幼少期の微生物叢コロナイゼーションは、肥満細胞におけるNGF産生を制御することによって侵害受容器の感受性をプログラム

2024年12月18日 17:10

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幼少期の微生物叢コロナイゼーションは、肥満細胞におけるNGF産生を制御することによって侵害受容器の感受性をプログラム

https://www.mucosalimmunology.org/article/S1933-0219(24)00125-9/fulltext

する Nasser S. Abdullah ∙ Amyaouch Bradaia ∙ Manon Defaye∙ ... ∙ Mircea Iftinca ∙ Kathy D. マッコイ ∙ クリストフ・アルティエ altier@ucalgary.ca... さらに表示

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概要
腸内細菌叢が疼痛感受性に影響を及ぼすことが最近のエビデンスから示唆されており、微生物叢を標的とした疼痛介入の可能性が強調されている。幼少期には、微生物叢と侵害受容器の両方が微調整され、環境要因に応答するが、それらが互いにどのように相互作用するかについてはほとんど知られていない。われわれは、無菌モデルおよび無配偶者モデルを用いて、微生物叢のコロニー形成が、部分的には肥満細胞による神経成長因子（NGF）の産生を調節することによって、侵害受容器の感受性を制御することを証明した。その結果、無菌マウスでは、熱刺激やカプサイシン刺激に対する応答が少なく、これは侵害受容器の細胞膜へのTRPV1の輸送が減少していることと相関していることがわかった。無胚芽マウスでは、肥満細胞のNGF発現レベルが低い。熱刺激およびカプサイシン誘発刺激に対する知覚低下、TRPV1輸送の減少、およびNGF発現の減少は、マウスを出生時にコロニー形成すると逆転するが、離乳後にコロニー形成すると逆転しない。マウスの生後数週間のマスト細胞脱顆粒とNGFシグナル伝達の阻害は、成体になってから知覚過敏の表現型につながることから、マスト細胞とNGFシグナル伝達が、生後早期のコロニー形成と侵害受容器感受性の関連に関与していることが示された。これらの知見は、幼少期の微生物叢が、マスト細胞のNGF産生とその後の侵害受容器感受性の形成に関与していることを示唆している。
意義
侵害受容器は、痛覚刺激を感知し伝達する特殊な感覚ニューロンである。生後早期において、侵害受容器は感覚経験や環境の影響を受ける。我々の研究結果は、腸内細菌叢のコロニー形成が、痛覚刺激に対する侵害受容器応答の閾値設定に不可欠であることを示している。私たちは、幼少期の細菌コロニー形成が肥満細胞による神経成長因子の産生を制御し、その後の人生の痛みに対する感受性に影響を与えることを示している。本研究は、腸内細菌叢を標的とした新たな疼痛治療法開発の可能性を明らかにするものである。
はじめに
前臨床および臨床研究から、腸内細菌叢が痛みの感受性に影響を与えることが示唆されており、疼痛管理や治療において微生物叢を標的とした介入の可能性が強調されている1-4。侵害受容器は、侵害刺激を感知し伝達する特殊な感覚ニューロンである。侵害受容器のサブセットは、カプサイシンや熱の受容体である一過性受容体電位バニロイド-1（TRPV1）を発現しており、炎症や傷害に反応して感作され、活動が亢進し、疼痛閾値が低下する5-7。侵害受容器の発達は胚から始まり、分化と感受性のプログラミングが起こる生後早期まで続く8,9。この発達の遅れにより、感覚侵害受容系は環境に適応する機会が与えられる。侵害受容器のこの適応の窓は、腸内細菌叢の確立と一致している。侵害受容器と同様に、生後早期の腸内細菌叢もまたダイナミックな発達段階にあり、外的影響（摂食様式、分娩様式、遺伝、母体のストレス、抗生物質の使用など）に敏感に反応し、後に宿主の生理機能を乱す可能性がある10。動物モデルでは、生後早期の腸内細菌叢の変化（dysbiosis）が成体での内臓過敏性の亢進につながることが示されている。しかし、幼少期の微生物叢が侵害受容器の感受性を制御するメカニズムは完全には解明されていない。
神経成長因子（NGF）は、侵害受容器と疼痛の重要な制御因子である11。NGFは侵害受容経路の発達、感作、可塑性に影響を及ぼし、疼痛感受性と慢性疼痛状態の維持に寄与している12-15。NGFは、トロポミオシン受容体キナーゼA（TrkA）とTRPV1を発現するペプチド作動性侵害受容器のサブセットに作用する11,16-18。侵害受容器の生存に不可欠な役割に加え、NGFは侵害受容器特異的受容体の発現や、TRPV1.15をはじめとする疼痛シグナル伝達に関与するイオンチャネルの制御に極めて重要である。マスト細胞は最近、末梢におけるNGFの主要な供給源のひとつであり、ヒトおよび動物モデルの両方において侵害受容器の重要な制御因子として注目されている19-21。これらの肥満細胞は皮膚の侵害受容器線維と密接な接触を形成しており、その成熟と発達はマイクロバイオームの影響を受けている21-24。ここでは、微生物叢のコロニー形成が、部分的には肥満細胞の成熟とNGFシグナル伝達を制御することによって、侵害受容器の感受性をプログラムすることを示す。
結果
生後の微生物叢コロニー形成は、無菌マウスのカプサイシン感受性の低下を回復させる
幼少期の微生物叢が侵害受容にどのような影響を及ぼすかを調べるため、以前に報告されたTRPV1-pHluorinレポーターマウスを使用した25。そして、特異的病原体フリーマウス（SPF）、無菌マウス（GF）、gnotobiotic Oligo-Mouse-Microbiota（OMM12）.26、および離乳後のGF-colonized（GF-C）TRPV1-pHluorinマウスのカプサイシン誘発反応を調べた（図1A、B）。無菌状態で生まれ、P24でSPF微生物叢にコロニー形成されるGF-Cマウスは、生後早期のコロニー形成の重要性を調べるために使用された。OMM12微生物叢は、マウス腸内の5つの主要な原核生物門（バクテロイデス門、バチロタ門、シュードモナドータ門、放線菌門、疣贅菌門）を代表する12種のマウス常在細菌から構成されている。OMM12マウスは、微生物叢の構成が侵害受容にどのように影響するかを評価するために使用された。コロニー形成状況を検証するため、SPF、GF-CおよびOMM12マウスの盲腸重量を測定し、糞便サンプルの16S rRNA塩基配列を決定した（図S1A-E）。以前に報告したように、GFマウスの盲腸は未消化の食物繊維の発酵により5倍以上肥大していた28。このパラメータは、GF-CマウスおよびOMM12マウスではそれぞれ完全に、あるいは部分的に回復しており、GF-CマウスおよびOMM12マウスのコロニー形成が成功したことを裏付けている（図S1B）。糞便サンプルの16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを行い、SPFマウス、GF-Cマウス、OMM12マウスの微生物組成を測定した（図S1C-E）。SPFマウスとGF-Cマウスのα（図S1C）とβ（図S1D）の多様性は類似しており、OMM12マウスとは有意に異なっていた。このことは、各群の属の相対的存在量（図S1E）にも反映されており、GF-C群ではSPF微生物叢のコロニー化が成功し、OMM12群ではgnotobiotic状態であることを示している。

図1 無胚芽マウスは、熱およびカプサイシン誘発性侵害受容反応が低下しているが、これは生後早期のコロニー形成によってのみ回復する。(A）TRPV1チャネルの細胞外ターレット領域にpHluorinを付着させたトランスジェニックマウスモデル（TRPV1-pHluorin）を用いた。(B）4群のTRPV1-pHluorinマウスを作製した。SPF＝特異的病原体フリーマウス。GF = 無菌マウス。GF-C = 離乳後にコロニー形成されるGFマウス。OMM12＝出生時にコロニー形成された中程度に多様な微生物叢を定義したオリゴマウス-微生物叢マウス。(C) Hargreaves試験により、雄の熱刺激に対する肉球引き抜き潜時を測定した。SPF、n=21；GF、n=23；GF-C、n=16；OMM12、n=18。(D）カプサイシンテストを行い、雄におけるカプサイシン誘発性侵害行動を測定した。SPF、n=18；GF、n=20；GF-C、n=16；OMM12、n=19。統計解析は、一元配置分散分析（One-way ANOVA）とTukeyのポストホック検定を用いて行った（* p < 0.1, *** p < 0.001, **** p < 0.001）。結果は平均値±SEMを示す。
次に、各マウス群の熱およびカプサイシン感受性を、熱侵害に対するHargreaves試験およびカプサイシン試験を用いて調べた。その結果、雄性GFマウスでは、熱刺激に対する肉球引き抜き潜時が増加した（図1C）。この熱感受性はOMM12マウスでのみ回復した。同様に、後肢にカプサイシンを注射すると誘発される侵害行動も、雄性GFマウスでは減少し、OMM12マウスでのみ完全に回復した（図1D）。重要なことは、これらの実験が雄マウスで行われたため、雌マウスでもハーグリーブス試験とカプサイシン試験を行ったところ、同様の結果が得られたことである。このことから、熱およびカプサイシン感受性に対するマイクロバイオームの性特異的な影響はないことが示唆された（図S2A、S2B）。雄マウスでは、冷感（図S2C）、機械的感受性（図S2D）、ヒスタミンに対するかゆみ反応（図S2E）、ホルマリン注射に対する第1相および第2相反応（図S2F）など、他の感覚モダリティも調べた。すべての試験で、GFマウスとGF-Cマウスで同様の知覚過敏の反応がみられ、OMM12マウスでは回復した。これらの結果は、生後24日間のコロニー形成が侵害受容反応の正常な発達に不可欠であることを示唆している。
生後早期のコロニー形成は、侵害受容器の仕様と神経解剖学的構成をそのまま維持すると同時に、TRPV1トラフィッキングを制御している
無菌状態で生まれたマウスで観察された感受性の変化が侵害受容器の仕様の変化によるものであるかどうかを理解するために、まず、GFマウスとコロニー形成マウスの小型DRGニューロンのサブセットを評価した。TRPV1チャネルは、生後早期にはDRGニューロンの大きなサブセットに発現しているが、成体期にはペプチド作動性の小径C線維に徐々に減少する9。細菌のコロニー形成が、ペプチド作動性TRPV1+ニューロンの発達と特定に影響を及ぼすかどうかを調べるため、SPF、GF、GF-C、OMM12マウスのDRGにおけるTRPV1-pHluorin+ニューロンの割合とそのサイズ分布を解析した。TRPV1-pHluorin+ニューロン、TrkA+ニューロン、CGRP+ニューロン、SP+ニューロンの割合とサイズ分布には、4つの異なるコロニー形成状態間で差は見られなかった（図2A-F）。次に、TRPV1-pHluorinとTrkA、IB4、SPとの重なりを調べたが、グループ間に差は見られなかった（図S3A-C）。これらの結果と合わせて、TRPV1+ニューロンは脊髄後角のラミナIと外側ラミナIIに正常に投射しているのに対し、IB4+ニューロンは内側ラミナIIに投射していることから、侵害受容器の分化と中枢投射は、コロニー形成の状態にかかわらず、そのまま維持されていることがわかった（図S3D）。

図2 侵害受容器の分化はマイクロバイオームによって変化しない。(A）SPF、GF、GF-C、OMM12マウスのDRGにおけるTRPV1-pHluorin、TrkA、IB4、CGRP、SPの免疫染色の代表画像（スケールバー＝100μm）。DRG切片ごとに、（B）TRPV1-pHluorin+（n＝5-10/群）、（C）TrkA+（n＝5-6/群）、（D）IB4+（n＝4/群）、（E）CGRP+（n＝3-4/群）、（F）SP+（n＝3-4/群）の侵害受容器の割合とサイズ分布を算出した。統計解析は統計解析は、Kruskal-Wallis検定とDunnのpost-hoc検定、または二元配置分散分析とTukeyのpost-hoc検定で行った。結果は平均値±SEMを示す。
次に、足底の皮膚における侵害受容器の神経支配の密度とパターンを調べた（図3A）。CGRP+線維（図3B）、GFRα2+線維（図3C）、PGP9.5+線維（図3D）の神経支配密度を解析したところ、それぞれペプチド性線維、非ペプチド性線維、汎神経性マーカーのマーカーであり、真皮、表皮ともに神経支配のパターンに変化は見られなかった。このことは、皮膚の感覚神経支配は生後早期のマイクロバイオームによって変化しないことを示唆している。しかしながら、TRPV1-pHluorin神経支配を解析すると、特に表皮でシグナルの減少が観察された（図3E）。ペプチド性線維はまだ存在していることから、TRPV1-pHluorin染色の減少は、TRPV1チャネルの発現低下、あるいは侵害受容器終末への軸索輸送や膜挿入を含む輸送障害に起因している可能性が示唆される。

図3 皮膚神経解剖学的組織はマイクロバイオームによって変化しない。(A）SPF、GF、GF-C、OMM12マウスの後肢の真皮と表皮におけるTRPV1-pHluorin、CGRP、GFR⍺2、PGP9.5線維の免疫染色の代表的な画像（スケールバー＝100μm）。真皮および表皮の線維密度は、(B) CGRP+線維（各群n = 3）、(C) GFR⍺2+線維（各群n = 3-4）、(D) PGP9.5+線維（各群n = 3-4）、および(E) TRPV1-pHluorin+線維（各群n = 3-6）について算出した。統計解析は統計解析はKruskal-Wallis検定とDunnのpost-hoc検定で行った（* p < 0.1, ** p < 0.01, *** p < 0.001）。結果は平均値±SEMを示す。
DRGの免疫組織化学とウェスタンブロット解析を用いて、TRPV1チャネルの総発現量を測定した（図4A-D）。タンパク質の発現に群間差は認められなかった。次に、SPFマウス、GFマウス、GF-Cマウス、OMM12マウスから単離したTRPV1ニューロンの細胞特異的解析を行うことで、TRPV1の細胞膜への挿入を探索した。非透過化ニューロンの細胞外GFPエピトープを染色することで、細胞表面上のTRPV1チャネルの存在を確認することができた（図4E）。その結果、GFおよびGF-Cニューロンでは膜結合型TRPV1の減少が観察されたが、OMM12ニューロンではSPFコロニー化マウスと同様の表面発現レベルが認められた（図4F、G）。したがって、今回の結果から、初期生育期のマイクロバイオームは、DRG内のTRPV1+ニューロンの数（図2A、B）やDRG内のTRPV1タンパク質レベル全体（図4A-D）には影響しないものの、細胞膜におけるTRPV1の局在には影響することが示された（図4F、G）。

図4 GFマウスではTRPV1の機能が低下し、OMM12マウスでは回復している。(A）SPFマウス、GFマウス、GF-Cマウス、OMM12マウスのDRGにおけるTRPV1-pHluorinの免疫染色の代表画像（スケールバー＝100μm）。(B）各群について、DRGニューロンからのTRPV1-pHluorinのシグナル強度を測定した（各群n = 3-6）。(C、D）DRG溶解液からのTRPV1-pHluorinを、β-チューブリンに対して正規化した抗GFP抗体を用いてウェスタンブロットした（各群n＝3〜4）。(E）TRPV1の細胞膜への挿入を測定し、膜結合TRPV1と細胞内TRPV1を区別するために、膜結合TRPV1-pHluorinをGFP抗体とAlexa 555二次抗体で非透過状態で免疫染色した。(F）SPF、GF、GF-C、OMM12マウスの培養DRGニューロンにおける膜結合TRPV1-pHluorinを示す代表的な画像（スケールバー＝2μm）。(G）SPFマウス（平均強度＝68.07）、GFマウス（平均強度＝41.87）、GF-Cマウス（平均強度＝45.20）、OMM12マウス（平均強度＝63.90）から採取したDRGニューロンにおける膜結合TRPV1のシグナル強度の定量化（各群n＝269-363）。(H）TRPV1-pHluorin+DRGニューロンで記録されたカプサイシン誘発スパイク発火（100 nM）を示す代表的なトレース。すべてのin vitro電流クランプ実験において、500msの矩形電流パルスを10pAずつ、5秒間隔で注入した。スケールバー：20 mV/50 ms。(I) SPFマウス（2.54±0.62Hz、n=18）、GFマウス（0.57±0.13Hz、n=19）、GF-Cマウス（1.13±0.19Hz、n=26）、OMM12マウス（1.85±0. 統計解析は、Kruskal-Wallis検定とDunnのpost-hoc検定、またはOne-way ANOVAとTukeyのpost-hoc検定を用いて行った（* p < 0.1, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001）。結果は平均値±SEMを示す。
TRPV1輸送の減少が侵害受容器の機能的変化をもたらしたことを確認するため、次にカプサイシンに対する単離されたDRGニューロンの感受性を評価した。カプサイシンに対するTRPV1-pHluorin+ニューロンの全細胞パッチクランプを行った（図4H）。100nMのカプサイシンによって誘発される活動電位の発火は、GFマウスでは減少したが、OMM12マウスでは回復した（図4I）。これらの所見は、われわれの行動学的結果と一致し、知覚過敏の表現型は、脊髄上部の影響というよりもむしろ、侵害受容器におけるTRPV1の翻訳後修飾の変化によるものであることを示唆している。
早期のコロニー形成は肥満細胞由来のNGF産生を制御する
TRPV1の細胞膜への輸送に影響を与える主な分泌因子のひとつがNGFである15。NGFは侵害受容器上のTrkA受容体に作用し、Srcキナーゼを介してTRPV1をTyr200でリン酸化し、細胞膜へのチャネル輸送を増加させる15。肥満細胞は皮膚の侵害受容器と密接な接触を形成し、末梢におけるNGFの主要な産生因子の一つであることが示されている19-22。さらに、肥満細胞の分化はマイクロバイオームによって制御されており、初期のコロニー形成が、肥満細胞の発達と成長因子およびサイトカインの産生に重要な役割を果たしている23,24。そこで我々は、マイクロバイオームが誘発するTRPV1の翻訳後修飾の潜在的なドライバーとして、肥満細胞由来のNGFを調べた。マスト細胞顆粒のマーカーとして、フルオロクロム標識したアビジン-スルフォローダミンを用いて、SPF、GF、GF-C、OMM12マウスの足底皮膚のマスト細胞密度を比較した22,29。マスト細胞の密度はどのコロニー形成条件でも同程度であることがわかったので（図5A、B）、次にこれらの細胞におけるNGFのレベルを調べた。まず、皮膚のNGF+細胞は、アビジン+細胞（平滑筋細胞）やF4/80+細胞（マクロファージ）ではなく、α-平滑筋アクチン+細胞（平滑筋細胞）と完全に重なっていることが観察された（図5C、D）。さらに、NGFは肉球皮膚でCD11b+細胞（マクロファージ）（図S4A）またはCD11c+細胞（樹状細胞）（図S4B）とも重ならなかった。さらに、肥満細胞欠損マウス（B6.Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ）を用いると、皮膚にアビジン+細胞もNGF+細胞も見られなかった（図5E）。さらに、DRG内にもNGF+細胞は見られなかった（図S4C）。免疫組織化学で肥満細胞のNGFレベルを比較すると、GFおよびGF-CでNGFシグナル強度の有意な減少が認められた（図5F、G）。このNGFレベルの低下は、OMM12肥満細胞では回復した。従って、これらのデータは、早期の微生物コロニー形成が、肥満細胞の成熟とNGF産生を促進する鍵となることを示している。

図5 肥満細胞由来NGFはGFマウスでは減少し、OMM12マウスでは回復する。(A）アビジン＋皮膚肥満細胞を示す代表的な画像（スケールバー＝100μm）。(B）後肢における肥満細胞の密度の定量化（各群n = 4-5）。(C）後肢皮膚の真皮および表皮におけるNGF、アビジン、⍺-SMA、およびDAPIの免疫染色の20倍（スケールバー＝100 µm）および63倍（スケールバー＝25 µm）の代表的画像。(D）後肢皮膚の真皮と表皮における免疫染色NGF、アビジン、F4/80、DAPIの20倍（スケールバー＝100 µm）と63倍（スケールバー＝25 µm）の代表画像。(E）野生型マウスと肥満細胞KOマウスの後肢皮膚の真皮と表皮における免疫染色NGF、アビジン、DAPIの代表的な画像（スケールバー＝100μm）。(F）皮膚肥満細胞におけるNGF免疫染色を示す代表的な画像（スケールバー＝5μm）。(G）皮膚肥満細胞におけるNGFシグナル強度の定量化（各群n = 8-14）。統計解析は、Kruskal-Wallis検定とDunnのpost-hoc検定、またはOne-way ANOVAとTukeyのpost-hoc検定を用いて行った（* p < 0.1, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001）。結果は平均値±SEMを示す。
最後に、これまでの報告によると、GFマウスは大腸拡張に反応して内臓知覚過敏を示す。我々は、GFマウスの内臓知覚過敏を確認した（図S5A）。皮膚で観察されたTRPV1輸送の減少という同じ表現型が腸でも起こるかどうかを調べるために、腸のTRPV1-pHluorin+線維とPGP9.5+線維を評価した（図S5B）。その結果、TRPV1-pHluo線維もPGP9.5線維も神経支配密度に違いは見られなかった（図S5C, D）。肥満細胞を調べるため、大腸と皮膚のAvidinとMCPT1の免疫染色を比較した（図S5E）。その結果、腸ではほとんどがMCPT1+肥満細胞を発現し、皮膚ではほとんどがアビジン+肥満細胞を発現していた。NGF発現レベルを見ると、皮膚ではNGF+細胞が有意に多かった（図S5F）。NGFと大腸のMCPT1+細胞および肉球のアビジン+細胞との重なりを比較すると、皮膚のNGF+細胞の96％以上がアビジン+であるのに対し、腸のMCPT1+細胞との重なりはごくわずかであることが観察された（図S5G）。これらの結果は、侵害受容器と肥満細胞に対する微生物叢の制御メカニズムが、腸と皮膚では異なることを示している。
生後早期のコロニー形成は、部分的には肥満細胞由来のNGFを介して侵害受容器感受性をプログラムする
SPFマウスとOMM12マウスの侵害受容器感受性が肥満細胞とNGFによって決定されるかどうかを調べるため、SPFマウスとOMM12マウスを用い、生後期間中（P24の離乳まで）に抗NGF中和抗体を注射し、成体になってから熱とカプサイシンに対する感受性を調べた（図6A）。生後期間にNGFを中和すると、SPFマウス（図6B）およびOMM12マウス（図6C）の熱感受性は、GFマウス（図1C）で観察されたレベルまで低下した。さらに、SPFマウス（図6D）およびOMM12マウス（図6E）でNGFシグナルを遮断すると、カプサイシン注射によって誘発される侵害行動も減少した。したがって、抗NGFを投与したSPFマウス（図6F）およびOMM12マウス（図6G）のDRGニューロンにおけるTRPV1輸送を測定したところ、細胞膜に結合したTRPV1の減少が観察された。最後に、肥満細胞を関与させるために、肥満細胞安定化剤（MCS）であるクロモリンナトリウムをSPFとOMM12の仔マウスに生後早期（仔マウスの生存を確実にするためP14まで）に注射した（図6H）。抗NGF処理で観察されたように、MCSを投与されたSPFマウス（図6I）およびOMM12マウス（図6J）は、GFマウス（図1C）で見られたレベルと同様の熱感受性を低下させ、カプサイシンに対する侵害行動の減少を示した（図6K、6L）。同様に、MCSを投与したSPFマウス（図6M）およびOMM12マウス（図6N）では、TRPV1膜挿入が有意に減少した。これらの結果は、生後早期の肥満細胞の脱顆粒とNGFシグナル伝達が侵害受容器におけるTRPV1輸送の制御に関与し、成人期の侵害受容器感受性の閾値設定に部分的に関与していることを示唆している。

図6 マスト細胞由来のNGFは、生後の侵害受容器の感受性のプログラムにおいて中心的な役割を果たしている。(A）SPFおよびOMM12マウスに、生後期間中に抗NGFまたはアイソタイプコントロール（IgG）を注射し、8週目に検査を行った。抗NGFまたはIgGを投与した（B）SPFマウスと（C）OMM12マウスでハーグリーブス試験を行い、（D）SPFマウスと（E）OMM12マウスでカプサイシン試験を行った（SPF n＝13-15/群、OMM12 n＝18-19/群）。F）SPF（IgG平均強度＝63.32、抗NGF平均強度＝44.42）および（G）OMM12（IgG平均強度＝84.47、抗NGF平均強度＝64.11）マウス（SPF n＝183-220／群、OMM12 n＝379-494／群）の抗NGFおよびIgG対照ニューロンからの膜結合TRPV1-pHluorinのシグナル強度の定量化。(H）SPFマウスおよびOMM12マウスに、出生後の期間にクロモリンナトリウム（肥満細胞安定化剤、MCS）またはPBS（Veh）を注射し、8週目に試験した。(I)SPFマウスと(J)OMM12マウスでハーグリーヴス試験を行い、(K)MCSまたはVehを投与したSPFマウスと(L)OMM12マウスでカプサイシン試験を行った（SPF n = 5-8/群、OMM12 n = 18-19/群）。M）SPF（Veh平均強度＝85.23、MCS平均強度＝58.26）および（N）OMM12（Veh平均強度＝100.36、MCS平均強度-74.94）マウス（SPF n＝221-250／群、OMM12 n＝364-385／群）のMCSおよびVehニューロンからの膜結合TRPV1-pHluorinのシグナル強度の定量化。統計解析はMann-Whitneyのunpaired t testを用いて行った（* p < 0.1, ** p < 0.01, **** p < 0.0001）。結果は平均値±SEMを示す。
考察
本研究において、我々は、幼少期のマイクロバイオームが、皮膚肥満細胞におけるNGFの産生を促進することによって、一部は成人期の侵害受容閾値に影響を及ぼすことを報告した（図7）。その結果、TRPV1の細胞膜への輸送が増加する。我々は、幼少期の微生物叢の欠如が、(i)侵害熱とカプサイシンに対する体性反応の減少、(ii)カプサイシンによる侵害受容器の発火の減少、(iii)細胞膜へのTRPV1輸送の減少、(iv)皮膚肥満細胞におけるNGF産生の減少につながることを示した。一方、侵害受容器知覚低下は、侵害受容器の仕様の変化や組織支配の変化によるものではないことがわかった。さらに、幼少期にマスト細胞の脱顆粒やNGFシグナル伝達を阻害すると、GFマウスで観察される知覚過敏の表現型が生じることも明らかにした。これらの結果は、侵害受容器の感受性の微調整が行われる人生の形成期において、侵害受容の形成にマイクロバイオームが果たす役割を浮き彫りにしている。

図7 提案モデル。私たちが提案するモデルは、1）幼少期のマイクロバイオームが、2）侵害受容器上のTRKAに作用するシグナル伝達カスケードにつながる肥満細胞の発達とNGFの放出にどのように影響し、3）TRPV1の細胞膜への輸送を増加させ、それによって4）成人の侵害受容器の熱やカプサイシンに対する感受性をプログラムするのかを示している。
内臓痛30、化学療法誘発性疼痛31、神経障害性疼痛32、炎症性疼痛3、片頭痛33、線維筋痛症34、先天性疼痛不感症35を対象としたいくつかの研究で、マイクロバイオームが疼痛と関連していることが明らかになっている。しかし、マイクロバイオームが最も大きな効果を発揮する正確なタイミングは、依然として不明である。侵害受容器の特異性は生後早期に微調整され、生後早期に侵害受容器が活性化すると、後に感受性の亢進につながることが研究で示されている9,36。いくつかの証拠から、生後早期のマイクロバイオームが内臓痛を特異的に制御することが示唆されており、さらに広義には、生後早期の多様な微生物群集が、全身の正常な疼痛シグナリングの発達に不可欠であることが示唆されている1,2,3。侵害受容に対する微生物叢の時間的影響を調べるため、われわれは2つのモデルマウスを用いた。1つはGFで生まれ、離乳後にコロニー形成されるマウスで、もう1つは最小限の微生物叢で生まれるマウスである。重要なことは、GFマウスで観察される知覚過敏の表現型は、生後数週間の間に微生物がいない場合にのみ生じるということである。
我々は、侵害受容器の感作におけるTRPV1の役割が確立されていることから、TRPV1の機能の研究に焦点を当てた。その結果、カプサイシン感受性、熱感受性、およびTRPV1の細胞膜への輸送が、生後早期のマイクロバイオームによって制御されていることがわかった。興味深いことに、他の感覚モダリティを調べても同様の傾向が観察されたことから、初期生育期のマイクロバイオームの影響はTRPV1にとどまらず、TRPM8、電圧ゲート型ナトリウム・カルシウムチャネル、ヒスタミン誘発性のかゆみや炎症性疼痛に関与するGタンパク質共役型受容体など、他のイオンチャネルも制御している可能性が示唆された。GFマウスのカプサイシン感受性と熱感受性の違いは、われわれが提唱したメカニズムで説明できるが、それ以外にも、幼少期のマイクロバイオームによって調節される細胞タイプ、イオンチャネル、シグナル伝達経路が、全体として侵害受容器の感受性に寄与している可能性が高い。
その結果、GFマウスは有害な物理的・化学的刺激に対して低感受性であることがわかった。文献的には、GFマウスの感覚応答に関しては相反する報告があり、私たちが観察したのと同様の低感受性表現型を示す研究もある3。対照的に、ナイーブなGFマウスでは、大腸膨満による内臓感受性の測定で侵害受容過敏が観察されている1。GFマウスの内臓痛反応と体性痛反応との間に食い違いが生じる理由は、皮膚や腸粘膜を支配する神経細胞のサブタイプの特異性37、およびここで皮膚の肥満細胞について述べたような非神経細胞との相互作用によると考えられる。従って、肥満細胞は末梢の侵害受容器と密接な接触を形成し、双方向的な相互作用を行うことで、神経発達、痛み、炎症、かゆみを制御することができる38。さらに、皮膚と粘膜に存在する2つの互いに排他的な肥満細胞集団が同定されており、それぞれが特異的なトランスクリプトーム・コア・シグネチャーを持っている39。腸に存在する粘膜肥満細胞（アビジン-；MrgprB2-）は、皮膚に見られる結合組織肥満細胞（アビジン+；MrgprB2+）とは有意に異なる39。皮膚の結合組織マスト細胞は、粘膜マスト細胞とは異なる発生起源を持つ。それらは侵害受容器とより密接に関連し、粘膜肥満細胞よりも長命で、異なる更新動態を持つ39。皮膚に比べ、腸にはアビジン＋；MrgprB2＋肥満細胞が相対的に少ないこと、また、発生過程で侵害受容器の感受性を調節する上で重要な役割を果たすことが、GFマウスで観察された内臓痛と体性痛の感受性の違いを説明するのかもしれない。実際、それぞれの解剖学的ニッチにおいて、皮膚肥満細胞はNGFの主な産生者であるが、粘膜肥満細胞はそうではないことが観察された。ヒトでは、12の臓器に分布する7つの肥満細胞サブセットが同定されており、それぞれが異なるトランスクリプトーム・コア・シグネチャーを持っている39。このことは、微生物叢、肥満細胞、侵害受容器の間の複雑な関係をさらに浮き彫りにしている。皮膚求心性神経における侵害受容閾値の調整には、微生物叢のコロニー形成に依存するメカニズムとして、肥満細胞とNGFシグナル伝達が関与している可能性が高いことが示されたが、大腸膨満感に対する内臓知覚過敏の引き金となる微生物叢主導のプロセスが何であるかは、まだ明らかにされていない。そのため、Piezo2.40というイオンチャネルが候補に挙がっている。
肥満細胞に影響を及ぼすマイクロバイオームの役割は、新たな研究分野である。GFマウスでは、皮膚の肥満細胞はほとんど未分化で、未熟な表現型を示す23,24,41。これは、皮膚マイクロバイオームが産生するリポテイコ酸（LTA）が、ケラチノサイト上のtoll様受容体2（TLR2）に作用するためと考えられている。この相互作用により、幹細胞因子（SCF）の産生と放出が誘導され、それが肥満細胞上のc-kitに結合し、肥満細胞の分化と成熟を促進する24。微生物叢が肥満細胞を制御するもう一つのメカニズムは、免疫グロブリンを介したものである。GFマウスでは、新生児期にB細胞のアイソタイプスイッチングが起こるため、IgEレベルの上昇が観察され、未熟な肥満細胞につながる23,42。IgEの誘導を抑制するには、出生時に重要なレベルの腸内微生物の多様性が必要である23。成体GFマウス（IgE高値）とSPFマウス（IgE検出不能）を同居させても、GFマウスの血清IgEは低下せず、肥満細胞は成体になっても未熟なままであることから、NGF欠損の表現型はこの重要な適応ウィンドウの間に獲得されることがわかる。しかし、この時期のOMM12コンソーシアムによる腸内コロニー形成は、IgEレベルを回復させるのに十分である42。さらに、マスト細胞が完全に成熟するのは生後8～15日後であることが研究で示されている43。このことは、マスト細胞は生後間もない時期に適応期を迎え、微生物叢の影響を受けることから、本研究において、マスト細胞が微生物叢と侵害受容器をつなぐ役割を果たす可能性があるという考えを裏付けている。いくつかの重要な微生物種が、生後早期のB細胞表現型の転換とIgEの抑制を制御し、肥満細胞の成熟に影響を与える役割を担っていることが示唆されている。そのような種には、Enterococcus faecalis KB1、Akkermansia muciniphila YL44、Blautia coccoides YL58などがあり、これらはすべてOMM12のgnotobioticモデルに含まれている42。皮膚マイクロバイオーム（LTAを通じて）または腸内細菌叢（B細胞アイソタイプスイッチングを通じて）が、肥満細胞によるNGF産生に必須であるかどうか、また、我々のモデルにおける侵害受容器の制御における役割については、まだ解明されていない。
侵害受容器は有糸分裂後の感覚ニューロンである。これらのニューロンは通常、生後早期から分裂することなく生涯存続する。しかし、これらの細胞のイオンチャンネルとその関連タンパク質は、恒常性を維持するために絶えず合成と分解を繰り返しており、その半減期は数時間から数日に及ぶ44,45。したがって、成体で観察されるTRPV1の膜挿入の違いは、新しく合成されたTRPV1チャネルを標的とする継続的なプロセスから生じている可能性が高い。この調節は、キナーゼ発現レベルの調節かシャペロンタンパク質による内部調節を介して起こる可能性があり、その発現はNGFシグナルによって初期に決定される可能性がある。
NGFは、特にTRPV1感作とカプサイシン感受性を考慮すると、侵害受容器感受性の最もよく知られた制御因子のひとつである15,46。侵害受容器のTrkA受容体に作用するNGFが、カプサイシン感受性の正常化に重要な役割を果たしていることが示されている。逆に、NGFをコードする遺伝子であるNtrk1の機能喪失変異は、ヒトの痛みに対する先天性不感症につながる47-49。この過程は主に、TRPV1の翻訳後修飾を制御する役割に起因している。TrkAを介したNGFシグナル伝達は、Tyr200でTRPV1をリン酸化するSrcキナーゼを活性化し、その結果、TRPV1の細胞膜への輸送が増加する。末梢では、NGFはケラチノサイト、マクロファージ、マスト細胞から産生されると報告されている19,50,51。興味深いことに、ナイーブな動物の足底皮膚を調べたところ、NGFはもっぱら肥満細胞で認められ、ケラチノサイトやマクロファージでは発現していなかった。このことは、基礎条件下では、肥満細胞が皮膚におけるNGFの主要な産生者であることを示唆している。さらに、マスト細胞の脱顆粒を防ぐと、熱反応、カプサイシン誘発反応、細胞膜へのTRPV1輸送の減少という点で、抗NGF中和抗体を用いた場合と同じ表現型が誘導された。これらの知見は、皮膚肥満細胞によって産生される可能性のあるNGFが、侵害受容器におけるTRPV1輸送に発達段階から影響を及ぼす可能性があることを示している。侵害受容器を発達的に制御する初期生育期のマイクロバイオームの影響を受けるNGFの供給源が、マスト細胞だけなのかどうかについては、さらなる研究が必要である。皮膚肥満細胞と侵害受容器との密接な相互作用は十分に確立されているが、肥満細胞由来のNGFが侵害受容器に影響を及ぼす正確なメカニズムについては、さらなる研究が必要である。Mrgprb2-Creマウスモデルのようなトランスジェニックモデルを開発することで、結合組織肥満細胞のNGFを選択的に枯渇させることができ、侵害受容器におけるTRPV1のNGF介在性調節について、より深い洞察が得られるだろう39。
P4からP11の間の早期の抗NGF投与は、機械感受性の感覚ニューロンの機能的変化を誘導することが示されている52,53。さらに、成人における抗NGFの急性投与は、熱感受性をベースライン以下に低下させるのに十分ではない54。我々の研究では、新生児期の抗NGF治療が、成人期における不快な熱反応とカプサイシン誘発反応を調節する上でどのような影響を及ぼすかを調べた。先に述べた研究は、われわれの結果とともに、生後早期のNGFシグナル伝達を阻害することは、後に侵害受容器の機能的変化を誘導するのに十分であることを示している。注目すべきは、Ntrk1.55-57の機能喪失変異を持つヒトで以前に報告された、GFマウスにおける皮膚神経支配の変化が観察されなかったことである。したがって、感覚ニューロンの神経支配の変化を見るためには、NGFの完全な欠失が必要であると考えられる。侵害受容器感受性の制御における初期肥満細胞由来NGFの役割をよりよく理解するためには、結合組織肥満細胞におけるNGF産生を制御することが不可欠であり、発達初期にその放出をブロックし、離乳後にそれを回復させる。このアプローチにより、早期NGF曝露の意義が明らかになるだろう。さらに、in vitroとin vivoの両方で、侵害受容器反応に対する肥満細胞由来NGFの効果を包括的に特徴づけることが、肥満細胞由来NGFが、早期からのマイクロバイオームの崩壊と、その後の侵害受容器感受性の変化との間の重要な関連に直接関与していることを明らかにするために必要である。
痛み、炎症、ストレスなどの有害な出来事を早期から経験した人は、痛みの感受性が変化し、後に慢性疼痛を発症するリスクが高くなる58。重要なことは、こうした出来事には微生物組成の変化が伴っていることであり、これは発達中の神経系に長期にわたる影響を及ぼす可能性がある59。私たちの研究は、生後早期のマイクロバイオームとその後の侵害受容との間に機能的なつながりを確立し、このプロセスを組織化する上で肥満細胞が重要な役割を果たしていることを強調している。肥満細胞の機能を調節することを目的とした微生物叢由来の治療法は、早期生育異常から生じる痛みを緩和する新たな治療手段を提供する可能性がある。
方法
動物-すべての実験はCanadian Council for Animal Careのガイドラインに従って行われ、すべてのプロトコル（AC22-0142）はUniversity of Calgary Health Science Animal Care Committeeの承認を得た。TRPV1-pHluorin C57BL/6 Jマウスは、当研究室で既述のように開発した25。肥満細胞KOマウス（B6.Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ）はジャックス社から入手した（系統番号030764）。すべての実験は、特に記述がない限り、年齢をマッチさせた雄で行った。動物はケージ（30×20×15cm）に入れ、水と餌を自由に与えた（1ケージあたり1～5匹）。温度は23±1℃に制御し、12時間明期／12時間暗期サイクル（午前7時点灯）で飼育し、すべての実験は午前9時から午後1時の間に行った。GFおよびOMM12にコロニー形成されたグノトビオティックマウスは、国際マイクロバイオームセンター（IMC）内のフレキシブルフィルムアイソレーターで飼育され、SPFマウスはカルガリー大学のマウスバリアユニット（MBU）で維持された。OMM12マウスは、IMCでOMM12にコロニー形成されたダムから生まれた。GF-CマウスはIMCで生まれ、離乳後にMBUに移され、コロニー形成を促進するために、年齢および性別が一致したSPFマウスの使用済みケージに入れられた。コロニー形成状況は糞便サンプルの16S rRNAシークエンシング解析で確認し、各実験の盲腸サイズをモニターした。
微生物叢組成分析-PowerFecal Pro® DNA単離キットを用いて、各便サンプルから全ゲノムDNAを製造者の指示に従って抽出した。16S rRNA遺伝子V4可変領域は、内部バーコード付きPCRプライマーを用いて増幅した（F：AATGATACGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TATGGTAATTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA、R： CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT）KAPA HiFi HotStartマスターミックス（Roche Sequencing）を用いて25サイクルPCRを行った。サーモサイクラーの条件は以下の通りである： 98 °Cで2分間、続いて98 °Cで30秒間、55 °Cで30秒間、72 °Cで20秒間を25サイクル行い、その後72 °Cで7分間の最終伸長ステップを行った。増幅されたPCR産物を1 %アガロースゲルで確認した。その後、PCR産物をNucleoMag NGS Clean-up and Size Select（Macherey-Nagel）を用いて精製し、SequalPrep Normalization Plate（Invitrogen）を用いて濃度を正規化した。アンプリコンをプールし、Qubit HS DNA kit（Invitrogen）およびTapestation D1000 assay（Agilent）を用いて、それぞれ濃度と品質を決定した。V2-500サイクルキット（Illumina Inc）を用いて、MiSeq Benchtop DNAシーケンサー（Illumina）でアンプリコンシークエンシングを行った。その後、プールしたライブラリーを変性させ、5 % PhiX ControlとともにIllumina MiSeqカートリッジにロードする準備をした。
行動
カプサイシンテスト-マウスをまず行動室に1時間馴化させ、その後個別のプレキシガラスチャンバーで45分間の馴化を行った。エタノール中のカプサイシン（シグマ、M2028）のストック溶液を生理食塩水/10%エタノール/0.5%Tween80（REF）で希釈した。カプサイシン（1.6μg）を30G注射針（0.3 mm x 13 mm、BD PrecisionGlide）を用いて植物内に注射した。その後、マウスをそれぞれのプレキシグラスチャンバーに戻し、侵害行動（舐める、振る、たじろぐ、注射した足を持ち上げる）を5分間ビデオ録画した。
熱感受性（Hargreaves test）-1時間後、行動観察室に馴化させた後、マウスを透明なプレキシガラスの上にある個別のプレキシガラスチャンバーに45分間入れた。熱性皮膚侵害受容は、前述したように、集束した放射熱ビームに反応して後肢を引き抜くまでの潜時として測定した60。Plantar Test Apparatus (UgoBasile, Gemonio, Italy)を用い、放射熱線(IR = 30)を後肢の足底に照射した。後肢1匹につき3回（マウス1匹につき合計6回）測定した。組織の損傷を防ぐため、15秒をカットオフタイムとした。
機械的感受性、Von Freyテスト-マウスを1時間行動観察室に馴化させ、その後プラスチック製の個室内の金属メッシュ上に45分間置いた後、自動化されたVon Frey金属フィラメント（Ugo Basile社、Gemonio、イタリア）による前足引き抜きに対する閾値を測定した。フィラメントを後肢の足底にあて、マウスが前足を引き抜くまで一定の圧力を加えた。後肢1本につき3回（マウス1匹につき合計6回）測定した。
ヒスタミンによる痒み-マウス麻酔にはイソフルランを用いた（導入5%、維持2.5%）。背中を剃毛し、滅菌生理食塩水で希釈した45mMヒスタミン（Sigma-Aldrich、H7125）50μlをうなじに皮内注射した。注射後すぐにマウスを個別のプレキシガラスチャンバーに置き、その行動をカメラで30分間記録した。ひっかきの回数が記録された。ひっかきの一回とは、マウスが後肢をうなじに上げ、その後口か床に戻した場合を指す。
ホルマリン試験-マウスを1時間行動観察室に馴化させ、その後45分間プレキシガラス製の個室に置いた。右後肢に滅菌PBSで調製した2.5％ホルマリン溶液25μlを注射した（足底内）。マウスを対応するチャンバーに戻し、侵害行動（舐める、振る、ひるむ、注射した足を持ち上げる）を行った時間を、ビデオレコーダーを用いて、第一の「侵害受容期」（0～10分）と第二の「炎症期」（15～35分）について記録した。
コールドプレート試験-コールドプレート試験（Bioseb, Pinellas Park, FL）を用いて、寒冷刺激に対する感受性を測定した。マウスは試験前に5分間プレートに馴化させた。プレートは0℃±0.5℃に設定した。マウスを冷えたプレートの上に置き、プレートにマウスを置いてから侵害受容の最初の顕著な行動徴候（前肢の震えと跳躍）が現れるまでの潜時を、既述の潜時時間として記録した61 。
大腸膨満（CRD）に対する内臓運動反応（VMR）-内臓感受性を測定するため、CRDに対するVMRを既述のように行った62。キシラジン／ケタミンを用いてマウスを麻酔し、腹部の外腹斜筋に2つの電極を留置した。手術から2日間回復した後、CRDを行った。電極はBio Amplifier（いずれもADInstruments社製）を介して筋電図収集システムに接続し、直径10.5mmのバルーンカテーテル（Edwards Life-Sciences社製、Cat.No.12TLW404F）をマウスの直腸近位5mmに挿入した。マウスは5分間の休息を挟んで、10秒間の膨張（圧力15、30、45、60mmHg）を4回連続して受けた。腹筋の筋電図活動を記録し、LabChart 7（ADInstruments）を用いてVMRを算出した。
NGFを阻害するために、NGF中和抗体（1mg/ml）（Exalpha、L146M）またはIgGアイソタイプコントロール（1mg/ml）（Leinco Technologies、I-536）のいずれかの10μl腹腔内注射を、P2から離乳（P24）まで3日ごとにSPFおよびOMM12の仔に行った。肥満細胞の脱顆粒を抑制するために、クロモリンナトリウム塩（19.5 mM）（Sigma-Aldrich、C0399）またはPBSの10μl腹腔内注射を、SPFおよびOMM12の仔マウスに対してP2から開始し、仔マウスの生存を確実にするためにP14まで3日ごとに行った。その後、マウスは6～8週齢まで回復させた。
細胞培養-HBSSに2mg/mlのコラゲナーゼI型と4mg/mlのディスパーゼ（ともにInvitrogen社製）を加えた溶液を用い、37℃で45分間マウスDRGを解離させた後、HBSSで2回洗浄し、Neurobasal A培養液（Thermo Fisher Scientific社製）で1回洗浄した。ニューロベースA培養液は、熱不活性化ウシ胎児血清（HI-FBS、10％）、B-27（2％）、ペニシリン（100U／ml）、ストレプトマイシン（100μg／ml）、神経成長因子（NGF、50ng／ml）およびグリア細胞由来神経栄養因子（GDNF、50ng／ml）（すべてInvitrogen製）を添加した。4mlの培地中で、火で磨いたガラス製のパスツールピペットを用いて、個々のニューロンを分散させた。解離させたDRGニューロンを、ラミニンとポリオルニチン（ともにSigma-Aldrich製）で処理したガラスカバースリップ上で37℃、湿度95%、CO2 5%で一晩培養した。
電気生理- パッチクランプ記録のために、ニューロンを以下のものを含む細胞外記録液で灌流した（単位はmM）： NaCl 140, KCl 5, CaCl2 2, MgCl2 1, Hepes 10, D-glucose 10, 22℃。TRPV1-pHluorin+ニューロンを倒立型蛍光顕微鏡（Olympus IX51、Olympus America Inc.）電流クランプモードでは、Axopatch 200BアンプとDigidata 1550Aデジタイザーを組み合わせて記録を行った。データ収集にはローパスフィルター（5kHz）を用い、Clampex 11（Molecular Devices）を用いて10kHzでサンプリングした。神経細胞は、以下の細胞内溶液を入れた抵抗2～3MΩのホウケイ酸ガラスピペットを用いてパッチされた： K-gluconate 105 mM、KCl 30 mM、MgCl2 4 mM、EGTA 0.3mM、HEPES 10 mM、Na2ATP 4 mM、Na3GTP 0.3mM、Na-phosphocreatine 10 mM、pH 7.35。化学物質はSigma-Aldrichから入手した。データ解析はEasy Electrophysiology（Easy Electrophysiology Ltd）とPrism 9（GraphPad）を用いて行った。
免疫染色と共焦点顕微鏡-脊髄、結腸、足底皮膚、DRGをマウスから採取し、PBSで灌流した後、4%PFAで処理した。その後、組織を3時間（DRG）または24時間（脊髄、結腸、足底皮膚）固定し、30%スクロースで24時間処理した。次に組織をOCT（Thermo Fisher Scientific）に包埋し、クリオスタットを用いて10μmの切片に切り出した。次に組織をPBSで2回洗浄し、5 % BSAと1 % Triton-X 100を含むPBS溶液で60分間ブロックした。次に組織を、一次抗体を含むPBS溶液中、3 % BSAと0.3 % Triton-X 100で、RTで一晩インキュベートした。PBSで洗浄後、組織を二次抗体で1時間インキュベートした。スライドをPBSで洗浄し、Aqua PolyMount（Polysciences Inc.）またはProlong Gold Antifade with DAPI（Invitrogen, P36931）でマウントした。スライドはZeiss 510共焦点顕微鏡（ImageJで解析）またはLeica SP8共焦点顕微鏡（LAS Xで解析）で画像化した。この研究では以下の一次抗体を用いた：ポリクローナルウサギ抗GFP（1:500, ChromoTek, PABG1）、ポリクローナルウサギ抗PGP9. 5（1:500、Proteintech、14730-1-AP）、モノクローナルウサギ抗NGF（1:200、abcam、ab52918）、ポリクローナルヤギ抗TrkA（1:200、R&D Systems、AF1056）、ポリクローナルラット抗Substance P（1:500、Millipore、MAB356）、ポリクローナルヤギ抗GFRα2（1:500、R&D Systems、AF429）、ポリクローナルウサギ抗CGRP（1： 500、Sigma-Aldrich、PC205L）、モノクローナルラット抗F4/80（1:500、BioLegend、123102）、モノクローナル抗マウスCD11b-APC（1:200、BioLegend、101212）、モノクローナル抗マウスCD11c-PE（1： 200、BioLegend、117308）、モノクローナルマウス抗αSMA（1:250、Sigma-Aldrich、C6198）、モノクローナルラット抗MCPT1（1:20、Invitrogen、14-5503-80）。この研究では以下の二次抗体を使用した：ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488（1:2000、Invitrogen、A11008）、ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 555（1:2000、Invitrogen、A21428）、ニワトリ抗ウサギ Alexa Fluor 647（1:2000、Invitrogen、A21469）、ロバ抗ラット Alexa Fluor 647（1:2000、Jackson ImmunoResearch、712-605-153）。二次抗体のインキュベーションには以下を用いた： IB4 Alexa Fluor 568 conjugate (1:500, Invitrogen, I21412), Avidin-Sulforhodamine 101 Texas Red conjugate (1:20000, Sigma-Aldrich, A2348).
皮膚および腸の神経支配密度解析は、後肢の足底皮膚でマウス1匹につき少なくとも10枚の画像を無作為に撮影することにより行った。線維の全長を測定し、マウス1匹あたりの対象組織の面積で正規化した。後肢の足底皮膚において、肥満細胞密度を、後肢の足底皮膚において無作為にマウス1匹あたり少なくとも10枚の画像を撮影し、それらの画像中の肥満細胞の数を数え、マウス1匹あたりの関心組織の面積（真皮および表皮）に対して正規化することにより測定した。肥満細胞NGFシグナル強度解析は、後肢の足底皮膚で少なくとも30個の肥満細胞を無作為に撮像し、ImageJを用いてシグナル強度を解析することにより行った。
DRGニューロンの割合解析は、DRGをマウス1匹につき少なくとも10枚撮影し、陽性ニューロンの数をマウス1匹につきDRGあたりのニューロン総数に対して正規化することにより行った。DRGニューロンのサイズ分布とシグナル強度は、ImageJを用いて各陽性ニューロンの面積を手動で測定することにより測定した。
TRPV1膜局在免疫染色のために、DRGニューロン細胞培養を上記のように行った。3時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、4%PFAで15分間RT固定した。PBSで3回洗浄した後、細胞をPBS中5 % BSAで15分間ブロックした。一次抗体、ポリクローナルウサギ抗GFP（1:200, ChromoTek, PABG1）をPBS中1 % BSAで37 °C、20分間添加した。PBSで2回洗浄後、2次抗体であるヤギ抗ウサギAlexa Fluor 555 (1:2000, Invitrogen, A21428)をPBS中1 % BSAで37 °C、20分間添加した。2回の洗浄後、カバースリップをDAPI入りProlong Gold Antifadeでスライドにマウントし、Leica SP8共焦点顕微鏡で撮影した。画像は63倍で撮影し、強度分析はLAS Xを用いて行った。
ウェスタンブロット- ビュレットブレンダー（Next Advance社製）を用いてDRGをSSB02ビーズ（Next Advance社製）でホモジナイズし、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（Thermo Scientific社製）を添加したRIPA緩衝液で45分間溶解した。遠心分離（10,000 g、10 分間、4 ℃）後に上清を回収し、Bradford assay（Bio-Rad laboratories）を用いてタンパク質濃度を算出した。ポリアクリルアミドゲル（7%）でライセート（50μg）を分離し、タンパク質をニトロセルロース膜（Sigma-Aldrich）に転写した。TRPV1-pHluorinタンパク質のレベルを調べるために、膜をTBS-T中の5 %牛乳で1時間RTでブロックし、1 %牛乳中のポリクローナルウサギ抗GFP（1:1000, ChromoTek, PABG1）で4℃で一晩プローブした。膜をTBS-Tで3回洗浄し、3%牛乳中西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識抗ウサギ抗体（1:10000, Cedarlane, NA934）とインキュベートした。バンドはECL Select Western blotting detecting reagent (Cytiva, RPN2235)を用いて可視化し、バンド密度はImage Jを用いて算出した。サンプルの標準化には3 %牛乳中のウサギ抗β-チューブリンIII抗体（1:2000, Sigma-Aldrich, T2200）の強度を用いた。
統計-統計解析は、GraphPad Prism 9 ソフトウェアを用いて行った。正規分布の検証にはD'Agostino-Pearson正規性検定を用いた。2つの平均値を比較するガウス型データの場合、統計的有意性はスチューデントのt検定を用いて評価した。2群以上を比較するガウス型データの場合、統計的有意性は一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用い、多重比較にはTukeyのpost-hoc検定を用いて評価した。2群比較の非ガウス型データについては、ノンパラメトリックのMann Whitney U検定を用いて統計的有意性を評価した。2群以上を比較した非ガウス型データについては、Kruskal-WallisとDunnのポストホック検定を用いて統計的有意性を評価した。統計的有意性はp<0.05で確立された。値は平均標準誤差平均（SEM）で表した。
CRediT著者貢献声明
Nasser S. Abdullah：執筆-校閲・編集、執筆-原案、形式分析、データキュレーション、概念化。アムヤウチ・ブラダイア執筆-校閲・編集、方法論、形式分析、データキュレーション、概念化。Manon Defaye: 執筆-校閲・編集、形式分析、データ管理。クリスティーナ・オーランド方法論、データキュレーション。Kristofer Svendsen: データキュレーション。アナベル・ディッケマンデータキュレーション。メリッサ・デランヌ＝クメナルデータキュレーション。アーメド・ハッサンデータキュレーション。ミルチャ・イフティンカ執筆-校閲・編集、データキュレーション。Kathy D. McCoy: 執筆 - 査読 & 編集、方法論、概念化。クリストフ・アルティエ執筆-校閲・編集、執筆-原案、監督、プロジェクト管理、資金獲得、概念化。
利益相反宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる既知の利益相反関係や個人的関係がないことを宣言する。
謝辞
この研究はカルガリー大学スナイダー研究所の国際マイクロバイオームセンター（IMC）で行われた。IMCは、カルガリー大学カミング医学部、カナダWestern Economic Diversification（WED）、Alberta Economic Development and Trade（AEDT）の支援を受けている。本研究は、Crohn's and Colitis Canada（CCC）（CAへ）およびThe Canadian Institutes of Health Research（CIHR）（CAへ助成金388441）の運営助成金により行われた。NSAは消化器病学会（CAG）の奨学金を得ている。MDはCIHRの博士研究員支援助成金を受けた。マスト細胞KOマウスの皮膚組織は、Nathan Peters博士とMatheus Carneiro博士から提供された。代表的な図はBiorenderを用いて作成した。
付録A 補足データ（1）
以下は本論文の補足データである：
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補足データ 1
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