糞便微生物叢移植は離乳子豚の空腸宿主-微生物叢界面を調節する

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糞便微生物叢移植は離乳子豚の空腸宿主-微生物叢界面を調節する


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概要

背景

離乳期に関連する腸疾患は養豚業界における大きな懸念事項である。この研究は、離乳後下痢（PWD）を含む離乳後の主要な腸疾患に主に関与するにもかかわらず、微生物学的変化という点ではあまり研究されていない腸のセグメントである、離乳期の子豚の空腸に対する糞便微生物叢移植（FMT）の効果を調査するものである。3週齢の子豚32頭を2群に均等に分けた： コントロール群とFMT群である。FMT群には、離乳後1日目と3日目に3ヵ月齢の健康な豚の糞便微生物叢調製液を投与した。各群の半数にFMT後10日目に腸管毒素原性大腸菌（ETEC）を接種した。離乳後3週目（FMT後14日目と18日目）に子豚を安楽死させ、マイクロバイオーム、メタボローム、トランスクリプトーム解析のために腸管組織と内容物を採取した。

結果

空腸微生物叢は、FMT後3週目に回腸および結腸と比較してα多様性の有意な増加を示した。FMTは空腸微生物叢組成を有意に濃縮したが、対照の離乳子豚では複数の細菌属が特異的に欠如していた。FMTはビフィズス菌科のPseudoscardovia属の濃縮と強く関連していたが、これは離乳期の対照子豚の空腸では欠乏しており、同じ科のBifidobacterium属の存在量とは逆相関していた。FMTに関連する他の属には、Solobacterium属、Shuttleworthia属、Pseudoraminibacter属が含まれ、対照子豚ではErysipelotrichaceae属や Acidaminococcus属などの細菌が最も豊富であることが確認された。メタボローム解析の結果、炭水化物、アミノ酸、ヌクレオチド、ビタミン、および異種物質の代謝にFMTの有意な調節効果が認められ、栄養利用の改善が示唆された。トランスクリプトーム解析により、免疫、代謝、バリア、神経内分泌機能に関連する遺伝子発現に対するFMTの調節効果がさらに確認された。ETEC感染の状況下でFMTを事前に投与すると、病原体の排出には影響がなかったにもかかわらず、微生物の多様性とメタボローム組成が有意に変化し、下痢の重症度が低下したことから明らかなように、保護的な役割を果たす可能性が示唆された。

結論

本研究は、空腸の健康増進におけるFMTの有望性を強調するものである。さらに、この結果は、FMTが、豚や、ヒトのように腸の解剖学的構造および生理学が類似した他の単胃種における小腸の腸内環境の異常に関連する病態に対処するための潜在的な戦略であると考えられることを示唆している。

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はじめに

商業的養豚において、離乳は豚の発育における最も重要な出来事の一つであり、急激な食餌、環境、社会的変化を伴う [1]。最近の研究では、食餌・環境条件の急激な変化と離乳ストレスが腸内細菌異常の状態に収束し、子豚の離乳後下痢（PWD）などの離乳関連疾患の発症に極めて重要であることが確認されている [2,3,4]。出生後、子豚の腸は母体および環境の細菌叢で速やかにコロニー形成され、その組成と多様性は腸の健康と腸管感染症に対する感受性に重要な役割を果たす [5]。離乳時の環境因子やストレスとともに、固形飼料への突然の移行は子豚の腸内細菌叢に劇的な変化をもたらし、腸内細菌異常症を引き起こす [6]。

腸内細菌叢の変化は、離乳後の主要な腸内細菌感染と密接に関連している [2]。さらに、腸内細菌叢異常症は腸内代謝産物の変化を誘発し、腸管バリア透過性を高め、粘液産生を減少させ、腸内の炎症性サイトカインを上昇させる [7,8]。離乳後の腸内細菌異常症は、腸管毒素原性大腸菌 （ETEC）のコロニー形成とPWDへの進行における重要なステップであると同定されている [2]。さらに、最近の研究では、ETEC感染などの離乳に関連した疾病が、子豚の腸内環境異常を直接誘発し、さらに悪化させ、その結果、腸炎と下痢を媒介することが示されている [9,10,11]。これらの研究により、腸内細菌異常症が離乳関連豚病、特にPWDの病因における重要な因子であり、病気の発症と顕在化の両方に関与していることが立証された。従って、離乳移行期に腸内細菌異常症を対策することで、このような感染症を予防し、同時に疾患の臨床的発現を抑えることができる。

飼料や環境の変化、子豚の離乳年齢に関連する飼育方法は、実用的かつ経済的な問題から、商業的な豚の生産において大きく変わる可能性のないパラメータである。しかし、現在のマイクロバイオーム研究の知見に基づけば、離乳後の異食症をコントロールすることは可能である。糞便微生物叢移植（FMT）は、ヒトおよび獣医学において、多くの腸内疾患の治療に広く用いられている[12,13]。これには、クロストリジオイデス・ディフィシル感染症（CDI）、炎症性腸疾患（IBD）、潰瘍性大腸炎、クローン病などの疾患が含まれる[14]。ヒトにおけるCDIの管理は、腸内細菌異常症や腸内感染に対する根本的な治療戦略としてFMTが成功した最も注目すべき例である [15]。例えば、子豚のPWDは、腸内細菌異常症とそれに続く病原体のコロニー形成という点で、CDIと類似した病態を示す [16]。したがって、成熟した健康な腸内細菌叢を離乳期の子豚に移植して腸内細菌叢を安定化させれば、腸内細菌叢異常症やPWDを予防できる可能性がある。

FMTに伴う腸内変化は、ヒト、げっ歯類、そして少ないながらもブタを含む家畜で広く研究されている[12,13,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35]。これらの研究のほとんどは、大腸微生物叢、特に大腸に焦点を当てたものである。しかし、ETEC感染の主要な標的部位である小腸に対するFMTの影響に関する研究はまだ限られている。ETECに加えて、クロストリジウム感染症やロタウイルス感染症を含む豚の主要な腸疾患は、主に小腸、特に栄養吸収の主要部位で最も長い腸管セグメントである空腸に影響を及ぼす [36]。回腸とともにこの腸管が関与することは、サルモネラ、ローソニア、腸コロナウイルス感染などの他の感染症でも重要であり、FMT研究における空腸の重要性を強調している［36］。そこで本研究では、子豚のETEC感染によるPWDに焦点を当て、空腸のマイクロバイオーム、トランスクリプトーム、およびメタボローム環境に対するFMTの影響を調査した。

材料と方法

ドナー動物、FMT混合物の調製、およびETEC接種物

本研究のための糞便微生物叢混合物（FMT mix）は、最近発表されたプロトコール[37]に従って、6頭の健康な3ヶ月齢のドナー豚から調製した。全ドナー豚はアイオワ州立大学獣医診断研究所（ISU-VDL）で PEDV、PCV、豚インフルエンザウイルスおよび腸管寄生虫のスクリーニングを受けた。簡単に説明すると、排泄されたばかりの糞便を無菌的に50 mlのチューブに入った滅菌済み減菌PBSに集め、氷上で嫌気性ワークステーションに移し、さらに処理した。プールされた糞便は、適量のあらかじめ還元したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で5倍に希釈され、ミキサーでホモジナイズされた。この懸濁液を滅菌篩で濾過し、レシピエントに経口投与するか、10％滅菌グリセロールと混合して-80℃で保存した。ETECの接種には、ISU-VDLから分離されたF18陽性の臨床溶血性大腸菌を用いた。本研究で使用したETEC臨床分離株の遺伝子型は、ISU-VDLでPCRベースのETEC-virulence panelを用いて検証し、F-18ピラスを標的としたRNAscope in situ hybridizationを用いて空腸粘膜への細菌の付着を視覚的に証明した（補足図1）。この細菌をトリプシン大豆ブロスで一晩培養し、希釈とプレーティングにより菌数を定量した。106CFU/mlのETEC細胞からなる最終接種液を5mlのPBSに再構成し、直ちに接種するために氷上で動物施設に輸送した。

ETEC感染実験、サンプル収集、およびETEC定量化

すべての動物実験および処置は、プロトコルIACUC-22-246および18-342のもと、IACUC（Institutional Animal Care and Use Committee）に従って実施された。子豚は、ETEC 感染に対する遺伝的感受性が確認された既知の群れから調達した [38]。離乳させ、3週齢で体重を測定した32頭の哺乳子豚を無作為に4つの実験群（1群あたりn= 8）に分け、スターター飼料と飲料水を自由に摂取できる個別ペンに収容した。治療群は以下の通りである： 対照群、FMT対照群（FMT）、ETECチャレンジ対照群（EC）、FMT-ECチャレンジ群（FMT＋EC）。FMT群およびFMT＋EC群には、実験開始1日目および3日目（離乳1日目および3日目）に、糞便マイクロバイオームミックス（各日5mLの溶液を経口投与）を直接経口投与した[27]。試験の約 10 日目（離乳後 10 日目）に、EC 群および FMT + EC 群の動物に約106CFU の F18 陽性 ETEC を経口接種した。対照群にはPBSを経口投与した。動物の体重を測定し、8日間下痢を観察し、異なる時点（0、2、4、および8dpi）で糞便サンプルを採取した。感染後4日目と8日目（FMT後14日目と18日目）に各群4頭の子豚をそれぞれ犠牲にし、腸組織（RNAseq用に空腸、回腸、結腸をRNA Laterに、病理組織検査用に10％緩衝ホルマリンに）と糞便（空腸中部、回腸中部、結腸末端（直腸）-細菌学的分析用に新鮮なもの、16秒RNA配列決定とメタボローム分析用に-80℃で瞬間凍結保存したもの）を採取した。試験期間中、下痢を起こした豚の数を毎日記録した。下痢の重症度は、治療群とは盲検化された2名の独立した担当者が、公表されているスコアカードを用いて記録した[38]。溶血性大腸菌の排出は、糞便スワブを Remel Blood Agar（5%ヒツジ血液を含む TSA）にプレーティングし、35 °C で 24 時間インキュベートすることで評価した。0は増殖なし、1は一次菌叢の溶血性コロニーのみ、2は二次菌叢にまで及ぶ適合性増殖、3は三次菌叢までの増殖、4は寒天平板の四次菌叢までの溶血性大腸菌の増殖を示す。感染者および非感染者の糞便検体は、培養によるETEC検査が定期的に行われた。大腸菌が疑われるコロニー（サンプルあたり1つの溶血性コロニー）の身元は、ISU VDLでマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）を用いて確認した[39]。QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA)を用いて、200mgの糞便から製造者の指示通りに全DNAを単離した。リアルタイムPCRは、CybrGreen Q-PCR Kit（New England BioLabs, Ipswich, MA）を用い、QuantStudio 3 PCR機（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）で、以前に発表されたプロトコルおよびF18遺伝子のオリゴヌクレオチドプライマー[40]に従って行った。既知の力価の大腸菌懸濁液200 µlから単離した全DNAを標準として使用し、F18陽性ETECの絶対定量は標準曲線法で行った[40]。実験計画の図解は補足情報として提供されている（補足図2）。

16 s- rRNA配列決定とマイクロバイオーム解析

DNA抽出と配列決定

DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit（Qiagen、MD、米国）を用いて、異なる処理群（FMT後14日目と18日目に犠牲となったすべての子豚；n＝8）から別々に空腸、回腸、および結腸内容物から全DNAを抽出し、すべてのDNAサンプルを、Illumina MiSeqシーケンスプラットフォームでさらに解析するまで-20℃で保存した。各サンプルの全DNAを断片化し、Nextera XT DNA Library Preparation Kit（イルミナ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてシーケンスアダプターでタグ付けした。遺伝子特異的配列は細菌の16S V3およびV4領域を対象とした。イルミナDNAライブラリーは、最終ローディング濃度3 pMの較正済みAmpureビーズ精製PCR産物と25% PhiXコントロールを用いて調製し、MiSeq V3キットを用いてMiSeq上で300 bp、60サイクル、ペアエンドモードでシーケンスした。メタゲノム配列決定により、サンプルあたり平均100万リードが得られた。シーケンス後、リードの品質評価を行い、ペアエンドをマージした。PCR産物は分子量と濃度に基づいて均等にプールされた。

統計解析およびネットワーク解析

Divisive Amplicon Denoising Algorithm (DADA2 v1.10)をカスタマイズしたワークフローを用いてシーケンスデータを処理した。このプロセスにより、品質管理、プライマー除去、分類学的割り当てを組み込んだノイズ除去によるアンプリコン配列バリアント（ASV）の表が得られた。Cutadaptはフォワードプライマーとリバースプライマーをトリミングし、リードをマージしてペアエンド配列を作成した。品質チェックにより、リードの長さと品質が適切であることが確認された。出力は、配列、ASV存在量、分類学の詳細を示すBIOMテーブルであった。MicrobiomeAnalystは、マイクロバイオームデータの統計的、視覚的、メタ解析のための包括的なツールとして、すべての解析に利用された[41]。統計解析とグラフ出力にはMicrobiomeAnalyst Rパッケージを採用した。サンプルの20％未満に存在する、または最小カウントが4未満のフィーチャーはフィルタリングで除外され、分散の少ないフィーチャーは四分位範囲間の基準に基づいて削除された。サンプルはシーケンス深度が等しくなるように希釈され、TSS（Total Sum Scaling）を用いて正規化され、Bray-Curtis指標を用いたPCoA順序解析やPERMANOVA[42]を含む様々な指標や統計手法を用いて、アルファ多様性とベータ多様性が解析された。コアマイクロバイオーム解析とバイオマーカー解析が行われ、有意な特徴とその効果量が特定された。治療群間の分類学的差異の頑健性は、線形判別分析効果量（LEfSe）分析 [43]を用いて評価した。ヒートツリーは、デフォルトのWilcoxonp値カットオフ-0.1と線形判別分析スコア(LDA)スコア閾値2.0を採用した調整p値によって有意性を決定し、差次的に豊富な特徴を可視化するために "Metacoder "Rパッケージを使用して構築した[44]。MicrobiomeAnalyst のMaAsLin2 を用いて一般線形モデルを利用し、微生物の特徴と実験メタデータとの関連を同定した[45]。治療群などの主要なメタデータは "固定効果 "として含まれ、時点は共変量としてコントロールされ、これも "固定効果 "とした。このアプローチにより、潜在的な交絡変数をコントロールし、微生物の特徴と実験条件との関連について頑健な統計量を抽出することができた。QIIME2では、実験グループ間で発現量の異なる分類群を同定するために、マイクロバイオーム組成解析（ANCOM）を実施した。この解析では、微生物分類群の存在量表をANCOMプラグインに入力し、相対存在量に有意差のある分類群をW統計に基づいて同定した[46]。

空腸内容物の非標的メタボローム解析

定性的大規模プロファイリング

空腸内容物（FMT後14日目に犠牲となった子豚3頭分）の非標的メタボローム解析をMayo Metabolomic Core facility（ミネソタ州ロチェスター）で実施した。空腸内容物を6倍量の冷アセトニトリル/メタノール（1:1比）で脱タンパクし、氷上で30分間、4℃で断続的にボルテックスした後、18,000xgで遠心した。13C6-フェニルアラニン（250ng/μlで3μl）を、脱タンパクする前に内部標準物質として各サンプルに添加した。上清を2つのアリコートに分け、Agilent Technologies 6550 Q-TOF 質量分析計と 1290 Infinity UHPLC を使用して分析するために乾燥させた。ポジティブおよびネガティブのエレクトロスプレーイオン化条件下で、100-1200 m/zの質量範囲にわたって、10,000-35,000の分解能でデータを取得した（別々のラン）。代謝物分離は、親水性相互作用カラム（HILIC、エチレン架橋ハイブリッド2.1×150mm、1.7μm；Waters）と逆相C18カラム（高強度シリカ2.1×150mm、1.8μm；Waters）を用い、それぞれ流速400μl/分で20分間のランタイムで行った。各サンプルは、代謝物カバレッジを最大化するために4回実行された。サンプルは3連で注入され、品質管理サンプルは各実行中に複数回注入されました。生データファイルは、Masshunter DA Reprocessor ソフトウェア (Agilent) を使用して .cef 形式に変換しました。データのアライメントとピークマトリックスの変換は、Mass Profiler Professional (Agilent) を用いて行いました。解析には、教師なし主成分分析、ANOVA、3D プロット、ヒートマップ、および部分最小二乗判別分析 (PLS-DA) を使用しました。このプロセスにより、差次的に発現した成分の正確な質量分子量のリストが得られ、これをMetlinデータベースと照合して推定同定を行った。同定された成分は、参照標準に対して検証された。Q-TOF法の質量精度は<5ppm、保持時間精度は<0.2%であった。1.2倍の変化は4%の精度で検出可能であった。

メタボロームデータとパスウェイ解析

75%のサンプルで少なくとも5000ピーク強度の閾値を設定し、ダウンストリーム解析の対象とした。RパッケージMetaboAnalystRは、データの正規化、差次的発現解析、可視化を容易にした。代謝物は正規化（SumNorm）、対数変換、平均中心化（MeanCenter）された。主成分分析（PCoA）により、データの不均一性、傾向、外れ値が強調された。階層的クラスタリング分析（HCA）により、サンプル注入、グループ複製、および臨床変数に関連する代謝物クラスター間のクラスタリングパターンが明らかになりました。コントロールvs.FMTおよびECvs.FMT + EC間のStudentの対にならないt検定を含む単変量解析は、FDR調整p値≦0.05および｜fold change｜≦1.5を必要とする、差次的に発現した代謝物を同定するための多重検定補正を用いて実施された。

空腸組織のRNA-seq解析

組織処理およびRNA-seq解析は、BGI Genomics Inc. 各群でFMT後14日目に犠牲にした3頭の子豚の腸組織サンプル（空腸中部からの切片）を、さらなる処理に使用した。各サンプルから全RNAを抽出し、TRIzol法を用いて精製した。その後、BGISEQ500プラットフォーム（BGI Genomics）でRNA配列決定を行った。10サンプルが多重化、配列決定、遺伝子発現差解析、トランスクリプトーム発現解析を受けた。生データの品質管理はSOAPnukeソフトウェアを用いて行い、rRNAやその他のコンタミを除去したクリーンリードを得た。クリーンリードは、mRNAおよびロングノンコーディングRNA定量にはHISATを、遺伝子配列アライメントにはBowtie2を用いてSus scrofaゲノム配列にマッピングした。circRNAの定量には、クリーンリードを既知のS. scrofacircRNAにアライメントした。小分子RNAはクリーンタグをmiRNAデータベースおよびS. scrofaゲノム配列にマッピングすることで同定した。各遺伝子の発現レベルは、マッピングされたリードに基づいて計算された。差次的発現解析は、MA-plotソフトウェアを介してDEGseq法を用い、発現値をlog2値に変換して行った。グループ間の遺伝子発現レベルの比較にはStudentのt検定を用いた。DEGの機能分類とパスウェイは、Gene Ontology (GO) EliteとDAVID Bioinformatics Resources for Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways analysisを用いて評価した。すべてのデータは、BGI Genomics Inc.が提供するDr.Tomオンライン解析システムを用いて手動で抽出することができた。

統合的マルチオミクス解析

FMTによって誘導される統合的な代謝およびトランスクリプトーム変化を解明するために、Chongら（2019）[48]によって記載されているように、MetaboAnalyst 4.0（https://www.metaboanalyst.ca ）を使用して共同パスウェイ解析を実施した。メタボロームデータについては、RパッケージMetaboAnalystRを用いて、SumNorm法を用いて代謝物強度を正規化し、対数変換し、平均中心化した。トランスクリプトームデータについては、遺伝子発現レベルを正規化し、下流解析のために対数変換した。メタボロームおよびトランスクリプトームデータセットを MetaboAnalyst の Joint Pathway Analysis モジュールにアップロードし、KEGG データベースを用いて代謝物および遺伝子を対応するパスウェイにマッピングすることで、これらのデータセットの統合を促進した。合同パスウェイ解析は、メタボロームデータとトランスクリプトームデータのp値を組み合わせて、有意に影響を受けたパスウェイを同定するために実行された。パスウェイの有意性を評価するために、メタボローム解析とトランスクリプトーム解析の個々のp値を組み合わせて、Fisher の手法を用いて共同p値を算出した。合同p値が0.05未満のパスウェイは、有意に濃縮されていると考えられた。

同様に、マイクロバイオームとメタボロームの相関解析は、MicrobiomeAnalyst 2.0を使用して行いました。MicrobiomeAnalyst 2.0（https://www.microbiomeanalyst.ca ）内の統合マイクロバイオームメタボロミクスパイプラインに、各比較のメタボローム存在量ペアリストと種存在量テーブルをアップロードしました。統計的相関分析では、距離ベースの相関法を利用して線形相関と非線形相関の両方を検出した。結果はインタラクティブなヒートマップとして要約された。対相関分析における偽陽性の多さという問題に対処するため、5000以上の高品質なゲノムスケール代謝モデル（GEM）を用いたモデルベース相関アプローチを採用した。これにより、微生物分類群とその代謝物の間の確率ヒートマップが得られた。その後、統計的相関ヒートマップとモデルベース相関ヒートマップを重ね合わせることで、データ駆動型と知識駆動型のエビデンスの流れを統合した。

統計解析

個々に収容されたブタを実験単位とした。下痢スコアおよび糞便排出スコアを含む、個々の治療群および動物からの臨床的、微生物学的、および実験室パラメータは、治療群に対して盲検化された担当者によって記録される。2群間の差は、対応のないスチューデントのt検定を用いて分析した。2群間の比較データは、独立標本t検定を用いて分散分析を行い、統計的に分析した。4群間の比較データは、一元配置分散分析（ANOVA）にTukeyの多重比較検定を加えて分析した。

結果

FMTは空腸内細菌叢を有意に変化させ、特定の細菌集団を濃縮した

離乳期の子豚の腸内微生物ランドスケープに対するFMTの影響を調べるために、16 s rRNA配列決定と包括的マイクロバイオーム解析を利用した。子豚には離乳1週目にFMT混合飼料を2回経口投与し、離乳2週目にサンプル採取のために安楽死させた。FMT後14日目と18日目にそれぞれ4頭を安楽死させ、空腸、回腸、結腸からサンプルを採取し、16 s rRNA配列決定を行った。マイクロバイオーム解析の結果、空腸微生物叢の組成（図1A）、細菌のα多様性（図1D（シャノン指数）および補足図3（Chao1指数））、β多様性（図1E）に大きな変化が見られた。回腸と結腸では、同程度の組成とβ多様性の変化が観察されたが、空腸とは異なり、α多様性指標に差はなく、微生物多様性の変化はFMT2週目までに平準化するようであった。これらの区間では、空腸と比較して、FMT処理によって組成上の影響を受けた細菌群集は少なかった（補足図4および5）。したがって、ここからは、本研究の焦点である空腸で観察された微生物学的シフトの程度により、空腸の変化のみを記述する。

図1

離乳期の子豚の空腸マイクロバイオーム組成と多様性に対するFMTの影響。Aコントロール群とFMT群の空腸腸内細菌叢の実際の存在量を属レベルで示した積み上げ棒グラフ。Bコントロール群とFMT群における有意に異なる微生物属の階層的分類学的分布と相対的存在量を示すヒートツリー。ヒートツリー上の色は、FMT群とコントロール群間のlog2変換存在量レベルの中央値比を表し、正の値（赤の濃淡）はFMT群で存在量が多いことを示し、負の値（青の濃淡）はコントロール群で存在量が多いことを示す。Cコントロール群とFMT群における微生物属の遺伝的多様性の比較と個体群密度を描いた微生物群集の系統樹アバンダンスマップ。青い四角は、コントロール群の離乳子豚では有意に欠乏しているが、FMTを受けた子豚では豊富である属を選択して示している。ツリーを囲む数字はブートストラップ値を表し、枝の信頼度を示す。E主成分分析（PCoA）散布図は、対照群とFMT群の空腸微生物叢におけるβ多様性を示す。

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FMTは、サンプリング日数にかかわらず、空腸微生物叢のα多様性を有意に増加させた（p= 0.03）（図1D）。同様に、主座標分析（PCoA）プロットで示されたβ多様性分析では、対照群とFMT群の間に明瞭なクラスタリングが見られ、両調査時点におけるこれらの群間の微生物群集組成の実質的な違いを示していた（p= 0.002）（図1E）。FMT後10日目と14日目に安楽死させた動物から採取したサンプル間では、αおよびβ多様性に有意差は認められなかった。コントロール群とFMT群の比較解析から、安楽死やサンプル採取日（FMT後14日対18日）にかかわらず、細菌集団に有意な変化が認められ、存在量ヒートマップ（図1B）および系統樹存在量マップ（図1C）から明らかであった。FMTはClostridia（クロストリジウム）綱の存在量を著しく増加させ、特にEubacteriales（真正細菌）目にスポットを当て、Eubacteriaceae（真正細菌科）とLachnospiraceae（ラクノスピラ科）の増加が顕著であった。Lachnospiraceae科では、Acetitomaculum属、LachnospiraceaeNK3A20グループ、Shuttleworthia属などが著しく増加し、Ruminococcus gauvreauiグループは減少した。さらに、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderiaグループを含むBurkholderiales目と科の中で、特にGammaproteobacteriaクラスが大幅に増加した。逆に、FMTは、コリオバクテリア綱とコリオバクテリア目、特にアトポビア科とオルセネラ属に著しい影響を与えた。アシダミノコッカス目とそれに対応するアシダミノコッカス科・属も、FMT後に濃縮された。科のレベルでは、Erysipelotrichaceaeと Solobacterium属の増加が観察された。さらに、FMTによりPseudoscardovia属の存在量が有意に増加し、Eubacterium nodatumグループの存在量は減少した（図1B、C）。

線形判別分析の効果量（LEfSe）により、FMT処理に関連する特徴的な属が同定された。これには、シュードスクラドビア属、ソロバクテリウム属、シャトルワシア属、シュードラミニバクター属が含まれ、対照の子豚ではエリシペロトリキア属や アシダミノコッカス属などの細菌が最も多いことが確認された（図2C）。このような違いは、対照群とFMT群のコアマイクロバイオーム組成の違いに明らかであった。各群のコアマイクロバイオームは、20％以上のサンプル有病率に基づき、属レベルでの相対存在頻度が0.01％以上で同定された。離乳期の子豚の空腸にはビフィズス菌が生息しているが、3ヶ月齢の若齢成体ドナー豚に由来するFMT群では、ビフィズス菌に代わってシュードカルドビアが生息しているようである（図2A, B, E）。このことは、対照群とFMT群のこれら2つの属（Bifidobacteriumvs.Pseudoscardovia ）（図2E）とコアマイクロバイオームの組成（図2A, B）との間に逆相関があることからも明らかである。一般線形モデルによる重回帰を用いた多因子解析では、FMTと様々な微生物属との間に有意な関連が認められ、Pseudoscardovia（p=1.72E-4）とAcetitomaculum（p=8.27E-4）が際立っていた（図2D）。この観察結果はANCOM分析によってさらに裏付けられ、FMTと偽心房細動との間に有意な関連があることが強調された。パターン分析（図2E）では、FMT群のシュードカルドビアと関連する特定の細菌属、例えばシュードラミバクター（Pseudoramibacter）やバークホルデリア（Burkholderia）が明らかになり、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、オルセネラ（Olsenella）、ユウバクテリウム・ノダツム（Eubacterium nodatum）など、対照群で流行している細菌と逆相関していた。FMTと有意かつ正の相関を示したその他の有意な細菌属は、Erysipelotrichaceae_UCG_002（p= 0.00102）、Pseudoramibacter（p= 0.00102）、Acidaminococcus（p= 0.0035）、Solobacterium（p= 0.00371）、Lachnospiraceae_NK3A20_group（p= 0.00789）であった。一方、Eubacterium_nodatumグループ（p= 0.00597）とOlsenella（p= 0.00896）は、FMTと有意かつ負の相関を示した（図2E &3 ）。

図2

離乳期の子豚の空腸内細菌叢の組成パターンに及ぼすFMTの影響。A対照の離乳子豚のコアマイクロバイオーム組成を示すヒートマップ。各グループのコアマイクロバイオームは、20％以上のサンプル有病率、および属レベルでの0.01％以上の相対存在頻度に基づいて同定した。X軸は検出閾値を表し、相対存在率を示す。色の勾配はサンプル全体の各属の有病率を表し、スケールは0.0（青）から1.0（赤）の範囲である。高い有病率は暖かい色（赤に近い）で示され、低い有病率は冷たい色（青に近い）で示される。BFMTを受けた対照離乳子豚のコアマイクロバイオーム組成を示すヒートマップ。Cコントロール群とFMT群の間で有意に豊富な分類群を表示した線形判別分析（LDA）の効果量（LEfSe）チャート。D重回帰分析で、コントロールおよびFMT子豚に関連する細菌属を、有意性および共変量の影響とともに表示。Eコントロール群とFMT群における様々な細菌属の存在量と空腸におけるPseudoscardovia属との相関。

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図3

対照群とFMT群で存在量の異なる主な細菌属。アセチトマクラム属（Acetitomaculum）、アシダミノコッカス属（Acidaminococcus）、オルセネラ属（Olsenella）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ソロバクテリウム属（Solobacterium）のコントロール群とFMT群間の存在量の差を表した箱ひげ図。

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FMTは、離乳期の子豚の空腸微小環境において、栄養代謝、異種物質代謝、腸内恒常性維持に重要な代謝経路を再プログラムする

FMTを受けた離乳子豚の空腸内容物の包括的なメタボローム解析では、幅広い代謝経路が有意に変化しており、腸内細菌代謝と腸上皮細胞代謝の複雑な相互作用が示されている。ヒートマップによる視覚化では、すべての分析モード（nc、pc、nhilic、philicモード）において、FMT群と対照群の間に明確なパターンが観察され、FMTが空腸内容物内の代謝物レベルに大きな影響を与えていることが示唆された（図4A（ncモード）、 補足図6および7（他のすべてのモード））。ヒートマップの可視化に異なる分析法を用いる目的は、空腸内容物中に存在する代謝物の幅広いスペクトルを捉えることであり、それらは分析中に化学的性質や挙動が変化する。それぞれのモード-nc（順相クロマトグラフィー）、pc（極性化合物クロマトグラフィー）、nhilic（通常の親水性相互作用クロマトグラフィー）、philic（極性親水性相互作用クロマトグラフィー）は、極性、溶解度、クロマトグラフィー媒体との相互作用に基づいて、異なるタイプの代謝物を対象とします。これらの多様な分析モードを採用することで、メタボロームの包括的なプロファイリングを実現し、非極性から高極性まで幅広い代謝物を確実に捕捉して分析することができます。主成分分析（PCoA）プロットは、FMT群と対照群の分離をさらに明確に示している（図4B）。PCoAプロットは、コントロールと比較して、FMTグループ内で緊密なクラスタリングを示しており、FMT処理子豚の間でより均質な代謝反応を示している（図4B）。この均質性は、FMTが収束的な代謝状態につながることを示唆しており、おそらく空腸における新しい安定したマイクロバイオーム環境の確立を反映している。

図4

離乳子豚の空腸メタボロームに対するFMTの効果。Aコントロール群とFMT群における代謝物濃縮の差を示す代表的なメタボロームヒートマップ（ncモード解析）。他のモード（pc、nhilic、philicモード）の結果は補足図8に示す。Bこの主座標分析（PCoA）プロットは、コントロール群とFMT群間のメタボロームプロファイルの分散を描いている。他のモード（pc、nhilic、philicモード）のPCoA結果は補足図9に示す。C代謝経路の濃縮解析を表す棒グラフ。この図は、ncモードのメタボロームデータからFMT後に濃縮された上位25代謝経路の概要を示している。他のモード（pc、nhilic、philicモード）の濃縮結果は補足図10に示す。

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パスウェイ解析により、FMT後の空腸内容物の代謝経路に有意な変化が認められた（図4C（ncモード）、 補足図7（他のすべてのモード））。チトクロームP450が関与する薬物代謝経路が有意な変化を示し（nc：p＝3.36e-09）、FMTが異種物質の処理を調節する可能性を強調した。例えば、アザチオプリンの代謝物である6-メチルメルカプトプリンの相対濃度は、コントロールと比較してFMT群で有意に増加しており、FMT群では薬物代謝が亢進していることが示された（図5A）。アミノ酸、グルコース、脂質の代謝に不可欠なビタミンB6の代謝は有意に変化しており（nc：p= 2.54e-03）、FMTが重要な栄養経路に影響を及ぼしていることが示唆された（図4Cおよび5C）。ビタミンB5（パントテン酸）とビタミンB6（ピリドキシン）の両副腎皮質レベルは、FMT群では対照群に比べて有意に低下していたが、EC群ではビタミンB5のレベルが高かった（図5A）。同時に、ビタミンB6の代謝産物である2-オキソ-3-ヒドロキシ-4-ホスホブタン酸のレベルが空腸で上昇したことから、FMT処理子豚ではこのようなビタミンの代謝が亢進していることが示唆された（nc：p= 0.00417）（図5A）。リジン分解およびビオチン代謝の経路も有意な調整を受け（nc:p= 1.93e-02）、アミノ酸および栄養処理に対するFMTの効果が強調された（図4Cおよび5A）。遊離リジン、セリン、バリン、メチオニン、ベタイン（グリシンのトリメチル誘導体）、および2-オキソ-4-メチルチオブタン酸のようなアミノ酸代謝物の相対的空腸レベルは、吸収または下流代謝の促進を示唆する対照と比較して、FMT群で有意に減少した（図5A）。

図5

離乳期の子豚の空腸に濃縮された主な代謝産物の相対量に対するFMTの影響。A薬物、ビタミン、アミノ酸代謝に関連する選択された空腸代謝産物の対照群とFMT群の相対存在量。Bコントロール群とFMT群間の脂質代謝に関連する選択された空腸代謝物の相対存在量。Cコントロール群とFMT群間の炭水化物代謝に関連する選択された空腸代謝産物の相対存在量。

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脂質のホメオスタシスと膜組成の維持に極めて重要な脂質代謝と不飽和脂肪酸の生合成は顕著な影響を受け、FMTが脂質関連経路に調節的な役割を果たしていることが示された（図4Cおよび5B）。ステロイドホルモン生合成の変化（nc:p= 1.04e-02）は、成長と代謝を制御する重要な役割を示している（図4Cと5B）。例えば、ETEC感染は非感染コントロールと比較して空腸のコレステロール硫酸塩レベルを有意に増加させたが、FMTはETEC感染群と非感染群の両方で空腸遊離コレステロール硫酸塩を有意に減少させたことから、下流代謝の吸収が増加したことが示唆された（図5B）。さらに、コントロール群およびETEC群と比較して、FMTは、腸内細菌叢によって代謝されるストレス関連ステロイドであるテトラヒドロコルチゾンの空腸レベルを有意に低下させたことから、この化合物の細菌代謝が亢進していることが示唆された（図5B）。同様に、7-a,25-ジヒドロキシコレステロールおよび4.4-ジメチルコレスタ-8.14.24-トリエノールの空腸レベルは、コントロールと比較してFMT群で減少しており、コレステロールおよび胆汁酸代謝におけるFMTの影響を示唆していた（図5B）。一次胆汁酸代謝の変化は、脂肪の消化吸収、コレステロールのホメオスタシス、および腸内細菌叢組成の調節に対するFMTの実質的な影響を示唆している。さらに、炎症と自然免疫反応に重要なアラキドン酸代謝は、FMTによって著しく変化した（図4C &5B）。このことは、プロスタグランジンD2、11,12-エポキシエイコサトリエン酸、15-ヒドロキシエイコサテトラエン酸（15(S)-HETE）などの炎症性メディエーターのレベルが、対照と比較して大幅に低下したことからも明らかである。同様に、コリンの相対濃度はFMT群で有意に増加した（pc：p= 0.042）（図5B）。

解糖や糖新生などの経路を含む炭水化物代謝は有意に変化し、FMTによって代謝の柔軟性とエネルギー管理の適応が促進されることが明らかになった（図4C）。ピルビン酸代謝の変化（nc:p= 1.41e-02）は、エネルギー産生の中心経路の変化を示している（図4C）。もう一つの注目すべき所見は、FMT後の空腸内容物中のD-ラクトースレベルの上昇である。D-ラクトースは乳糖の異性体で、主に細菌によって産生される（図5C）。このことから、ドナーとなった若齢成体豚の微生物叢には、子豚のミルクベースの離乳前食とは対照的に、固形飼料に適応した乳酸産生菌の割合が高い可能性が示唆される。もうひとつの可能性は、FMT群ではD-乳酸の代謝または吸収が低下していることである。しかし、これを確認するにはさらなる研究が必要である。さらに、FMT群では、グリコサミノグリカンの合成に重要な役割を果たすグルコサミンやn-アセチルマンノサミンなどのアミノ糖が、非チャレンジ群と比較して顕著に増加していた（図5C）。同様に、スクロースの相対レベルは、コントロールと比較してFMT群で有意に増加したが、有意性は不明であった。ヌクレオチド代謝の変化は、エネルギー伝達、遺伝子発現、細胞内シグナル伝達に重要なヌクレオチドの生合成と分解の著しい変化を示している（図4C &5C）。FMT群では、空腸内容物中のアデニンやヒドロキシアデニンなどの遊離核酸レベルが有意に低かった（図5C）。

離乳期の子豚の空腸内容物のマイクロバイオーム-メタボローム相関分析により、FMT群では対照群と比較して、濃縮された細菌属と濃縮された腸内代謝産物の間に有意な相関があることが同定された。予測ヒートマップ（図6）はこれらの相関を示し、赤は強い正の相関を、青は相関なし（相関スコア＝0）を示す。FMT群で差次的に濃縮された細菌属と相関する主な代謝物には、ホスホセリン、L-ヒスチジンとその代謝物3-(イミダゾール-4-イル)-2-イソプロピルホスフェート、バリンやイソロイシンなどの分岐鎖アミノ酸、チロシンとフェニルアラニンの代謝物であるL-アロゲネートが含まれる； 解毒に関連する代謝産物であるγ-グルタミル-β-シアノアラニン、チアミン代謝に関与する代謝産物である5-(2-ヒドロキシエチル)-4-メチルチアゾール、D-乳酸やD-グルコースなどの糖、腸粘液バリアに不可欠なシアル酸の構成要素であるN-アセチルマンノサミンなどである。興味深いことに、これらの代謝物のいくつかの変化と強い相関が観察され、それはビフィズス菌の存在量の差と強く相関していた。この解析の限界は、FMT群で最も有意に濃縮され、ビフィズス菌の存在量と逆相関するPseudoscardovia属の代謝相関情報が、この新しく同定された細菌に関する代謝経路データベースがないため、この結果にはないことである。

図6

離乳期の子豚（FMT対コントロール）における、属レベルでの腸内細菌叢-メタボローム相関。このヒートマップは、FMTを受けた子豚の空腸で濃縮された様々な細菌属と、コントロールと比較してFMT群で濃縮された主要な空腸代謝産物との相関を示している。ヒートマップのカラーグラデーションは、各細菌属と代謝産物との相関係数を示している。

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全体として、これらの知見は、離乳子豚の空腸環境における広範な代謝リプログラミングを誘導し、栄養吸収、代謝効率、および全体的な腸の健康を向上させるFMT治療の可能性を示すものである。

FMTは離乳子豚の免疫、代謝、バリア、神経内分泌機能に関連する空腸遺伝子発現を調節する

離乳期の子豚の空腸組織を網羅的にトランスクリプトーム解析した結果、FMT後の遺伝子発現に有意な変化が認められ、微生物群集が空腸の環境とその生物学的プロセスに大きな影響を与えていることが明らかになった。FMTを行った子豚では、いくつかの遺伝子が有意に発現上昇しており、免疫調節、抗菌防御、代謝プロセス、細胞シグナル伝達経路を網羅する多面的な反応を示していた（図7A, B）。

図7

離乳子豚の空腸遺伝子発現に対するFMTの効果。ARNAseqの結果で、対照群とFMT群における選択された発現差のある遺伝子（DEG）の相対発現と関連代謝経路を示す。B異なる経路とシステムに関連する遺伝子の発現量を示す差分解析ボックスプロット。

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発現が増加した遺伝子の中で、LYZL4（リゾチームA）は抗菌活性を高める潜在的な役割のために際立っており、FMTが病原性細菌に対する粘膜防御機構をサポートする可能性を示唆している。同様に、PGLYRP2（ペプチドグリカン認識タンパク質2）も、抗菌性免疫応答に関連する遺伝子のひとつであるが、この遺伝子も上昇しており、FMTが腸管免疫を増強するという考えをさらに裏付けている。免疫応答はさらに、免疫監視に関与するKLRB1（Killer Cell Lectin Like Receptor B1）と、炎症と免疫応答の重要な制御因子であるTNFRSF11B（TNF Receptor Superfamily Member 11b）の発現上昇によって強調された。これらの変化は、免疫系の微妙な調節を示唆しており、おそらく有益な微生物叢を助長する、より寛容で調節された環境を反映している。

代謝的な意味合いでは、炭水化物代謝に関与する遺伝子であるUGDH（UDP-glucose 6-dehydrogenase）がアップレギュレートされ、粘膜の炭水化物処理の変化を示唆し、粘液産生と粘膜バリアに影響を与える可能性があった。さらに、プリン代謝に重要なPNP（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）は、FMTがヌクレオチドのターンオーバーに広範な影響を与え、間接的にアミノ酸代謝とタンパク質合成に影響を与えることを示している。また、ALOX12B（アラキドン酸12-リポキシゲナーゼ、12R型）やHAVCR1（A型肝炎ウイルス細胞受容体1）のような、脂質代謝と免疫調節にそれぞれ関与する遺伝子にも注目した。これらの遺伝子のアップレギュレーションは、腸内の脂質シグナル伝達経路や免疫細胞の相互作用の変化を反映している可能性があり、FMTが宿主の生理学に広範な影響を与えていることをさらに強調している。

ADGRF1（接着Gタンパク質共役受容体F1）やUMODL1（ウロモジュリン様1）など、細胞構造やシグナル伝達に関与する遺伝子もいくつか発現が上昇しており、FMTが細胞接着、組織の完全性、腸の恒常性維持に重要なシグナル伝達経路に影響を及ぼす可能性が示唆された。さらに、粘液産生に関与するMUC19（ムチン19）や、タンパク質のユビキチン化に関連するKLHL14（ケルヒ様ファミリーメンバー14）などの遺伝子は、FMTに対する腸の反応の複雑さを強調しており、病原体に対する物理的バリアから、腸細胞内のタンパク質のターンオーバーやシグナル伝達の調節に至るまで、あらゆるものに影響を与えている。

トランスクリプトーム解析では、発現が増加した遺伝子が強調されただけでなく、FMT群で発現が減少した遺伝子もかなり特定された（図9）。このうち、神経内分泌およびストレス応答の制御に関与するCHGA（クロモグラニンA）と、炎症および免疫応答の重要なメディエーターであるC5AR1（補体成分5a受容体1）が有意に減少していた。この発現低下は、FMTの潜在的な抗炎症作用と一致し、ストレス応答と炎症シグナル伝達の抑制を示している可能性がある。FXYD6（FXYDドメイン含有イオン輸送調節因子6）は、ナトリウム-カリウムATPアーゼの調節、つまり電解質バランスに関連しているが、これも発現の減少を示した。同様に、マクロファージの発生と機能に重要なCSF1R（コロニー刺激因子1レセプター）や、凝固と自然免疫に関与するCLEC3B（C型レクチンドメインファミリー3メンバーB）のような遺伝子の発現も低下しており、免疫細胞の制御が変化し、より制御された、より炎症性の低い状態へと移行している可能性が示唆された。

神経幹細胞の増殖に関与するNES（ネスチン）とGABRA3（γ-アミノ酪酸A型受容体α3サブユニット）のダウンレギュレーションによって示されるように、神経新生と神経細胞機能も影響を受けているようで、FMT後の腸脳軸コミュニケーションにおける潜在的変化を強調している。代謝経路も影響を受けており、クレアチン合成に不可欠なGAMT（グアニジノ酢酸N-メチルトランスフェラーゼ）や、ミトコンドリア輸送系の一部であるSLC25A45（ソリュートキャリアファミリー25メンバー45）などの遺伝子の発現が減少していた。これは、変化した腸内細菌叢に対応して、エネルギー利用とミトコンドリア機能を最適化するための代謝調整を反映しているのかもしれない。同様に、DNA分解に関与するDNASE1（デオキシリボヌクレアーゼI）と、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー生合成に重要なPIGQ（ホスファチジルイノシトール糖鎖アンカー生合成クラスQ）も減少しており、細胞のターンオーバーと膜動態の変化を示している。細胞骨格形成と繊毛形成にそれぞれ関与するKIF12（キネシンファミリーメンバー12）とIFT88（絨毛内輸送88）のダウンレギュレーションに見られるように、構造成分と細胞集合プロセスも調節されているようである。このことは、FMTに反応して細胞の形態や運動性が変化することを示唆しているのかもしれない。

さらに、細胞増殖のキープレイヤーであるFGFR1（線維芽細胞増殖因子受容体1）と血管新生に関与するANG（アンジオジェニン）のダウンレギュレーションは、組織の増殖と修復メカニズムの再調整の可能性を示唆しており、おそらく新しい微生物環境に最適化しているのだろう。観察されたダウンレギュレーションは、血液凝固に関与するFGB（フィブリノーゲンβ鎖）や、免疫防御機構に関与するIL17D（インターロイキン17D）など、特定の局在的機能を持つ遺伝子にまで及んでいる。ダウンレギュレートされた遺伝子のこの幅広いスペクトルは、腸内細菌叢と宿主の遺伝子発現との間の複雑な相互作用を強調し、炎症性シグナル伝達の減少、ストレス応答の調節、代謝・免疫機能の調節に対するFMTの深い影響を浮き彫りにしている。しかしながら、これらの結果をさらに検証するためには、個々の遺伝子発現研究を用いたさらなる確認が必要である。

合同パスウェイ解析（図8）は、個々のトランスクリプトーム解析およびメタボローム解析から得られた知見を検証するだけでなく、離乳子豚のFMTによって誘発される相互に関連した代謝および遺伝子発現変化の包括的な概観を提供した。この統合的アプローチは、離乳子豚の空腸環境におけるFMTによって引き起こされる代謝および遺伝子発現変化の広範なスペクトルを反映し、いくつかの有意に影響を受けた経路を浮かび上がらせた。アミノ酸、炭水化物、脂質の代謝に関連する経路が著しく濃縮されたことは、FMTが空腸の代謝の柔軟性と栄養利用能力を高める役割を果たしていることを強調している。

図8

離乳子豚の空腸トランスクリプトーム-メタボローム共同パスウェイ解析（FMT vs. コントロール）。FMT群と対照群の空腸トランスクリプトーム-メタボローム共同パスウェイ解析。バブルプロットは様々なパスウェイの影響と有意性を示しており、バブルの大きさはパスウェイの影響を、色はパスウェイの有意水準を反映する-log10(p)値を表している。

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最も影響が大きかった経路はバリン、ロイシン、イソロイシンの生合成で、これらの必須分岐鎖アミノ酸の代謝に大きな変化があったことを示している。プリン代謝も大きな影響を受け、ヌクレオチドの生合成と回転が促進されたことを反映している。もう一つの大きな影響を受けた経路は、グリシン、セリン、スレオニン代謝であり、FMT後の空腸におけるアミノ酸代謝の変化を強調している。ステロイド生合成経路も著しく影響を受け、脂質代謝の変化を示唆した。ケトン体の合成と分解もまた、顕著な影響を受けた経路であった。さらに、アスコルビン酸およびアルダル酸代謝が有意に変化し、抗酸化プロセスとビタミンC代謝の変化を示唆した。

また、糖鎖の生合成とヌクレオチドの代謝の増加を反映し、アミノ糖代謝とヌクレオチド糖代謝に著しい変化が見られた。D-グルタミンとD-グルタミン酸の代謝は顕著に変化した。システインとメチオニン代謝は濃縮され、含硫化合物産生の変化を示した。その他の影響を受けた経路には、薬物代謝、ニコチン酸およびニコチン酸アミド代謝があり、NAD +産生の増加を示した。ガラクトース代謝は顕著な濃縮を示し、炭水化物代謝の変化を反映した。ペントースとグルクロン酸の相互変換経路も顕著に関与しており、炭水化物代謝と解毒における役割を強調している。

最後に、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー生合成経路とブタン酸代謝経路が顕著な影響を受け、前者は細胞シグナル伝達と膜アンカープロセスの変化を示唆し、後者は短鎖脂肪酸の産生促進を示唆した。これらの知見は、FMTによって誘導される代謝シフトの包括的な全体像を提供し、離乳子豚の健康と発育に重要な様々な生物学的プロセスに対するFMTの広範な影響を浮き彫りにした。

離乳子豚の空腸におけるETEC関連の変化と転帰に、FMTの前治療が異なる影響を与える

ETEC感染は、4dpi目と8dpi目の両方で採取したチャレンジ群のすべての豚で、チャレンジ動物の糞便サンプルのPCRと遺伝子型判定によって確認された。未チャレンジの対照群では、F-18 + veのETECは検出されなかった。対照群とETEC群のマイクロバイオーム解析から、興味深い知見が得られた： α多様性、β多様性、および特定の分類群の存在量に、これら2つのグループの空腸内容物間で有意差は観察されなかった（それぞれ補足図9A、B、C）。二因子分析では、ETEC感染群における真正細菌（Eubacteriales）クラスとの正の関連を除いては、どの特定の分類群についても治療群との有意な関連は認められず、この観察がさらに強調された（データは示さず）。この結果は、ETEC感染にかかわらず、離乳期の子豚の腸内細菌叢は驚くほど類似していることを示唆している。これは、対照の離乳子豚の腸内細菌叢が、ETEC感染子豚に匹敵する事実上のディスバイオシス状態であることを示している。しかしながら、ETEC感染群と対照群のメタボローム解析では、ETEC感染後の特定の代謝経路が濃縮され、ETEC感染における代謝物レベルの有意差が明らかになった（補足図10A、B、C）。さらに、ETEC感染は、感染プロセスに関連した分子変化を反映するRNA-seq結果に見られるように、コントロールと比較して空腸遺伝子発現を有意に変化させた（補足図11A、B）。しかし、106CFU/mlのETEC株の接種は、チャレンジ群に軽度から中等度の下痢を誘発し、チャレンジ後4日目にピークに達した。感染動物における空腸の組織学的変化は、散在した付着細菌細胞、軽度の粘膜下浮腫と混合炎症浸潤、およびまれな陰窩膿瘍を伴う最小から軽度のものであった（図12B）。ETECの付着は臨床的な下痢と関連しており、そのピークはDPI 4であったことから、DPI 8のサンプルで目に見えるETECの数が少なかったことは予想外ではなかった。

マイクロバイオーム解析は、ETEC群とFMT-EC群との間のマイクロバイオーム組成および多様性における有意差を明らかにした。FMT-EC群とETEC群間のベータ多様性において有意差が観察され、PCoAプロット上の各群の明確なクラスタリング（p= 0.02）によって示された（図9D）。興味深いことに、FMTを受けたETEC感染子豚（FMT-EC群）では、α多様性の有意な減少が見られた（図9C（Shannon指数）＆補足図12（Chao1指数））。ETEC群とFMT-EC群の比較から、ETEC感染動物におけるPseudoscardoviaの存在量（p= 0.005）とFMT投与歴の間に正の関連があることが明らかになり、これはFMT-EC群のコアマイクロバイオーム組成にも反映された（図9A, B）。逆に、ETEC感染群におけるFMT治療の欠如は、Bifidobacterium属、Mogibacterium属、Lachnospiraceae_NK3A20グループ、およびSharpea属の減少に関連していた（図9F, E）。これらのグループ間の最も顕著な違いは、FMT-ECグループではETECグループと比較してPseudoscardovia属の存在量が増加し、前述のようにFMTグループ対コントロールグループで見られたようにBifidobacterium属の存在量が低いことであった（図9F, E &10 ）。さらに、FMTを受けたETEC感染子豚は、Sharpea属、Mogibacterium属、Lachnospiraceae属、およびAcidaminococcus属を含むいくつかの細菌属の存在量の減少を示した（図9F、Eおよび10）。これらの知見は、ETEC感染における腸内細菌叢組成の調節におけるFMTの重要な影響を強調するものであり、特にPseudoscardoviaのような有益な属の存在量を増加させるFMTの役割を強調するものである。

図9

ETEC感染離乳子豚の空腸マイクロバイオーム組成パターンと多様性に対する事前のFMTの効果。AETEC感染子豚のコアマイクロバイオーム組成を示すヒートマップ。BFMT治療を事前に受けたETEC感染子豚のコアマイクロバイオーム組成を示すヒートマップ。CETECに感染した対照子豚（EC）および事前にFMT治療を受けたETEC感染子豚（FMT-EC）の空腸微生物群集内のα多様性のシャノン指数を示すボックスプロット。D主成分分析（PCoA）の散布図で、EC群とFMT＋EC群の空腸微生物叢のβ多様性を示した。EEC群とFMT + EC群における微生物属の遺伝的多様性の比較と個体群密度を示す微生物群集の系統樹アバンダンスマップ。FEC群とFMT + EC群における有意差のある微生物属の階層的分類学的分布と相対的存在量を描いたヒートツリー；GEC群とFMT + EC群における様々な細菌属の存在量と空腸におけるPseudoscardovia属との相関。

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図10

EC群とFMT＋EC群で発現量の異なる主な細菌属。EC群とFMT＋EC群におけるLactobacillus属、Mogibacterium属、Megasphaera属、Sharpea属、Bifidobacterium属、Pseudoscardovia属、Paeudoramibacter属の存在量の差をボックスプロットで示す。

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メタボローム解析により、ETEC群とFMT-EC群の空腸内容物における様々な代謝経路の濃縮度と異なる代謝物の個々の存在量に有意差が認められ、ETECによる空腸内腔のメタボローム変化が確認された（図11A、B、C）。これらの変化は、FMT処理後の炭水化物、アミノ酸、プリン代謝の濃縮を含め、ある程度コントロール群とFMT群のそれと類似していた（図11C）。しかしながら、ETECに暴露された離乳子豚の空腸における糞便微生物関連の変化は、必ずしも良好ではなかった。ヒスタミンおよびその代謝物であるイミダゾール酢酸のレベルの上昇が、ETEC単独チャレンジと比較してFMT-EC群で観察された（図11D）。このことは、FMTが、ETECチャレンジ群における局所的なアレルギー反応または免疫反応を誘発し、これらの動物における炎症または腸透過性反応につながる可能性があることを示唆している。

図11

ETEC感染離乳子豚の空腸メタボロームに対するFMT前投与の影響。Aコントロール群とFMT群における代謝物濃縮の差を示す代表的なメタボロームヒートマップ（ncモード解析）。B主座標分析（PCoA）プロットで、EC群とFMT + EC群間のメタボロームプロファイルの分散を示す。C代謝経路の濃縮解析を表す棒グラフ。この図は、「ncモード」メタボロームデータから得られたEC群とFMT + EC群における上位25の濃縮代謝経路の概要を示している。DETEC感染離乳子豚の空腸ヒスタミンおよびヒスタミン代謝物イミダゾール酢酸の相対量に対するFMTの効果

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空腸マイクロバイオームおよびメタボロームシグネチャーで観察されたシフトに加えて、ETEC群とFMT-EC群の間の下痢スコアでもある程度有意差が観察された（図12A）。FMT処理動物は、ETEC対照群と比較して、感染後4日目に有意に低い下痢スコアを示した。下痢は、すべての群で4日後に徐々に治まり、感染後4日後の下痢スコアに有意差は観察されなかった。ETECが誘発する下痢は、子豚の腸内では構造的下痢というよりむしろ機能的下痢であることから、これは驚くべきことではない。さらに、我々の実験では、ETECチャレンジは軽度の臨床症状しか誘発しなかった。チャレンジ後4日目（下痢のピークスコア）の糞便サンプルのF-18ピラスを標的とするTaqMan qPCRは、ETEC群とFMT-EC群の間で糞便ETEC負荷量に有意差はないことを明らかにした（図12C）。総合的な大腸菌排出スコアには、処置群間で有意差は認められなかった（補足図13）。

図12

離乳子豚の下痢スコア、空腸組織学および糞便中ETEC排出に対するFMTの効果。A異なる処理群における、異なる時点での一時的な下痢スコア評価。B下痢のピーク時（ETECチャレンジ後4日目）の異なる処置群の空腸組織像。C異なる治療群におけるETECチャレンジ後4日目の糞便F-18 + ETEC細菌量

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考察

子豚のPWD管理にFMTを統合することは、一般的に離乳後に起こる腸内細菌異常症の悪影響を軽減する新しいアプローチを提示する。我々の知見は、離乳期の子豚におけるFMTの多面的な利点に関する既存の知見を裏付け、拡張するものであり、マイクロバイオーム、メタボローム、トランスクリプトームの各側面を包含し、これらは離乳期の子豚のより健康的な腸内環境に総合的に寄与している[25,26,27,29,30,31,37,49,50]。

例えば、Tangら（2020）は、離乳期の子豚における腸内細菌群集、免疫応答、およびバリア機能に対するFMTの効果を調査し、成長成績、結腸長、および腸内細菌叢組成の有意な変調の顕著な改善を見出した。このアプローチでは下痢も改善され、腸の健康と疾病抵抗性を高めるFMTの役割が実証された［29］。同様の研究では、FMTの実用化に焦点を当て、子豚の成長と腸内細菌叢組成に対する異なる送達方法の効果を調べた。すべてのFMT処置が対照と比較して体重と日増体を改善した一方で、この研究では凍結乾燥した飼料中FMTが腸内微生物群集構造を顕著に変化させたことが強調され、豚管理におけるFMT投与をより容易にする可能性が示された［51］。

FMTが腸管免疫反応とバリア機能に及ぼす影響については、いくつかの研究で実証されている。Xiangら（2020）は、FMTとプロバイオティクスを組み合わせた早期介入により、炎症が有意に抑制され、腸管バリア機能が改善し、離乳ストレスが緩和されたことを示した［32］。同様に、Maら（2021）も、FMTが有益な細菌を豊富にし、タイトジャンクションタンパク質を強化し、炎症性サイトカインをダウンレギュレートする能力を実証し、それによってより健康的な腸内環境が育まれることを示した［24］。Rahmanら（2023）は、FMT処理した離乳期のブタにおいて、盲腸における特定の有益な細菌属の濃縮とプロピオン酸産生の増加を示し、微生物組成の適度な変化とアミノ酸代謝に関連する代謝産物の産生促進に寄与した［27］。さらに、Liuら（2024）は、FMTが腸内細菌叢由来のリポ多糖（LPS）レベルを低下させ、酸化ストレスを緩和し、腸管バリアの完全性を維持し、最終的に離乳初期に誘発される結腸内細菌叢異常による下痢を軽減することを実証した［52］。Chengら（2018）は、FMTが有益な腸内細菌を増加させ、保護的オートファジーを強化し、代謝プロファイルを改善し、腸の形態改善と透過性の低下につながることを実証した［53］。一方、Nowlandら（2020）は、多様性の増加と潜在的に病原性のある細菌と有益な細菌の存在を観察した。この研究は、大腸菌の増加にもかかわらず、乳酸桿菌のような有益な微生物も豊富にすることで、腸内細菌異常症を緩和するFMTの能力を強調している［25］。

糞便サンプルや大腸内容物におけるFMTに関連した変化を調査した先行研究とは異なり、本研究では特に、栄養吸収とETECのコロニー形成の主要部位である豚腸の最長セグメントである空腸に焦点を当てた。そこで、離乳期の子豚を対象に、FMT後の空腸内容物のメタボロームとマイクロバイオームの変化、および空腸組織における遺伝子発現の変化を調べた。その結果、FMTは離乳子豚の空腸の微生物多様性を有意に高め、空腸微生物叢の組成を変化させ、特にPseudoscardovia（シュードカルドビア）などの小腸細菌集団を濃縮することが明らかになった。注目すべきことに、微生物の多様性の増加と特定の分類群の調整は、成熟した健康な腸で見られるものを模倣しており、FMTが離乳後の子豚の腸内細菌叢の成熟を促進することを示唆している。これは、離乳が腸に与える破壊的な影響を考えると、特に関連性が高い。回腸や結腸とは異なり、空腸ではFMT後3週目にα多様性の増加がみられ、この未解明だが重要な腸管セグメントにおけるFMTの影響が長期にわたって持続することが示された。先行研究とは異なり、FMT後の遠位腸管セグメント（回腸と結腸）における微生物多様性の変化は、本実験ではわずかであった。これは、研究デザインのばらつき、FMTの接種量と投与量の違い、投与頻度、FMT後の腸内容物採取のタイミングに起因するのかもしれない。我々の研究では、2回投与後のFMT投与3週目に採取したサンプルからマイクロバイオームの変化を解析した。空腸の微生物多様性指標に強固な変化が観察されたのは、遠位区間に比べてベースラインの微生物多様性が比較的低いことに加え、生理学的要因やその独特の微小環境によるものと考えられる。これらの要因によって、空腸では効果が長期化したのに対し、遠位節ではもともと微生物多様性が高いため、組成の安定化がより急速に起こったと考えられる。

ビフィズス菌科ビフィズス菌属の中でも、より広く知られているビフィズス菌属に近縁なシュードカルドビア属は、小腸内細菌叢の中では比較的研究が進んでいない微生物である[54,55]。結果は、対照動物からの存在量データに見られるように、離乳子豚の空腸にはこの細菌が存在しないことを示している。興味深いことに、空腸におけるPseudoscardoviaの存在量が著しく増加し、Bifidobacteriumの存在量と逆相関していることから、同じ細菌ファミリーの中でFMT後の微生物集団に顕著な変化が見られる。我々の知る限り、これは、離乳期およびFMTを受けた子豚における、この特定の、そして最近発見された小腸細菌の欠如と存在量に関する最初の報告である。ビフィズス菌の集団は、乳糖や牛乳に含まれる他の単糖を発酵させる能力により、子豚のミルク給与に主に関連している [56,57]。離乳後の子豚がミルク食から固形食に移行すると、腸内細菌叢は新たな食餌基質に適応するために組成が大きく変化する。我々の研究で観察されたように、FMT処理した離乳期のブタでは空腸のシュードカルドビアが増加していることから、腸内細菌叢が固形飼料に顕著に適応していることが示唆される。FMT処理動物において統計的に最も有意な組成変化の一つとして同定されたこの移行は、有益な適応メカニズムを示唆しているのかもしれない。慣行飼育の豚と放牧飼育の豚の腸内細菌叢に関する最近の研究で、放牧飼育の豚では他の細菌の中でもシュードスカルドビア・ラダイ（Pseudoscardovia radai）がより豊富であることが明らかになり、放牧環境で見られる複雑な植物性多糖類を豊富に含む飼料との関連が示唆された［58］。この知見は、固形飼料に移行する離乳期の豚でFMT後にこの細菌の存在量が増加するという観察と一致しており、ビフィズス菌の増殖に有利な乳糖優位のミルク飼料とは対照的に、固形飼料に多く含まれる複雑な植物性多糖類や繊維を効率的に代謝する役割を果たす可能性を示している。同様に、離乳早期の子羊のルーメン微生物叢の時間的動態に関する別の研究では、離乳早期のような食餌の変化が、Pseudoscardoviaの存在量の変動を含む微生物叢組成に大きな影響を与えることが明らかになった [59]。したがって、FMT後に観察されたPseudoscardoviaの増加は、食餌の変化に対する適応メカニズムを反映している可能性があり、離乳期の豚においてより健康で回復力のある腸内細菌叢に寄与している。

Pseudoscardoviaの他に、FMTによって濃縮される注目すべき属にはPseudoramibacterと Solobacteriumがある。Pseudoramibacter属は、複雑な多糖類や繊維を中鎖脂肪酸（MCFA）に分解することから、複雑な固形飼料への適応と関連しており、豚の腸の健康と成長成績を促進する多因子効果を有する[60,61,62,63]。ソロバクテリウムの多さは、健康な哺乳期から離乳期へのマイクロバイオームの移行、固形飼料へのマイクロバイオータの適応、特に繊維とタンニンの利用と関連することが多く、豚のより良い脂肪沈着と病気抵抗性と関連することが見出されている[61,64,65,66,67]。FMTを実施した子豚にこれらの細菌が集団的に存在することは、バランスのとれた腸内細菌叢を確立することにより、成長成績を向上させ、飼料効率を改善し、消化管疾患の発生率を低下させるFMTの可能性を強調するものである。

FMT後に観察された空腸内容物の代謝経路には、エネルギー産生、栄養代謝、および異種物質の処理に関与する経路を含む有意なシフトが認められ、宿主の腸内メタボロームに対する微生物群集の影響が大きいことが明らかになった。マイクロバイオームとトランスクリプトームの共同解析によってさらに検証されたこれらの変化は、代謝機能に対する微生物の直接的な寄与の可能性を反映しているだけでなく、宿主の空腸上皮細胞が栄養素の代謝と利用の改善に向けて再プログラミングされていることも示唆している。これらの知見は、FMTを行った離乳子豚や新生子豚において、乳酸、ビタミン、脂肪酸、脂質などの大腸代謝産物が増加したという過去の報告と一致している[26,33,53,68]。ビタミンB6の代謝や脂質の生合成といった重要なプロセスに関与する空腸代謝物の変化は、FMTを投与した子豚の栄養状態が改善され、成長成績が向上する可能性があることを示唆しており、特に注目に値する。

これまでの知見と一致して、われわれのトランスクリプトーム解析は、FMTが空腸組織内の遺伝子発現に及ぼす調節的影響についての洞察を提供し、離乳期の子豚における腸管免疫応答、代謝、腸管バリア、および恒常性に関与する遺伝子における有意な調節を強調した［24,29,32,52］。抗菌防御および免疫調節に関連する遺伝子の発現増加は、FMTが空腸の微生物ランドスケープを形成するだけでなく、病原体に対する回復力を高めるために粘膜免疫系をプライミングすることを示唆している。同時に、ストレス応答と炎症性シグナル伝達に関連する遺伝子のダウンレギュレーションは、FMT後の腸内環境がより恒常的で炎症が少ないことを示しており、ETECのチャレンジに直面したFMT治療動物の下痢スコアの重症度が低下したという観察と一致している[28,29,52]。さらに、トランスクリプトーム-メタボロームジョイントパスウェイ解析は、FMTによって誘導された代謝物のシフトをさらに検証し、エネルギー、脂質、アミノ酸、ヌクレオチド、および異種生物代謝に関与する経路を含む主要な経路における有意な変化を強調した。さらに、FMT後の離乳子豚において、発現量の異なる主要な腸内代謝産物は、濃縮された空腸細菌の属の違いと相関していた。この情報は、離乳子豚の腸の健康を増進するための精密微生物叢および代謝産物に基づく戦略を開発するために利用できる。

ETEC感染によりマイクロバイオームおよびメタボロームプロファイルの両方が著しく破壊されたが、FMTの前処置により、そのような変化に対してある程度の回復力が得られた。ETEC群とFMT-EC群の間の下痢スコアおよびマイクロバイオーム組成の差は、腸内感染に対するFMTの保護効果を強調している。これらの結果は、離乳後の下痢に対するFMTの保護効果に関する以前の観察結果を裏付けるものである[28,29,52]。この防御機構には、微生物の多様性の向上、病原体の競合的排除、宿主免疫応答の調節が複合的に関与していると考えられ、最終的には感染症誘発性腸内異常症の重症度とその臨床症状を軽減する。

結論

要約すると、本研究は、離乳によって誘発される子豚空腸の腸内細菌異常症の有害な影響に対抗するFMTの可能性を明らかにした。この結果は、FMTがこの腸セグメントに関連する離乳後の疾患を軽減する有望な戦略であることを示している。FMTは、より回復力が高く健康に寄与する腸内細菌叢を育成し、代謝効率を高め、免疫およびストレス関連遺伝子の発現を調節することにより、PWDの複雑な病態に対処する多面的な介入の可能性が浮上した。さらに、このブタの研究結果は、小腸内細菌異常症や小腸内細菌過剰増殖（SIBO）のような関連疾患を有するヒトなど、消化管の解剖学的構造および生理学が類似している他の動物種にも拡張できる可能性がある。将来的な研究機会としては、豚の生産に向けたFMTプロトコルの最適化（例えば、粗製腸内容物ではなく、より定義された精密な微生物叢コンソーシアムを使用する）や、成長成績および健康への長期的影響の調査が挙げられる。さらに、FMTは、ヒトを含む他の動物種における小腸内細菌異常症に関連する病態に対処するための潜在的な戦略であると考えられる。

データの入手可能性

本研究の結果を裏付ける配列データは、NCBI GenbankにプライマリーアクセッションPRJNA1109784で寄託されている。メタボロームと遺伝子発現のデータセットは、補足情報として提供している。

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参考文献のダウンロード

謝辞

サンプル処理とオミックス解析において貴重な助力をいただいたInnomics Inc.のMei Liu、Sanya Pal、Renyu Li、Mayo Clinic Metabolomic CoreのXuan-Mai Pettersonとそのチーム、Diversigen Inc.のEric Saulnierとそのチームに深く感謝する。

資金提供

このプロジェクトは、USDA National Institute of Food and AgricultureのAgriculture and Food Research Initiative競争的助成金番号2022-67015-40720およびIowa Pork Producers Associationの助成金番号19-216 IPPAの支援を受けた。

著者情報

著者および所属

  1. オーバーン大学、オーバーン、AL、36849、米国

  2. シャンクマール・ムーヨットゥ＆ファルナズ・ユーセフィ

  3. アイオワ州立大学、アイオワ州エイムズ、50011、USA

  4. シャンクマール・ムーヨットゥ、ガンウー・リー、オルハン・サヒン、エリック・バロウ、ブレット・スポンサー、アレハンドロ・ラミレス

  5. デラウェア大学、ニューアーク、DE、19716、米国

  6. ムハメド・シャフィーク・ムヤリックカンディ

  7. オクラホマ州立大学、スティルウォーター、OK、74078、USA

  8. ジョイ・スカリア

  9. ケンタッキー大学（KY州レキシントン、40506、USA

  10. ブレット・スポンテラー

  11. アリゾナ大学（アリゾナ州ツーソン、85721、米国

  12. アレハンドロ・ラミレス

貢献

SMはアイデアの考案、プロジェクトの開発、実験の監督・実施、データの解析、原稿の作成を行った。ARはプロジェクトの共同開発、動物実験の監督・実施、データ解析、原稿の査読を行った。JSはプロジェクトを共同開発し、実験のマイクロバイオーム部分を監督し、結果と原稿をレビューした。MSMはマイクロバイオーム解析を行い、結果の解析と可視化を行い、原稿の共同執筆とレビューを行った。FYは、メタボロームおよびトランスクリプトーム解析を行い、結果を可視化し、オミックスデータをまとめ、原稿をレビューした。BSはマルチオミクス解析、サンプル処理、原稿執筆を共同監修した。EBは、このプロジェクトの感染症および病理学的要素を共同監修し、原稿をレビューした。GLはマイクロバイオームのサンプル処理を監修・実施した。

責任著者

Shankumar MooyottuまたはAlejandro Ramirezにご連絡ください。

倫理申告

倫理承認と参加同意

すべての動物実験および処置は、プロトコールIACUC-22-246および18-342に基づき、Institutional Animal Care and Use Committee（IACUC）に従って行われた。

出版に関する同意

本原稿には、いかなる形であれ、個人のデータは含まれていない。すべての資料は著者が所有しており、許可を得る必要はない。

競合利益

著者らは、競合する利益はないと宣言している。

追加情報

出版社ノート

シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保つ。

補足情報

補足資料1

補足資料2

補足資料3

補足資料4

権利と許可

オープンアクセスこの記事はクリエイティブ・コモンズ表示-非営利-改変禁止4.0国際ライセンスの下でライセンスされています。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、ライセンスされた素材を改変したかどうかを示す限りにおいて、いかなる媒体や形式においても、非営利目的での使用、共有、配布、複製を許可するものです。本ライセンスの下では、本記事またはその一部から派生した翻案物を共有する許可はありません。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制により許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ をご覧ください。

転載と許可

この記事について

この記事の引用

Mooyottu, S., Muyyarikkandy, M.S., Yousefi, F.et al.糞便微生物叢移植は離乳子豚の空腸宿主-微生物叢界面を調節する。Microbiome 13, 45 (2025). https://doi.org/10.1186/s40168-025-02042-9

引用文献のダウンロード

  • 2024年5月8日受領

  • 2025年1月20日受理

  • 2025年02月07日発行

  • DOIhttps://doi.org/10.1186/s40168-025-02042-9

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