

謝辞

B.E.C.は日本学術振興会海外特別研究員の助成を受けた。P.L.は沖縄科学技術研究所の助成を受けた。U.A.は、Alon Scholarships（イスラエル高等教育評議会）からの資金提供を感謝する。放射光実験は、高輝度光科学研究センター（JASRI）の承認（課題番号2023A2731）を得て、SPring-8のBL32XUで行った。初期原稿を批評的に読んでくれたA. Vardi、X線データ収集に協力してくれたD. Kozome、合成とNMRに協力してくれたP. Jain、GC-MSに協力してくれたY. IinumaとO. Smith、装置へのアクセスとトレーニングを提供してくれたOISTの機器分析セクションとシーケンスセクションに感謝する。

著者情報

著者および所属

  1. 沖縄科学技術大学院大学 タンパク質工学・進化ユニット（日本、恩納村
    ベン・E・クリフトン、上地源一郎、パオラ・ラウリーノ

  2. エルサレム・ヘブライ大学植物・環境科学部（イスラエル
    ウリア・アルコロンブリ

  3. オーストラリア国立大学・化学研究科（オーストラリア首都特別地域・キャンベラ
    コリン・J・ジャクソン

  4. オーストラリア国立大学・化学研究科・ペプチド・タンパク質科学ARCセンター・オーストラリア首都特別地域・キャンベラ
    コリン・J・ジャクソン

  5. オーストラリア国立大学、オーストラリア首都特別地域、キャンベラ、化学研究科、合成生物学におけるARCセンター・オブ・エクセレンス
    コリン・J・ジャクソン

  6. 大阪大学蛋白質研究所、日本、吹田
    パオラ・ラウリーノ

貢献

B.E.C.とP.L.は本研究を発案した。B.E.C.とG.-I.U.はクローニング、タンパク質発現、精製を行った。B.E.C.が残りの実験と計算を行い、B.E.C.、U.A.、C.J.J.およびP.L.がデータを解析し、論文を執筆した。P.L.はプロジェクトを監督した。

連絡先

Ben E. CliftonまたはPaola Laurinoまで。

倫理申告

競合利益

著者らは競合する利益はないと宣言している。

査読

査読情報

Nature誌は、本著作の査読に貢献したGavin Thomas氏とその他の匿名の査読者に感謝する。査読報告書はこちら。

追加情報

出版社からの注記Springer Natureは、出版された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っている。

図表

Extended Data 図1 Ca. P. ubique HTCC1062 SBPのSAR11細菌間での分布。

(a) 候補目「Pelagibacterales」のSBP PFAMクランCL0177およびCL0144に属するSBP配列をInterProデータベースから取得し、配列同一性35％でクラスタ化した。グラフは8配列以上を含む各SBPクラスター中の配列数を示す。Ca.で表されるクラスター。P. ubique HTCC1062で表されるクラスターを緑色で示した。(b)Ca. P. ubique HTCC1062由来SBPのホモログ分布。P. ubique HTCC1062由来のSBPのホモログが、ゲノム配列が完全なSAR11株において分布している。Ca. P. ubique HTCC1062の対応するタンパク質と50%未満の配列同一性を持つホモログ。P. ubique HTCC1062の対応するタンパク質と50%未満の配列同一性を持つホモログは示していない。エコタイプの分類は文献34. 34.から引用し、説明は文献2からそのまま引用した。

Extended Data Fig. 2 SBPs SAR11_1179とSAR11_1238は、リン酸および鉄（III）結合タンパク質である。

(a) 1 mM Na2HPO4非存在下（黒）または存在下（赤）におけるSAR11_1179の熱変性（ΔTM= 10.9 ± 0.4℃、平均±s.d.、n= 3テクニカルレプリケート）。(b-c）28mMのNa2SO4非存在下（b）または存在下（c）で、23μMのSAR11_1179を185μMのNa2HPO4で滴定した代表的なITCデータ。データをone-set-of-sitesモデルに当てはめると、硫酸塩非存在下で133 ± 28 nM、28 mM硫酸塩存在下で892 ± 122 nMのKdが得られた（平均値±s.d.、n= 3または4反復滴定、log10 Kd値に対する両側t検定で有意差あり、P= 3.03 ×10-5,t= 14.28, df = 5, 平均値間の差 = 0.831, 95%信頼区間 = 0.681〜0.981）。(d)大腸菌から精製したSAR11_1238の紫外可視スペクトル。リガンドは添加せず、内因性に結合した鉄(III)の存在を示す。(e-f) 鉄(III)を(e)クエン酸鉄(III)または(f)硫酸アンモニウム鉄(II)として滴定した、リガンドなしのSAR11_1238の紫外可視スペクトル。(g-h) (g)クエン酸鉄(III)または(h)硫酸アンモニウム鉄(II)として供給された鉄(III)とSAR11_1238の滴定。4回（g）または2回（h）のテクニカルレプリケート（独立滴定）からの離散データポイントを示す。線は滴定の直線部分へのフィットを表す。(i) 鉄(III)結合SAR11_1238とクエン酸塩の競合滴定、440 nmの吸光度によるモニター。2つのテクニカルレプリケート（独立した滴定）からの結果を離散データポイントとして示す。

Extended Data Fig. 3 GC-MSとX線結晶構造解析による共精製SBPリガンドの同定。

各タンパク質について、左側のグラフは、タンパク質サンプル（すなわち、タンパク質から抽出し、トリメチルシリル誘導体化を施した共精製リガンド）（上）と対応する化学標準物質（下、反射）の抽出イオンクロマトグラムを示す。右側のグラフは、タンパク質サンプル（上）と対応する標準物質（下、反射）の主要なクロマトグラフィーピークのマススペクトル。SAR11_1361では、コハク酸ビス（トリメチルシリル）のマススペクトルに特徴的なイオンがないため、オレンジ色で示したブランクラン（試薬のみ）との比較により、コハク酸の存在を示しています。タンパク質サンプルに追加された3つのピークは、グリセロール（タンパク質精製由来）、コハク酸、α-メチルグルコシド（内部標準）の順に対応します。SAR11_0655(a)とSAR11_0769(b)については、共精製リガンドが同一であることを示すさらなる証拠が、外因性リガンドを添加せずに得られたタンパク質の結晶構造から得られた。共精製リガンドの電子密度は、様々なレベル（SAR11_0655の場合、炭素原子と酸素/窒素原子を区別するため）でコンター化したmFo-dFc省略マップで示されている。

Extended Data 図4 SAR11_1210とl-アルギニンの非正規結合様式。

(a-c) SAR11_1210とl-アルギニンの複合体の結晶構造（1.32Å）。ラージドメイン、スモールドメイン、ヒンジ領域をそれぞれ緑、オレンジ、紫で示す。(a）全体構造。(b) l-アルギニン分子の電子密度。+3σで等値化したmFo-dFcomit mapで示す。(c-d) このSBPファミリーに典型的なアミノ酸結合モチーフを示す(c) SAR11_1210と(d)Geobacillus stearothermophilus由来の相同なリジン/アルギニン/オルニチン結合タンパク質（Kd39 nM, PDB ID2Q2A）とのl-アルギニンの結合様式の比較。残基はSAR11_1210の相同位置に従って番号が付けられている。(e-g) SAR11_1210のl-アルギニンに対する結合親和性に対するE108A置換の影響。(e,f) SAR11_1210とSAR11_1210(E108A)の等モル混合物とl-アルギニンとの競合的ITC滴定。(g) SAR11_1210のWTおよびE108A変異体とl-アルギニンの相互作用に関する熱力学的パラメータ。棒グラフはテクニカルレプリケート（別々の滴定）の平均を表し、個々のデータポイントとして示されている（WT,n= 5; E108A,n= 3）。

Extended Data 図5 SAR11_0769に対するβ-d-グルコースの結合様式。

(a-b) SAR11_0769とd-グルコースの滴定の代表的なITCデータ。(a) 2-sets-of-sites結合モデル、または(b) d-グルコースの2つのアノマー型を考慮した競合結合モデルに適合。(c-e) SAR11_0769とβ-d-グルコースの複合体の結晶構造（1.86Å）。(c) 全体構造。(d）β-d-グルコース分子と隣接する水分子の電子密度。アノマー水酸基の密度が明瞭に分解されている。(e）β-d-グルコースの結合様式。

Extended Data 図6 世界の海洋メタゲノムにおけるSAR11（Ca. P. ubique HTCC1062）由来のSBP遺伝子の存在量。

(a)TaraOceans OM-RGCv2+Gメタゲノムデータセットの表層サンプルにおける各遺伝子の存在量を示す。データはOcean Gene Atlas v2.0から10-30のe-valueカットオフを用いて取得し、ABC SBPについては40%、TRAPおよびTTT SBPについては55%の配列同一性閾値を用いてフィルタリングした。各位置における存在量は、マップされたリードの割合として表され、直線スケール上の点面積で表される。(b)OM-RGCv2+Gメタゲノムデータセットの表層/表層（SRF、n= 83、実線）、深層クロロフィル極大（DCM、n= 53、ストライプ）、中層（MES、n= 38、チェッカーボード）サンプルにおける各SBPの存在量を比較した箱ひげ図（中央線は中央値、箱ひげは25パーセンタイルと75パーセンタイル、ひげは最大値と最小値）。統計的比較は補足表12に示す。

Extended Data 図7 世界の海洋メタトランスクリプトームにおけるSAR11（Ca. P. ubique HTCC1062）由来のSBP遺伝子の存在量。

(a)TaraOceans OM-RGCv2+Tメタトランスクリプトームデータセットの表層サンプルにおける各遺伝子の存在量を示す。データはOcean Gene Atlas v2.0から10-30のe-valueカットオフを用いて取得し、ABC SBPについては40%、TRAPおよびTTT SBPについては55%の配列同一性閾値を用いてフィルタリングした。各位置における存在量は、マップされたリードの割合として表され、直線スケール上の点面積で表される。(b)OM-RGCv2+Tメタトランスクリプトームデータセットの表層/表層（SRF、n= 103、実線）、深層クロロフィル極大（DCM、n= 49、ストライプ）、中層（MES、n= 26、チェッカーボード）サンプルにおける各SBPの存在量を比較した箱ひげ図（中央線、中央値、箱限界、25%および75%分布、ひげ、最大値および最小値）。統計的比較は補足表12に示す。

Extended Data 図8 Ca. P. ubique HTCC1062から選択したSBPの系統解析。

(a) UniProtKB Reference ProteomesとSwiss-ProtデータベースのSAR11_0655、SAR11_0953、SAR11_1336の1000ホモログの最尤系統樹。SAR11 SBPの位置を矢印で示す。ノードは分類名と、対応するタンパク質のCaと比較して保存されている結合部位残基の割合で色分けされている。P. ubique HTCC1062。(b) (a)で表示した配列の分類学的分布。SAR11_0655の場合は、(a)で示したクレードに属する配列のみを考慮した。

Extended Data 図9 SAR11_0655とSAR11_1361のゲノム状況から、 Ca. P. ubique HTCC1062。

ABCトランスポーター遺伝子（SBP遺伝子を含む）はオレンジ色で、輸送された基質の代謝に関与すると推定される遺伝子は赤色で示した。(a)SAR11_0655（9,248bp）のゲノムコンテキスト。SAR11_0662-SAR11_0664は大腸菌由来のpxpABC遺伝子と相同である（配列同一性30.0%）。pxpABCは5-オキソプロリナーゼをコードし、ATP依存的にl-ピログルタミン酸からl-グルタミン酸への加水分解を触媒する90。 (b) SAR11_1346およびSAR11_1361のゲノムコンテキスト（14,635 bp）。SAR11_1354は、グルタル酸をl-2-ヒドロキシグルタル酸に変換し、l-リジンからα-ケトグルタル酸への異化に関与するグルタル酸2-ヒドロキシラーゼをコードする大腸菌由来のcsiDと高い配列同一性（41.5%）を示す91。Ca. P.ubiqueのオペロンにはl-リジン異化経路の残りは欠損しているが、機能未知のFAD依存性オキシドレダクターゼ（SAR11_1353）が含まれており、l-リジン異化経路と類似してl-2-ヒドロキシグルタル酸をα-ケトグルタル酸に変換している可能性がある。略号：αKG、α-ケトグルタル酸。(c)1H-NMR(500 MHz,D2O)によるSAR11_1354のin vitroグルタル酸2-ヒドロキシラーゼ活性の実験的確認。α-ケトグルタル酸およびグルタル酸のコハク酸および2-ヒドロキシグルタル酸への完全変換が観察された。反応条件 1 mM グルタル酸、1 mM α-ケトグルタル酸、100 µM Fe(NH4)2(SO4)2、5 µM SAR11_1354、20 mM 酢酸アンモニウム緩衝液、24 °C で 16 時間インキュベート。右は反応混合物、左は酵素なしのコントロール。アスタリスクの付いたピークは酢酸に対応する。SAR11_0662-0664とSAR11_1353の機能検証も試みたが、SAR11_0662とSAR11_1353は大腸菌で可溶性発現できなかった。

Extended Data Fig. 10 SAR11_0769とSAR11_1361の対照的な系統分布。

(a) UniProtKB Reference ProteomesとSwiss-Protデータベースから得られたSAR11_0769とSAR11_1361のホモログ500の最尤系統樹。SAR11_0769とSAR11_1361の位置を矢印で示す。ノードは分類名と、対応するタンパク質のCaと比較して保存されている結合部位残基の割合で色分けされている。P. ubique HTCC1062。SAR11_0769はバクテリアの間に広く分布しているが、SAR11_1361は主にSAR11バクテリアと他の海洋性アルファプロテオバクテリアのごく一部に限られているようである。(b)SAR11_1361と類似の結合部位を持つタンパク質配列（類似の機能を持つことが示唆される）を示す、SAR11_1361系統樹のクレードの拡大図（aで示される）。

補足情報

補足情報

補足方法；補足注1-10；補足図1-12；補足表1、2、4-8、10-13および参考文献。

報告概要

査読ファイル

補足データ1

個々のITC実験のデータ。

補足データ2

これまでに報告されたSBPの結合親和性。

補足表3

SBP機能のハイスループットスクリーニングに使用したリガンドの全リスト。

補足表9

本研究で使用したオリゴヌクレオチドおよび合成遺伝子の配列。

権利と許可

オープンアクセスこの論文は、クリエイティブ・コモンズ表示-非営利-改変禁止4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、ライセンスされた素材を改変したかどうかを示す限り、いかなる媒体または形式においても、非営利目的での使用、共有、配布、複製を許可するものである。本ライセンスの下では、本記事またはその一部から派生した翻案物を共有する許可はありません。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制により許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/。

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この記事の引用

Clifton, B.E., Alcolombri, U., Uechi, GI.et al.ユビキタス海洋細菌の超高親和性輸送タンパク質。Nature(2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07924-w

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  • 2023年3月10日受領

  • 2024年8月07日受理

  • 2024年9月11日発行

  • DOIhttps://doi.org/10.1038/s41586-024-07924-w

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ネイチャー (Nature)ISSN 1476-4687 (online) ISSN 0028-0836 (print)

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