遊びとくすぐり反応はラットの後頭葉周囲灰白質の側柱にマップされる

遊びとくすぐり反応はラットの後頭葉周囲灰白質の側柱にマップされる
ナタリー・グローヴェリ 7
ジャン・シモネ 7
ウェイ・タン
アントン・ドヴォルザーク
ディートマー・シュミッツ
ミヒャエル・ブレヒト 8
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オープンアクセス掲載:2023年7月28日DOI:https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.06.018
PlumXメトリクス
ハイライト

PAGをブロックすると、ラットのくすぐったさと遊びが阻害される

PAGにおけるユニット記録は、くすぐりと遊びの柱状表現を示している。

特に、PAGの側柱は遊びやくすぐりの際に活性化される。

外側PAGの光遺伝学的不活性化により、遊び行動が障害される。
まとめ
皮質剥離後も遊びが持続することは、遊びを制御する皮質下のメカニズムを示唆している。我々は、ムシモールまたはリドカインによるラットの側頭葉周囲灰白質の全体的遮断が、くすぐり行動と遊びを阻害することを見いだした。我々は、若くて遊び好きなラットの脳橋周囲灰白から、種間接触、遊び、くすぐりに対する発声と神経活動を記録した。ラットは触られると弱く発声し、遊びやくすぐりに対してはより強く発声した。また、くすぐりや戯れに対して、声帯周囲灰白質は多様だが強い変調を示した。遊びとくすぐりに対する神経細胞の反応に基づく階層的クラスタリングにより、異なる脳橋周囲灰白質のカラムにマッピングされる機能的クラスタが明らかになった。具体的には、背外側および背内側の脳橋周囲灰白カラムに、遊び/くすぐりに中立的なユニットとくすぐり/遊びに中立的なユニットが観察された。対照的に、強く遊び/くすぐりに興奮するユニットは外側カラムにマップされ、不安原性条件によって抑制された。光遺伝学的に外側脳橋橋柱を不活性化すると、くすぐったさと遊びが阻害された。われわれは、遊びと笑いには、側部後頭葉周囲灰白円柱が決定的に重要であると結論づけた。
グラフィカル抄録
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キーワード
遊び
くすぐり
中脳
脳橋周囲灰白
神経ピクセル
笑い
感情神経科学
オプトジェネティクス
発声
本能的行動
はじめに
哺乳類の行動の中でも、遊びは神経生物学的レベルで最も理解されていないものの1つである。性行動や攻撃行動、恐怖、報酬、感覚処理、さらには認知をつかさどる神経回路については大まかな見当がつくが、遊びの根底にある神経回路を明らかにすることは今のところできない。大脳皮質の広範な病変研究から、遊びは他の哺乳類の行動と同様、大脳皮質がなくても進行することがわかっている。
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また、遊びの行動やくすぐったさを維持するには、ドーパミン作動性の報酬メカニズムが重要であることも明らかである。
3
本研究では、遊び行動における脳橋周囲灰白（PAG）の役割を検討する。PAGが遊びの基質である可能性を示す証拠はいくつかある。第一に、社会的相互作用に富んだ遊びをした後の動物における即時型遺伝子発現の解析である。
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およびヒトにおけるくすぐりと笑いの回路解析
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は、PAGが関与していることを示している。第二に、PAGは発声の制御において決定的な役割を担っている。
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とポジティブな感情の発声は、遊びを組織化する上で最も重要である。
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第三に、PAGは攻撃行動と逃避行動の両方を制御できることが示されている、
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これらは、変化した形で、プレー中の戦いでも起こる。
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第四に、PAGはほとんどの本能的行動の制御に関与している。
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われわれのアプローチは、げっ歯類の遊びに関する先行研究から多くのヒントを得た。従って、私たちは非常に遊び好きなげっ歯類であるラットを使っている、
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遊びの指標として50kHzの発声を研究した。
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さらに、遊び心を抑制することが知られている不安誘発条件下で動物をテストした、
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遊び心の神経相関のアッセイとして行った。以前の研究とは異なり、我々はニューロピクセルを用いた高分解能の神経記録と、自由に行動するラットの四電極記録に焦点を当てている。遊びを研究する上で、このようなアプローチは斬新であり、非常に重要である。私たちは、自由に遊ぶ動物における神経細胞記録の欠如が、遊びの神経生物学的理解の乏しさの最大の原因であると考えている。神経記録という困難な条件下で遊びを誘発し評価するためには、このようなラット-ヒトのパラダイムが有効だからである。
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最後に、PAGを理解するためには、PAGの特定の列に記録ユニットを割り当てることが重要である。
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1）PAGは遊びに必要なのか？(2) PAGのニューロンは、触ったり、くすぐったり、遊んだりすることに反応するのか？(3)もしそうなら、これらの反応は互いにどのように関連しているのか、また、遊びとくすぐり反応の神経的束縛を示す証拠はあるのか。(4)遊びに関する活動はPAGの柱状組織にマップされるか？(5) PAGの遊び関連ニューロンは不安原性条件や発声にどのように反応するか？(6)遊びには特定のPAGカラムが必要なのか？
我々は、PAGが遊びに必要であることを発見し、PAGにおいて遊びとくすぐりに関連した神経細胞活動を観察した。特に、遊びやくすぐり時に強く興奮する神経細胞集団が同定され、そのほとんどがPAG外側カラムにマップされた。対照的に、遊びには無関係でくすぐりを抑制する神経細胞はPAG背側カラムに分布していた。外側PAGカラムに干渉すると、遊びが中断される。
結果
データセット、デザイン、研究の根拠
本研究は、遊びの神経相関を同定するという実験的課題に立ち向かうためにデザインされた。この問題に対する我々のアプローチは、Pankseppらの先駆的研究
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の先駆的な研究、そしてわれわれ自身の過去の研究に基づいている。
18
人間も動物も自由に遊ぶ必要がある、
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このため、頭部を固定した動物では研究を行うことができなかった。本研究では、ラットとヒトの種間遊びとくすぐりのパラダイムを用いている、
10
このパラダイムは、人間の実験者が遊びのきっかけを作ることができ、同時に記録することも容易である。
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と種内社会的遊びに容易に適応できる。特に問題なのは、遊びの行動が通常の行動から変化してしまうことである。つまり、遊びで戦う若いラットは、侵入者を攻撃する成体のラットと非常によく似た行動をとる。
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したがって、遊びの神経相関を「通常の行動」からの神経反応と区別するには、さらなる行動学的・神経学的証拠が必要である。特に、ラットのポジティブな感情を示す重要な行動マーカーである50kHzのラット発声を研究した24。
24
-その結果、動物の情動状態についての知見が得られた。さらに、遊び心を抑制することが知られている不安誘発条件下での神経細胞反応を研究し、反応が遊び心と相関しているかどうかをさらに確かなものにした。最後に、遊び心とくすぐったさはラットにおいて深く関係しているようだという事実を利用する。従って、くすぐったがりのラットほど遊び好きであり、その逆もまた然りであることが一貫して判明している。
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興味深いことに、私たちが研究したくすぐり行動と遊び（実験者の手を追いかける）行動は、感覚面でも運動面でも大きく異なっている（くすぐり時には強い触覚刺激を与えるのに対し、手を追いかけている時には接触はなく、微妙な合図を与えるだけ）。このような感覚と運動の顕著な違いを考えると、もし細胞が遊びを表現していないのであれば、くすぐりと遊びに対して同じような発火をする可能性は低いと考えられる。そこで我々は、くすぐり反応と遊び反応によるニューロンのクラスタリングを分析の中心に据えた。そのため、私たちの研究は、さまざまな刺激（さまざまな形態の触覚と音）、行動相互作用（遊びとくすぐり）、行動測定（発声とビデオ分析）、行動条件（正常対不安原性）、ユニット記録、ブロッキングを組み合わせた。この複雑な分析は、遊びにおけるPAGの役割を評価するという、たったひとつのシンプルな目標を目指している。
後頭葉周囲灰白質の遮断はくすぐったさと遊びを妨げる
分析の第一段階として、くすぐったさと遊び心にPAGが必要かどうかを調べた。この目的のために、4匹のラットにくすぐりと遊び（図1B）の間、対照実験としてムッシモール（γ-アミノ酪酸A型[GABAA]受容体アゴニスト）または生理食塩水を注射し（図1A）、PAGの活動をグローバルにブロックした。動物の背側（仰向け、図1C）をくすぐると、対照条件下では多数の鳴き声が誘発されたが、ムッシモールを塗布した後は減少した（図1D）。同様の観察はこのようなブロック実験すべてで行われ、有意な効果を示した（p = 0.027；図1E）。腹部のくすぐり（非常に強いくすぐり刺激；図1F）に対する呼びかけ反応も、ムッシモール注射によって減少したが、完全には消失しなかった（p = 0.003、図1Gおよび1H）。同様に、種間遊び（追いかけ手の条件、図1I）に対する呼びかけの反応も減少し（図1J）、遊び行動への関与はPAG遮断後に有意に減少した（p = 0.02、図1K）。興味深いことに、ムシモールでPAGニューロンを遮断しても、超音波発声（USV）が完全に消失するわけではなく、むしろくすぐったさや遊びたいという欲求が行動に依存して減少した。すべての動物において、PAG遮断の効果は背側くすぐり時のUSVの急激な減少をもたらしたが、腹側くすぐり時のUSVは有意に減少したものの依然として存在した。
図1ムッシモールを用いた脳下垂体周囲灰白質の全体的遮断は、くすぐりと遊びを妨げる
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さらに、6匹のラットでPAGをリドカインでブロックした。結果は動物によって概ね同様であったが、これらの動物のうち3匹については対照条件が多く、より広範なデータセットが得られた。これらの動物に関するデータを図S1に示す。リドカインによるPAGの様々な前後レベルでの遮断は、くすぐったさと遊びを妨害した。リドカイン注射は、ムッシモール注射と同様に、くすぐったさと遊びを減少させた。しかし、ムッシモール治療と比較して、リドカイン注射にはより多くの副作用があるようであった。以前の研究
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PAGリドカイン遮断の効果は、遊びやくすぐったさだけにとどまらず、運動性の変化も伴っていた。
ムッシモールやリドカインでPAGの活動を遮断すると、くすぐったさと遊びが確実に減少する。結論として、くすぐったさと遊びにはPAGが必要である。
触覚とくすぐりは発声を誘発し、声帯周囲灰白における興奮と抑制を引き起こす。
PAGにおける神経反応が遊び心とどのように関係しているかを分析する第一歩として、触ったりくすぐったりすることに対する行動と神経反応を評価した（図2）。具体的には、背側への優しいタッチ（図2A左）、背側へのくすぐり（図2A中；中程度の強さのくすぐり刺激）、腹側へのくすぐり（図2A右；実験者によって動物が仰向けにひっくり返される強いくすぐり刺激）の効果を調べた。予想通り、USVの発生率は背側の優しいタッチから背側のくすぐり、腹側のくすぐりへと増加した（図2B左から右）。
図2触覚とくすぐりによって誘発される声帯の発声と興奮性・抑制性神経反応。
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くすぐりや遊びに対する行動や発声の反応から遊び好きと判断した5匹のラットを用いて、遊びやくすぐり中にPAGの85の単一ユニットを記録した。個々のユニットが刺激によって有意に変調されるかどうかは、ベースライン/ブレイクインターバルからのランダムサンプリングから計算された発火率の分布に対して誘発発火率を検定することによって決定した（STAR Methods参照）。図2Cと2Dに示した外側PAGユニットでは、他の多くのPAGユニットと同様に、行動に対する反応は有意に興奮性であった（背側ジェントルタッチではN=31/82、背側くすぐりではN=37/85、腹側くすぐりではN=48/85）。また、体性感覚皮質のデータと類似した観察として、実際に反転して触れる前に発火率が上昇することが示唆された。
19
抑制性反応はあまり観察されなかった（背側の優しいタッチではN=17/82、背側のくすぐりではN=23/85、腹側のくすぐりではN=22/85）。特に腹側くすぐり試行では、USVはくすぐり開始前のフリップ中に大きく増加した。全体として、異なる行動中に有意に変調されたユニットの数（図2Eと2Fのマゼンタ）は、PAGユニットが背側くすぐりよりも腹側くすぐりにより変調され、背側ジェントルタッチよりも背側くすぐりにより変調されることを示唆している（背側ジェントルタッチではN = 48/82、背側くすぐりではN = 60/85、腹側くすぐりではN = 70/85、図2F）。
さらに、誘発スパイク率（図2E）および対応する反応指標（RI、STAR Methods参照；図2F）は、背側ジェントルタッチおよび背側くすぐりと比較して、腹側くすぐりでより大きな分散を示した。最終的に、RIの絶対値を比較すると、変調は背側くすぐり（RIの絶対値中央値=0.249）で背側ジェントルタッチ（RIの絶対値中央値=0.242）に比べて大きく、腹側くすぐり（RIの絶対値中央値=0.408）ではさらに大きいことが示された。Wilcoxon符号順位検定によると、絶対反応指数は背側くすぐりの方が背側ジェントルタッチよりも高く（p = 0.0035）、絶対反応指数は腹側くすぐりの方が背側くすぐりよりも高かった（p = 0.00002）。
まとめると、このデータは、触覚刺激がPAGにおいてさまざまなレベルの興奮または抑制を引き起こし、その反応強度がこれらの刺激によって誘発される発声の数に関連する可能性があることを示唆している。
遊びは様々なレベルの興奮を脳橋周囲灰白質に引き起こす
PAGにおける神経反応の解析の第二段階として、遊びによって誘発される反応を調べた。ここで注目した遊びは、ラットが実験者の手を追いかける遊びである（図3A）。ラットは手を追いかけるパラダイムを楽しみ、自発的に素早く実験者の手を追いかけて走り、50kHzの発声を行った（図3B）。このような遊びの間、PAGの神経細胞はさまざまなレベルで変調を受けた。図3Cと3Dの細胞はPAGの側柱に位置し、中程度の興奮反応を示した。母集団レベルでは、ほとんどの点が図3Eの統一線より上にあり、ほとんどのRIが正であるため（図3F）、遊び中のスパイク率はベースライン/休憩中よりも高い傾向があった。多くのユニットがプレイ中に有意に変調され（N = 51/82）、ほとんどがプレイ中に興奮し（N = 41）、3分の1が非変調（N = 31/82）、抑制されたのはわずかであった（N = 10/82、図3Eおよび3F）。このことから、ラットのPAGニューロンは遊びの間、興奮するか無変調になる傾向があるが、抑制されることはほとんどないと結論づけられる。
図3遊びは発声を誘発し、声帯周囲灰白における興奮性神経応答を引き起こす。
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遊びとくすぐり反応に応じたニューロンのクラスタリングにより、遊びのPAGカラムへの系統的なマッピングが明らかになった。
上記で紹介したように、私たちは、遊び心を表現するニューロンにおけるくすぐりと遊びの連結的表現を通して、遊び心の神経的相関を同定したいと考えた。この可能性を評価するため、Wardの方法を用いた階層的クラスター分析を行い、追い手と腹側くすぐり時の反応に基づいて類似細胞をグループ化した（図4）。図4Aと4Bに、各クラスターについてチェイシングハンドと腹側くすぐりのRIを示す。5つのクラスターは、その反応プロファイルと、統計的妥当性のための各群の最小データ点数に基づいて区別された。各クラスターについて、活動パターンを表す名前と、それぞれの細胞の空間分布をプロットするための記号を選んだ。図4Cと4Dに示すように、反応クラスターとPAGカラムの間には高度に系統的な関係があった。対照的に、我々のデータセットでは前後差は見られなかった。図4Dの積層ヒストグラムは、4つのPAGカラム（背内側カラム（N=12ユニット）、背外側カラム（N=13ユニット）、外側カラム（N=36ユニット）、腹外側カラム（N=21ユニット））に対する異なる反応クラスターの分布を示す。カイ二乗検定では、各列の反応クラスターが非常に非ランダムに分布していることが示された（p = 0.0000047）。我々は一連のフィッシャーの正確検定を実行し、与えられたクラスターの与えられた列への非ランダム分布を、他のすべてのクラスターおよび他のすべての列を合わせた分布と比較して評価した。われわれの統計的アプローチは多くの組み合わせ（20）を必要とするため、p値の昇順で検定結果をランク付けし、0.05より低い相加的p値を導く最初のものだけを有意とみなした（n = 6、表S1参照）。遊び中立／くすぐり抑制クラスター（N = 23ユニット）は、他のクラスターやカラムと比較して背内側カラムに最も多く存在した（p = 0.0014、順位2）。背外側カラムでは、遊び／くすぐり中立細胞の割合が最も高かった（N = 14ユニット、p = 0.007、順位5）。側柱は、強く遊び／くすぐりに興奮する細胞（N = 16ユニット、p = 0.00011、順位1）が優勢で、遊び／くすぐりに中立的な細胞（p = 0.004、順位3）がないことで際立っている。腹側カラムでは、遊び中立／くすぐり抑制細胞の割合が低く（p = 0.0046、順位4）、適度に遊び／くすぐり興奮細胞の割合が高い（N = 21、p = 0.0099、順位6）。別の解析として、腹側のくすぐり刺激と追いかけ手のRIを列間で比較したところ、同様の構造と機能の関係が見られた（図S2）。くすぐり反応と遊び反応の共同解析により、PAGの外側カラムに興奮性の遊び／くすぐりホットスポットがあることが明らかになった。
図4遊びと腹側のくすぐり反応は、側頭葉周囲灰白質のカラムに系統的にマッピングされ、遊び／くすぐり興奮は側頭葉カラムに優位に存在する。
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不安原性条件下では、遊びやくすぐりで強く興奮した細胞の活動が抑制される。
遊びの特徴はその気分に依存することであり、安全で快適だと感じなければ遊びは始まらないことが長い間認識されてきた。そこで私たちは、実験動物を不安誘発性条件、すなわち強い照明の下で高架下に置いた（図5A、右）。予想通り、不安誘発条件はくすぐりによって誘発されるUSVを抑制した（図5B）。さらに、不安誘発条件がPAGの神経活動に及ぼす影響を評価したところ、進行中の活動や誘発される神経反応に対する複雑でばらばらな不安誘発効果が観察された。PAG全体で遊びやくすぐりに対する反応が異質であることから、不安誘発効果が遊びやくすぐり反応にどのように関係しているのだろうかと考えた。この疑問を解決するため、異なる遊び／くすぐり反応細胞クラスターにおける不安誘発効果を別々に評価した。その結果、強く遊び／くすぐりに興奮するPAG細胞のクラスターに属する個々のニューロン（図5Cと5D）と集団ニューロン（図5Eと5F）のくすぐり反応は、不安原性条件によって系統的に抑制されることがわかった（中央値［第1四分位値-第3四分位値］；通常時：11.1［7.8-40.7］Hz；不安原性：9.16［5.9-18.2］Hz；3匹のラットのN＝15ユニット、p＝0.002）。図4で同定された他のクラスターは、より複雑な効果を示した（データは示さず）。我々は、強く遊び／くすぐりに興奮したPAG細胞は、くすぐり反応の不安抑制を示すと結論づけた。
図5強く遊び／くすぐりに興奮したクラスターからのユニットは、不安原性条件下で変調が少ない。
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強く遊び／くすぐりに興奮した細胞は、発声前と発声中に発火する。
次に、PAGの活動が発声とどのように関連しているかを調べた。以前の結果と一致している、
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では、発声前と発声中に発火するPAGニューロンの一部が観察された。また、発声に関連した抑制を示した細胞は、より少数であった。前回の結果に導かれ、図4で定義したように、遊び／くすぐり反応に従って細胞を選別した後、この発声に関連した活動を再度評価した。不安誘発効果に関しては、遊び／くすぐり反応クラスターは発声関連活性において著しく異なっていた（図6）。具体的には、強く遊び／くすぐりに興奮した細胞は、発声前と発声中に発火することがわかった（図6B上）。これは他のPAG細胞には当てはまらず、そのほとんどが発声に関連した活動をほとんど、あるいは全く示さなかった（図6C）。
図6発声前および発声中に強い遊び／くすぐり興奮を示す脳橋周囲灰白質細胞
キャプション
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この発見から、私たちは、私たちが説明した遊び／くすぐりの変調（図2、3、4）が、主に発声の存在によるものなのかどうかを確認することにした。このため、腹部のくすぐり時の発火率を再計算したが、今回は発呼を囲む短い間隔を除いて計算した（図S3）。その結果、ほとんどの細胞の発火率、特に興奮したクラスターからの発火率は、くすぐり中の呼びかけにわずかに影響されるだけであることがわかり、最初の発見が補強された。
また、様々な音の再生に対するPAG細胞の聴覚応答も分析した（図S4）。予備的な分析では、いくつかの細胞は特定の音（すなわち、50kHzの呼びかけ対恐怖の呼びかけ）に対して選択的であるように見えたが、ほとんどの細胞はホワイトノイズ刺激に強く反応した。再生音に対する反応はクラスターによって異なるようであった。特に、強く遊び／くすぐりに興奮した細胞は、遊び中立／くすぐり抑制のクラスターと比較して、聴覚的再生により多く反応した。我々は、強く遊び／くすぐりに興奮するPAG細胞は、発声前や発声中に強く放電することから、笑いを駆動している可能性があると結論づけた。
外側PAGカラム活動への光遺伝学的干渉はくすぐりと遊びを妨害する
私たちの記録から、遊びで活性化された細胞はPAGの外側カラムにマップされ、外側カラム細胞は不安抑制と発声に関連した活性を示すことが示唆された。これらの観察から、PAGの外側カラムが遊びのために必要なのだろうかと考えた。この疑問を解決するため、PAGをArchTまたはGFP（対照動物）で両側性にウイルス導入し、側柱に向けてライトガイドを埋め込んだ（図7A）。組織学的に、ウイルス発現とライトガイドの両方がPAGの側柱を正確に標的にしていることが示された（図7B）。光誘導によるアーキロドプシンTP009（ArchT）の活性化（光遺伝学的抑制）は、腹側および背側のくすぐりに対する発声反応を抑制した（腹側：p = 0.01、n = 4匹、背側：p = 0.049、n = 3匹、paired t test）が、GFP（対照動物）の光適用には効果がなかった（図7C）。光によるArchTの活性化も社会的遊びを抑制したが（図7Dと7E、p = 0.016、n = 3）、対照動物では効果がなかった。我々は、くすぐったさと遊びには外側PAGカラムが必要であると結論づけた。
図7外側PAGカラムの光遺伝学的阻害はくすぐったさと遊びを妨げる。
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考察
まとめ
我々は、PAGのグローバルブロックがくすぐりや遊びを妨害することを発見した。PAGニューロンはくすぐりや遊びに対して多様な反応パターンで強く反応する。遊びに対して中立的でくすぐりによって抑制される細胞はPAGの背内側および背外側のカラムに見られるが、くすぐりに強く遊びを興奮させる細胞は外側のカラムにマップされる。このような強くくすぐったがったり遊びで興奮したりする細胞は、不安原性条件によって抑制される。最後に、外側PAGカラムの選択的抑制が、くすぐったさと遊びを妨げることを示す。
脳橋周囲灰白は遊びに決定的に関与している
私たちのブロック実験は、遊びとくすぐりにはPAGが適切に機能していることが必要であるという考えを支持するものである。無傷の動物において、くすぐりが激しい発声を引き起こすにもかかわらず、同じ動物においてPAGの抑制下で50kHzの鳴き声と遊びが抑制されるのは驚くべきことである。このような抑制は、動物が発声できるにもかかわらず起こる。PAG遮断による行動変化は大規模であり、PAGの前後軸全体にわたって起こる。ムシモールとリドカインの両方がプレーをブロックする。しかし、遮断効果の詳細は異なる。具体的には、GABAAアゴニストであるムシモールは通過線維に影響を与えないはずであり、リドカイン塗布と比較して、より特異的な結果をもたらし、副作用を軽減する可能性がある。さらに、最も強い（腹側の）くすぐり刺激は、遮断下でもUSVを誘発する可能性があり、これらの刺激によって誘発される強い感覚が遮断効果に優先するのではないかと考えられる。この遮断効果は、PAGの遊びへの関与を示す他の証拠と一致している。このような証拠には、社会的相互作用に富んだ遊びをした後の動物の背側PAGにおける即時型初期遺伝子発現が含まれる。
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およびヒトにおけるくすぐりと笑いの回路解析
5
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PAGの関与が示唆されている。さらに、不安誘発性条件は通常ラットに覚醒効果をもたらす。したがって、不安原性条件によって側索の遊び／くすぐり活性化ニューロンが抑制されることは、これらの細胞の活動が単に遊び中の覚醒を反映しているのではないことを示している。PAGが遊びを媒介するという考えは、くすぐり、遊び、50kHzの呼びかけによるPAGニューロンの強い反応調節に関する我々の観察によって補強された。また、PAG遮断の効果は、遊びに対する皮質病変の微妙な効果よりもはるかに深いものであった。
1
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15
ほぼ間違いなく、外側PAGは単独で作用しているのではなく、外側視床下部など他のさまざまな脳構造と協調して遊びやくすぐりを制御している、
25
扁桃体などである、
26
体性感覚
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および前頭前皮質
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遊びとくすぐり反応の列構成
PAGが前後軸に沿って縦に積み重なったカラムで構成されているという我々の考えは、解剖学的および生理学的観察から生まれた。
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私たちのいくつかの観察結果は、PAGにおける遊びの表現がこのような柱状組織に従っていることを示唆している。遊びやくすぐりに対する生理的反応もまた、PAGの柱状組織に従っており、その反応パターンの多くは、PAGの柱状組織に関するこれまでの研究と一致していた。特に、背内側カラムと背外側カラムでは、遊び中立/くすぐり抑制細胞が優勢で、遊び/くすぐり興奮細胞が存在しないことは、恐怖と逃避反応におけるこれらのカラムの役割を指摘する他の研究を裏付けている（Lefler et al.
14
を参照）。外側PAGカラムで遊びやくすぐりに強く興奮するニューロンが優勢であることについては後述する。
脳橋周囲灰白とその外側カラムはどのようにして遊びを組織化するのか？
PAGにおける遊びの制御の神経メカニズムについての理解は、まだ始まったばかりである。われわれのデータは、遊びの制御におけるPAGの役割をしっかりと立証しているが、これらの神経回路で遊びがどのように実行されるかはまだ明らかではないことを強調しておきたい。(1)強い触覚刺激であるくすぐりに対する強い反応を報告する。本研究では側柱から36個のニューロンを記録したが、興味深いことに、その多くが高い誘発平均発火率（＞25Hz、図2、3、S2）を持つ強いくすぐり反応を示した。強く断続的なくすぐり刺激でこのような平均発火率を達成するには、100Hz以上の瞬時発火率が必要である。体幹の体性感覚皮質（触覚と遊びに強く関連した神経構造）からの数百回の記録では、このような激しい反応は見られなかった。
18
(2)ポリモーダルな反応を示す細胞、特に遊び／くすぐりに興奮する細胞が、他のPAGニューロンと比較して高い聴覚反応を示した（図S3）。遊び／くすぐり興奮細胞の高い聴覚応答性は、遊びと機能的に関連している可能性がある。実際、遊び好きな動物やヒトは感覚刺激に対して非常に反応的であり、感覚の無反応は遊び好きでないことの確固とした指標となる。(3)強い遊び・くすぐり興奮細胞で観察された気分依存性と不安抑制は、遊びに関連した活動の特徴である。(4) 強い遊び／くすぐり興奮を示す細胞のほとんど全てが、発声に関連した活動も示す。ラットでは50kHzの発声、ヒトでは笑いを伴う遊びは、遊びを調整する必須の社会的シグナルである。例えば、ケンカごっこの最中には、実際のケンカとは異なる行動をとることができるように、パートナーがコミュニケーションをとることを可能にする。
15
(5)くすぐりと遊びは運動感覚パターンという点で非常に異なるため、外側PAGカラムの強く遊び／くすぐりに興奮する細胞で、遊びとくすぐり反応の連結的表現が観察されたことは、些細なことではない。このことは、これらのニューロンが単なる感覚情報や運動指令よりも遊びに関係している可能性が高いことを強く示唆している。(6)生理学的反応と同様に、我々の光遺伝学的抑制実験は、外側カラムが遊びに必要であることを示している。
我々のデータを要約すると、遊び行動の制御にPAG回路が強く関与していることがわかる。PAG細胞が、本研究で検証されなかった遊びの他の側面に敏感であるかどうかを調べることは価値があるだろう。特に、ルールは遊びの基本である。
23
ラットと人間のかくれんぼゲームでは、人間のプレイヤーがルールに違反すると、ラットはイライラする、
27
例えば、人間のプレイヤーがきちんと隠れなければ、ラットはイライラする（ブレヒト、個人的観察）。PAGニューロンがルールや、遊びの行動を魅力的なものにしている数多くの他の複雑な要素に敏感かどうかを調べる価値はあるだろう。
STAR★メソッド
主要資源表
REAGENTまたはRESOURCEIDENTIFIER化学物質、ペプチド、組換えタンパク質ケタミンメディスター・アルツネイミッテル・ヴェルトリープ社N/AXylazineメディスター・アルツネイミッテル・ヴェルトリープ社N/ARimadylZoetis Deutchland社N/ALidocaineBelapharm社、VechtaN/ALidocaineB. Braun SE, Melsungen, GermanyN/AMuscimolAlomone Labs, Jerusalem IsraelN/AMetamizolratiopharm GmbH, Ulm, GermanyN/ANaCl 0.9%B. Braun SE, Melsungen, GermanyN/AUrethaneSigma AldrichN/AEye cream Bepanten, BayerMedios Apotheke an der Charté, Anike Oleski e． Kfr, Luisenstraße 54/55, 10117 BerlinN/AS塩化ナトリウム NaClCarl Roth GmbH, Karlsruhe, GermanyN/AP塩化カリウム KClSigma AldrichCat# P5405-250GM 塩化マグネシウム六水和物 MgCl2-6H20Carl Roth GmbH, Karlsruhe, GermanyCat# 2189.2塩化カルシウム二水和物 CaCl2-2H20Carl Roth GmbH, Karlsruhe, GermanyCat# HN04. 1HEPES - 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure-Carl Roth GmbHCat# 9105.4アガローススタンダードCarl Roth GmbH, Karlsruhe, GermanyCat# 3810. 2Optibond Kit All in one, Kerr, GmbHAltschul Dental GmbH, Mainz,Cat# 80691Charisma、Kulzer GmbHAltschul Dental GmbH, Mainz,Cat# 21463Paladur、Kulzer GmbHAltschul Dental GmbH, Mainz,Cat# 82462Kwik cast Silicone sealantWorld Precision Instruments, Sarasota, FL, USAN/ASuper GlueUHU GmbH & Co. KG Bühl／Baden，GermanyN／ADiI（1，1′-ジオクタデシル-3，3，3′，3′-テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレート）Sigma AldrichCat＃ 42364DiR．DiIC18(7) (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-Tetramethylindotricarbocyanine Iodide)Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USACat# D12731細菌およびウイルス株AAV8-CAG-GFPCharité Viral Core FacilityN/AAAV8-CAG-ArchT-GFPUniversity of North Carolina Vector CoreN/A実験モデル： 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験モデル: 実験動物/系統ラットLong Evans雄Janvier labsN/AハードウェアNeuropixels 1.0プローブおよび制御システムIMECN/AHarlan 8ドライブ、テトロ電極構築システム、電極メッキシステム（NanoZ）および収集システム（digital lynx sx）Neuralynx,Inc.、USAN/AnanoZWhite Matter、シアトル、WA、USAN/ASステレオタクチック装置Narishige Scientific Instrument Lab、 東京、日本N/無線テトロ電極記録用ロガー： ラットログ64の旧バージョンDeuteron Technologies LtdN/AUltrasonic microphonesAvisoft Bioacoustic, Glienicke/Nordbahn, GermanyCat# CM16/CMPA / Knowles FG-OUltraSoundGateAvisoft Bioacoustic, Glienicke/Nordbahn、 ドイツ416HUltraSoundGateプレーヤーAvisoft Bioacoustic, Glienicke/Nordbahn, Germany116HUltrasonicスピーカーAvisoft Bioacoustic, Glienicke/Nordbahn, GermanyCat# 60108CED - Power1401 625 kHzCambridge Electronic DeviceRRID： SCR_0016040Dell Workstations 5820T。 Dell561 nm DPSS laserChangchun New Industries OptoelectronicsCat# MBL-FN-561-1Optic fiber implantsThorlabsCat# FT200UMTG ガイドカニューレ、G26ニードル、Sterican ®B. Braun SE, Melsungen, GermanyCat# 4657683インジェクションカニューラ、Nanofilニードル、33G BVLDWorld Percision Instruments, Sarasota, FL, USACat# NF33BV-2シリンジ、Nanofil 10 μlWorld Percision Instruments, Sarasota, FL, USANANOFILソフトウェアおよびアルゴリズムMATLAB R2019bThe MathworksRRID： SCR_001622Deepsqueak (Ultrasonic vocalization detection and curation)Russell Marx, Kevin Coffey, Robert Ciszek, & Lara ValderrabanoRRID:SCR_021524ELAN version 6. 1Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive, Nijmegen, The NetherlandsRRID:SCR_021705Kilosort 2. 0 and 2.5 (spike sorting for tetrodes)Marius PachitariuRRID:SCR_016422Kilosort 3 (spike sorting for neuropixel)Marius PachitariuRRID:SCR_016422Anaconda with Python 3.7.4Anaconda Inc. RRID:SCR_008394Phy2 (spike sorting curation)Cyrille RossantN/ASpike2Cambridge Electronic DeviceRRID:SCR_000903ImageJNIHRRID:SCR_003070Prism8GraphPadRRID:SCR_002798Deposited data図データMendeley Datahttps://doi.org/10.17632/chnfyfd2k9.1Custom MATLABコードMendeley Datahttps://doi.org/10.17632/chnfyfd2k9.1
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リソースの有無
リードの連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトであるMichael Brecht (michael.brecht@bccn-berlin.de)までお願いします。
材料の入手可能性
本試験では新規の試薬は得られていない。
実験モデルおよび研究参加者の詳細
すべての実験手順は、動物福祉に関するドイツのガイドライン（ライセンス番号G0279/18、G0072/21）に従って実施した。
Long-Evans系雄性幼若ラットはJanvier社から商業的に入手した（到着時3～4週齢）。動物は餌と水に自由にアクセスでき、12時間の明期／暗期に維持された。実験前の1～2週間は、少なくとも1日1回、動物の世話が行われた。行動馴化、手術、記録を含むすべての実験手順は暗期に行われた。
方法の詳細
行動パラダイムとビデオ撮影分析
実験開始前にラットを実験者とくすぐり環境に慣れさせ、動物が快適で遊びやすいようにした。私たちのチームの以前の研究で説明されたものと同じレイアウトを使用した。
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簡単に説明すると、ラットは自宅のケージからテストボックス（プラスチック製、43×30cm、高さ26cm）、すなわち遊び場に移され、ストレスを軽減し、遊び行動を促進するために相対的暗闇（20lx未満）に置かれた（「通常条件」と呼ぶ）。ラットは約2～7日間の馴化の後、くすぐったがり、遊びたがるようになった。短い初期期間（通常10～30秒）の後、行動パラダイムを開始し、様々な感覚刺激（背側および腹側のくすぐり、背側および腹側の優しいタッチ、図2）、遊びの相互作用（手を追いかける、図3）、実験者の手を環境から完全に離す「ベースライン」期間、実験者の手を環境の上端に動かさない「休憩」期間を繰り返し与えた。実験者は木綿の手袋を着用し、実験中は手袋を交換しなかった。理想的には、各感覚刺激／遊びの段階は5～7秒間続き、その間に5～7秒間のベースラインまたは休憩の段階があり、これらの段階はすべてランダムなシーケンスに従って実行され、各感覚刺激／遊びの段階は少なくとも7～8回繰り返された。
不安誘発条件下では、背側と腹側のくすぐりのみが行われた。
神経記録中、最初の実験では各相の時間が正確に定義された標準的な構造になっているとは限らないが、ある相が少なくとも3回実行されたか、20秒間持続したセッションのデータを使用した。
私たちは感覚刺激を系統的に実行することを目指したが、私たちが研究している行動の性質上、動物のくすぐったさや遊びへの関与の試行ごとのばらつきを排除する方法はなかった。実際、遊びはその自由さと他の刺激に対するもろさによって定義されるため、試行ごとのばらつきは常に予想される。
通常の状態でくすぐったくない動物は分析に用いなかった。さらに、背部くすぐり刺激（図7およびS1）に対してくすぐったくならないラットは、この刺激の解析には含めなかった。
赤外線照明下での連続ビデオ撮影には、トップビューとサイドビューのカメラを1台ずつ使用した（60fps）。行動フェーズのオンセット時間とオフセット時間は、ELAN 6.1ソフトウェア（Max Planck Institute for Psycholinguistics、オランダ）を用いて同定した。
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). 図1、図2、図3、図5、およびS1のラットの模式図は、石山ら（19）より引用した。
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上記の行動と刺激の動画は、ラットのくすぐったさと遊びに関する最初の発表で入手可能である。
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超音波発声の記録と分析
超音波発声（USV）は、コンデンサー型超音波マイクロホン（CM16/CMPA-5V）または無指向性エレクトレット型超音波マイクロホン（Knowles FG-O、Avisoft-Bioacoustics社、Glienicke/Nordbahn、ドイツ）のいずれかを用い、環境の床から約50cmの高さ、特に中央の位置に設置してモニターした。
超音波マイクロホンをAvisoft-UltraSoundGate 116Hに接続し、Dell Workstation 5820T上で動作するAvisoft-RECORDER USGHソフトウェア（Avisoft Bioacoustics, Glienicke/Nordbahn Germany）を用いて、250kHz、16ビットの分解能で信号を取得し、デジタル化した。
USVはDeepSqueak 1.0で検出し、DeepSqueak 2.7.0でキュレーションした（主要リソース表参照）。キュレーションは、検出された USV の 1 つ 1 つを目視で確認し、USV の検証、検出ボックスの絞り込み、偽陽性イベン トの拒否、または新しい検出ボックスの追加による見逃された USV（偽陰性）の追加を行いました（https://github.com/DrCoffey/DeepSqueak を参照）。Deepsqueakは、非常に信頼性の高いUSVオンセットの検出を可能にし、今回のデータセットでは、検出されたUSVを識別可能なサブグループ（フラット、モジュレーテッド、トリル...）に分類しませんでした。
再生」実験では、UltraSoundGateプレーヤー116Hとvifaスピーカー（Avisoft Bioacoustics, Glienicke/Nordbahn Germany）を用いて、音声信号（純音、ホワイトノイズ、USV）を動物に聞かせた。これらの再生信号は録音システムで捕捉されたため、ラットが発するUSVと区別するために、DeepSqueakを用いて個別に検出し、「ピュアトーン」、「ホワイトノイズ」、「フィアーコール」、「50kHz-コール」に手動で分類した。
ブロッキング実験
手術-ガイディングカニューレの埋め込み
動物（3～4週、60～80g）は手術中、イソフルラン（酸素中1.5％vol/vol）で麻酔した。体温はヒーティングマットで維持し、呼吸数と反射を連続的にモニターした。手術30分前にカルプロフェン（5mg/kg）を皮下注射した。動物を定位装置に固定し、頭皮下にリドカイン（2％、B. Braun SE、ドイツ）を投与し、アイクリーム（Dr. Winzer Pharma GmbH）を塗布した。PAGにつながるカニューレの正確な埋め込みを確実にするため、成体ラットの脳座標と比較して思春期ラットの脳がわずかに小さいことを補正するために、BregmaとInteraural Line間の距離に基づいて、各動物について個別にインプラントの座標を計算した。
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ガイディングカニューレは滅菌（100％EtOHで一晩）したG26針（B. Braun SE、ドイツ）を使用し、先端は7mmに先細りし、針の反対側には1cmのポリエチレンチューブをつけた。開頭手術は両側から行い、カニューレは定位座標APで脳損傷を最小限にするため9度の角度で下げた： -7.68、ML:1.63、DL:2.46（Bregmaに対するmm単位）。これにより、カニューレはPAGの上方に留置され、注射針がPAG内の所望の注入深度に到達できるようになった。ガイドカニューレはアクリル接着剤（UHU GmbH & Co. KG、ドイツ）で固定し、カニューレのポリエチレンチューブを仮止めした。インプラントの安定性を高めるため、頭蓋骨にアンカースクリューをねじ込んだ。インプラントはさらに、3Dプリンターで作製した取り外し可能な蓋付きプラスチックキャップ（高さ11mm、歯科用リン酸塩セメントパスタで固定）で保護した（Hoffmann Dental Manufaktur GmbH、ドイツ）。
回復と実験準備
動物には術後の痛みと炎症を抑えるため、手術の1日前と3日後にメタミゾールを飲料水に溶かしたもの（200mg/kg）を与え、1週間回復させた。実験前日、インプラントのキャップを外し、ポリエチレンチューブを切断し、注射針（ハミルトン注射器、33Ga x 10mm針、NanoFil #NF33BV ）がカニューレを通るようにした。実験中の注射手技の新規性のストレスを軽減するため、ラットに2μlの等張0.9％NaCl溶液（B. Braun SE、ドイツ）を両側から注射した。
ムシモール、リドカインおよび対照実験
ラットは実験の5日前に遊び場と実験者に慣れさせた。実験では、ラットを短時間拘束し、生理食塩水、リドカイン（20mg/ml）またはムッシモール（生理食塩水で希釈した100μM、Alomone Labs社、イスラエル）のいずれかを2μl、ガイディングカニューレを通してPAGに片側から注射した。30秒から1分間の休憩の後、ラットをカチカチのアリーナに入れた。背部くすぐり、腹部くすぐりの感覚刺激と、ラットが実験者の手を追いかける遊びの相互作用がランダムな順序で誘発され、それぞれ5～7秒持続し、ベースライン期間は7秒であった。実験は1つの条件（コントロール／ムシモール／リドカイン）で合計8分間続いた。くすぐったくない動物は分析に用いなかった。
組織学
実験後、動物をイソフルラン過剰投与で殺し、脳を摘出して4%パラホルムアルデヒド溶液に一晩移し、その後、脳を0.1%NaN3を含むリン酸緩衝液に移した。事後解析のため、死後にDiRを注射して注射部位を可視化した。脳は300μmの厚さにスライスし、Leica双眼鏡（4倍率）で可視化した。
ユニット記録、解剖学および解析
5匹の若齢（6～8週齢）雄Long-Evans系ラット（200～250g）を用いて、テトロ電極とニューロピクセルの記録を行った。
着床前準備
外科手術はすべて6週齢の動物で、ケタミン（100mg/kg）およびキシラジン（7.5mg/kg）麻酔下で行った。体温はヒーティングパッドで維持し、直腸プローブ（Stoelting, Wood Dale, IL, USA）で連続的にモニターした。呼吸回数と痛覚反射（後肢をつまむ）は実験中継続的にモニターし、必要に応じて麻酔薬のブースター投与を行った。動物の頭部を定位装置（ナラシゲ科学器械研究所、東京、日本）に固定した後、リドカインを頭皮下に注射した。5分後、頭蓋表面の大部分を露出させるため、頭蓋上部の皮膚パッチを切除した。前頭骨、頭頂骨、頭頂間骨を結合組織から掻き出し、リンゲル（単位mM、135NaCl、5.4KCl、1MgCl2・6H2O、1.8CaCl2・2H2O、5HEPES、pH7.2、浸透圧290mOsm/kgH2O）で十分に洗浄し、送風機で乾燥させた。ブレグマ-ラムドバ相対背腹距離を0.1mm未満に調整し、手術用ペン（ブレグマ社製：AP-7.2mm；ML-0.5mm）を用いて頭蓋骨の開頭中心位置を決定した。すべてのマイクロマニピュレーションは、SM-6 Controler and Keypadに接続されたLuigs-and-Neuman Juniorマイクロマニピュレーター（4軸、XYZZ）を用いて行われた。露出した頭蓋表面はUV活性化接着剤（オプティボンド・オールインワン）で処理した。2本の金メッキスクリューを開頭部から離れた頭頂間または前頭骨に固定し、接地のための接点を設けた。その後、カリスマ（UV活性歯科用コンポジット）をオプティボンド層の上、金ネジの周囲と上、開頭部の周囲に塗布し、浅い井戸を形成した。その後、インプラントのタイプに応じたサイズと形状の開頭術とデュロトミーを行った。Harlan 8マイクロドライブインプラントには1 x 2 mmの長方形の開頭（ML x AP）を行い、Neuropixelsプローブインプラントには直径約1 mmの円形の開頭を行った。
テトロデ・ドライブ、インプラント、日降下、データ収集と病変
手術に先立ち、Neuralynx社から提供された基本的な取り付け説明書に従って、8個の独立可動テトロ電極からなるHarlan 8ドライブ（Neuralynx社、米国、主要リソースの表を参照）を製作した。テトロデスは2本×4本のマトリクス状に配置され、隣接するテトロデスの間隔は0.5mmであった。テトロデスは直径12.5μmのニクロム線（Sandvik, Sandviken, Sweden）を金メッキしたもので、インピーダンスは約250kΩであった（NanoZ）。脳内のテトロデスの軌跡を識別しやすくするため、テトロデスは植え込む直前に蛍光トレーサーDiI（ThermoFisher Scientific Inc.
インプラントがドライブを受け取る準備ができたら、液体がドライブに入るのを防ぐため、マイクロドライブガイドチューブをミネラルオイルに短時間浸した。マイクロマニピュレーターを使用して、ガイドチューブが脳表面の真上に来るように、また、脳と接触する可能性はあるが、必ずしも接触する必要はないように、ドライブを位置決めした。このステップでは、テトロ電極が矢状洞や合流洞に当たらないように、AP/MLターゲティングを微調整した。開頭部全体を1％アガロースで覆い、Lチューブを包埋した。次にマイクロドライブを歯科用セメント（Paladur, Heraeus Kulzer, Hanau, Germany）で固定した。テトロ電極は最初、脳内に約1-2mm下げた。記録は通常、手術の2-3日後に開始した。実験期間中に新しいユニットがサンプリングされるように、各レコーディングの少なくとも1時間前に、毎日最低150μmずつ電極を進めた。
神経信号は、Deuteron Technologies社が開発した32チャンネルワイヤフリーニューラルロガーを用いて32kHzで取得した。このシステムはヘッドステージとプロセッサーボードで構成され、信号の増幅、デジタル化、処理を行い、マイクロSDカードに保存した。システム全体はHarlan-8ドライブのキャップに機械的に取り付けられ、保護フォームで覆われていた。ニューラル・ロガーのプロセッサー・ボードは、基地局との通信を可能にする無線信号を受信・送信し、基地局とロガー間のTTLによる正確な同期を可能にした。TTLはまた、ベースステーションからAvisoft-UltraSoundGate 116Hと、両方のカメラから見えるLEDに送られ、すべてのデバイスの同期をとった。通常、TTLは100msの長さで、1秒ごとに200msのジッターで送信された。したがって、ランダムなTTLトレインが得られ、異なるデバイスからの信号の非均等な整合が可能になった。
最終記録セッションの後、動物は20％ウレタン（5ml/kg）で深く麻酔され、テトロ電極に10μAの負電流を10秒間流すことで電解病変が行われた（nanoZで実施）。個々のテトロデトラックには、ポストホックでの同定を可能にするため、固有の病変セットがタグ付けされた。簡単に言うと、1つの病変が最後の記録の位置（トラックの終端）に適用され、その後、個々のテトロ電極に固有のパターンに従って、トラックに沿って病変のパターンが行われた。
ニューロピクセルの埋め込みと記録
ニューロピクセル1.0プローブ
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プローブは、基準ピンと接地ピンをはんだ付けし、銀線を介して金ピンに接続することで準備された（後に頭蓋骨の接地ネジに連結された対応するピンに接続するため）。その後、プローブは、ヘッドステージに接続されたプローブを堅固に保持し、頭蓋骨に移植されるように設計された自作のホルダーに固定された。植え込む直前に、電極が残した軌跡を標識するために、プローブをDiIに短時間（約1分間）浸した。その後、プローブは理想的な位置として、脳表面から7.2mmの前後方向（AP）と0.5mmの内側-外側（ML）に配置された。テトロデの植え込みと同様に、AP/MLのターゲティングを微調整し、副鼻腔を避けるようにした。この時点で、プローブを下降させながらニューロピクセルの信号をモニターできるように、基準ピンをスクリューピンに接続し、ケーブルをヘッドステージに接続した。その後、プローブは表面から5.5～6.5mmまで、毎秒約5μmの速度で下降した。モニターはオフにし、ケーブルを抜いてから続行した。Kwik-castシリコンシーラント（World Precision Instrument, Sarasota, FL, USA）を用いて開頭部を密閉し、露出した電極先端を保護した。その後、ホルダーを歯科用セメント（Paladur, Heraeus Kulzer, Hanau, Germany）で固着し、マイクロマニピュレーターから離し、最後に50ml円錐遠心チューブの一部をホルダーとリファレンスピンの周囲にセメントで固着して保護した。チューブのキャップは、半分のチューブを閉じ、ラットをケージ内で自由にしている間、インプラントを保護するために使用した。ラットが動き回っている間、コネクターに張力がかからないように、ケーブルをねじって取り付けるための穴とホルダーを備えた改良型キャップを、記録用に使用した。われわれの植え込みシステムはまだ最適化が必要であり、他のシステムと比較しても遜色はない。
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最も重要なことは、我々のアプローチにより、個々のセッション中、またセッション間でも安定した記録が可能になったことである。同期のために、CED-Power1401 625 kHz（Cambridge Electronic Device、英国ケンブリッジ）に結合したSpike2を使用して非規則的なTTLトレインを生成し、Neuropixels PXIe収集モジュール、Avisoft-UltraSoundGate 116H、および両方のカメラから見えるLEDに送信した。TTLは通常100msの長さで、15～20秒のシーケンスを不規則に送信し、実験中常に繰り返された。
ユニット記録時の実験セットアップ
前述の行動パラダイム（「通常条件」）と同じレイアウトを使用した。くすぐり誘発USVを抑制することが知られている不安原性条件、
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不安誘発条件は、一定の高照度照明と昇降プラットフォーム（15 x 15 cm、高さ27 cm、図5）から構成された。行動セットアップの残りの構成要素は変更しなかった。プラットフォームは、腹側をくすぐるためにラットを仰向けにできるようにした。
組織学
動物を20％ウレタン（30 ml/kg）の過量投与で殺し、0.1 M PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で経心的に灌流した後、4％パラホルムアルデヒド溶液で灌流した。動物の頭蓋骨から脳を取り出し、4％パラホルムアルデヒド溶液に12～24時間入れ、その後0.1M PB（リン酸緩衝液）に入れた。ビブラトーム（Mikrom, HM 650 V, ThermoFisher Scientific）を用いて冠状切片（厚さ80-100μm）を得た。切片はマウントせず、蛍光像と明視野像（Leica DM 5500B）を得るためのスライドに短時間移した。明視野画像により、関心領域の境界、すなわちPAGと隣接領域およびPAGカラムを正確に定義することができた。テトロ電極で誘導された病変と電極（テトロ電極またはニューロピクセル）が残した軌跡は、ほとんどの場合、明視野画像上で識別可能であった。電極のDiIコーティングは赤色蛍光トレースを残し、これは電極トラックの位置を確認するために使用された。各セッションでは、チャンネル間の波形プロファイルによって各ユニットの位置を決定するため、テトロ電極またはニューロピクセルチャンネルを領域と前後レベルに割り当てた。領域へのチャンネルの割り当ては、主にトラックの先端からの距離、トラックに沿った各領域のスパンを測定することによって行われた。距離は個々のスライスで測定し、スライス角度に対する電極の角度に応じて補正した。収縮は、テトロ電極実験では病変間の距離を見ることで正確に補正でき、ニューロピクセル実験ではプローブに沿った生理学的信号とトラックの解剖学的構造との相関から推定した。このために、電極信号の標準偏差やスパイクの有無などの生理学的ランドマークを使用した。これらは、セッション間のドリフトなどの収縮補正を超えて、電極とトラックの最終的な位置合わせにも有用であった。例えば、水道管に位置するチャンネルは標準偏差が最も低く、白質に位置するチャンネルは灰白質よりも標準偏差が低い傾向があり、より一般的には、2つの異なる領域間の境界は、標準偏差、スパイクレート、スパイク振幅の急激な変化によって示されることが多かった（実際にはスパイク振幅をアライメントに使用したことはないが、スパイク形状のシグネチャーはそのための追加的な方法となるはずである）。
スパイクの選別
バンドパスフィルターをかけたデータ（0.3-4 kHz）またはハイパスフィルターをかけたデータ（>0.3 KHz）から、テトロ電極記録の場合はKilosort 2.5、Neuropixels記録の場合はKilosort 3を用いてスパイクを検出し、クラスタ化した（主要リソースの表参照）。検出されたクラスターは、セッション全体にわたってユニットが存在すること、スパイク振幅パターン（十分に高く、チャンネル間で異なる）、明確な不応期が存在すること（2ミリ秒以下の自己相関がないか低い）などの標準的な基準に基づいて、ノイズまたは良好に分類された。最後に、Phy2の類似性関数とスパイク波形、自己相関図、相互相関図の視覚的検査を用いてクラスタを統合した。
ユニットの包含基準
PAG内に位置するチャンネルとテトロ電極からのユニットのみを最終解析に用いた。これらのユニットには、背内側PAG（DMPAG）、背外側PAG（DLPAG）、外側PAG（LPAG）、および腹内側PAG（VMPAG）のユニットが含まれ、対象となる実験フェーズ中に1Hz以上の発火率を示したユニットが最終解析に用いられた。最終的には、5匹のラットのPAGに位置する93ユニットのうち、N=85ユニット（うち3ユニットはニューロピクセルで、2ユニットはテトロ電極で記録）を対象とした。
行動の光遺伝学的操作
ウイルスベクター
AAVベクターは、ノースカロライナ大学ベクターコア(AAV8-CAG-ArchT-GFP)またはシャリテ・ウイルスコア施設(Charité-Universitätsmedizin, Berlin)(AAV8-CAG-GFP)から入手した。ウイルス力価はAAV8-CAG-ArchT-GFPで2.5 x 1012粒子/mL、AAV8-CAG-GFPで1.05 x 1012粒子/mLであった。
ウイルス注射
3週齢の雄性Long-Evansラットを無作為にGFP対照群とArchT群に分けた。ケタミン(100 mg/kg)とキシラジン(7.5 mg/kg)の麻酔下で、両側のウイルス注射(片半球あたり300 nl)は、以下の座標を用いて外側PAGを標的とした： AP, - 6.1 mm; LM, ± 0.65 mm; DV, - 4.3 mm。注射後、ラットは視神経線維を外側PAGの上方に20度の角度で両側に移植した（AP, - 6.1 mm; LM, ± 2.7 mm; DV, - 5.1 mm）。インプラントは、アンカースクリュー、UV硬化型接着剤（Optibond All-In-One）、カリスマ（UV活性化歯科用コンポジット）、歯科用セメント（Heraeus）で頭蓋骨に固定した。ラットは、最適なオプシン発現を可能にするため、行動実験を開始する前に少なくとも4週間回復させた。
光ファイバーの埋め込み
生体内光遺伝学的操作実験用の埋め込み型光ファイバーは、コア径200μm、外径230μm、開口数（NA）0.39のマルチモード光ファイバー（Thorlabs社製、Cat No:FT200EMT）と内径230μmのセラミックフェルール（Thorlabs社製、Cat No:CFLC230-10）から作製した。
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ArchTの光刺激には、561nmのダイオード励起固体（DPSS）レーザー（MBL-FN-561-100mW、CNI Lasers、中国）を用いて561nmの黄色光を発生させた。最終的な黄色光出力は、光ファイバーパワーメーター（Thorlabs、PM100D）を用いて光ファイバー先端で10～15mWに測定・調整した。
回復と馴化
手術後、ラットは単独でケージに入れられた。くすぐり実験と荒遊び実験では、実験の3週間前から実験者と実験場に慣れさせ、1日15分間見慣れないラットとペアを組ませた。馴化実験と社会的遊び実験は80×58×30cm（長さ×幅×高さ）のアリーナで行った。くすぐり実験は43×30cmのアリーナで行った。光遺伝学的実験の1週間前に、すべてのラットはアリーナとパートナーを探索しながら、視神経パッチコードで頭を縛られることに慣れさせた。
くすぐりと遊びの間の光遺伝学的抑制
試験中、ラフ・アンド・タンブル・プレイ・セッションは380秒間続いた。黄色光刺激プロトコルは1401デジタイザーでトリガーし、Spike2ソフトウェア（Cambridge Electronic Designs, Cambridge, UK）で制御した。一定の光刺激期間（10秒）と無刺激期間（40秒）を含む刺激サイクルを、1セッションにつき6回適用した。この処置の間、LPAGは片側または両側に抑制された。くすぐり実験では、背側くすぐり、腹側くすぐり、追手を5～7秒間行い、それぞれの行動の間に7秒間のベースライン期間を設けた。このシーケンスを各実験で5回または10回繰り返した。ライトは2回目のトレイルごとにくすぐり中に作動させた。ビデオとUSVの記録は、ムッシモール・ブロッキング実験と同様に行った。ELAN 6.1ソフトウェア
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およびDeepSqueakを、それぞれ遊び行動およびUSVの解析に使用した。
光遺伝学的に操作したラットの社会的遊び行動は、以下の行動パターンの持続時間を評価することで評価した： パウンシングとパウンシングされること、ピンニングとピンニングされること、ボクシング。
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パウンシングとは、一方の動物が相手の背側に突進しようとすることであり、ピンニングとは、一方のラットがもう一方の動物をひっくり返してその上に立つことである。
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Boxingは両方のラットが後ずさりしながら素早く押し合い、前足で突くと定義した。PouncingとBeing-Pouncedの両方を「Pounce」、PinningとBeing-Pinnedの両方を「Pin」とし、Pounce、Pin、Boxの合計で社会的遊び行動を評価した。
組織学
ウイルス標的化および視神経線維の位置の事後検証のため（図7）、蛍光顕微鏡Leica DM5500（対物レンズ5倍）で画像を撮影した。ラットが側方PAG内でウイルスの発現を示さなかった場合、および光ファイバーの先端の位置が側方PAGから500μm以上離れていた場合は、解析から除外した。さらに、それぞれの冠状スライスは、まずラット脳アトラス中の最も近い対応する冠状スライスに帰属させた
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の最も近い対応する冠状スライスに帰属させた。
定量化と統計解析
すべての定量化と統計解析は、特に断りのない限りMATLABを用いて行った。
個々のユニットについて、ある行動中の発火率は、その行動のさまざまなインスタンスを通して発生したスパイクの合計を、その行動の合計持続時間（すなわち、さまざまなインスタンスの持続時間の合計）で割ったものとして計算した。ベースライン時と休憩時も同様に算出し、ベースライン時と休憩時の加重平均としてベースライン／休憩率を算出した。
各行動について、ベースライン／休憩率に対する反応指数（RI）を以下のように算出した：

rbehaviorは行動中の発火率（Hz）、rbaseline/breakはベースライン／ブレーク中の発火率（Hz）です。RIは両者が同じであれば0に等しく、行動中にセルが抑制されると-1、行動中にセルが活性化すると+1の傾向を示す。RIが+0.33の場合は2回増加、-0.6の場合は4回減少を示す。
図に示したイベント前後のスパイクヒストグラムは、イベントのオンセットで整列させ、各ビンのスパイクカウントを平均し、ビンのサイズ（秒）で割ってグラフを正規化（Hz）したものである。遊びやくすぐりのイベント／行動の性質上、イベントの長さは必ずしも同じではないことに注意してください。これらのプロットでは、1.5秒より長いイベント／行動のみを対象とした。図では、イベント前後のヒストグラムの時間スパン（x軸）は、より長かったり短かったりするイベントがあったとしても、わかりやすくするために通常4秒に制限した。図6とS3のスパイク・パーイ・コール・オンスセット・ヒストグラムは、ビン幅10msで作成し、50msの一様カーネルを用いて平滑化した（50msの移動平均）。
特定の行動に対する単一ユニットの反応（背側ジェントル・タッチ、背側くすぐり。腹側くすぐり、追いかけ手；図2、3）に対する単一ユニットの反応を、ベースライン／ブレイク期間中のベースライン・レートと比較し、細胞ごとに統計的に検定した。実際の一連の行動ウィンドウ中の発火率が、同じ行動ウィンドウをベースライン／ブレイク期間に位置づけ、そこから計算された発火率の分布とどう比較されるかを検証した。そのために、ベースライン／ブレーク期間はすべて1つの巨大な擬似ベースライン／ブレークフェーズに連結され、その中に与えられた行動からのX個のウィンドウがランダムに配置され、ベースライン／ブレークのサブレートが計算された。これを1000回実行してレートの分布を生成し、与えられた動作中の実際のレートの順位を決定した。その順位が97.5パーセンタイルより高ければ、発火率はベースライン／ブレイクより有意に高いとみなされ、順位が分布の2.5パーセンタイルより低ければ、発火率は与えられた行動によって有意に抑制されているとみなされた。
背側ジェントル・タッチ、背側くすぐり、腹側くすぐりに対する絶対反応指数の分布が異なるかどうかを判定するために、フリードマン検定に続いて補正p値（ボンフェローニ補正：有意にするために必要なp値を検定数で割る、つまりここでは3）を用いたポストホック・ウィルコクソン検定を用い、差の有意性を判定した（図2）。
PAGの4列にクラスターが不均一に分割されているかどうかを検定するために、χ2.検定を実行する。次に一連のフィッシャーの正確検定を実行し、あるクラスターのある列への非ランダム分布を、他のすべてのクラスターおよび他のすべての列を合わせた分布と比較して評価する。我々の統計的アプローチは多くの組み合わせ（20）を必要とするので、p値の昇順で検定結果をランク付けし、0.05より低い加算p値を導く最初のものだけを有意とみなした（n = 6、表S1参照）。この方法は必ずしもすべての非ランダム分布パターンを示すわけではないが、最も顕著なものを明らかにした。
ウィルコクソンの符号付き順位検定は、一対のオブザベーションの2つのグループを比較するために使用され、多重比較の場合、p値は、ボンフェローニ補正、すなわち、有意性に必要なp値（＊0.05、＊0.01、＊＊0.001）をその分析で実行された検定の数で割ることによって補正された。
社会的遊び実験の統計解析は、GraphPad Prism, Version 8を用いて行った。対照群とArchT群間の群間差は、社会的遊びのパラダイムについては二元配置分散分析（way-way ANOVA）の後にボンフェローニ（Bonferroni）ポストホック検定を、くすぐり中のUSVの分析については対のt検定を用いて検出した。P < 0.05を統計的に有意とみなした。
データとコードの利用可能性
図データはMendeley Data: https://doi.org/10.17632/chnfyfd2k9.1。
すべてのオリジナルコードはMendeley Data: https://doi.org/10.17632/chnfyfd2k9.1。
その他の情報については、要請があれば研究責任者から入手可能である。
謝辞
本研究は、Humboldt-Universität zu Berlin, Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlin, NeuroCure Cluster of Excellence (Exc49-390688087), Einstein Center for Neurosciences Berlin, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP 1665, BR 3479/12-1, and SFB1315), and the European Research Council (BrainPlay ERC Synergy Grant)の支援を受けた。動物の行動イラストを提供してくださった石山晋平氏に感謝する。Konstantin Hartmann、Andreea Neurkirchner、Undine Schneeweiß、Tanja Wölk、Maik Kunert、Arnold Sternの各氏には、卓越した技術的サポートをいただいた。
著者の貢献
構想、J.S.、N.G.、E.M.、D.S.、M.B.、方法論、J.S.、N.G.、W.T.、M.C.-M.、A.D.、調査、N.G.、J.S.、W.T.、M.C.-M.、A.D.、形式分析、J.S.、N.G.、W.T.、可視化、J.S、 可視化、J.S.、N.G.、W.T.、執筆、J.S.、M.B.、N.G.、W.T.、査読・編集、N.G.、J.S.、W.T.、M.C.-M.、E.M.、A.D.、D.S.、M.B.、監修、M.B.、リソース、M.B.、D.S.、資金獲得、M.B.、D.S.。
利益申告
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
インクルージョンと多様性
私たちは、包括的で多様かつ公平な研究実施を支持する。
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資料S1. 図S1-S4および表S1
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グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
出版 2023年7月28日
受理 受理：2023年6月22日
改訂版受理 2023年5月16日
受理：2023年5月16日 2022年6月16日
出版段階
インプレス、修正校正
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.06.018
著作権
© 2023 The Authors. 発行：エルゼビア社
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図表
グラフィカルアブストラクト
図1ムッシモールを用いた脳橋周囲灰白質の全体的遮断は、くすぐりや遊びを妨げる。
図2触覚とくすぐりによって誘発される声、および声帯周囲灰白質の興奮性・抑制性神経反応。
図3遊びは声調と興奮性神経反応を誘起する。
図4遊びと腹部のくすぐり反応は、側頭葉周囲灰白質のカラムに系統的にマッピングされ、遊び／くすぐり興奮は側頭葉カラムに優位に存在する。
図5強く遊び／くすぐりに興奮したクラスターからのユニットは、不安原性条件下では変調が少ない。
図6強い遊び／くすぐり興奮を示す声帯周囲灰白細胞は発声前と発声中に強い反応を示す。
図7側枝の光遺伝学的抑制はくすぐりや遊びを妨害する。
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