反復入浴が犬の皮膚微生物叢に及ぼす影響

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反復入浴が犬の皮膚微生物叢に及ぼす影響

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2023年8月12日
反復入浴が犬の真皮微生物叢に与える影響

反復入浴が犬の皮膚微生物叢に及ぼす影響

Dakota Discepolo1°* Russell Kelley2° Adrian Watson2° Erin Perry1°
1°米国イリノイ州カーボンデール、南イリノイ大学、動物科学・食品・栄養学科
2°ロイヤルカナンUSA、ペットヒース栄養センター、ルイスバーグ、OH、USA
はじめに 作業犬は日常的に、汚染物質や汚れを除去するために毎日の入浴を必要とするような環境条件の中で活動している。頻繁あるいは反復的な入浴が犬の皮膚微生物叢に及ぼす影響は不明である。本研究の目的は、毎日の反復入浴後のイヌの真皮微生物集団の変化を明らかにすることである。

方法：ラブラドール・レトリーバー（n = 16）を14日間にわたり、食器用洗剤の希釈液（1.6％洗剤液）で毎日入浴させた。0日目、7日目、14日目、16日目、21日目、28日目、35日目、42日目、49日目に採取した滅菌スワブ（n = 142）を用いて真皮微生物DNAを収集し、16秒シークエンシングにより真皮微生物叢の変化を評価するため、α多様性、β多様性、相対存在量を分析した。

結果：毎日の入浴により、Shannon、Chao1、およびいくつかの稀なバリアントアンプリコン配列の多様性が有意に増加した。一般的に高い存在量が報告されているが、相対的存在量は放線菌門、ファーミキューテス門、プロテオバクテリア門で減少した（p < 0.05）。

結論：希薄な食器用洗剤による毎日の反復入浴は、正常な健康な真皮微生物分類群を有意に減少させ、イヌの真皮微生物叢に有意な変化をもたらした。イヌの真皮微生物叢の変化は、イヌの真皮の健康に悪影響を及ぼす可能性があり、さらなる調査が必要である。

1.はじめに
イヌの真皮微生物叢に関する現在の研究は、アレルギーやアトピー性皮膚炎などの病態に焦点を当てている。これまでの報告では、健康な個体群と疾患個体群の両方における優勢な分類群の相対的な存在量が特徴づけられている（1-4）。プロテオバクテリア（Proteobacteria）、ファーミキューテス（Firmicutes）、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）、アクチノバクテリア（Actinobacteria）がより多く存在することがいくつかの研究で報告されている（1-4）。皮膚常在細菌叢には多くの要因が影響する。アトピー性皮膚炎は、微生物組成に大きな変化をもたらすことが報告されている(1, 5)。

真皮微生物叢に影響を及ぼす因子を特定することを目的としたこれまでの取り組みでは、個人差が微生物変化の主な要因であることが報告されている（4）。その他の要因としては、サンプルの解剖学的部位や人種などがある。さらに、食事の影響も真皮微生物叢に潜在的な影響を与える原因として同定されている(6)。真皮微生物叢に悪影響を及ぼす可能性のあるその他の要因としては、洗浄剤や洗剤の使用などの局所的治療が挙げられる。

洗浄剤への暴露は、おそらく皮膚pHの変化によるものであろうが、ヒトにおける真皮微生物叢の乱れの一因であることが報告されている（7-10）。また、皮膚刺激もpHの変化と関連している（11、12）。しかしながら、洗浄剤や洗剤がイヌの真皮微生物叢に与える影響については、現在のところ科学的文献にはあまり記載されていない。

イヌにとって真皮常在細菌叢の変化は重要かもしれないが、ヒトにも影響が及ぶ可能性がある。これまでの報告では、イヌと接触しているヒトは真皮や腸内細菌叢を共有していることが示されている(13-15)。イヌやその他の家畜のペットはフォマイトとして機能し、ブドウ球菌を含む病原性細菌を媒介することが報告されている（16-19）。イヌの真皮微生物叢の常在菌であるS. pseudintermediusは、ヒトの皮膚に定着して感染を引き起こす可能性がある(17)。イヌからヒトに感染するケースもあるため、ヒトへの感染率はよくわかっていない。また、S.pseudintermediusの特定株は、S.aureusと同様に複数の薬剤に耐性を示し、治療を複雑にしている(18, 20)。従って、これらの潜在的な病原体を増加させる要因は、健康リスクを増大させるので避けるべきである。皮膚マイクロバイオームにコロニーを形成する病原体は、ヒトの取扱者に潜在的なリスクをもたらす。

作業イヌは頻繁にハンドラーや器具の近くで生活したり、移動したりするため、病原性細菌がコロニー形成された場合、拡散する可能性が高まる。さらに、災害現場（21）や都市環境（22, 23）のような配備された場所では、汚染物質にさらされる可能性が高いため、作業イヌの管理には、必要な汚染除去プロトコルの一部として洗剤を頻繁に使用することが含まれる。しかし、この勧告は、捜索救助（SAR）イヌが最大14日間連続して災害現場に派遣される可能性があり、毎日の除染が必要であることを考慮していない。ワシントン州オソの地すべりに対応したイヌの評価では、3日以内に食器用洗剤で毎日除染したイヌの皮膚刺激が報告されている（24）。このような除染手順により、皮膚刺激と関連することが多い皮膚微生物叢が変化した可能性がある。報告された症状は、洗剤の使用を中止すると減少した。

毎日の洗剤使用が真皮微生物叢に及ぼす影響と、入浴を中止した後の回復力を明らかにするためのデータが必要である。そこで本研究の目的は、食器用洗剤を用いた毎日の除染に伴う真皮微生物叢の変化を明らかにし、除染中止後の真皮微生物叢の回復を特徴付けることである。

2.材料と方法
2.1.動物と治療
本研究は、Southern Illinois UniversityのInstitutional Animal Care and Use Committee（15-032）およびRoyal Canin倫理委員会の承認を得た。本研究では研究コロニーのラブラドール・レトリーバー（n = 16）を使用した。ラブラドール・レトリーバーは、作業犬としてもペットとしても人気のある犬種であることから選択された。除外基準には、抗生物質などの薬剤の使用、アレルギーの既往、皮膚疾患の既往が含まれた。イヌは犬舎に収容され、屋内・屋外ラン1つにつき2頭ずつ飼育された。すべてのイヌは毎月の寄生虫駆除と標準的なワクチン接種を受けていた。この施設には、研究対象群に何らかの不快感や病気が発生した場合に備え、獣医チームが常駐していた。1頭のイヌが14日目にヒップポイントでアトピー性皮膚炎を発症したため、IACUCのガイドラインと獣医チームの勧告に従い、治療を継続するためにさらなる試験から除外された。イヌにはNRCの要求値であるタンパク質21％、粗脂肪10％以上を満たすように配合されたチキンベースの飼料を与えた。イヌは試験開始前に最低90日間、この飼料に順応させた。

すべてのイヌは模擬除染を1日1回、連続14日間受けた。試験プロトコールは、イヌの除染方法について以前に発表された推奨事項（25）を参考にした。除染は訓練を受けた技術者が行い、水温（約36℃）、洗浄順序、洗浄圧、すすぎ時間を管理した。除染は、首の付け根から尾の先まで水を噴射するスプレーノズルを用いて、枝肉全体を飽和状態にすることから始まった。16オンスの希釈食器用洗剤溶液（Dawn dish detergent, Proctor & Gamble, Cincinnati, OH; 水3.7Lに対して希釈洗剤59ml）を肩、背中、胸郭、胸部、腹部、脚部にまんべんなく塗布した。イヌの肩、背中、左側、右側、胸部、腹部を泡が出るまでマッサージした。背側および腹側の解剖学的部位は泡で2分間マッサージした。脚を泡立て、それぞれ 30 秒間洗浄した。各イヌを石鹸残渣がなくなるまで（約4～5分）すすいだ。清潔なタオルを 2 枚使い、イヌをタオルドライした。イヌの被毛は湿ったままにしておいたが、飽和状態にはしなかった。タオルはすべて100％コットンで、同じブランドとモデルのシリーズ（Towelhub, Atlanta, GA）を使用した。

2.2.データ収集と目視評価
訓練された技術者1名により、0日目、7日目、14日目、21日目、28日目、35日目、42日目、49日目に皮膚スワブを採取し、目視評価を行った。0日目の採取は除染開始前に行われた。皮膚微生物叢スワブは、Norgen Biotechnology社（カナダ、オンタリオ州）の全DNA保存・スワブ採取システムを使用し、30秒間の連続回転皮膚接触を用いて、右ヒップポイントの3cm2°の領域から採取した。製造元の推奨に従い、各データ収集の前に、収集部位を#40の刃（Oster, Boca Raton, FL）で毛の生える方向に沿って剃毛した。最後の汚染除去から48時間後の変化を観察するため、16日目に皮膚微生物叢の追加採取を行った。

皮膚の健康スコアの評価は2名の訓練された技術者が行った（補足資料1参照）。被毛の光沢、被毛の状態、背中のふけ、体のふけを、以前に発表された研究（11, 26, 27）を参考にスコア化した。視覚的評価はすべて0～4（最低～最高）で行い、半点刻みで評価した。

2.3.微生物叢分析
南イリノイ大学にて、Norgen Microbiota DNA分離キット（カナダ、オンタリオ州）を用いて、綿棒から微生物DNAを抽出した。分離されたDNAは、16Sアンプリコンシークエンスパイプラインを通して次世代シークエンシング（Diversigen Inc.） DNA濃度が低かったため、8サンプルが除外された。したがって、ここで報告するデータには134の皮膚微生物サンプルが含まれる。注目すべき変数には、試験日、被毛の光沢、被毛の状態、体のふけ、背中のふけに関連する差異が含まれる。

2.4.アルファ多様性分析
犬の真皮微生物叢のα多様性の解析は、アンプリコン配列変異体（ASV）を用いて行った。サンプルの10％未満に存在する希少なASVはASV表から除外され、合計1,530個のASVが得られた。アルファ多様性の3つの異なる指標、Shannon、Chao1、および観察されたASVは、Rのveganパッケージを使用して、最小配列決定深度に希釈されたフィルタリングされたASV数表から計算された。毎日の入浴がアルファ多様性に影響するかどうかを調べるために、日を固定効果として、犬のアイデンティティをランダム効果として含む線形混合モデルが使用された［アルファ多様性〜日＋（1|犬名）］。さらに、日、皮膚・被毛スコアおよびそれらの交互作用を固定効果として、犬のアイデンティティをランダム効果として含む線形混合モデル［α多様性～日 * 変数 + (1 | 犬名)］を構築し、毎日の入浴に関する交絡効果を同定するために使用した。

2.5. ベータ多様性分析
ベータ多様性分析は、3つの異なる距離法を用いて実施した： Bray-Curtis法、重み付けなしUniFrac法（不在の存在のみを考慮）、重み付けUniFrac法（分類群の多さを考慮）。さらに、Rのveganパッケージのenvfit関数を用いて、調査日によるベータ多様性の変化、および皮膚と被毛の状態スコアによる影響を評価した（図2）。

www.frontiersin.orgFigura 1. Bray Curtis距離のPCoAを試験日別に色分けしたもの（p = 0.001, R2° = 0.27）。
www.frontiersin.orgFigura 2. Bray-Curtis距離のPCoAを日別に色分けしたもの（p = 0.001、R2° = 0.27）、およびフケスコアによる形状（p = 0.025、R2° = 0.0708）。
2.6.存在量の差
存在量の差分析は、門、目、科、属、ASVを含むすべての分類学的レベルで行った。微生物群データの組成性を考慮するため、ALDEx2 Rパッケージに実装されているモンテカルロ（MC）サンプリング（N = 20インスタンス）を用いて、生の分類群カウントを中心対数比（CLR）変換した存在量分布に変換した。毎日の入浴に関連する分類群存在量の変化を評価するために、CLR変換された存在量の各MCインスタンスにおいて、各分類群について日を固定効果として、犬のアイデンティティをランダム効果として含む線形混合モデルを作成した：taxon ~ day + (1|dog name)。さらに、日、皮膚・被毛スコアおよびそれらの交互作用を固定効果として、犬のアイデンティティをランダム効果として含む線形混合モデル [taxon ~ day * variable + (1|dog name)] を構築し、毎日の入浴に関する交絡効果を同定するために使用した。

生のps値を各MCインスタンス内で収集し、Benjamini-Hochberg（BH）法を用いて多重仮説検定（多重分類群検定）のために補正した。すべてのMCインスタンスにわたる平均期待p値は、生p値とBH補正p値について計算され、最終結果として報告された。有意な分類群については、LOESS回帰に平滑線を重ねた経時的なCLR変換分類群存在量の散布図を作成した。さらに、ある分類群が視覚的評価と有意に関連する場合、その変数の箱ひげ図／短冊図を作成した（図3）。

www.frontiersin.orgFigura 3.背中のふけ（p < 0.001）の日ごとのレベル（p = 0.69）の違いによる藍藻類の現存量を示す箱ひげ図。
3. 結果
3.1.アルファ多様性
その結果、毎日の入浴によって、シャノン多様性（p < 0.001）、Chao1（p < 0.001）、および観察されたASVの数（p < 0.001）が調査期間を通じて増加した（図4）。各指標のアルファ多様性は35日目にピークに達した。被毛の状態はChao1指数に影響を与えた（p = 0.018）。サンプルの豊かさを測定するChao1は、被毛の状態が最も低いスコア（スコア＝1）で増加した。このことから、真皮微生物叢の種の豊富さと被毛の状態スコアには逆相関があることが明らかになった。さらに、被毛のふけはChao 1に影響を与え（p = 0.039）、ふけスコアが1ではChao 1が低く、スコア2ではChao 1が高くなった（図5）。フケのスコアが上がると種の豊富さは増加したが、被毛の状態が良くなる（スコアが上がる）と豊富さは減少した。被毛の状態と背中のふけの変化は、調査日の変化に関連した変化とは相互作用しなかった。

www.frontiersin.orgFigura 4. 毎日の入浴は、シャノン多様性指数（p < 0.001）、Chao1（p < 0.001）、および観察されたASVの数（p < 0.001）を有意に増加させた。
www.frontiersin.orgFigura 5.後肢ふけのレベル別のChao1指数を示す箱ひげ図（p = 0.0389）。
3.2 ベータ多様性
非加重UniFrac距離が日間で有意に異なることから、分類群の存在は毎日の入浴に影響された（p = 0.001, R2° = 0.27）。予想通り、同じ犬から採取したサンプルは、他の犬から採取したサンプルと比較して高い類似性を示した（p = 0.001, R2° = 0.31）（図6）。分類群数を考慮すると、UniFrac加重距離は日による影響を受けなかったが（p = 0.851, R2° = 0.00266）、犬によるクラスタリングは維持された（p = 0.001, R2° = 0.345）。これらのデータから、分類群数は毎日の入浴には影響されず、特定の分類群の有無にのみ影響されることが示された。

www.frontiersin.orgFigura 6. 犬によって色分けされたブレイ・カーティス距離のPCoA（p = 0.001 R2° = 0.31）。
β多様性指標と被毛の状態、被毛の光沢、背中のフケとの間にも有意な関連が見られ、それぞれの変数がサンプル間の違いに寄与していることが示された。Bray-Curtis距離を用いると、被毛の状態（p = 0.052）、被毛の光沢（p = 0.004）および背中のふけ（p = 0.025）（図2）は、皮膚微生物叢組成の変化と関連していた。統計モデル内でこれらの変数をコントロールしても、微生物組成の日間差は有意なままであった（p = 0.001、R2° = 0.27）（図1）。

3.3.存在量の差
毎日の入浴は、放線菌（p < 0.001）、ファーミキューテス（p < 0.001）およびプロテオバクテリア（p < 0.001）を含む、一般的に優勢な細菌の相対存在量を有意に減少させた（図7）。さらに、属レベルで60の分類群の存在量が毎日の入浴によって有意に変化した。最も多い25種をヒートマップで示した（図8）。藍藻類はふけ（p < 0.001）と有意な関係があったが、日（p = 0.69）とは関係がなかった。さらに、シアノバクテリアの変化について、日数とふけスコアとの交互作用は見られなかった（p = 0.856）。しかし、ふけスコアが増加するにつれて、藍藻類の存在量が増加したことは重要である（図3）。

www.frontiersin.orgFigura 7.毎日の入浴は、門レベルで放線菌（p < 0.001）、ファーミキューテス（p < 0.001）、プロテオバクテリア（p < 0.001）分類群の存在量を減少させた。
www.frontiersin.orgFigura 8. 時間の経過とともに有意に変化した最も豊富な25属のCLR変換存在量を示すヒートマップ。属が分類されていない場合は、その最も高い分類レベルがヒートマップに示されている。
4. 考察
イヌの真皮微生物叢のより良い理解は重要な研究分野であり、イヌの真皮の健康にとって極めて重要な要素である。存在する分類群に関するこれまでの報告では、アトピー性皮膚炎（AD）などの疾患状態に関連する生物に焦点が当てられてきた（5）。これまでの除染の推奨には、毎日除染を行うイヌには食器用洗剤またはアルカリ性洗浄剤を使用することが含まれていたが（25）、今回発表されたデータはこれらの推奨に疑問を投げかけるものである。さらに、配備中のイヌに食器用洗剤で毎日除染を行った結果、皮膚に炎症が生じたという報告もある（24）。今回発表されたデータは、これまでの食器用洗剤の使用推奨に関連した、皮膚微生物組成の変化に関する新たな証拠となるものである。

ADを発症したイヌの皮膚微生物叢に関する研究では、健康な皮膚のイヌ集団とADを発症したイヌ集団との間に重要な違いがあることが報告されている（1、3、5、28）。一般的に、健康なイヌとADを発症したイヌには同じ一般的な分類群が存在するが、これらの分類群の存在量は健康状態によって異なる（1, 3）。これらの研究では、イヌはプロテオバクテリア（Proteobacteria）、ファーミキューテス（Firmicutes）、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）、シアノバクテリア（Cyanobacteria）などが優勢であると報告されている（1, 2, 4）。しかし、ADに罹患したイヌでは、健康なイヌに比べて観察された分類群の数が全体的に少ないという矛盾した結果が報告されている(2)。これらの相違は、被毛のタイプ、解剖学的部位、あるいは研究集団の犬種の違いによって説明できるかもしれない。しかし、これまでの研究では、相対的な存在量がADと関連し、いくつかの主要な分類群が健常対照群と比較してより多く存在するようになるという点で一貫して一致している。

これまでの研究と同様に、本研究でも、プロテオバクテリア、ファーミキューテス、およびアクチノバクテリオータが優勢な門として同定された(1, 2, 4)。毎日の入浴は微生物組成に影響を及ぼし、UniFracの重み付けされていない距離は、研究日を通して有意にクラスター化した。さらに、毎日の入浴は、シャノン多様性、Chao1、および観察されたASVの数を有意に増加させた。これらの結果は、種の豊富さだけでなく、それらの種の存在量も調査期間を通じて異なっており、活発な入浴期間中により大きな影響が観察されたことを示している。多様性は入浴停止後に増加し、調査期間を通じて継続したが、ベースラインの測定値には戻らなかった。これらの結果は、食器用洗剤で繰り返し入浴することによって、種の豊富さが増加し、真皮微生物叢のそれらの種の存在量も増加したことを示しているのかもしれない。

提示された結果の傾向から、アルファ多様性の測定値が最も低かったのは7日目であったことは興味深い。この傾向は、非常に希薄な食器用洗剤溶液による毎日の除染を1週間行っただけで、常在菌の分類群にすでに悪影響が生じたことを示しているのかもしれない。しかし、真皮微生物叢がどの程度の速度で損なわれ、どの程度の速度で回復するのかをよりよく理解するためには、さらなる試験が必要である。

報告されたα多様性の変化は、毎日の入浴を繰り返す間に、最も優勢な真皮微生物叢の相対的存在量の変化を伴っており、これらの分類群の存在量は、研究全体を通じて、当初のベースライン測定値よりも減少していた。これらの知見は、α多様性指標の変化とともに、連続入浴がイヌの真皮微生物群に持続的な影響を与えることを確認した。しかし、これらの変化が有益かどうかは現在のところ不明である。入浴処理によってより優占的な分類群の生息数が減少し、非居住的な分類群がより多くの資源を利用できるようになり、その存在感が高まった可能性がある。この説は、7日目に観察されたアルファ多様性の減少によって支持されるかもしれない。本研究で優占した門（プロテオバクテリア、ファーミキューテス、アクチノバクテリオタ）は7日目に存在量のピークを迎え、その後存在量は減少したが、これは種の豊かさの増加につながる可能性がある。種の豊富さの増加は、すべての場合において有益であるとは限らない。このような変化は、以前に示唆されたようにアトピー性皮膚炎を引き起こす可能性がある(1-3)。さらに、イヌが生活および/または就労する環境に存在する人獣共通感染病原体のコロニー形成が増加する可能性もある。

これまでの研究からは、分類群の存在量や個体数の変化が、栄養（水分や脂質）の利用可能性の低下による皮膚疾患の結果なのか、あるいは皮膚バリアの完全性の変化によるものなのかは不明である。しかし著者らは、微生物プロフィールの変化は真皮の健康状態の変化を示すものであると結論づけている(29, 30)。経表皮水分喪失量（TEWL）や皮膚pHなどの測定を通じて、真皮微生物叢と皮膚疾患およびバリア機能障害との関係をより明確にするために、さらなる研究が必要である（31, 32）。

上述のいくつかの研究では、ブドウ球菌の増加が主にイヌのADと関連していることが判明している（2、3、5）。ここで示したデータは、ブドウ球菌の有意な増加が連続入浴時にピークに達し、毎日の入浴がなくなるとベースライン値より低下することを示している。この知見は、食器用洗剤による犬の毎日の反復入浴が、AEまたは感染のリスクを増加させることを示している可能性がある。このリスクの増加は、皮膚上の水分にさらされる機会が増加した結果であり、また皮膚pHの浄化作用によりブドウ球菌が増殖しやすい環境になった結果である可能性がある。この研究では属を超えた報告をしていないが、もしこれらの増加したブドウ球菌がS. pseudintermediusやS. aureusのような潜在的な病原体であれば、この所見はハンドラーやチームメイトに対するリスクの増加を示している可能性がある。今後の研究では、反復入浴に関連したブドウ球菌種の変化が、記載されているような人獣共通感染症の病原体を引き起こすかどうかを明らかにすべきである。

これまでの研究で、被毛の状態スコアおよびフケと皮膚の健康との間に関係がある可能性が指摘されている（27、33、34）。今回発表された知見は、皮膚微生物叢と被毛の状態およびフケとの関係を示す新たな証拠となる。これらの知見は新規のものであり、真皮の微生物叢が真皮の健康において重要な役割を果たしていることを示すさらなる証拠となる。さらにこれらのデータは、視覚的特徴と真皮微生物叢の関連性が、Bray-Curtis距離を用いたβ多様性の有意な変化に基づくことを示唆している。これらの違いは、分類群の存在と相対的存在量の両方を考慮した場合、視覚的評価がサンプル間の差のかなりの部分を占めていることを示している。種の豊富さ（Chao 1）のα多様性値は、ふけに加えて被毛の状態によっても有意な差があった。これは、フケが目立つようになる（スコアが増加する）と種の豊富さは減少し、被毛の状態が改善する（スコアが増加する）と種の豊富さは減少することを示している。これは相反する結果であるが、真皮治癒の一環として脂質産生が増加し、被毛の状態に影響を与えた可能性がある(35)。最後に、視覚的評価とともに、いくつかの分類群の存在量も変化した。その一例が、ふけとの関係におけるシアノバクテリアの変化である。シアノバクテリアの存在量は、ふけスコアが高くなるにつれて増加した。二次代謝産物として生成される細胞毒素（既知の発がん性物質）のため、シアノバクテリアの存在量の増加は特に懸念される(36)。さらなる研究では、分類群における個々の変化と、被毛や皮膚の健康状態の変化との関係の可能性を調べる必要がある。

本研究でイヌを連続的に除染した結果、イヌの真皮微生物叢に長期にわたる変化が生じたことは明らかである。これまでの研究で、真皮微生物叢は表皮の表面を越えて真皮にまで及んでいることが示されており（37）、除染と入浴方法に関する今後の研究では、表皮の表面を越えた真皮微生物叢の影響を調査すべきである。他の研究では、解剖学的部位によって分類群の組成や存在量が変化する可能性が指摘されている。今後の研究では、様々な解剖学的構造をサンプリングし、可能性のある差異を特定する必要がある(1)。

真皮微生物叢と真皮の健康との関係の全容は不明であるが、フケの発生に関連した真皮微生物叢の変化も、密接な関係を支持すると思われる知見である。この研究で使用した除染プロトコルで使用した洗剤は、現場で通常使用されるものより希薄であることも重要である。現場で使用される食器用洗剤は一般的に希釈されていないため、さらに大きなダメージを与える可能性がある。したがって、今後の研究では、イヌの皮膚バリアと微生物叢への影響を軽減できる効果的な代替洗浄剤および／または獣医学的使用が承認されている方法を探す必要がある。

  1. 結論
    除染をシミュレートするために高濃度の食器用洗剤を用いた反復入浴は、イヌの皮膚の常在細菌叢に大きな影響を与えた。これらの変化のうち、ブドウ球菌の増加が見られた。ブドウ球菌は以前からアトピー性皮膚炎と関連しており（2, 3, 5）、その中にはヒトの健康に影響を及ぼす可能性のある株もある（19, 20）。除染プロトコールに使用した食器用洗剤は、現場で一般的に使用されている一般的な原液に比べ極めて希薄であったが、最終入浴後35日以内に基本量に回復することなく、イヌの真皮微生物叢の最も顕著な分類群のいくつかに影響を与えた。アルファ多様性指標におけるこれらの変化の傾向は7日目に最小に達したが、これは入浴シリーズの半分に過ぎず、標準的なイヌSARの展開時間の半分に相当する。このような方法を14日間の全展開期間にわたって現場で使用した場合、イヌの皮膚微生物叢は、より深刻ではないにせよ、同様の崩壊を経験すると予想される。また、7日後に影響が現れる可能性もあるが、この知見をさらに探るにはさらなる研究が必要である。

さらに、これらのデータは、微生物叢の変化と被毛の状態およびフケのスコアとの間に、これまで未解明だった関係があることを明らかにした。これらの関連性は、皮膚微生物叢の変化が、ふけや被毛の状態評価の変化を通じて視覚的に観察できる可能性を裏付けている。

  1. 研究の限界
    本研究は2020年春に実施されたため、COVID 19の大流行により、研究技術者の移動制限により、より多くの研究集団にアクセスすることができなかった。その他の限界としては、培養に基づく方法がないこと、水だけで除染集団をコントロールできないことなどが挙げられる。今後の研究では、水のみによる除染の効果を検証し、介助犬やセラピー犬を含む作業分野で一般的に使用される犬種を使用し、様々な解剖学的部位の微生物分析を行い、皮膚環境全体と入浴に伴う影響をより完全に把握する必要がある。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表されたデータは、オンラインレポジトリFigshareで見ることができる。Figshare doi: 10.6084/m9.figshare.23403308はhttps://figshare.com/projects/Impacts_to_canine_dermal_microbiota_associated_with_repeated_bathing/169451。

倫理的声明
この動物実験は、Southern Illinois University Institutional Animal Care and Use Committee（15-032）およびRoyal Canin倫理委員会の審査・承認を得た。

著者の貢献
DDは試験デザイン、データ収集、データ解析、統計解析、原稿作成に参加した。RKは試験デザイン、データ収集、統計解析、原稿のレビューに参加した。EPはすべての面を監督した。AWは試験デザイン、原稿の準備と修正に参加した。すべての著者が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。

資金提供
本研究の資金はすべてロイヤルカナンSAS（650 Av. de la Petite Camargue, 30470 Aimargues, France）から提供された。

謝辞
著者らは、本研究がRoyal Canin SAS, Aimargues, Franceから資金提供を受けたことを表明する。資金提供者は本試験に以下の関与をした：著者RKとAWは本試験中Royal Canin SASに雇用され、本試験中に使用する施設と設備を提供した。

利益相反
RKとAWはRoyal Canin SASの従業員であった。

残りの著者は、潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない中で研究が実施されたことを宣言する。

編集者注
本論文に記載された内容はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものではありません。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、あるいはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証されるものでも、保証するものでもない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2023.1204159/full#supplementary-material。

参考文献
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受理：2023年4月11日、承認：2023年7月18日；
発行：2023年08月09日。

編集者

カタリナ・ネナドヴィッチ、ベオグラード大学、セルビア。

査読者

ジャニス・ローレン・ベイカー（獣医戦術グループ、米国）。
Nemanja Zdravkovic, セルビア、セルビア獣医科学研究所

Copyright © 2023 Discepolo, Kelley, Watson and Perry. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。

*Correspondence: Dakota Discepolo, Dakota.discepolo@siu.edu

免責事項：本論文で表明されたすべての声明は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者のものを代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証されるものでも、支持されるものでもありません。

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