Candida glabrata由来β-(1,3)-グルカン合成酵素のクライオ電子トモグラフィーを用いた予備的構造解明の試み
Candida glabrata由来β-(1,3)-グルカン合成酵素のクライオ電子トモグラフィーを用いた予備的構造解明の試み
で
クリスティナ・ヒメネス＝オルティゴサ
1,,†,
ジェニファー・ジァン
2,3,†,
陳 武淵
4,
桑 旭苑
2,3,5,
ケリー・R・ヒーリー
6,
ポール・カステラーノ
2,3,
Nikpreet Boparai
2,3,
スティーブン・J・ルドケ
4,
デビッド・S・パーリン
1と
ウェイ・ダイ
2,3,
1
Hackensack Meridian Health-Center for Discovery and Innovation, 111 Ideation Way, Nutley, NJ 07110, USA（アメリカ
2
ニュージャージー州立大学ラトガース校細胞生物学・神経科学科（604 Allison Road, Piscataway, NJ 08854, USA
3
ニュージャージー州立大学ラトガーズ校定量生物医学研究所（174 Frelinghuysen Road, Piscataway, NJ 08854, USA
4
ベイラー医科大学生化学・分子生物学科、1 Baylor Plaza、ヒューストン、テキサス州77030、米国
5
中南大学高気圧酸素学科、長沙410008、中国
6
ウィリアム・パターソン大学生物学部（300 Pompton Road, Wayne, NJ 07470, USA
*
著者名：Authors who correspondence should be addressed.
†
これらの著者はこの仕事に等しく貢献している。
J. Fungi 2021, 7(2), 120; https://doi.org/10.3390/jof7020120
受理されました： 2020年12月4日／改訂：2021年2月1日／受理：2021年2月2日／掲載：2021年2月6日
(本論文は、特集「抗真菌薬開発における構造生物学の応用」に属しています。）
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アブストラクト
エキノカンディン系薬剤は、Candida glabrataのようなアゾール耐性菌の感染率の上昇に伴い、Candida属感染症に対するフロントライン治療薬となった。エキノカンディンは、細胞膜に存在し、真菌の細胞壁の主要成分であるβ-(1,3)-グルカンの生合成を触媒する真菌特異的酵素であるβ-(1,3)-グルカンシンターゼ（GS）を標的とします。しかし、GSの触媒サブユニットのホットスポット変異に起因するエキノカンディン系薬剤への耐性が新たな問題となっている。このため、細胞壁形成の主要な生合成装置であり、重要な創薬ターゲットであるGSの理解は不十分であった。本研究では、クライオ電子線トモグラフィー（cryo-ET）とサブトモグラム解析により、C. glabrataの推定GS複合体の六量体クラスターの予備構造を明らかにし、それぞれのサブユニットがN末端と中央の触媒ドメインという二つの注目すべき細胞質ドメインを有していることを明らかにした。本研究は、この難解なタンパク質複合体の構造的・機能的研究の基礎を築き、真菌の細胞壁合成に関する知見や、より有効な抗真菌薬の開発を可能にするものである。
キーワード
Candida glabrata；グルカン合成酵素（GS）；クライオ電子線トモグラフィー（cryoET）
はじめに
侵襲性真菌症は公衆衛生上の重大な脅威となっており、世界で10億人以上が感染し、年間110万人以上が死亡しています。Aspergillus属、Candida属、Cryptococcus属の菌は、最も一般的なヒトの病原真菌であり、侵襲性・表在性の様々な真菌感染症を引き起こす。喘息、後天性免疫不全症候群（AIDS）、糖尿病、癌、臓器移植、コルチコステロイド療法の使用などの健康状態は、侵襲性疾患の重要な危険因子である。侵襲性真菌症の治療には、適時適切な抗真菌剤治療が不可欠である[1,2,3,4]。
真菌の細胞壁は、成長、生存、真菌の形態形成と病原性、浸透圧や機械的ストレスからの保護に必要な大規模なリモデリングを受ける必須の動的構造である。真菌の細胞壁には哺乳類に匹敵するものがないため、新しい抗真菌療法の優れたターゲットとなっています[5]。真菌の細胞壁は、多糖類とタンパク質が互いに共有結合で架橋した複雑なマトリックスで形成されており、キチンやβ-(1,3)-グルカンからなるより構造的で均一な内層と、成長段階や真菌の種類によって組成が異なるより不均質な外層に分かれています [6] （図1）。β-(1,3)-グルカンは、真菌細胞壁の最も豊富な構造成分であり、触媒サブユニットが細胞膜に埋め込まれた酵素複合体によって合成され、おそらく新しく合成された直鎖状のβ-(1,3)-グルカン鎖を細胞壁に押し出す孔として働き、集合してさらに修飾される [7] 。
図1. (A)走査型電子顕微鏡および(B)透過型電子顕微鏡で見たCandida glabrata細胞（CW = 細胞壁）。(B）キャンディダ属の真菌細胞壁の主要成分の構成と組織を模式的に示したもの（図は[6]より引用）。
Candida glabrataは、広く使用されているアゾール系抗真菌薬に対する耐性を獲得する能力があるため、米国の多くの臨床現場で生命を脅かす真菌感染症の一般的な原因として浮上してきた[8]。そのため、エキノカンディン系抗真菌薬（カスポファンギン、アニデュラファンギン、ミカファンギン）は、現在、C. glabrataおよびその他のカンジダ種に対する好ましい第一選択療法となっています[9]。これらの薬剤は、β-(1,3)-グルカンの生合成を担う酵素複合体β-(1,3)-グルカン合成酵素（GS）の触媒サブユニットを阻害することにより細胞壁の完全性を変化させます [10]. エキノカンディン耐性は依然として稀な事象であるが、臨床使用の増加に伴い増加傾向にあるようである[11,12]。エキノカンジンに対する感受性の低下は、GSの触媒サブユニットをコードするFKS1およびFKS2遺伝子の高度に保存されたホットスポット領域のアミノ酸置換と関連している [13]．細胞壁の生合成に重要な役割を果たし、創薬ターゲットとして高い評価を得ているにもかかわらず、糖鎖分解酵素複合体はこれまで精製が難しく、その全体的な立体構造やβ-（1,3）-グルカン合成の構造メカニズムに関する知見は限られている [14]. したがって、重要な生合成装置としてのグルカンをよりよく理解するためには、直接的な構造情報が必要である。
膜タンパク質は様々な細胞機能において普遍的な役割を担っているにもかかわらず、これらのタンパク質のサンプル精製は、その構造を解明するための重要なボトルネックとなっている。従来の構造解析技術では、目的のタンパク質を本来の環境から抽出するか、ナノディスクやリポソームで膜タンパク質を再構成する必要がありました[15,16,17]。特に精製や結晶化が困難な膜タンパク質の構造解析には、クライオ電子トモグラフィー（cryo-electron tomography: cryoET）が推奨されるようになった[18,19]。クライオETの利点の一つは、細胞景観を直接可視化し、様々な生物の生体分子や高分子機械の構造ダイナミクスや空間構成を、本来の環境下で決定できることである[20,21,22]。cryoET技術とサブトモグラム平均化の進歩により、酵母細胞における構造探索と細胞プロセスの詳細な特徴付けが可能になりました[23,24,25]。ここでは、クライオETとサブトモグラム解析を応用して、C. glabrataの推定GS複合体の構造と空間分布を明らかにする。材料と方法
2.1. 歪み
Candida glabrata 2001/CBS138 および 200989（CBS138 his-/trp-/ura-） 株は American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA, USA）から入手し、FKS1 遺伝子ノックアウト株（200989△fks1：： ScURA3）は S. Katiyar（Drexel University College of Medicine）から贈られた [26]. C. glabrata FKS1 を構成的に発現させるために、[27]に記載されているようなギャップリペアアプローチが使用された。プラスミドpCN-PDC1（nourseothricin耐性マーカー、強力なプロモーター（PDC1）およびC. glabrata CEN/ARSを含む）［28］をEcoRVで線形化し、アルカリホスファターゼ（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）により処理した。FKS1のコード領域は、EcoRV制限部位の両側に相同なオーバーハング領域を含むプライマーを用いて増幅された（表1）。次に、コンピテント酵母細胞を、精製したPCR産物およびEcoRV直線化pCN-PDC1で共形質転換した。形質転換後、細胞をYPDブロスで3時間伸長させ、その後100μg/mLノルセオトリシン（Jena Bioscience, Jena, Germany）を添加したYPD寒天培地で選択した。すべての形質転換体は、構築物の存在についてPCRでスクリーニングし、その後、FKS1遺伝子のインサート全体を配列決定して野生型の配列を確認した（プライマーは表1参照）。プラスミド（pFKS1）からの適切なFKS1発現を確認するため、∆fks1形質転換体は、FKS2阻害剤であるFK506（Invivogen, San Diego, CA, USA）に対する感受性についてもスクリーニングされた。FKS1 を発現する細胞は FK506 耐性を示すが、∆fks1 親細胞は感受性を示す [26]。コントロールとして、野生型および∆fks1細胞もまた、空ベクターで形質転換した。
表 1. 本研究で使用したオリゴヌクレオチド。
2.2. RNA 抽出と定量的 RT-PCR
細胞はYPDまたは100 µg/mLのnourseothricinを添加したYPD（プラスミド保有株）で対数期半ばまで培養した。RNeasy Mini kit（Qiagen Science, Germantown, MD, USA）を用いて、製造者の説明書に従って全RNAを抽出し、-80 ℃で保存した。RNAの濃度と純度は、UV分光光度計（NanoDrop One; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて、230（OD230）、260（OD260）、280nm（OD280）での吸光度を測定することにより決定した。RNAの完全性は、1％変性アガロースゲルと非変性アガロースゲルを通した電気泳動によってさらに確認された。FKS1およびFKS2の発現レベルは、RT-PCRによって測定した。
すべてのqPCR反応は、12.5μLの2X One Step RT-PCRバッファー（One Step SYBR Ex Taq qRT-PCR kit；TaKaRa Bio Inc、 Mountain View, CA, USA）、各プライマー0.2μM、Takara Ex Taq HS（5 U/μL）、RT Enzyme Mix 0.5 μL、RNA（5 ng/μL）2μLをMx3005Pリアルタイム装置（Stratagene、La Jolla, CA, USA）で行った。最適な熱サイクル条件は、逆転写のための42 °C、5分、続いて95 °C、10秒の初期変性ステップ、95 °C、5秒（変性）、60 °C、20秒（アニーリングおよび伸長）の40サイクルからなる。実験は、各データポイントについて3連で実施した。遺伝子発現における相対定量は、正規化のために遺伝子RDN5.8の発現量を用いて2-ΔΔCt法[29]で決定した[30]。使用したプライマーは、表1に示す。
2.3. ウェスタンブロッティング
Fks1発現レベルは、以下の菌株CBS138、200989△fks1、200989＋pCN-PDC1-FKS1および200989△fks1＋pCN-PDC1-FKS1から、先に記載したようにウェスタンブロット分析によって全細胞抽出液中で決定した［31］。ブロットしたタンパク質を、抗Fks1一次抗体（GenScript Biotech, Piscataway, NJ, USA）と共に、2％TBST中1：5000の希釈度で4℃、16時間インキュベートした。洗浄した膜を、1:3000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（抗ウサギ；Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA）と1時間インキュベートした。バンドは、製造者の指示に従ってNovex ECL Chemiluminescent基質 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) で可視化した。
2.4. 濃縮血漿膜分画の単離
CBS138株（野生型、WT）および200989 ∆fks1 + pCN-PDC1-FKS1 （KH238）株から濃縮細胞膜フラクションを単離した。プラスミド保有株はYPD（酵母エキス1％、ペプトン2％、デキストロース2％）または100μg/mLノルセオトリシン添加YPDで、対数期半ばまで培養した。遠心分離により細胞を回収し、水で2回洗浄した後、1% ß-メルカプトエタノール（MilliporeSigma, Burlington, MA, USA）を用いて30℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を水で2回洗浄し、バッファーS（1Mソルビトール、10mM HEPES、pH 6.5）に再懸濁した。細胞壁を除去してプロトプラストを生成するために、Trichoderma harzianum（MilliporeSigma, Burlington, MA, USA）由来の溶解酵素をバッファSに加え、穏やかに振とうしながら室温で一晩インキュベートした後。プロトプラストの発生を顕微鏡で観察し、少なくとも90%の細胞が細胞壁を欠いていることを確認した。プロトプラストを遠心分離で集め、ホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤カクテル（MilliporeSigma, Burlington, MA, USA）を添加したPBS1Xで2回洗浄して溶解し、次に、1段階のスクロース勾配にロードした。精製された細胞膜は、SW41ローター（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）で39,000rpmで3時間遠心した後、1mM EDTA、1mM DTT、10mM Tris (pH 7.0) を含むステップグラジエントの53.5-43.5%（wt/wt）スクロース界面で回収されました。膜を50.2 Tiローター（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）で39,000rpmで1時間洗浄し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含むPBS1Xに再懸濁し、4℃で保存後、凍結電子顕微鏡での可視化前にプランジ冷凍した。
2.5. EMグリッドの調製
野生型およびKH238株から得られた濃縮細胞膜画分には、画像処理中の傾斜系列整列を容易にするためのフィデューシャルマーカーとして6 nmの金粒子を混合した。抽出した細胞膜サンプルの3.5μLのアリコートを、湿度（95％）と温度（20℃）を制御したチャンバー内でLeica EM GPプランジャー（Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA）を用いてガラス化する前に、グロー放電されたQuantifoilホーリーグリッド（R2.0/1.0、Cu、200メッシュ; Quantifoil）へ適用した。プランジ凍結したグリッドは、イメージングまで液体窒素デュワーフラスコで保管した。
2.6. トモグラフィーのデータ収集
試料の画像と傾斜系列は、ポストカラムBioQuantumエネルギーフィルター（スリットは20eVに設定）およびK2直接電子検出器を備えた200kVで動作するTalos Arctica低温電子顕微鏡（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）で収集した。自動データ収集は、SerialEM [32]を用いて、以下の条件で実施した： 49,000倍の顕微鏡倍率、スポットサイズ8、100μmのコンデンサー開口、デフォーカス範囲-5--3μm。画像画素サイズは2.73Å/pixelであった。チルトシリーズは-69°から69°まで、3°ステップ刻みで行った。野生型とKH238株の細胞膜の合計625および272の傾斜系列を、60-80e-/Å2の累積線量でカウントモードで収集しました。各傾斜角において、露光中のステージドリフトとビームによる動きを補正するために、10枚の線量分画フレームを収集した。野生型酵母の細胞膜の傾斜系列のサブセットは、パデュー大学のThermo Fisher Titan Krios顕微鏡から42,000倍の顕微鏡倍率で収集し、Volta位相板で-0.5μmにデフォーカスした。画像ピクセルサイズは2.80Å/pixelであった。このサブセットは、対称性解析と予備的な構造解析のための初期モデルの生成に使用された。
2.7. トモグラフィーのデータ処理
各傾斜シリーズの動画フレームは、UCSF MotionCor2 [33]を用いて位置合わせを行った。モーション補正されたチルトシリーズのアライメントと断層像の再構成は、最新のEMAN2トモグラフィワークフロー[34]を用いて実施した。野生型細胞膜の場合、強い画像コントラストと検出可能なリング状構造を持つ断層像を選択し、その後のサブトモグラム平均化と解析を行った。これらの選択された断層像から、1283ピクセルのボックスサイズを使用して、〜50個の抽出された粒子からde novo初期モデルが生成された。デノボ初期モデルの等方的な解像度を達成するために、膜の特徴に関連した推定GS構造の側面図を持つサブボリュームのサブセットは、グリッド上の膜形状による粒子の好ましい向きを補償するために含まれました。EMAN2参照なし初期モデル生成ルーチンを、対称性を指定しない状態で5回繰り返した。対称軸へのアライメントを行った後、1818個の粒子からなるより大きなデータセットを用いたサブトモグラムの精密化に、初期モデルを使用した。構造的な対称性を評価するために、最初の平均マップに対して回転相互相関分析を行った。係数の2Dプロットでは、C6対称性を示す特徴的なピークが示された。サブトモグラムの精密化と平均化の際にC6対称性を指定して、2回目の精密化を実施した。
Fks1過剰発現細胞から単離された血漿膜は、より大きなリング状構造をより多く含んでいた。サブトモグラムの平均化のために、より大きな5108個の粒子セットを抽出した。1683ピクセルのボックスサイズで、上記と同様のサブトモグラム平均化と解析手順を行い、データセット全体の独立した半分の密度マップのフーリエシェル相関（FSC）により、14Åのグローバル分解能を持つ最終マップを作成した[35]。
3Dマップとサブユニットの可視化、セグメンテーション、ドメイン解析は、Chimera（University of California, San Francisco）[36]を使って行った。
2.8. GSの空間分布の解析
250個以上の推定GS粒子を含むトモグラムは、クラスター内の推定GS複合体の空間分布を評価するために使用された。複合体の中心の座標は、その後の最近接解析に使用された。推定GS複合体のクラスター内では、粒子の最近傍は最短直線距離の粒子と定義された。最近傍距離は、粒子の中心から最近傍の中心までの距離として計算された。2次元平均解析のために、推定GS複合体のパッチを含む183のサブトモグラムを2563ピクセルのボックスサイズで抽出し、高周波ノイズを除去するために30Åローパスフィルターを適用した。これらのタンパク質複合体クラスターの3Dサブトモグラムの投影を用いた参照不要の2D精密化により、2D平均を作成した。ユニットセルの注釈は、EMAN2で利用可能な測定機能を用いて行われた。結果
3.1. C. glabrataプラズマ膜におけるリング状構造の2つの集団の同定
C. glabrataの細胞膜に存在するタンパク質構造を調べるために、まずプロトプラスト（浸透圧的に安定な液体栄養培地で培養すると生存可能で、新しい細胞壁を合成して通常の表現型に戻ることができる細胞壁のない酵母細胞）を作成しました。C. glabrata野生型株CBS138のプロトプラストから、スクロース勾配で濃縮した細胞膜画分を採取し、これらの膜断片を低温電子顕微鏡Talos Arcticaを用いて画像化しました。これらのクラスターは、細胞膜上に不均一に分布し、主に大きな膜領域でパッチ状に見られた（図2A、C、青矢印、補足動画S1）。さらに、直径125Åの小さなリング状の構造も、頻度が低く、より緩やかなクラスターで観察された（図2B,D；ピンクの矢印、および補足動画S2）。小さなリングは、大きなリング状構造に比べて著しく少なく、全断層像の1%未満で検出された。
図2. 低温電子顕微鏡（cryo-electron tomography）により、Candida glabrata CBS138株の細胞膜に2つのリング状構造物が見つかった。(A)直径170Åの大きなリング状構造が緩く詰まったクラスターを持つ細胞膜のスライス図。(B) 125Åの小さなリング状構造を示す代表的な断層像のスライス図。電子密度の高い粒子は金のフィデューシャルである。(C) (A)で囲った大きなリング状構造（青矢印）の拡大スライス図。(D) (B)で囲った小さなリング状構造(ピンクの矢印)を拡大したスライス図。
この大小のリング状構造が、未知のβ-(1,3)-グルカン合成酵素(GS)に相当するかどうかを調べるために、FKS1遺伝子を構成的に発現する株を作成した。まず、プラスミドpCN-PDC1-FKS1を持つ株が本当にFKS1遺伝子を過剰発現していることを確認するために、FKS遺伝子の発現量を測定した。ログ成長期中期に採取した細胞からRNAを単離し、FKS1およびFKS2 mRNAのレベルを野生型株CBS138および200989のそれと比較した。その結果、プラスミドを含む200989＋pFKS1株および200989 Δfks1＋pFKS1 株のFKS1の発現量は、両野生型株の発現量と比較してそれぞれ3倍および4倍増加することが確認された。また、FKS2の発現量もプラスミド含有株では2倍増加し、ノックアウト株で観察されたレベルと同様であった（表2）。ウェスタンブロット解析の結果、プラスミドを保有する株は、野生型株と比較して、Fks1タンパク質をより多く含んでいることがわかった（図3A）。さらなる解析には、200989 Δfks1 + pCN-PDC-FKS1 (KH238) 株を使用しました。
図3. Candida glabrataのFks1過剰発現株における大きなリング状構造。(A) Fks1の発現量。異なる菌株のC. glabrata細胞を液体YDP上で100 μg/mLのnourseothricin添加（プラスミド保有株）または無添加でログ期中期まで培養し、TCA法でタンパク質を抽出した。 pFKS1 = pCN-PDC-FKS1、KH238株 = 200989 Δfks1+ pFKS1. (B）野生型株由来の大きなリング状構造（青矢印）のパッチを示す代表的な断層像のスライス図。(C）Fks1過剰発現株（KH238）の膜における大きなリング状構造のスライスビュークラスター（オレンジ矢印）。(D) KH238株（橙色）と野生株（青色）のクラスター内の大きなリング状粒子の最近接距離を示すヒストグラム。(E) 大きなリング状構造からなる半結晶配列の2次元平均値。
表2. 野生型株CBS138および200989と比較したFKS遺伝子の発現プロファイリング。
Fks1の過剰発現により、大小のリング状構造の存在量や分布が変化するかどうかを調べるため、Fks1過剰発現株（KH238）から収集した断層写真を評価し、野生型サンプルのデータと比較しました。注目すべきは、KH238株では野生型と比較して大きなリング状構造の相対量が著しく増加したことである（図3B、青矢印；図3C、オレンジ矢印、および動画S3）。Fks1過剰発現形質膜から収集した断層像の約22%は、大きなリングのクラスターを含んでいた。また、Fks1の過剰発現により、クラスター内の大きなリング状構造のパッキングがシフトしていた。ニアレストネイバー解析の結果、野生型細胞の細胞膜では、クラスター内の大きなリング状構造は、240Åに明確なピークを持つガウス分布に従う2次元分布を形成していた（図3D；青）。Fks1の過剰発現により、これらのタンパク質クラスターの組織は、180Åにピークを持つ狭い分布へと変化した（図3D；オレンジ）。これは、これらの大きなリング状密度の測定直径（~170Å）よりもわずかに大きい。これらのクラスターのパッチを2次元平均化すると、大きなリング状構造の半結晶配列パッキングが確認され、隣接する複合体の間隔が最小であることがわかった（図3E）。以上のことから、生化学的および構造学的データから、これらの大きなリング状の構造は、推定されるGS複合体であることが示唆された。
3.2. サブトモグラム平均法によるグルカン合成酵素複合体の構造決定
さらに、推定GS複合体のドメイン構成を調べるために、野生型とKH238株の細胞膜から抽出した粒子でサブトモグラム平均化（図S1）を実施した。野生型とFks1-overexpressing細胞からの2つの3Dサブトモグラム平均の間の全体の形態は似ている（図4A、B）。KH238株の膜からの推定GS複合体の高解像度マップは、フーリエシェル相関（FSC）により決定された〜14Åで分解され（図4C）、タンパク質複合体の存在量が高いために得られた。
図4. グルカン合成酵素（GS）複合体の構造解析。(A) 野生型 (A) -灰色およびKH238 (B) -紫色の細胞膜からの推定GS構造の等値面、上面図。(C) Fks1過剰発現株からの推定GS複合体のサブトモグラム平均のフーリエシェル相関（FSC）による解像度評価。(D) Fks1過剰発現株のサブトモグラム平均の局所分解能評価の上面図（左）と切断面図（右）。(E) Fks1-overexpress株の推定GS密度マップを分割した上面図（左）および側面図（中央）。複合体の単量体ユニットにおける細胞質側のN末端と中央の触媒ドメインはそれぞれピンクと青で注釈されている。
推定されるGS複合体は、直径62Åの中央孔を持つC6対称性を示す（図4B, Movie S4;)．局所分解能マップから、複合体の全体的なコンフォメーションは、中央ドメインの上部領域を除いて、比較的安定で硬い（図4D; 赤）。6量体複合体の各単量体ユニットは、片側に向かって突出した2つの膜外ドメインを明確に示していた（図4E）。Saccharomyces cerevisiaeのFks1タンパク質のトポロジーモデル[14]に基づいて、これらの2つのドメインは、それぞれ細胞質、N末端（図4E、動画S4；ピンク）および中央触媒ドメイン（図4E、動画S4；青）として割り当てることができます。N末端ドメインが球状コンフォメーションをとるのに対し、より大きな中央ドメインは、トップ球状ドメイン、ネック領域、およびタンパク質複合体を下層の膜に接続する基底ドメインによって定義されている。GS複合体の隣接するモノマー間の相互作用は、N-末端ドメインの先端領域と中央の触媒ドメインから伸びる密度によって媒介されているようである。複合体の中心孔は、中央触媒ドメインの基底領域によって形成されている。グリッド上の細胞膜の形状は、優先的に配置されるため、断層写真ではサイドビューの数が少なくなっています。その結果、GS複合体の膜貫通ドメインの解像度は低くなっている。考察
グルカン合成酵素（GS）は、真菌類に不可欠でユニークな酵素であることから、抗真菌治療の理想的なドラッグターゲットである。このことは、エキノカンジン系薬剤の臨床的成功によって証明されている。しかし、40年以上にわたる熱心な研究にもかかわらず、GS複合体の構造を解明するための大きな進歩はなく、基本的な可溶化と生成物の封じ込めを超えることはできませんでした [7] 。酵素活性の強化にもかかわらず、真菌のGSを精製して構造に基づく研究を進めたという報告はない。今回、我々は、細胞構造、特に膜タンパク質をネイティブな状態で3D可視化する強力な技術であるcryoETを用いて、病原体Candida glabrataの推定GS複合体の初期構造を説明する最初の研究を発表した。
濃縮された細胞膜画分から収集したトモグラムは、プロトプラスト形成後の野生型とFks1過剰発現株（KH238）の両方で、パッチ状に分布するリング状の構造体のクラスターを示した。プロトプラストは、浸透圧を安定化させる液体栄養培地で培養すると、新しい細胞壁を合成し、正常な細胞に戻ることができる。細胞壁の再生は、細胞表面に敷き詰められたキチンやß-(1,3)-グルカンのミクロフィブリルの形成から始まる [37]. 私たちの研究室のこれまでの研究で、細胞壁の再生は、断層写真で観察されるクラスターの分布パターンと一致する、細胞膜全体に局在する明確な電子密度の高い領域（および図5）で起こる可能性があることが示された。
図5. (A)対数期で増殖したCandida glabrata CBS138株の透過型電子顕微鏡写真。黄色の矢印は細胞膜を示す。CW＝細胞壁。(B）細胞壁を酵素で除去した後のC. glabrataプロトプラスト、（C）90分後のYPD液体培地＋ソルビトール1M中でのC. glabrataプロトプラストの再生。オレンジ色の矢印は、細胞壁の新しい成分の合成が行われる可能性がある、細胞膜の電子密度の高い領域を示している。パネルBとCのサイズバーは同じである。
サブトモグラム平均化の結果、推定されるGS複合体はC6対称性を示し、酵素複合体が6量体構造であることが示唆された。C. glabrataには、GSの触媒サブユニットをコードする2つのFKS遺伝子があり、これらは88%の配列同一性を持ち、機能的には冗長である[26]。Fks1またはFks2の触媒サブユニットは、細胞膜において類似した構造とオリゴマー状態をとる可能性があるため、GS複合体はFks1またはFks2の触媒サブユニットと構成的に異質である可能性がある。現在のサブトモグラム平均の分解能は、2つのタンパク質パラログ間のコンフォメーションの違いを認識するために必要な原子レベルの詳細を解決するには十分ではありません。
我々の構造モデルでは、GS複合体の各モノマーは、以前の研究[14]に基づいて、それぞれ437アミノ酸と660アミノ酸からなる細胞質N末端と中央触媒ドメインとして割り当てられる2つの膜外ドメインを含むことがわかった。さらに、両ドメインの先端領域から伸びる密度が観察され、隣接するモノマー間の相互作用が示唆されました。S.cerevisiaeでは、N末端ドメインの変異によりβ-(1,3)-グルカンの合成が阻害され、中央ドメインの変異によりGSの触媒活性が失われることから、細胞壁生合成に必要な複数の機能ドメインから構成されていると仮定されている[38,39]。我々は、細胞質ドメインの両方が互いに、また複合体の隣接するモノマーのドメインと相互作用して、β-(1,3)-グルカンの新生鎖を形成していると推測している。
高等植物のセルロース合成酵素に関する最近の論文では、セルロース原繊維は3量体セルロース合成酵素複合体の個々のモノマー内の直径10-15Åの狭いチャネルから押し出されることが提案されている [40]。今回のサブトモグラムによる推定GS六量体の平均では、中央の触媒ドメインは固体密度として解像され、両側には明らかな開口部や出口はない。この解像度では、各モノマーにチャネルが存在するのか、あるいはチャネルがグルカン原線維を収容するのかどうか判断できない。これらの推定GS複合体の中心では、6つのFksモノマーの中央触媒ドメインの基底領域が直径62Åの膜貫通孔を形成している。グルカン合成の基礎となる押し出し機構を明らかにするためには、基質結合ポケットと触媒アミノ酸の位置を明確にした複合体の原子分解能マップが必要である。
今回のC. glabrataの予備的な構造解析は、かつて捉えどころのなかったグルカン合成酵素複合体の探索を可能にするものであり、今後さらに構造・機能解析を進め、細胞壁合成におけるグルカンの意義、現在の抗真菌薬と酵素の相互作用について理解を深め、より有効な抗真菌治療戦略の開発に貢献する。
補足資料
以下は、オンライン（https://www.mdpi.com/2309-608X/7/2/120/s1）でご覧いただけます。図S1. サブトモグラム解析と平均化ワークフロー；動画S1. C. glabrata CBS138株プロトプラスト膜の大きなリング状構造のスライス図（https://drive.google.com/file/d/18iT68GkqJXkcelNfGrVo_N6z-_bx2D7a/view?usp=sharing）; 動画S2. C. glabrata CBS138株プロトプラスト膜の小さなリング状構造体のスライス図（https://drive.google.com/file/d/18kf0C5KAGJmv4aEa5iM6pK4Bbk3YfOQ3/view?usp=sharing）; 動画S3. C. glabrata KH238株プロトプラスト膜の大きなリング状構造のスライス図（https://drive.google.com/file/d/18lCntJEAlqvCfOPFT-G_ViI_40Guy_5Z/view?usp=sharing）; 動画S4. 推定GS複合体のサブトモグラム平均の3次元等曲面表現。マップは、閾値と回転を変えて表示した。タンパク質複合体のサブユニットがセグメント化され、異なる色で注釈されている (https://drive.google.com/file/d/18loLi5Ri5XHrB67jauIS0kN-HwTtuWCw/view?usp=sharing)。
著者からの寄稿
概念化、C.J.-O.、D.S.P.、W.D.、方法論、C.J.-O.; J.J.; K.R.H.; X.K.; P.C.; M.C. and W.D. Investigation, C.J.-O.; J.J.; M.C.; P.C.; X.K., N.B.; S.J.L. and W.D. 執筆、初稿、 C.J.-O. 監修、C.J.-O.; J.J.; M.C. and W.D.; 執筆-レビューおよび編集、C.J.-O.; J.J.; D.S.P. and W.D.; 資金獲得、D.S.P.; S.J.L. and W.D. すべての著者がこの原稿に読み、同意したことを示します。
資金提供
この研究は、D.S.P.に米国国立衛生研究所（R01AI109025）、S.J.L.に（P011030036319およびR01GM080139）の支援を受けた。パデュー大学から収集したトモグラフィデータは、高解像度低温電子顕微鏡用国立衛生研究所Midwest Consortium（U24 GM116789-01A1）から支援を受けた。この研究は、W.D.へのRutgers Busch Biomedical Research Grantからも一部支援を受けている。
インスティテューショナル・レビュー・ボード声明
該当事項はありません。
インフォームド・コンセントに関する声明
適用外です。
データの利用可能性に関する声明
この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。トモグラフィーのデータ解析に使用したプログラムはEMAN2.orgから入手可能である。野生型とKH238株の推定GSの電子密度マップは、それぞれEMDataBank-accession number EMD-23122とEMD-23123に寄託されています。
謝辞
データ収集にご協力いただいたRutgers CryoEM and Nanoimaging FacilityのJason Kaelber氏、Purdue UniversityのThomas Klose氏に感謝します。
利益相反
情報開示の声明 D.S.P.は、米国国立衛生研究所から資金提供を受け、The Centers for Disease Control and Prevention、Amplyx、Astellas、Cidara、およびScynexisと契約しています。また、Amplyx、Astellas、Cidara、Matinas、N8 Medical、Scynexisの諮問委員を務めています。また、D.S.P.はエキノカンジン耐性に関する米国特許を取得している。残りの著者は、潜在的な利益相反はないことを宣言している。
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