上部腸管に沿ったヒトメタボロームの変化

2023年5月11日 11:15

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公開日：2023年5月10日
上部腸管に沿ったヒトメタボロームの変化

https://www.nature.com/articles/s42255-023-00777-z?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

ジェイコブ・フォルツ
レベッカ・ニール・カルバー
...
オリバー・フィーエン
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Nature Metabolism (2023)この記事を引用する
45 Altmetric（アルトメトリック
メートル法詳細
アブストラクト
ヒトの食事は、そのほとんどが小腸で処理されます。小腸内の代謝物は、宿主の分泌物に加え、摂取したエクスポソーム1や微生物による変換に由来する。ここでは、健康な男女15名を対象に、日常的な消化活動中の上部腸管内腔内容物の時空間的変化を調査した。そのために、非侵襲的な摂取可能なサンプリング装置を用いて、274個の腸内サンプルと対応する60個の便ホモジネートを収集し、5種類の質量分析法2,3と16S rRNA配列決定を組み合わせて分析した。スルホン脂質やヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸エステル（FAHFA）脂質を含む1,909種類の代謝物を同定しました。便と腸のメタボロームが劇的に異なることが観察されました。食品代謝物は、食事バイオマーカーの傾向を示し、腸管に沿ったジカルボン酸の予想外の増加や、管腔ケト酸と果物摂取量の正の関連性を示した。食事由来の代謝物と微生物に関連する代謝物は、最も大きな個人間差異を占めています。特に、サンプリング前6ヶ月以内に抗生物質を服用した2人の個人は、生物活性FAHFAsとスルホノリピッドおよび他の微生物関連代謝物のレベルに大きなばらつきを示している。個体間変動から、FAHFA代謝に関与する候補としてBlautia種を同定した。以上のように、ヒトの小腸と上行結腸を生理的条件下で非侵襲的にin vivoサンプリングすることにより、食事、宿主、微生物代謝の関連性が明らかになりました。
主な内容
我々は、健康な15人の上部腸管から採取した管腔サンプルのメタボロームの違いを包括的に研究することで、空間的および時間的変動の程度をよりよく理解し、メタボロームとマイクロバイオームのデータを統合する見込みを測ることを目的としています。関連するコンパニオン出版物4では、これらの装置を用いて、微生物叢の構成、プロファージ誘導、宿主プロテオーム、胆汁酸の微生物修飾における腸管内の変動を研究しています。ボランティアは、サンプリング時点ごとに4つのサンプリングデバイスのセットを飲み込みました。これらの摂取可能なサンプリングデバイスは、pH感応性コーティングを施したカプセルに、一方向弁でキャップされた折りたたみ式収集ブラダーで構成されています。4種類の装置は、腸溶性コーティングが異なるだけで、pH5.5（タイプ1）、pH6（タイプ2）、pH7.5（タイプ3および4）で溶解した（図1a）。このコーティングの厚さとpH応答性により、胃排出後の腸管の特定位置でのサンプリングが可能になりました。このデバイスには、追跡用のパッシブな無線周波数識別チップ以外の電子機器は含まれていない。コーティングが溶解すると、伸縮性のある収集ブラダーが拡張し、真空吸引によって最大400μlの管腔内容物を収集しました。一方通行のバルブにより、サンプルの損失や下流の流体からの汚染を防ぐことができました。便サンプルは-20℃で凍結し、すべてのデバイスは分析前に便から回収されました。液体内容物は、皮下注射針を使用してデバイスから回収されました。生サンプルのアリコートは16SリボソームRNAマイクロバイオーム解析に、遠心分離したサンプルの上澄みはメタボローム研究に使用されました。ここでは、同じサンプルのメタボロームについて綿密な解析を行い、これまでヒトのサンプルで検出されたことのない代謝物、食事の重要なバイオマーカー、参加者間および参加者内の化学プロファイルの比較を報告します（補足表1および2）。

図1：近位腸と遠位腸の代謝物量を比較した結果、幅広い化合物で有意差があることが明らかになった。
a、上部腸管調査の研究デザイン。4種類の腸管サンプリング装置を用いて、近位から遠位までの上部腸をサンプリングした。15名のヒト参加者は、1日目の最初のテスト後、昼食後と夕食後の2日間で、少なくとも16個のデバイスを飲み込んだ。デバイスは回収され、ターゲットおよびノンターゲットのLC-MS/MSおよびGC-MS法で分析された。 b, サンプル分析に使用した5つのメタボロームアッセイから特定された代謝物。化学クラス画分は自動化されたClassyFire化学分類に基づいて含まれている。 c, LMMを用いて上部腸管領域間の違いの有意性を計算した。横の破線は有意性閾値P < 0.05 (n = 1,182代謝物)を表しています。丸印は非有意、菱形はFDR補正後の有意（P < 0.05）を示す。腸内サンプルの50%以上で検出された代謝物のみを本解析の対象とした（n = 1,182）。効果量係数はLMMで推定した傾きで、係数が正（負）は近位上腸と比較して遠位上腸でレベルが高い（低い）ことを示す。縦の破線-点線は、±0.2効果量係数。
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タイプ1～4の内腔内容物のpH測定値は、十二指腸、空腸、回腸、上行結腸をカバーする、腸管全体で予想されるpH勾配4、5と一致した（図1a）。タイプ1および2デバイスのpHはタイプ3および4デバイスと有意に異なるが（拡張データ図1aおよび補足表3；Wilcoxon二元順位和検定、P = 2.4 × 10-14）、タイプ1とタイプ2デバイス間、タイプ3とタイプ4デバイス間のpHには有意差はなかった（拡張データ図1a）。そこで、1/2型と3/4型は、それぞれ上部腸管の近位部（十二指腸、空腸）と遠位部（回腸、上行結腸）に関連づけました。
これらのカプセル装置で捕捉された内腔内容物および関連する便サンプルの分析には、5種類の質量分析法を使用しました。クロマトグラフィーの保持時間、正確な前駆体質量、質量分析フラグメンテーション（MS/MS）をMassBank.us公開ライブラリおよびNIST20ライセンスライブラリと照合することにより、品質管理（QC）と定量の目的で使用した155の内部標準物質を含め、腸管腔および便の内容物の化学物質をMetabolomics Standards Initiative信頼レベル1～3でアノテーションしました（補表1）6。さらに、12,000を超える未知のクロマトグラフィーの特徴が、メソッドブランクのレベルを超えて確実に検出されました（補足表2）。ClassyFireソフトウェア7を使用し、構造的に注釈された代謝物は61の化学サブクラスに分類されました（補足表1）。親水性代謝物および親油性代謝物に焦点を当てた2種類の非標的高分解能液体クロマトグラフィー（LC）MS/MSアッセイにより、1,612種類の化合物が同定され、ほとんどのアノテーション化合物が得られた。さらに、6種類の短鎖脂肪酸（SCFA）と17種類の胆汁酸を対象としたLC-MS/MSアッセイにより、119種類の一次代謝物が追加されました（図1b）。総代謝量の変動に関するQC分析では、便と腸のサンプルが分離し、プールされた品質管理サンプルは強くクラスタリングされました（Extended Data Fig.1b）。
メタボロームの結果、便と腸のサンプル間（拡張データ図2）および腸管サンプル間（拡張データ図3）に顕著な違いがあることが判明しました。腸管全体の空間的な違いを明らかにするために、サンプリング位置（近位または遠位）やその他の変数を考慮した線形混合効果モデル（LMM）を適用しました（補足表3および4）。具体的には、装置サンプルの50%以上で検出された1,182種類の最も一般的な代謝物について検討した。これらのうち、630個（54%）は、遠位上腸と比較して近位上腸で有意に異なり（偽発見率（FDR）P < 0.05; LMM）（図1cおよび補足表4）、473個の代謝物が遠位上腸と比較して近位上腸でレベルが高く、157化合物が遠位上腸と比べて近位上腸でレベルが低くなりました（図1c）。SCFAs8,9、二次胆汁酸10、一部の微生物共役胆汁酸11,12を含む既知の微生物生成化学物質は、近位上部腸から遠位上部腸にかけて増加した（拡張データ表1および図1c）。検出された11種類のアセチル化アミノ酸のうち、7種類が上部腸の近位部から遠位部にかけて増加した（生P < 0.05; LMM）（Extended Data Table 1およびFigure 1c）。さらに、化学的にアノテーションされていない12,346の代謝物シグナルを調べ、腸の50%以上のサンプルで検出された9,317のシグナルに限定した（補足ファイル1）。全体として、3,594（38%）の特徴が近位上部腸と遠位上部腸の間で有意に異なり、近位上部腸では遠位上部腸に比べてレベルが高く、近位上部腸では遠位上部腸に比べてレベルが低い特徴が1,657ありました（FDR P < 0.05; LMM）（拡張データ図4）。
部位間の一般的な代謝の違いを調べるために、化学物質の濃縮統計を使用しました。ジおよびトリペプチドは、上部腸の近位部から遠位部にかけて最も有意に減少したクラスの一つであった（Extended Data Table 1およびExtended Data Fig.5）。測定された333種類のジおよびトリペプチドのうち、262種類が上部腸の近位部から遠位部にかけて存在量が有意に減少した（生のP < 0.05; LMM）（Extended Data Table 1）。糖、糖アルコール、ヌクレオシド、カルニチン、セラミドも、遠位サンプルに比べ近位腸管サンプルで有意に高いレベルを示した（Extended Data Table 1およびExtended Data Fig. 5）。このような腸内の空間的な違いは、ジ-およびトリペプチド14、アシルカルニチン15,16、ならびに腸に取り込まれる前にスフィンゴシンと遊離脂肪酸に加水分解されるセラミドの古典的な消化・吸収13を反映しています17。一方、SCFAは遠位領域で増加した（Extended Data Table 1および図1c）。これは、微生物による生産によるものと考えられる8,9。クローン病18に関連するアセチル化アミノ酸も、上腸の近位部より遠位部で高い値を示し（拡張データ表1および図1c）、おそらくアセチル化アミノ酸の吸収が非アセチル化アミノ酸より遅いためと考えられる19、20。胆汁酸は微生物によって広範囲に変換され、二次胆汁酸のレベルは腸に沿って増加する4。これらの観察結果は、カプセルデバイスが意図した場所からサンプリングされたという考えを支持するものです。また、あるタイプのデバイスの平均pHレベルは、上部腸管全体で予想される傾向に沿っていましたが、デバイスのタイプごとに観察されたpHの個人内変動は、遠位部位と近位部位のメタボローム変化と相関しませんでした。
28種類のフェノール代謝物を測定したところ、上腸管近位部から遠位部にかけて増加した（補足表4）。これらの傾向は、微生物酵素による植物細胞や細胞壁成分の脱グリコシル化や遅延分解などの酵素的変換21,22を含む複合的な要因によるものと考えられる23,24,25。例えば、亜麻仁系リグナンのsecoisolariciresinolは、近位試料に比べて遠位試料で最も有意に濃縮されており、バイオアベイラビリティ26と脱グリコシル化27の両方に起因すると考えられる。
ジカルボン酸も、上腸の近位部から遠位部にかけて濃度が上昇した（Extended Data Table 1および図1c）。実際、近位上部腸と遠位上部腸の間で有意に増加した代謝物の上位6つのうち3つはジカルボン酸であった（ヘキサデカン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸）（図1c）。ジカルボン酸は、ヒトの細胞28、植物29、微生物30,31で起こる脂肪酸の異化（ω酸化）時に生成する。リード化合物であるヘキサデカン二酸は、他のジカルボン酸、植物代謝物、胆汁酸、既知の微生物産生化合物と最も強い相関を示した（補足表5）。上皮細胞には、上皮のバリア機能維持に不可欠なオメガ水酸化脂質32が存在し、リパーゼによって切断されてジカルボン酸を形成することができる。我々は、上腸に沿ったジカルボン酸の一貫した有意な増加は、ヒト上皮脂質の異化に起因すると仮定している。
腸内試料の化学プロファイルは、便の化学プロファイルとは大きく異なっていた（Extended Data Fig.2）。31種類の代謝物が、便と比較して腸で平均100倍以上豊富に含まれていました。これらの代謝物は、糖化脂質、糖類、植物性天然物、カルニチン、微生物性共役胆汁酸、S-スクシニルシステインで構成されていた（補足表6）。また、ペプチドは一般的に、腸内サンプルと比較して便サンプルではかなり低いレベルであり、特に近位腸と比較した場合（Extended Data Fig.2）。また、腸内サンプルと比較して便で100倍以上豊富な代謝物を同定した（補足表6）。これらの代謝物は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールなどの極性脂質や、特定のFAHFAがほとんどである。便サンプルに膜脂質が多く含まれるのは、上腸の管腔サンプルと比較して、便には細菌細胞物質が多く含まれるためと考えられる。
次に、LMMを用いて、参加者が記録した食品摂取ログと腸管代謝物レベルとの関連性を検証した。カプセル装置を飲み込む6時間前に摂取した果物、アルコール、デザート、動物性タンパク質、野菜、穀物、コーヒー/紅茶、乳製品などの消費量をテストした（補足表3）。多重仮説検定で補正した後、いくつかの食品タイプは、いくつかの食品タイプのサンプルサイズが小さいことと、1,182代謝物の検定で強いFDR補正を考慮したため、当然のことながら、有意な関連代謝物がありませんでした（表1、図2a-dおよび補足表4）。本研究は参加者が15名と小規模であったにもかかわらず、これまでに血中で発見され、果物33やアルコール34の摂取と相関するさまざまな食事バイオマーカーを検証することができ、また、これまでに発見されていない他のバイオマーカーも発見することができました。
表1 参加者の特徴
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図2：腸内代謝物と食品タイプの関連性。
a,b,d, ボルケーノプロットは、LMMによって計算された果物（a）、アルコール（b）、デザート（d）の食品タイプに対する各代謝物の有意性を示す。消費は、サンプルデバイスを飲み込んでから6時間以内に食べた食品と定義する。P＜0.05の有意性（n＝1,182代謝物）を下側の破線-点線の水平線で区切った。丸印はFDR補正後の非有意、菱形はFDR補正後の有意（P < 0.05）を示す（n = 1,182）. 腸内試料の50％以上で検出された代謝物が本解析に含まれる。効果量係数はLMMによって算出された勾配推定値で、係数が正（負）は食品摂取後に代謝物が高く（低く）なることを意味します。c, 化学物質濃縮統計（ChemRICH）解析により、果物摂取後の有意な化学物質クラスが明らかになった。化学物質の親油性（logP）と化学物質クラスの有意水準-log10（P）でクラスを分離して可視化した。赤丸は果物摂取後に化学クラスが増加したことを示し、青丸は果物摂取後に化学クラスが減少したことを示す。e, テオフィリンとテオブロミンの濃度はカフェイン濃度と強い相関がある。f, カフェインと既知の代謝経路の化学図、検出された代謝物の構造と各構造のスピアマン順位相関係数（rs）（すべての代謝物についてP < 1.0 × 10-13; n = 1,182 metabolites）。
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効果量の差を±0.2、生のP < 0.05とすると、果物摂取は濃度上昇で20化合物、濃度低下で17代謝物と有意に関連した（図2a）。いくつかの代謝物は、厳密にFDR補正したP < 0.05でも果物の消費と直接関連していた（図2a）。N-メチルプロリンとスタキドリンは、非対照の食事研究において血漿の果物の消費バイオマーカーとして以前に報告されていた33。果汁の成分として知られるベトニン35も、生のP < 0.05（図2a）で果物摂取後に増加したが、FDRの有意閾値には達しなかった。同様に、3つのケト酸（4-メチル-2-オキソ吉草酸、ケトイソ吉草酸、3-メチル-2-オキソ吉草酸）も、生のP < 0.05 (Fig.2a) で果物の摂取に反応して有意に増加しました。代謝物は互いに独立したものではなく、食品組成や微生物・酵素の経路を経由して結びついている。そこで、ChemRICH化学セット濃縮統計を使って、有意に変化した代謝物のクラスターを特定した（図2c）。この戦略により、ケト酸が果物に対して最も顕著な反応を示す化学クラスであることが明らかになり（図2a、c）、ケト酸がヒト腸内の果物バイオマーカーであることが浮き彫りにされました。ケト酸は、腸内細菌によって行われるアミノ酸の酵素的脱アミノ化によって生成されます36。また、ChemRICHでは、フェニルアセテートやフェノール性天然物などの典型的な果実成分が、果実の摂取量と正の相関があることも明らかになった（図2c）。
アルコール摂取は、アルコール摂取の血漿バイオマーカーとして知られる硫酸エチル（FDR P < 0.05）と最も有意に関連していた（図2b）34。スタキドリンは、果物およびアルコール摂取の両方と関連していた（FDR P < 0.05）。Trp-LysはFDR補正後、アルコール摂取で有意に減少した（図2b）。合計40のジおよびトリペプチドがアルコール摂取により減少し（生P < 0.05）、ChemRICHクラスターP = 8.8 × 10-18 となった（補足表4、補足図1および2）。アルコール摂取後のジペプチドおよびトリペプチドの減少は、トリプシンおよびキモトリプシンが20％エタノール溶液中でも活性を示すことから39、直接的な阻害ではなく、おそらく膵臓の分泌障害37,38による総プロテアーゼ活性の低下を示唆した。デザート」は、ソーダ、ケーキ、アイスクリームなどの高脂肪・高糖分食品の摂取と定義した。2つの置換安息香酸、3-ヒドロキシ-4-メトキシ安息香酸と3,4-ジヒドロキシ安息香酸は、デザートと関連していた（生P < 0.05）（図2d）。これらの化合物は、バニリンとイソバニリンを分解する際の代謝中間体である40。ネオクロロゲン酸もデザートと有意に関連していた（生P < 0.05）。ネオクロロゲン酸は、チェリー42やモモ43など、さまざまな果物やベリー類41に含まれている。混合効果モデルに含まれる他の食品タイプも、有意に関連する代謝物を有していた（補足表4、補足図1および2）。
カフェインは大半のサンプルで検出された（補足表1）。これは、カフェインが経口摂取後1時間以内に急速に吸収され、血流中での平均半減期が4.5時間（範囲2.7～9.9時間）であることが主な理由と考えられます44。しかし、カフェインの代謝経路は、スピアマン順位相関分析によって容易に見分けることができました。カフェインとFDR P < 10-13で最も強く相関した6つの代謝物は、テオフィリンとテオブロミンを含む既知のカフェイン異化物45,46,47でした（図2e、f）。カフェインは代謝され、尿48や胆汁49などいくつかの経路で排泄される。今回の研究では、飲料の摂取からデバイスのサンプリングまでの間に数時間が経過しているため、胆汁がカフェインの測定源となることが予想されます。テオブロミンはチョコレートに含まれることが知られているが、デザートの消費とは関連せず、カフェインの代謝にのみ関連した。したがって、上部腸管代謝物の相関から、エクスポソーム代謝の微生物および酵素経路を再構築することができるかもしれない。特定の食品バイオマーカーを関連付けるには、食事介入を用いた多様な集団での専用研究が必要であろう。さらに、デバイスは細菌の生存率をほぼ維持するため4、デバイスから得られた培養分離株を使用して、個々の食品代謝物-細菌相互作用を確認することができる。
食事代謝物は、本研究の2日間および4回のサンプリング時点において、時間的な差異と関連していた。サンプリング時間とサンプリング地域のどちらが上部腸内代謝物に大きな影響を与えるかを調べるため、分散分析（ANOVA）を用いて、参加者別に4種類のデバイス間で、または参加者別に4つのサンプリング時点（各食後）で有意差のある代謝物の数を算出しました。近位サンプリング部位と遠位サンプリング部位間の代謝物レベルの大きな差は、しばしば時間ポイント間の代謝物の差に取って代わられ、15人中12人が、腸の部位（デバイスタイプ）間よりも食事（時間ポイント）間の方が統計的に異なる代謝物を有していた（拡張データ図6A、B）。これらの違いに寄与する化合物クラスを詳しく調べたところ、ジ-およびトリペプチド（カルボン酸の化学クラス内）がデバイスタイプ間で区別される最大の化学クラスであり、5人の参加者の有意差代謝物全体の70%以上、別の7人の参加者の40%以上を占めていました（拡張データ図7a）。サンプリング時点を区別する代謝物では、糖類（有機酸素化合物）が15人中13人で濃縮されていた（Extended Data図7b）。同様に、腸の部位よりもサンプリング時点を区別するイミダゾピリミジン、インドール、イソフラボノイドがより有意に異なることが判明した（拡張データ図7）。これらのクラスは、異なる食事中に摂取された食品タイプ間の変動により異なる食事代謝物を意味しますが、腸の領域間の区別にはそれほど有用ではありませんでした。
我々のデータセットでは、大きな個人間変動が見られた（Extended Data Fig.7）。参加者は特定の食事を処方されていないため、食事に基づく変動が参加者と時点を区別することが予想された。多変量判別分析（PLS-DA）を用いて、近位腸と遠位腸（デバイスタイプ）、および15人の参加者の間で、最も区別するために重要な代謝物の割合の違いを特定しました（Extended Data図6b）。サンプル間の全体的な分散が大きいため、参加者、デバイス、または時間ポイントに基づくPLS-DAの明確な可視化は困難でした。しかし、多変量解析に最も貢献した100の代謝物は、植物および微生物由来の代謝物によって最もよく説明される参加者固有の傾向を示した（拡張データ図6b）。これには、コショウ化合物のカプサイシン、亜麻仁化合物のsecoisolariciresinol、微生物産の酪酸とプロピオン酸が含まれている（補足表7）。N-メチルヒスタミン、フェネチルアミン、フェニルアセトアルデヒド、コハク酸など、参加者特有の変動を示した他の代謝物は、ヒト、食事、微生物の要因の組み合わせに依存すると考えられる。注目すべきは、階層的クラスタリングにより、参加者ごとに便サンプルが分離したのに対し、腸内サンプルは参加者ごとに強くクラスタリングされなかったことです（補足図3）。おそらく、食事成分の変動に支配されている近位腸に比べて、便では個人固有の腸内微生物がより多く存在するためと考えられます。
PLS-DA投影で全データを使用した場合、全体的なばらつきが大きいため、個体間差の直接可視化が困難であったが、特定の化合物は個体間で非常に大きな濃度差を示した（図3）。例えば、ヒトのヘム由来の胆汁色素であるビリベルジンやビリルビン、微生物が産生するウロビリンやステルコビリンは、一部の参加者の装置間で大きく変動し、また参加者10と15のステルコビリンのように特定の参加者で大きく減少または消失していました（図3）。二次胆汁酸の生成は、ステルコビリン生成と同様の酵素経路を用いることが提案されており50,51、ステルコビリン濃度が低かった2名の参加者は、二次胆汁酸であるデオキシコール酸の濃度低下も見られた（図3）。胆汁色素の同じ参加者固有のプロファイルは、便サンプルでも観察された（Extended Data Fig.8）。注目すべきは、この2人の参加者（10と15）が、研究前の6ヶ月間に抗生物質の使用を報告した唯一の人であったことです。これらの人々は、ステルコビリン、デオキシコール酸、FAHFAのサブセット、スルホノリピッドのレベルが非常に低いという特徴があり（図3）、これらはすべて、以前に腸内細菌叢との関連が指摘されている10、51、52、53である。経口抗生物質は、治療後1年以上にわたって腸内細菌叢に影響を与える可能性があります54。これらのデータは、代謝プロファイルが特定の経路に対する微生物活性の違いを反映しているという仮説を支持するものである。統計的検出力が限られているため、16S rRNA遺伝子定量化から得られる微生物種の存在量とステルコビリンレベルとの有意な関連は確認できなかったが、FAHFAおよびスルホノリピッドの存在は、特定の微生物種の存在量の差と関連していた。
図3：参加者間の差が強かった代謝物のヒートマップ。
代謝物には、胆汁色素、ヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸エステル（FAHFAとAAHFA）、SCFA、スルホノリピッド（SL）、二次胆汁酸が含まれます。サンプルは参加者ごとに整理され、抗生物質の摂取は、この研究の1ヶ月前と5ヶ月前に抗生物質を摂取した2人の参加者について表示されています。ヒートマップの色は、胆汁酸の代謝物量（ピーク高さ）または濃度（ナノグラム/ミリリットル）が低い（青）から高い（赤）までの範囲です。各代謝物（各行）のカラースケールの設定には、最小値と最大値を使用しています。
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FAHFAは10年前に初めて同定されました。これらは生物学的に活性であり、生理学を制御している55,56。アシルα-ヒドロキシル脂肪酸（AAHFA）は、α-脂質結合を持つFAHFAの特定のサブセットで、わずか2年前に発見された53。本研究では88種類のFAHFAを同定した（補足表1）。注目すべきは、4つの特定のFAHFAが参加者の間で非常に一貫した違いを示し、これらのFAHFAはすべて、長鎖ヒドロキシル脂肪酸バックボーンをC3-またはC4-短鎖部位でエステル化した結合である。これらの生理活性脂質のうち3つはα位でエステル化されており（AAHFA 4:0/22:0、AAHFA 3:0/22:0、AAHFA 3：0/24：0）、1つはバックボーンの他の場所でエステル化されています（FAHFA 3：0/23：0）。9人の参加者は、これらのFAHFAを頻繁に高レベルで示したが、6人の参加者は、非常に少ないか検出できない量を生成した（図3）。検出されないレベルはANOVA統計に使用できないため、有意差検定は行わなかった。便サンプルでも同様の個人差のある傾向が観察された（Extended Data Fig.8）。C3またはC4側鎖と長鎖脂肪酸を持つFAHFAで唯一頻繁に検出されたのはAAHFA 16:0/4:0であり、これは上述の4つのFAHFAと同じ個人差のある傾向にはならなかった。注目すべきは、長鎖脂肪酸またはSCFAの基質であるプロピオン酸（C3：0）および酪酸（C4：0）が低レベルであることは、腸内または便サンプルで観察されたこれらの短鎖FAHFAの差異を説明しなかったことだ（図3および拡張データ図9）。そこで、特定の細菌が目的の4つのFAHFAの有無と関連しているかどうかを調べた。Blautia obeumと系統的に最も近縁なBlautia属の1種とBilophila wadsworthiaに関連するプロテオバクテリアの2つの分類群は、これらのFAHFAの検出と有意に関連していた（補表8）。B. obeumはSCFA生産者57として知られており、短鎖脂肪アシル成分の生産が個体特異的なFAHFA生産のドライバーとなる可能性が示唆された。しかし、FAHFA 4:0/16:0は同じ個体特異的傾向を示さず、このことはBlautia種が最も多い脂肪酸C16-18の水酸化体形ではなく超長鎖脂肪アシル (22:0 and 23:0) をプロピオン酸とブチル酸エステルでFAHFAを特別生産するかもしれないと考えられる。化学的に関連するFAHFAは、グルコースホメオスタシスを改善し、インスリン感受性を刺激し、抗炎症効果を持つことが示されている55。したがって、今回の発見は、ヒトの腸内化学とFAHFAレベルの関連性を示すだけでなく、健康への影響も期待されます。
ここで、我々は、ヒトのサンプルにおけるスルホノリピッドの検出を報告する。これらの脂質は、最近になってリピドミクスライブラリーに追加されたばかりで58、マウスの腸管で微生物的に生成され、炎症促進および抗炎症の両方の表現型に関連していることが発見された59,60,61。腸内装置サンプルでは、サンプリング時点（食事）にかかわらず、強い個体間傾向でスルホノリピッドを検出し、スルホノリピッドが微生物的に生産される個体とそうでない個体があることが示唆された。抗生物質を投与されたことのある2名の参加者は、他のすべての参加者に比べてスルホノリピッドのレベルが非常に低く（図3）、抗生物質投与によって微生物生産者が排除された可能性が示唆されました。また、他の参加者の特定のサンプルにもスルホノリピッドは見られなかったことから、スルホノリピッドと細菌分類群との関連性を検討することにしました。スルホノリピッドを含むサンプルでは、潰瘍性大腸炎62に関連するDesulfovibrionaceaeのメンバー（補足表8）を含む10分類群が有意に濃縮されていた。また、スルホン脂質の生産が知られているBacteroidetesの2つのメンバーも濃縮されていた60。ヒトにおけるスルホノリピッドレベルの健康への影響は、よく理解されていない。最近、スルホノリピッドはマクロファージにおける炎症反応を増加させるが、リポポリサッカライドの存在下では炎症を減少させることが示された63。スルホノリピッドとヒトの健康との関係を明らかにするためには、さらなる調査が必要である。
本研究は、非侵襲的な摂取可能なサンプリング装置を用いて、健康なヒトの参加者の上部腸管におけるメタボロームの違いについて報告するものである。この結果は、消化と腸疾患に関する将来の詳細なin vivo研究の扉を開くものです。予想通り、便のメタボロームは腸のメタボロームとは大きく異なるものでした。したがって、便は腸管の代用品としては機能せず、むしろ（せいぜい）大腸の内容物の代用品としてしか機能しない。また、腸管内でも、50%以上の代謝物が近位と遠位で有意に異なる値を示しました。今後の重要な研究目標は、腸内のスルホノリピッド、ステルコビリン、長鎖AAHFA産生菌に対する抗生物質の影響と、その混乱が健康や疾病に及ぼす影響を明らかにすることである。抗生物質によるこれらの細菌の破壊は、炎症、糖尿病、炎症性腸疾患の発症や病因に関連すると考えられる55,60,63。したがって、抗生物質を投与された人がこれらの微生物を再増殖させるダイナミクスとメカニズムを明らかにすることが重要である。
関連するコンパニオンスタディ4では、同じデバイスのサンプルを用いて、いくつかのオミックスアプローチを用いて腸内環境の変動を広く研究しました。本研究で報告されたメタボロームに関する知見と同様に、腸内サンプルでは便と比較してより顕著なプロファージ誘導が見られ、宿主プロテオームと胆汁酸プロファイルは腸に沿って変化し、便のものとは大きく異なることがわかりました4。また、今回報告された腸管近位部と遠位部のペプチドやアミノ酸の大きな違いを補完するように、微生物が結合した胆汁酸濃度がアミノ酸に依存する傾向を示し、便では明らかでなかったことを本研究で明らかにしました。これらの研究は、腸から直接採取することの有用性を示すものであり、ヒトの宿主とその常在微生物との密接な関係についての理解を深めるものである。
パイロットスタディである本研究には、いくつかの限界があります。第一に、ヒト集団内および集団間の腸内代謝の範囲について結論を出すには、より多くの参加者が必要であり、より大規模な研究により、特定の細菌または細菌ファミリーと代謝変換とのより詳細なマイクロバイオーム全体の関連に対応することもできる。第二に、抗生物質の使用を報告した参加者は2名のみであったため、抗生物質の使用とスルホノリピッドおよびFAHFA代謝の阻害との間の潜在的関連性を今後の研究において強化する必要がある。第三に、時間的変動の解析は、連続する2日間の1日2時点に限定されたため、代謝や微生物組成の時間的変化は十分に評価されなかった。第4に、上部腸内細菌叢の組成と小腸細菌過剰増殖などの疾患状態に対する変動との関連については、具体的な別の調査が必要である。これらの制限にもかかわらず、我々の発見は、非侵襲的なサンプリング装置の使用とメタボロミクスおよびゲノミクスの組み合わせが、栄養学的研究とヒトの病気に対処するためのより正確な介入および予防戦略を可能にする大きな可能性を秘めていることを示す。
研究方法
摂取可能なサンプリング装置
関連するコンパニオン出版物4では、同じ文章を使ってカプセルサンプリングデバイス（CapScan、Envivo Bio）を説明しました。CapScanは、一方向のバルブでキャップされた中空の弾性収集ブラダーで構成されている4。この装置を包装するために、採取ブラダーを排気し、半分に折って、直径6.5mm、長さ23mmの溶解可能なカプセルの中に包装し、その上に腸溶性コーティングを施したものである。カプセルと腸溶性コーティングは、摂取時に口腔咽頭や胃の微生物によるコレクションブラダーの汚染を防ぐように設計されています。腸溶性コーティングとカプセルは、装置が目標pHに達すると崩壊します。このpHは、タイプ1ではpH5.5、タイプ2ではpH6、タイプ3およびタイプ4ではpH7.5で、タイプ4には、上行結腸に偏った収集を行う時間遅延コーティングもあります。腸溶性コーティングの崩壊後、採取ブラダーは直径6mm、長さ33mmのチューブに展開し、一方向バルブを介して最大400μlの腸管内内容物を吸引します。ブラダー内に採取されたサンプルは、装置が大腸内を移動して便にさらされる際にも、一方向バルブによって完全性が維持されます。
関連するコンパニオン出版物4では、同じ文章を使って研究デザインを説明しました。各参加者は、小腸の近位から内側にかけての領域（コーティングタイプ1および2）と、より遠位の領域（コーティングタイプ3および4）をターゲットとする異なるコーティングを施した4つのデバイスのセットを同時に摂取した。採取後、便を検体採取容器に移し、直ちに凍結した。採取後、便は解凍され、試験スタッフによって器具が回収された。サンプルの取り出しは、70％イソプロピルアルコールで膀胱を洗い、1mlシリンジに取り付けた滅菌皮下注射針で穿刺した。サンプルを微量遠心チューブに移し、InLab Ultra Micro ISM pHプローブ（Mettler Toledo）を用いてpHを測定した。メタボローム解析のため、40μlのアリコートを10,000gで3分間スピンダウンし、上清を回収した。残りのサンプルは、DNA抽出のために解凍されるまで冷凍保存されました。
研究デザイン
関連するコンパニオン出版物4では、同じ文章を使用して試験デザインを説明した。本研究は、WIRB-Copernicus Group Institutional Review Board（研究番号1186513）により承認され、各参加者からインフォームドコンセントを取得した。データの取得や解釈に支障をきたす可能性のある、臨床的に検出可能な胃腸の状態や疾患を患っている参加者を除外するため、健康なボランティアを選択した。
(1)18歳から70歳までの個人、(2)American Society of Anesthesiologists physical status class riskが1または2、(3)妊娠の可能性がある女性については、スクリーニング訪問から7日以内に尿による妊娠検査が陰性で試験期間中避妊する意思がある、(4)英語に堪能で試験計画を理解し試験要件を満たすとともに、書面による同意書を提供できる、などの基準をすべて満たしている参加者が試験に組み込まれました。
以下のいずれかの状態または特徴を有する参加者は、本試験から除外された：（1）以下のいずれかの既往歴がある： (1)ラップバンドや肥満手術を含む胃または食道の手術歴、腸閉塞、胃出口閉塞、憩室炎、炎症性腸疾患、イレウス瘻またはコロストミー、胃または食道がん、アカラシア、食道憩室、活発な嚥下障害または異食症、胃腸疾患に対する活発な薬剤使用 (2) スクリーニング訪問から30日以内に妊娠または計画妊娠、授乳； (3) 活動的な薬物乱用または依存（薬物またはアルコールの乱用を含む）、不安定な医学的または精神医学的障害、または治験責任医師の見解では試験の実施を妨げる可能性のある慢性疾患、または (4) 治験責任医師の判断で、試験参加中に個人の健康リスクを引き起こす可能性のある臨床状態。
この研究には15人の健康な人が登録され、それぞれが3日間の間に少なくとも17個のデバイスを飲み込みました。毎日の指示には、以下のガイドラインが含まれていた： 1日中、すべての食品とその摂取時間を記録すること、運動する場合は午前中に行うこと、朝食と昼食は通常通り食べること、昼食3時間後に4個のデバイスをカップ3分の2までの水とともに飲み込むこと、デバイス飲み込み後少なくとも2時間は何も飲食しないこと、2時間後に空腹であれば軽くつまむこと（最大200カロリーまで）；昼食後、翌朝までカフェイン入りの飲料を飲まない。このセットを飲み込んでから6時間後から次のセットを飲み込んでから48時間後まですべての便を採取する。昼食後6時間以上経過してから通常通り夕食を食べる。夕食後3時間後にキャップスキャン装置4セットとコップ3分の2の水を飲み、このセットを飲み込んだ後は朝まで何も飲食しない。アルコール摂取や食事内容については制限を設けなかった。摂取したデバイスはすべて回収され、試験中に有害事象は報告されなかった。合計で、274個のカプセルデバイスがメタボローム解析に十分な材料を提供し、225個がゲノム解析に十分な量またはシーケンスリード数（>2,500）を提供しました。試験中のすべての排便は、参加者によって直ちに-20℃で冷凍保存されました。参加者1は再現性の評価のために追加のサンプルを提供した。合計333の腸と便のサンプルがメタボロミクス法で分析されました。
非標的メタボロミクスサンプル調製
サンプル調製は、水、メタノール、メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）を用いた二相抽出64で行い、極性代謝物と非極性代謝物を分離しました。カプセルデバイスのサンプルは液体で、便のサンプルは固体であるため、カプセルデバイスの上澄みと便のサンプルは別々に調製されました。各上清サンプルについて、10 µlを深層サンプル調製用96ウェルプレートの1ウェルに、あらかじめ決められたランダムな順序で分注しました。サンプルは一度に1つの96ウェルプレートから抽出し、特に指定がない限り、すべての工程を4℃で実施した。10個の実験サンプルの間に、メソッドブランクと外部QCサンプルを準備した。ブランクは、サンプルの代わりに10 µlのLC-MSグレードの水を使用し、QCサンプルは、無関係な研究から得られたヒト消化管内容物のプールサンプル10 µlを使用しました。次に、SPLASH LIPIDOMIX Mass Spec Standard（Avanti）を含む170 µlのメタノールを各ウェルに加え、プレートをホイルでヒートシールした後、室温で30秒間激しく振り、シールを剥がして490 µl MTBEを添加しました。その後、プレートを再びヒートシールし、室温で30秒間激しくボルテックスし、オービタルシェーカーで5分間シェイクした。ホイルシールを剥がし、150 µl のLC-MSグレードの水を各ウェルに添加した。プレートを室温で30秒間ボルテックスし、708gで12分間遠心分離した。フォイルをディープウェルプレートから取り外し、12チャンネルピペットを使用して、上相の180μlアリコート2個を96ウェルVanquish LCプレート2枚に移した。次に、水相の50μlのアリコート2個を、他の96ウェルVanquish LCプレート2枚に移した。すべての96ウェルプレートは、室温で真空下で完全に乾燥させ、ホイルでヒートシールし、さらなる分析まで-80℃で保存した。各便サンプルをスパチュラで混合して調製し、5±1mgを2mlの微量遠心分離管に移した。次に、SPLASH LIPIDOMIX Mass Spec Standard（Avanti）を含む225μlのメタノールをすべての微量遠心管に加え、管を室温で10秒間ボルテックスさせた。3mmのステンレスボール2個と750 µl MTBEを各チューブに加え、サンプルをGeno/Grinder（SPEX）で1,500 Hzで1分間ホモジナイズしました。その後、188μlの水を各チューブに加え、各チューブを室温で30秒間ボルテックスした。チューブを14,000gで2分間、室温で遠心分離した。有機相の180μlの2つのアリコートを、2つの96ウェルプレートに移した。水相の50μlのアリコート2枚を96ウェルプレート2枚に移した。すべてのプレートを回転式真空エバポレーターで完全に乾燥させ、ホイルでヒートシールし、さらなる分析まで-80℃で保存した。
HILIC LC-MS/MS分析
サンプル調製の水相アリコートを-80℃から取り出し、CUDA65を含む29種類の同位体標識および合成内部標準を含む35μlの8：2アセトニトリル：水を各ウェルに添加した。その後、96ウェルプレートをホイルで密封し、室温で30秒間激しくボルテックスし、水浴中で5分間室温で超音波処理し、708gで15分間遠心分離した。プレートは分析まで4℃のオートサンプラーで保存した（オートサンプラーでの最大保存時間は48時間であった）。LC-MS/MSは、Vanquish LC（Thermo Scientific）をQExactive HF+軌道イオントラップ質量分析計（Thermo Scientific）に連結して実施した。クロマトグラフィー分離は、Waters Acquity UPLC BEH Amide カラム（長さ 150 mm × 内径 2.1 mm、粒子径 1.7 μm）に 5 mm プレカラム（長さ 5 mm × 内径 2.1 mm、粒子径 1.7 μm）を用いて実施した。移動相Aは100％水、Bは95：5アセトニトリル：水であった。両移動相とも、10mMギ酸アンモニウムと0.125%ギ酸で修飾した。流速は400μl min-1、カラム温度は45℃、注入量は3μlであった。LCグラジエントは、0分から2分までは100%移動相B、7.7分までは70%B、9.5分までは40%B、10.25分までは30%、12.75分までに100%Bに戻し、17分まで再平衡化しました。すべての移動相グラジエントシフトは直線的であった。サンプル注入前後の針洗浄溶媒として、アセトニトリル：水1：1を使用しました。加熱エレクトロスプレーイオン化（HESI）源条件は以下の通り：シースガス流量50、補助ガス流量13、スイープガス流量3、キャピラリー温度263℃、SレンズRFレベル50、補助ガスヒーター温度425℃、針電圧3，500Vと-3，500V（それぞれ正負イオン化モード）。スペクトルは、トップ4イオンのデータ依存型MS/MS取得（DDA）で収集された。MSスキャンは、60-900 m/zの60k分解能、AGCターゲット106イオン、最大蓄積時間100msで収集した。MS/MSスペクトルは、15k分解能、1Da分離ウィンドウ、50ms最大蓄積時間、3s動的排除ウィンドウ、フラグメンテーションのための20、30、60のステップ（N）CE、8×103 AGCターゲットで収集されました。すべてのスペクトルはセントロイドモードで保存された。プールされた各QCサンプルについて、反復排除MS/MSの3ラウンドを取得した。分析後すぐに、プレートを真空下で乾燥させ、ホイルで密封して-80℃で保存した。
リピドミクスLC-MS/MS分析
有機相のアリコートからサンプルプレートを-80℃から取り出し、50 µl 9:1 アセトニトリル/トルエンを各ウェルに添加した。その後、プレートをホイルで密封し、室温で30秒間激しくボルテックスし、水浴中で室温で5分間超音波処理し、708gで15分間遠心分離し、分析まで4℃に保ったオートサンプラーに移した（分析前のオートサンプラーでの最大保管時間は48時間）。リピドミクスLC-MS/MS分析には、Thermo Scientific Vanquish LCシステムとThermo Scientific QExactive HF+オービタルイオントラップ質量分析計を用いた。クロマトグラフィー分離には、Waters Acquity UPLC CSH C18 カラム（長さ 100 mm × 内径 2.1 mm、粒子径 1.7 μm）にプレカラム（長さ 5 mm × 内径 2.1 mm、粒子径 1.7 μm）を使用した。移動相Aは9：1アセトニトリル：水、Bは8：2IPA：アセトニトリルであった。ポジティブモードの電子スプレーイオン化（ESI）の場合、移動相は10mMギ酸アンモニウムと0.1%ギ酸で修飾した。ネガティブモードESIの場合、移動相は10mM酢酸アンモニウムで修飾された。流速は600μl min-1、カラム温度は65℃、注入量は5μlであった。移動相の勾配は、0から0.6分までは15%B、2分までは30%B、2.5分までは48%B、11分までは82%B、11.5から12分までは99%B、12.1から14.2分までは15%Bだった。HESIソースの条件は、シースガス流量55、補助ガス流量15、スイープガス流量3、キャピラリー温度275℃、SレンズRFレベル50、補助ガスヒーター温度450℃、針電圧3500V、マイナスイオン化モードはそれぞれ-3500Vであった。DDA MS/MSスペクトルは、上位4つのイオンについて取得した。MSスキャンは、120-1,700m/zの60k分解能、AGCターゲット106イオン、最大蓄積時間100msで収集した。MS/MSスペクトルは、15-k分解能、1-Da分離窓、正規化衝突エネルギー20、30、60、2-s動的排除窓、8×103 AGCターゲット、50-ms最大蓄積時間で収集した。スペクトルはセントロイドモードで保存された。各プールされたQCサンプルについて、反復排除MS/MSの3ラウンドが取得された。すべてのサンプルを分析した直後に、プレートを真空下で乾燥させ、ホイルで密封して-80℃で保存した。
非標的GC-MS分析
上記のように乾燥させた水相試料を-80℃から取り出し、ピリジン中40 mg ml-1 メトキシアミンヒドロクロライドを各ウェルに10μlずつ添加した。プレートを密封し、30℃で90分間振盪した。ホイルを取り除き、90μlのN-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（C8-C30脂肪酸メチルエステルの内部標準を含む）を各ウェルに加え、プレートを37℃で30分間振とうした。その後、プレートを2,400gで15分間、室温で遠心分離した。ホイルを取り除き、90 µlの上清をガラスインサート付きクリンプトップバイアルに移し、クリンプトシャットした。サンプルは、誘導体化から48時間以内に分析した。GC-MS分析は、以前に記載されたように実施された66。簡単に説明すると、RTx-5Sil MSカラム（30 m×0.25 mm内径、0.25 µm 95:5 dimethyl diphenyl polysiloxane film）を備えたAgilent 6890 GCで、0.5 µlを分割せずに分析した。クロマトグラフィーは、ヘリウムを1 ml min-1で使用し、50 ℃から275 ℃の温度勾配で行った。MS分析は、Leco Pegasus III TOF質量分析計を使用して実施した。スペクトルは、70eVのEIで17スペクトル/秒で収集された。データファイルはLeco ChromaTOFソフトウェアで前処理され、さらに自動GC-MSデータ処理パイプラインBinBase67とFiehnLibを用いてスペクトルおよび保持時間のマッチングを行った。
胆汁酸の定量化
胆汁酸は、既報のように標的化し、定量化した4。簡単に説明すると、親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）ESI+分析から乾燥した水相サンプルプレートを-80℃の冷凍庫から取り出し、60μlの胆汁酸ラン溶媒（100 ng ml-1の5種類の同位体標識胆汁酸内部標準を含む1：1 ACNメタノール）に溶解した。プレートを30秒間ボルテックスし、ウォーターバスで5分間超音波処理した。すべてのサンプルを胆汁酸ラン溶媒で30倍に希釈した。すべてのプレートを708gで15分間、4℃で遠心分離し、分析まで4℃でVanquishオートサンプラーに保存した。0～1,500 ng ml-1の間で9点標準曲線を作成し、サンプルで分析した。Vanquish UPLCとAltis QqQ質量分析計（Thermo Fisher Scientific）を用いて、標的LC-MS/MS分析を行った。Acquity BEH C18カラム（100 mm × 2.1 mm内径、1.7μm粒子径；Waters）を用い、移動相Aは水、Bはアセトニトリル、いずれも0.1%ギ酸を加えた。胆汁酸分析物の処理と定量には、SkylineソフトウェアとカスタムRスクリプトを使用した。
短鎖脂肪酸の定量化
SCFAの定量は、既報のプロトコル68に基づき、N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide（MTBSTFA）で誘導体化することにより実施した。簡単に説明すると、10 µlの腸管上清を、重水素標識SCFA内部標準物質を含む50 µlのLC-MSグレード水と10 µlの37%塩酸であらかじめ満たされた氷上の1.5 ml微量遠心管に移した。次に、同じく重水素標識SCFA内部標準物質を含む100 μlのMTBEを各チューブに加え、チューブを回転式シェーカープレート上で室温で30分間振盪した。チューブを14,000gで2分間遠心分離し、20 µl MTBE（上層）を低回収率インサートを装着したクリンプトップGC-MSバイアルに移しました。次に、各バイアルに5 µl MTBSTFAを加え、密封した。バイアルをオービタルシェーカープレート上で80℃で30分間振とうし、室温に冷却してGC-MSで分析した。Leco Pegasus IV TOF質量分析計と結合したAgilent 6890 GCを使用し、DB5 DuraGuard (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm) キャピラリーカラムを使用しました。続いて、1:10のスプリットモードを有効にし、ヘリウム流量を1.2 ml min-1、温度を50 ℃から290 ℃まで20.8分かけてランプし、50-550 m/zのスキャンレートを17スペクトル/minで1 µl注入した。80サンプルごとに1～100 µg ml-1の6点標準曲線を分析し、10サンプルごとにブランクサンプルを分析した。サンプルと標準曲線ミックスは、GC-MS 分析の 24 時間以内に調製されました。データは Agilent (.d) 形式に変換し、Agilent MassHunter Quant v.B.09.00 を使用して処理しました。実験サンプル中の SCFA の定量には、分析対象物質と内部標準物質の比率を用いた直線的な 6 点標準曲線を使用しました。
非標的 LC-MS/MS データ処理
MS-DIAL v.4.80 (ref. 58) を使用して、アンターゲットLC-MS/MSデータを処理した。HILIC LC-MS/MS（ESI+およびESI-）およびリピドミクス（ESI+およびESI-）データセットは、手動で最適化したパラメータで処理しました（補足表9）。ピークの高さは、すべての非標的分析について報告されました。実験MS/MSスペクトルは、HILIC分析ではMassBank of North AmericaおよびNIST20スペクトルライブラリと一致し、リピドミクス分析ではMS-DIALからのすべての脂質参照MS/MSスペクトルが使用された。同一のクロマトグラフィー条件下で実行された真正標準物質の HILIC およびリピドミクスの保持時間情報は、代謝物アノテーションのもう一つの証拠とした。代謝物のアノテーションは、リテンションタイムとMS/MSの正確な一致、および/またはライブラリスペクトルとの一致に基づいて行われました。ブランクサブトラクションは、実験サンプルからの最大強度がメソッドブランクの平均値の少なくとも10倍であるLC-MSフィーチャーを保持し、補足表2に記載されているように、さらなるデータ削減を行うことで実施しました。データ処理の最終段階は、MS/MSマッチング品質、ピーク品質、ピークアライメント、およびソース内フラグメント同定のために保持時間が近いフィーチャー間の相関を利用したソース内フラグメントの除去について、注釈付きフィーチャーを手動で調査しました。スペクトルライブラリの複数の代謝物が1つの実験的MS/MSと一致した場合、その一致は非一意的MS/MS一致として記録されました（補足表1）。Retip69を使用して計算された予測リテンションタイムは、低品質のアノテーションにフラグを立てるための追加の証拠ラインとして使用されました。
DNA抽出と16S rRNA遺伝子配列解析
Microbial DNA extraction kit（QIAGEN）70を用い、カプセルデバイスまたは100mgの便から50μlのDNAを抽出した。Earth Microbiome Project推奨の515F/806Rプライマーペアと5PRIME HotMasterMix（Quantabio, 2200410）を用い、サーモサイクラーで以下のプログラムで16S rRNAアンプリコンを生成した：94℃3分、94℃45秒、50℃60秒、72℃90秒の35サイクル、その後72℃10分。PCR産物は、UltraClean 96 PCR Cleanup kit (QIAGEN, 12596-4) と Quant-iT dsDNA High Sensitivity Assay kit (Invitrogen, Q33120) を用いて洗浄、定量、プールされた。サンプルはMiSeq（Illumina）で300-bpリードで配列決定した。シーケンスデータは、Chan Zuckerberg BioHub Sequencing施設でIllumina bcl2fastq アルゴリズムを使用して多重化解除した。その後の処理は、R統計計算環境v.4.0.3（文献71）およびDADA2を用いて、擬似プーリング72を用いて以前に説明したように行った。 truncLenFおよびtruncLenRパラメータは、それぞれ250および180に設定した。分類はSilva rRNA database v.132 (ref.73)を用いて割り当てた。2,500リードを超えるサンプルを解析に残した。
統計とデータ解析
統計検定はR71を使用して実施した。LMMは、lmerTestおよびlme4 Rパッケージを使用して実施した。腸内の空間的な違いを調べるために、サンプリング位置（近位（装置タイプ1、2）または遠位（装置タイプ3、4））、食べログから分類した8種類の食品（植物性と動物性タンパク質（肉、卵、魚）、穀物（米、パスタ、パン、その他の穀物）、コーヒーまたは紅茶、デザートまたはアルコール（ビール、ワイン、アルコール性炭酸飲料）、乳製品、果物）、6ヶ月以内の抗生物質摂取を固定効果変数、個人間変動をランダム効果変数とした（補足表3および4）。食品タイプは、カスタマイズした評価フォームを使用して、参加者が書いた食品ログから手動で割り当てた。代謝物量は対数10変換し、欠損値はゼロとして処理し、LMM解析の前に-1および1からスケーリングした。多重仮説検定を考慮し、Benjamini-Hochberg74補正を使用した。微生物叢（log2スケールのアンプリコン配列バリアント存在量）と代謝物（log10スケールの代謝物存在量）の間の相関は、ピアソンの相関を使用してアンプリコン配列バリアントレベルで計算しました。Limma-Voomを用いた差分存在量解析 FAHFAとスルホノリピッドについて、存在／不在の解析に利用された。絶対的な差分存在量が0.75を超え、Benjamini-Hochberg補正でP < 0.1である分類群のみを考慮した。濃縮統計の算出にはChemRICH75を使用した。クラスタリングはhclust関数で行い、代謝物のスピアマン順位相関行列はRのcor関数で、ユークリッド距離はRのas.dist関数で計算した。PLS-DAと主成分分析（PCA）はR76のroplsパッケージで行った。参加者とデバイスの種類を区別するPLS-DAモデルは、7重クロスバリデーションによって評価した。オーバーフィッティングをテストするためにropls Rパッケージで実行されたクラスラベルの20～1,000のランダムな順列を使用すると、モデルはQ2Y > 0.15およびP < 0.05を維持しました（参考資料77）。非標的LC-MS/MS（HILICおよびRP ESI+/-）の特徴は、各プラットフォームの内部標準の合計に正規化され、これは単一化合物への正規化よりも堅牢であることが示されている78. この正規化は、各LC-MSの特徴をそのサンプルの内部標準のピーク高さの合計で割ることによって行われました78,79。GC-MSデータは、公開されているプロトコル80で広く議論されているように、すべての注釈付き代謝物の強度の合計に正規化されました。この方法は、GC法特有の差異に対処するもので、最近では有用な総ピーク面積への正規化と呼ばれています81。プールされたQCデータは、CapScanおよび便サンプルと比較して、密集したクラスターにあることがわかりました（Extended Data Fig.1）。データセットを統合する際、複数のアッセイで検出された代謝物は、1つの装置からのデータのみを残すように簡略化し、技術的分散の低いアッセイからのデータを残すことを優先しました（プールされたQCの分散係数％）。単一アッセイで検出された代謝物は、プールQCの分散係数とは無関係に、データセットに残った（補足表1）。PCAおよびPLS-DAの前に、各代謝物についてLog10変換と、検出されなかった特徴の最小報告ピーク高さの10分の1を用いたゼロ値インピュテーションが行われた。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」をご参照ください。
データの入手方法
質量分析の生データは、Metabolomics Workbench (https://www.metabolomicsworkbench.org/) のstudy ST002073, ST002075, ST002407, ST002409, ST002411で入手できます。16Sおよびメタゲノミクスのシーケンスリードは、BioProject PRJNA822660のもと、NCBIで入手可能です。分類学はSilva rRNA database v.132 (https://www.arb-silva.de/)を用いて割り当てた。MassBank of North America public libraries (https://massbank.us/) およびNISTからライセンスを受けたNIST20 librariesを使用してマススペクトルの注釈を行った。スクリプトはZenodo (https://zenodo.org/record/7659119#.ZBGhMh_P23A)に保存されています。
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リファレンスのダウンロード
謝辞
J. Wells と Z. Tippins は、West Coast Metabolomics Center での質量分析に協力した。D.BarupalのRコードは、彼のGitHubサイトからダウンロードしたものをChemRICHの評価に使用しました。C. Brydgesは、統計的回帰分析について相談した。本研究は、O.F.へのUSDA 2021-67017-35783、K.C.H.へのNational Institutes of Health (NIH) grant RM1 GM135102、K.C.H.へのNational Science Foundation grant EF-2125383 から資金提供を受け、J.F. への給与はNIH R01 AT010216 およびNIH U19 AG023122 グラントにより提供されています。J.G.は、スタンフォード大学医学部学長フェローシップとNIH F32 DK130574の支援を受けている。D.A.R.はスタンフォード大学のThomas C. and Joan M. Merigan Endowmentの支援を受けています。K.C.H.とD.A.R.はChan Zuckerberg Biohub Investigatorです。
著者情報
著者と所属
西海岸メタボロミクスセンター、カリフォルニア大学デービス校（米国カリフォルニア州）。
ジェイコブ・フォルツ、フアン・モンテス・モラレス、オリバー・フィーエン
スタンフォード大学医学部遺伝学教室（米国カリフォルニア州スタンフォード市
レベッカ・ニール・カルバー
スタンフォード大学医学部医学科（米国カリフォルニア州スタンフォード市
ジェシカ・グレンビ＆デヴィッド・A・レルマン
シリコンバレー神経胃腸症・運動器センター（米国カリフォルニア州マウンテンビュー市
ジョージ・トリアダフィロプーロス
スタンフォード大学医学部微生物学・免疫学教室（米国カリフォルニア州スタンフォード市
デビッド・A・レルマン＆カーウィン・ケイシー・ホァン
チャン・ザッカーバーグ・バイオハブ（米国・カリフォルニア州・サンフランシスコ
デビッド・A・レルマン＆カーウィン・ケイシー・ホァン
米国カリフォルニア州パロアルト、退役軍人会パロアルト・ヘルスケアシステム感染症課
デビッド・A・レルマン
スタンフォード大学バイオエンジニアリング学部（米国・カリフォルニア州スタンフォード市
カーウィン・ケイシー・ホァン
Envivo Bio, San Francisco, CA, USA
ダリ・シャロン
貢献度
O.F.、K.C.H.、D.S.が本研究を設計した。J.F.は、J.M.M.の協力を得て、メタボロームデータの取得と処理を行った。J.F.は、統計解析を行い、図表を作成した。G.T.は参加者を募集し、同意書とサンプルを入手した。K.C.H.、R.N.C.、J.G.、D.A.R.はマイクロバイオームデータの取得、処理、分析を行った。J.F.とO.F.は、D.S.、K.C.H.、G.T.、R.N.C.の協力を得て原稿を執筆し、著者全員が最終バージョンの原稿を承認しました。
執筆者
オリバー・フィーエンに対応しています。
倫理に関する宣言
競合する利益
D.S.は、ヒトの消化管に関心を持つEnvivo Bio社の従業員であり、資本的利益を有しています。他のすべての著者は、競合する利害関係がないことを宣言している。
倫理的承認
本研究は、独立した組織であるCopernicus Groupが、研究番号に基づき、Western Institutional Review Board内で審査・承認されたものである。1186513. また、各参加者からインフォームドコンセントを得た。
ピアレビュー
ピアレビュー情報
Nature Metabolismは、Robert Quinnと他の匿名の査読者の方々の本作品の査読への貢献に対して感謝します。プライマリーハンドリングエディター： Ashley Castellanos-Jankiewicz, in collaboration with the Nature Metabolism team.
その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権の主張に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 概要の可視化。
a,腸管サンプリング装置タイプにおけるサンプルpH。ボックスは±1四分位範囲を表し、線は中央値から最も遠いサンプルまで伸び、中央値から1.5四分位範囲までが最大の伸びとなる。すべてのサンプルは個々の点としてプロットされている。(n=総計274台、デバイスタイプ1=75、デバイスタイプ2=70、デバイスタイプ3=69、デバイスタイプ4=60) ****メタボロームデータセットから正規化したピーク高を主成分分析（PCA）したものである。QCサンプルは、ヒト腸管サンプルの腸内容物をプールしたもの。
Extended Data 図2 部分最小二乗判別分析（PLS-DA）により決定された、腸管装置サンプルと便サンプルの区別に最も重要な80の代謝産物。
サンプルと代謝物は、階層的クラスタリングにより、それぞれX軸とY軸に整理されている。各サンプルには被験者番号とサンプルタイプ（デバイスタイプまたは便）のラベルが貼られています。色は代謝物の存在量を表し、最小値と最大値は代謝物ごとに個別に設定されている（行）。
Extended Data 図3 部分最小二乗法判別分析（PLS-DA）によって決定された、デバイスサンプルをタイプ別に区別するために最も重要な上位80代謝物。
サンプルはデバイスの種類ごとにX軸に、代謝物は階層的なクラスタリングに従ってY軸に整理されている。色は代謝物の存在量を表し、カラースケールの最小値と最大値は代謝物ごとに個別に設定されている（行）。
Extended Data 図4 上部腸の近位と遠位における未注釈機能のレベルの比較。
デバイス1+2（近位）のデータとデバイス3+4（遠位）のデータを比較した。有意性は線形混合効果モデル（LMM）を用いて計算した。横の破線はp < 0.05の有意性閾値を示す（正確なp値については補足表4を参照）。円は、偽発見率（FDR）補正後の有意差がない代謝物、または効果量係数が±0.2未満の代謝物を示しています。菱形は、FDR補正後（n = 9,317）および効果量係数>±0.2後に有意な（p<0.05）差異を有する代謝物を示す。腸内サンプルの50%以上で検出された特徴量のみを本解析に含めた（n = 9,317 feature）。効果量係数は、LMMによって推定された傾きであり、正の（負の）係数は、近位上腸と比較して遠位上腸で高い（低い）代謝物を表しています。縦の破線は、効果量係数の±0.20倍である。
Extended Data Fig. 5 近位上部腸と遠位上部腸で有意に異なる化学クラス。
化学物質の濃縮統計はChemRICHによって行われた。腸内サンプルの50%以上で検出された代謝物をこの解析に含めました（n = 1182代謝物）。これらの結果は、化学物質の親油性（logP）と化学物質クラスの有意水準である-log10（p-value）でクラスを分離することで可視化されました。赤丸は、化学クラスが近位上腸に比べて遠位上腸で高かったことを示し、青は、化学クラスが近位上腸に比べて遠位上腸で低かったことを示す。紫色は、その化学クラスタが、近位上部腸と比較して遠位部で有意に高い代謝物、および有意に低い代謝物を有することを示す。円の大きさは、化学クラスの大きさを表す。
Extended Data 図6 腸内メタボロームの空間的変動に対する時間的・個人的変動の比較。
a, 分散分析（Kruskal-Wallis）により各被験者について算出した腸内領域（デバイスタイプ）間または食事間（4つのカプセルデバイスのサンプリング時間帯）で有意差のある代謝物の数です。各被験者の50%以上のサンプルで検出された代謝物のみをこの解析に使用しました（n = 1182代謝物）。b.多変量判別分析（PLS-DA）を行い、被験者間、または地域間の区別に最も重要な代謝物を同定した。これらのグループを区別するために最も重要な100の代謝物は、投影スコア（VIP）における可変重要性によってランク付けされ、化学サブクラスによって分類される。代謝物が3つ以下の化学サブクラスは「その他」として報告されています。
Extended Data 図7 分散分析（Kruskal-Wallis）により、腸管領域間（デバイスタイプ）または食事間（4デバイスセットのサンプリング時点）で有意差があった代謝物の数を各被験者について算出した。
各被験者の50%以上のサンプルで検出された代謝物のみをこの分析に使用しました（n = 1182代謝物）。a,各被験者の腸管領域間で存在量が有意に異なる代謝物（化学クラス別、各化学クラスの割合） b,サンプリング時間帯間で存在量が有意に異なる代謝物（化学クラス別、各化学クラスの割合）。
Extended Data Fig. 8 被験者間で強い差がある代謝物。
代謝物には、胆汁色素、ヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸エステル（FAHFAとAAHFA）、短鎖脂肪酸、スルホノリピッド（SL）、二次胆汁酸が含まれる。すべての便サンプルのデータを示し、サンプルは被験者ごとに整理されています。本試験の1ヶ月前と5ヶ月前に抗生物質を摂取した2名の被験者をハイライトしています。カラーバーは、胆汁酸の代謝物量（ピーク高さ）または濃度（ng/mL）を表しています。各代謝物（各行）のカラースケールを設定するために最小値と最大値を使用した。
Extended Data 図9 FAHFA、AAHFA、および被験者間で存在量に強い差がある脂肪酸。
代謝物は、ヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸エステル（FAHFAおよびAAHFA）および全デバイスサンプルの50%超を検出した脂肪酸である。全デバイスのサンプルを示し、テーマごとに整理しています。上段（FAHFA）および下段（脂肪酸）内では、階層的なクラスタリングに基づいて代謝物を並べています。カラーバーは、胆汁酸の代謝物存在量（ピーク高さ）または濃度（ng/mL）を表す。各代謝物（各行）のカラースケールの設定には、最小値と最大値を使用した。
Extended Data Table 1 上部腸の近位部と遠位部で最も大きな違いを示した20の化学クラス
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補足情報
補足情報
補足図1-3.
報告書の概要
補足表
補足表1～9
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Folz, J., Culver, R.N., Morales, J.M. et al. Human metabolome variation along the upper intestinal tract. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00777-z
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2022年9月24日受理
2023年3月3日受理
2023年5月10日発行
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上部腸管に沿ったヒトメタボロームの変化

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