非便秘型過敏性腸症候群患者におけるリファキシミンによる腸内細菌叢組成の調節：分子学的アプローチ

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非便秘型過敏性腸症候群患者におけるリファキシミンによる腸内細菌叢組成の調節：分子学的アプローチ

https://europepmc.org/article/pmc/4675645


ソルディS
1
バシレイアディスS
2
ウジェリF
1
カンパナーレ M
3
モレッリ L
4
フォグリ MV
5
カランニ F
5
グリマルディ M
5
ガスバリーニ A
3
ガスバリーニ A
3
著者情報
臨床と実験消化器学、2015年12月04日、8:309-325
https://doi.org/10.2147/ceg.s89999 pmid: 26673000 pmcid: pmc4675645

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概要
リファキシミンは全身吸収が低く、主に腸内細菌叢への影響を通じてIBSの病態に作用することから、過敏性腸症候群（IBS）の治療薬として選択される可能性がある。本研究の目的は、非便秘性IBS患者の腸内細菌叢に及ぼすリファキシミン活性調節作用を生体分子ツールによって評価することである。15名の非便秘性IBS患者に550mgのリファキシミンを1日3回、14日間投与した。便サンプルは、治療開始前、治療終了時、および6週間の洗浄期間後に採取した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、変性勾配ゲル電気泳動、次世代シーケンシングをすべての検体に適用し、微生物の変動の可能性を検証し定量化した。リファキシミン投与は、治療対象者の微生物叢の全体的な組成には影響を与えず、少数の細菌群に変動を誘発し、ホモログまたは相補的な細菌群の置換によってバランスが保たれていた。リファキシミンは、主にClostridiumのような潜在的に有害な細菌に影響を与えるようであったが、Faecalibacterium prausnitziiのようないくつかの種の存在を増加させた。投与14日後におけるファーミキューテス/バクテロイデーテス比の低下と、ベースラインと比較して生物多様性の高い細菌プロファイルが追跡期間中に観察された。リファキシミン投与は、IBS症状の緩和とラクツロース呼気試験の正常化には有効であったが、被験者の微生物叢組成に劇的なシフトを誘発することはなく、より多様な組成へと向かう微生物集団の再編成を刺激した。反応者と非反応者の間の糞便微生物叢の変化の差異を推測することはできず、上部消化管微生物叢の質的／量的な変化と臨床的反応との相関を明らかにすることはできなかった。
図(7)
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cegロゴ
Clin Exp Gastroenterol. 2015; 8: 309-325.
2015年12月4日オンライン公開。
https://doi.org/10.2147/CEG.S89999
PMCID：PMC4675645
PMID: 26673000
非便秘型過敏性腸症候群患者におけるリファキシミンによる腸内細菌叢組成の調節：分子的アプローチ
サラ・ソルディ、1 ソティリオス・ヴァシレイアディス、2 フランチェスカ・ウジェリ、1 マリアキアラ・カンパナーレ、3 ロレンツォ・モレッリ、4 マリア・ヴィットリア・フォグリ、5 フィオレッラ・カランニ、5 マリア・グリマルディ、5 アントニオ・ガスバリーニ3
著者情報 著作権およびライセンス情報
この論文はPMCの他の論文に引用されている。
関連データ
補足資料
要旨
リファキシミンは全身への吸収が低く、主に腸内細菌叢への影響を通じてIBSの病態に作用することから、過敏性腸症候群（IBS）の治療薬として選択される可能性がある。本研究の目的は、非便秘性IBS患者の腸内細菌叢に及ぼすリファキシミン活性調節作用を生体分子ツールによって評価することである。15名の非便秘性IBS患者に550mgのリファキシミンを1日3回、14日間投与した。便サンプルは、治療開始前、治療終了時、および6週間の洗浄期間後に採取した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、変性勾配ゲル電気泳動、次世代シーケンシングをすべての検体に適用し、微生物の変動の可能性を検証し定量化した。リファキシミン投与は、治療対象者の微生物叢の全体的な組成には影響を与えず、少数の細菌群に変動を誘発し、ホモログまたは相補的な細菌群の置換によってバランスが保たれていた。リファキシミンは、主にClostridiumのような潜在的に有害な細菌に影響を与えるようであったが、Faecalibacterium prausnitziiのようないくつかの種の存在を増加させた。投与14日後におけるファーミキューテス/バクテロイデーテス比の低下と、ベースラインと比較して生物多様性の高い細菌プロファイルが追跡期間中に観察された。リファキシミン投与は、IBS症状の緩和とラクツロース呼気試験の正常化には有効であったが、被験者の微生物叢組成に劇的なシフトを誘発することはなく、より多様な組成へと向かう微生物集団の再編成を刺激した。反応者と非反応者の間の糞便微生物叢の変化の違いについて推測することはできず、上部消化管微生物叢の質的／量的な変化と臨床的反応との相関を明らかにすることはできなかった。

キーワード IBS、リファキシミン、次世代シーケンサー、微生物叢
はじめに
過敏性腸症候群（IBS）は、腸の習慣の乱れに伴う慢性的な腹痛や不快感の再発を特徴とする不均質な胃腸（GI）疾患である。特に、腸内細菌叢のアンバランスがIBSおよびIBS関連症状の一因であることが示唆されている2。

IBSの病態生理における腸内細菌叢の役割は、いくつかの研究で検討されている。選択的培養法と非選択的培養法を用いた初期の研究では、IBS患者の糞便サンプル中の大腸菌群、乳酸桿菌、ビフィズス菌、腸内細菌科細菌の生菌数が異なることが示された3。 -最近の分子生物学的手法を用いた研究では、IBS患者の腸内細菌叢の異常やディスバイオーシスの特徴が明らかにされ、Eubacterium-Clostridium coccoidesグループやLactobacillus属、Veillonella属、Coprococcus属、Collinsella属、Coprobacillus属のレベルのばらつきが示された6-11。

リファキシミンはリファマイシンから派生した非吸収性の経口抗生物質であり、グラム陽性、グラム陰性、好気性、嫌気性の腸内細菌に対して幅広い活性スペクトルを有する12。最近、リファキシミン550mgを1日3回、14日間投与することで、非便秘性IBS（非C型IBS）の症状が持続的に改善することが示された13。また、リファキシミン1,000～1,200mg/日を約10日間投与する臨床研究も発表されており、IBS症状の改善に関して有効であることが示されている。

したがって、この探索的研究の目的は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）-変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）-ハイスループットシークエンシング技術などのさまざまな分子技術を用いて、非C型IBS患者におけるリファキシミン投与後の糞便微生物群集の組成と多様性という観点から、腸内細菌叢に対する効果と影響を評価することであった。これらの技術により、実際、消化管の微生物叢のような細菌群集をより深く特徴付けることができる。特にイルミナシーケンスは、複雑な環境構成に関する知識を向上させる非常に強力で最新のツールとして選ばれた。

さらに、臨床症状との相関の可能性を二次的に調査した。

材料と方法
この探索的オープンラベル試験は、2011年5月から2012年6月にかけてローマ・カトリック大学内科・消化器科で実施された。プロトコールはローマ・カトリック大学（イタリア）倫理委員会のComitato Etico Indipendenteにより承認され、すべての患者が書面によるインフォームド・コンセントを行った。本研究はEuropean Clinical Trials Directive（EudraCT番号：2010-024177-39）に従って実施された。

研究対象者
15名の非C型IBS患者と5名の健常者（HS）を対象とした。非C型IBS患者のみにリファキシミン550mg錠を1日3回、14日間投与した。健常人には投与しなかった。

HSは18～75歳の男女で、合併疾患や消化器症状の反復がなく、臨床的に重要な異常のない者であった。

非C型IBS患者（Rome II診断基準による）23で、現在18～75歳のIBS症状を有する患者が登録された。便秘優位のIBS、炎症性腸疾患、糖尿病または不安定甲状腺疾患、十二指腸潰瘍または胃潰瘍の既往、憩室炎または感染性胃腸炎、腹部手術の既往、リファキシミン/リファンピンまたは賦形剤に対する既知の過敏症、乳糖不耐症、病原性細菌、酵母、寄生虫およびウイルスの便培養陽性、ヒト免疫不全ウイルス感染、腎疾患、心疾患または肝疾患を有する患者は除外された。

リファキシミン、その他の抗生物質、プロバイオティクス、抗精神病薬、鎮痙薬、サリチル酸ビスマスまたはカオペクテート、アロセトロン、緩下剤、ルビプロストン、プロトンポンプ阻害薬、麻薬、運動促進薬でスクリーニング前およびスクリーニング期間中4週間以内に治療を受けた被験者も試験から除外した。

試験期間中、非ステロイド性抗炎症薬による治療は連続3日以内とした。三環系抗うつ薬およびセロトニン再取り込み阻害薬は、試験期間中、スクリーニングの少なくとも6週間前から安定した用量での投与が許可された。

試験デザインと手順
併発疾患を除外するためのスクリーニング手順の後、HSの試験への関与は1回の糞便サンプルの採取に限定された。

非C型IBS患者にリファキシミン550mg錠を1日3回、14日間経口投与した。患者はさらに6週間追跡された。ベースライン評価の前に、患者は2週間のスクリーニングを受けた。非C型IBS患者には、IBS症状の改善を評価するため、治療期間中および6週間の追跡期間中、毎週IBS症状バイナリーアンケートを実施した。ベースライン時（T0）、投与14日終了時、6週間の追跡期間終了時（T56）に、糞便サンプル採取とラクツロース呼気試験（LBT）を行った。

有害事象は試験期間中モニタリングされた。各事象の期間と強度は治験責任医師によって記録され、試験薬との関係、結果と重篤度も併せて記録された。血液学的検査、生化学的検査、尿検査を含む標準的な臨床検査がスクリーニング時、治療終了時（T14）、追跡期間終了時（T56）に実施された。

有効性の変数
重要な臨床エンドポイントは、IBSの全身症状が十分に緩和された患者の割合であった。このエンドポイントは、評価期間中（すなわち、2週目から5週目まで）毎週質問された以下の質問に対する回答（はいまたはいいえ）から決定された： 「IBSの全症状に関して、試験薬投与開始前の感じ方と比較して、過去7日間にIBS症状が十分に緩和されましたか？その他の臨床エンドポイントは、同期間中に腹部膨満感、腹痛／不快感が十分に緩和されたと報告した患者の割合であった。

細菌群集DNA抽出
採取した糞便サンプルは-30℃で直ちに凍結し、使用するまで保存した。FastDNA SPIN KitおよびFastPrep Instrument（MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA）を用いて糞便細菌DNAを抽出した。抽出したDNAは、Quant-iT™ HS ds-DNAアッセイキットのPicoGreen法を用いてQubit™蛍光光度計（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）で定量し、検証した。

定量的PCR
リアルタイムPCR（RT-PCR）はepGradientS, RealPlex4装置（Eppendorf, Amburg, Germany）で行い、PCR産物の量を蛍光シグナルと相関させるためにSYBR Green I蛍光体を使用した。腸内細菌叢を構成する最も興味深い系統/属、すなわちビフィズス菌、腸内細菌科、ファーミキューテス、バクテロイデーテスに属する16S rRNA遺伝子を定量するための特異的プライマーは、既報のものを使用した。

PCR-DGGE分析
16SrDNA分子上に設計された2つのプライマー、Bact0124-GCfとUniv0515rが選択された。増幅はHeiligらの報告に従って行った27。ダイス係数とピアソン係数は専用ソフトウェアInfoQuest™FP Software（Bio-Rad Laboratories Inc.

原核生物 16S rRNA 遺伝子 PCR アンプリコンの多重ハイスループット配列決定
細菌および古細菌の16S rRNA遺伝子のV3-4超可変領域PCRアンプリコンおよびV5-6超可変領域PCRアンプリコンは、それぞれイルミナプラットフォームのマルチプレックスアプローチを用いてスクリーニングした29。プライマーとリンカーの設計に関する詳細は、Vasileiadisらによって以前に最適化されている30。

PCRアンプリコンプールは、Agencourt® AMPure® XPキット（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）の固相可逆固定化法を用いて精製した。V3ケミストリーによるイルミナシーケンスとアンプリコンのライブラリー調製は、Fasteris SA（スイス、ジュネーブ）が行った。

シーケンスデータ調製
シーケンシングしたライブラリーのベースコールおよびデマルチプレックスは、MiSeq Control V2.3.0.3（Illumina Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ）、RTA v1.18.42.0（Illumina Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ）、CASAVA v1.8.2ソフトウェア（Illumina Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて行った。アンプリコンの再構築は、Masellaらによって以前に公開された "pandaseq "スクリプトを用いて行った。31 Fastx-toolkitは、配列に適用されたデマルチプレックス処理に使用した（http://www.hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）。リードアセンブリとサンプルインデックスに基づくデマルチプレックスの結果、7,536,760リードが得られた。配列はNational Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)のSequence Read Archive (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)に提出され、BioProject番号PRJNA279031で公開されている。これらのリードはMothur v 1.32.1ソフトウェア32で処理し、キメラアンプリコン、ミス増幅遺伝子、遺伝子領域を除去した。

統計解析
完全解析と安全性データのセットには、少なくとも1回の試験薬の投与を受け、少なくとも1回のベースライン後の安全性評価を受けた無作為化された全患者が含まれた。

人口統計学的変数およびベースライン疾患因子
治療終了時および追跡調査終了時にLBTが正常化した被験者の数および割合、ならびに試験期間中各週にIBSの全体症状、腹痛／不快感、および腹部膨満感が十分に緩和された被験者の数および割合について、記述統計学的手法により要約した。

微生物学的分析
DGGE法で得られたデータの統計解析は、各被験者に属するプロファイルの類似性を客観的に解釈するために、ダイス係数を用いて行った。RT-PCRの結果の統計的評価は、DGGE解析の結果で確立されたように、異なる収集瞬間で、選択された細菌群を考慮して、重複して得られた値の平均値、中央値、標準偏差（SD）を用いて行った。リアルタイム増幅とデータ統計には、RealPlex装置とソフトウェアを使用した。

ハイスループットシーケンスデータ解析
α多様性指標の算出にはMothur v1.32.132のモジュールを使用し、その他の解析試験には、特に断りのない限り、Vegan34パッケージ搭載のR v 3.0.033ソフトウェアを使用した。サンプルごとに生成されたアンプリコンリードは、検出されない可能性のあるシーケンシングアーテファクト32に関連するバイアスと、αおよびβ多様性指標に対するサンプルサイズの影響を低減するために、対象とする微生物群ごとに最も少ないリード数で表されるサンプルの配列にダウンサンプリングされた35。OTUマトリックスと分類マトリックスを用いて、解析したサンプルのαおよびβ多様性を評価した。コアマイクロバイオーム解析は、各サンプリングで一貫して出現するOTUを同定するために行った。サンプル間の差異と実験に関連する仮説の検証は、クラスタリング解析と多変量解析アプローチによって分析した。ドミナントOTUと分類群はさらに、Metastats Rパッケージ37のStudent's t-testベースの一対比較と順位相関を用いて、処理と時間間の差分存在量と相関を分析した。興味深い配列は、RAxML-HPC v7.2.8ソフトウェアを用いて、タイプ分離株の部分16S rRNA遺伝子配列とともに最尤系統樹にかけた38。

結果
対象者の特徴
平均年齢（±SD）27.7±8.2歳（範囲：22-44歳）のHS5人（男性1人、女性4人）および平均年齢（±SD）34.5±14.5歳（範囲：19-62歳）の非C型IBS患者15人（男性5人、女性10人）が登録された。HSおよび患者はすべて白人であった。登録された患者およびHSのいずれも、スクリーニング受診前1ヵ月間および試験期間中に併用薬を服用していなかった。初回薬剤摂取前に実施した病原性細菌、酵母、寄生虫およびウイルスの便培養は、登録されたすべてのHSおよび患者で陰性であった。試験薬に対するコンプライアンスは全患者で90％以上であった。全例が56日間の試験期間を終了した。ベースライン時（T0）、非C型IBS患者15人のうち12人はLBTによりSIBOと診断された。

有効性
評価期間中、80％（12/15例）が主要臨床エンドポイントである全体的なIBS症状の十分な緩和の基準を満たした。全身のIBS症状が十分に緩和された患者は、腹部膨満感および腹痛/不快感も十分に緩和されたと報告した。LBTの正常化に関しては、ベースライン時にLBTによってSIBOの陽性診断が確認された患者12人中11人（92％）がリファキシミンによる治療終了時にLBTが陰性であり、10人（83％）がT56時に陰性であった。そのうち9人は、14日間の治療終了時と追跡終了時（T56）の両方でLBTが陰性であった。

治療終了時にLBTが陰性であった11人の患者のうち8人、T14とT56の両方でLBTが陰性であった9人の患者のうち7人は、IBS症状の全体的な緩和を達成した。臨床結果と呼気水素検査の結果の要約、および臨床反応と呼気水素検査の関係を表1に示す。

表1
臨床結果と呼気水素検査結果の要約、および臨床反応と呼気水素検査の関係

症状反応
SIBO陽性患者における症状反応とHBT正常化の関係
T0時点のSIBO HBT陽性 (n=12) T0時点のSIBO HBT陰性 (n=3) HBT除菌* (n=11) HBT異常* (n=1)
週間IBS全体症状 9 3 8 1
週間IBS関連腹部膨満感 9 3 8 1
腹痛と不快感 9 3 8 1
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注釈 T0 = ベースライン。

*HBTは14日間の治療終了時に実施した。
略語： IBS、過敏性腸症候群、HBT、水素呼気試験、SIBO、小腸細菌過剰増殖、T14、14日間の治療終了時のサンプリング時間。

分子データ
登録されたすべての非C型IBS患者（すなわち15例）とHSから採取した糞便検体は、「材料と方法」の項に従って処理した。RT-PCRから得られたすべての値を表2に報告する。

表2
RT-PCRにより検出された糞便1gあたりの採取時点ごとの異なる系統／属に属する16S rRNA遺伝子コピーの平均対数10量（±SD

非C型IBS患者
健常人
T0 T14 T56 T0
ビフィズス菌 7.51±062 7.47±1.25 7.25±0.85 7.75±0.82
腸内細菌科 6.21±1.14 6.49±0.97 6.88±0.86 6.51±0.95
ファーミキューテス属 9.86±0.45 9.80±0.76 9.48±0.67 10.02±0.30
バクテロイデーテス 8.61±0.74 8.98±0.77 8.52±0.66 8.66±0.58
比率 Firmicutes/ 1.15 1.09 1.11 1.16
バクテロイデーテス
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注釈 異なるサンプリング時間およびHSとの比較で計算されたすべてのP値は、0.079～0.912の範囲に含まれ、統計的有意性を示すことはなかった（P>0.05）。T0：ベースライン、T14：14日間の治療終了時、T56：6週間の追跡期間終了時。

略語： SD：標準偏差；RT-PCR：リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応；non-C IBS：非便秘型過敏性腸症候群；HS：健常者。

T0において、HSのビフィズス菌および腸内細菌科細菌の平均レベルは、各採取時間にわたってIBS被験者について算出された平均値と同様であった。

ビフィズス菌、腸内細菌、ファーミキューテス、バクテロイデテスの変動は、腸内細菌では経時的な増加傾向が観察されたものの、被験者に関連しているようであった（表2）。

DGGE解析により、リファキシミンがコア微生物叢の全体的な組成に有意な影響を及ぼさないことが確認された。このことは、15人の被験者および3つのサンプリング時点におけるバンドの存在量および濃度が均一であったことからも明らかである（T0=22±6.4、T14=20±7.0、T56=21±6.6、HSの平均バンド数は23±5.3）。

Diceの係数（T0 vs T14 80±5.7％、T14 vs T56 85±12％、T56 vs T0 77±13％）を用いて算出した同一被験者の異なるサンプリング時間間の類似性比較から、リファキシミン投与はコア微生物叢に関連性のある測定可能な変化を誘導しないことが示唆された。

しかし、T14検体における特定の細菌集団レベルの変動は、クロストリジウム代表（15例中8例）およびFaecalibacterium prausnitzii配列（15例中4例）で観察された。

ハイスループットシーケンスに基づく多様性スクリーニング
RT-PCRおよびDGGE解析で得られたデータを確認し、さらに解析するために、ハイスループットシークエンシングを実施した。

図1は、少なくとも1つのサンプルに10％以上含まれる分類群について、order-family分類に従って平均連結アルゴリズムを用いて行った、分類された配列の階層的クラスタリングを報告している。参加率が低い分類群は「その他」の配列グループに加えられた。得られたクラスタリングの結果、LachnospiraceaeとRuminococcaceaeが調査した微生物群集の大部分を占め、BacteroidaceaeとVeillonellaceaeがそれに続くことが明らかになった（図2A）。バクテロイデーテスはHS（4.92％）に比べてIBSサンプル（T0：5.58％、T14：9.49％、T56：11.7％）に多く、ビフィズス菌はHS（5.34％）に比べてIBSサンプル（T0：2.11％、T14：1.41％、T56：1.67％）に少なかった。

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図1
少なくとも1つのサンプルに10％以上含まれる分類群について、order-family分類レベルに従って分類した配列の階層的クラスタリング。

注．異なる色は各サンプルで同定された細菌分類群を示す。特定のクラスタリングは観察されなかった。

略号： HS、健常被験者、T0、ベースライン、T14、14日間の治療終了時、T56、6週間の追跡期間終了時。

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図2
IBS患者および健常人由来のサンプルの群集組成の円グラフ。

注釈 主な目／科レベルの分類群（A）と属（B）の平均値を各研究グループごとに示した。T0：ベースライン、T14：14日間の治療終了時、T56：6週間の追跡期間終了時。

略語 IBS、過敏性腸症候群、HS、健常者、IS、incertae sedis、Unc、未分類。

HSの属別円グラフ（図2B）では、IBSに比べHSではRoseburiaとFaecalibacteriumの存在率が低く、それぞれ前者6.52％対14.4％、後者3.42％対5.66％であった。さらに、リファキシミン投与終了時（T14）には、Faecalibacteriumが増加していた（T14：8.50％ vs T0：5.58％）。

図3に示すように、IBSサンプルの細菌群集は多様性が減少していた（Simpson's D）。この係数の平均値は、IBS被験者（16.1）よりもHS被験者（18.2）で高く、T0からT56にかけてわずかに増加する傾向を示し、リファキシミン介入後に細菌種の分化が回復するという仮説につながった。この観察は、円グラフ（図2AおよびB）からも推察され、T0における細菌群集の組成はT56におけるものと類似している。

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図3
多様性指数（Simpson's D）の箱ひげ図（サンプリングと非便秘IBS/HS対象者別にグループ化）。

注釈： 対応する平均値およびIBS関連サンプリング群の平均値も右上に示した。T0：ベースライン、T14：14日間の治療終了時、T56：6週間の追跡期間終了時。

略語 IBS：過敏性腸症候群；HS：健常者。

クラスタリング解析の結果、属レベルの分類学的レベルでは、調査された群集の特定の治療/時間ごとのグループ分けは示唆されなかった（図2B）。距離ベースの冗長性解析の結果、被験者とサンプリング時間の複合効果はサンプル間の全分散の68.6%に寄与したが、その大部分は被験者要因に起因し（説明された分散の94.3%、P<0.001）、サンプリング時間に関連するのはごく一部（説明された分散の5.7%、P=0.028）だけであった（抗生物質関連効果）（図4）。

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図4
距離ベースの冗長性解析（RDA）により、細菌群集の構成に対する被験者とサンプリング時間の複合効果を示す。

注釈 モデルによって説明された全分散とモデル構成要素への分割が上のプロットで報告されている。モデルによって説明された分散：全体の68.6％（P=0.005）：被験者の分散の94.3％（P=0）が説明され、時間の分散の5.7％（P=0.028）が説明された。T0：ベースライン；T14：14日間の治療終了時；T56：6週間の追跡期間終了時。

略号： S、被験者。

異なる実験時点のサンプル間およびHSとの一対比較では、T0およびT56と比較して、T14ではClostridiaceaeの参加が有意に低いことが示された。バクテロイデス科は、試験期間中およびHSと比較してIBS被験者で増加した。腸内細菌科は、HSと比較してIBS被験者でより豊富であった。Streptococcaceae（連鎖球菌科）でも有意差が認められ、IBS患者では経時的に減少した。逆にPrevotellaceae（前胸腺膿瘍科）は、HSよりもIBS検体で、特にリファキシミン投与後に多く認められた（図5）。

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図5
治療と時間による一対比較。

注 (A)支配的なOTUのHS, T0, T14, T56; (B)棒グラフ(A)に表示されたOTUの分類学的系統で、分析試料に少なくとも1%以上含まれる。T0：ベースライン、T14：14日間の治療終了時、T56：6週間の追跡期間終了時。a'と'b'は、一対比較検定による有意群を示す。ab'は、特定のサンプルグループと'a'または'b'に分類されたサンプルグループとの間に統計的に有意な差が示されなかったことを示す。太字のデータは、処理間で存在量に差があるOTUを示す。

略語： OTUs：操作上の分類単位；HS：健常者。

最大尤度系統樹によると、Clostridium bartlettiiの同じクレードに存在するOtu0020は、T14では2％からほとんど検出できない量まで減少し、T56では1％まで回復した（図5）。有意な変異を示した他のOTU（Otu0002、Otu0010、Otu0016、Otu0017）は、F. prausnitzii（T0で5.6％からT14で8.5％）、Roseburia inulinivorans（T0で2. 4％からT56で1.9％）、Streptococcus salivarius/vestibularis（T0で1％からT14で0.4％、その後T56で1.9％まで回復）、Blautia luti（T0で1.6％からT14で0.7％）であった。HSとIBS患者の異なるサンプリング時間間のコアバクテリオーム解析により、すべてのコアバクテリオームで共有される15個のOTUが得られた（表3）。コア・バクテリオームのOTU数は、順位に従って減少した： HS（13OTU）＞T0（10OTU）＞T14（6OTU）＞T56（5OTU）。このように、コアとなるバクテリオームは、時間と処理に伴って凝縮する傾向が見られた。ほとんどのOTUは、特に腸内環境に代表されるファーミキューテス門に属し、バクテロイデーテス門に含まれるOTUは15 OTU中わずか2 OTUであった。15OTU中5OTUがすべてのコアバクテリオームに含まれ、そのファミリー/属レベルの分類学的所属はRoseburia, Faecalibacterium, Bacteroides, Anaerostipes, Lachnospiraceaeに属していた。コア・バクテリオームの凝縮は、得られた逆シンプソンズD値（図3）によって示されるように、サンプル内多様性の減少傾向に対応し、距離ベースの冗長性解析結果（図4）によって確認されるように、IBS患者由来のサンプルでは、被験者間の細菌群集構造変動性（β-多様性）が増加した。

表3
健常人およびIBS患者由来のサンプルのコアバクテリオーム解析で同定された、すべてのコアバクテリオーム間で共有されるOTU

HS T0 T14 T56 Seq # out of 1,040,300 分類系統（ブートストラップ信頼度）
Otu0001 1 1 1 1 102862 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100);Lachnospiraceae(100);Roseburia
Otu0002 1 1 1 1 65495 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100); Ruminococcaceae(100);フェカリス菌
Otu0003 1 1 1 42466 細菌(100);バクテロイデーテス目(100);バクテロイデス目(100);バクテロイデス科(100);バクテロイデス属(100)
Otu0005 1 0 0 0 32368 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100);ルミノコックス科(100);Incertae_Sedis
Otu0006 1 1 1 1 28183 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100); Lachnospiraceae(100);Anaerostipes
Otu0007 1 1 1 1 27413 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100); Lachnospiraceae(100);Incertae_Sedis類
Otu0008 1 1 1 0 22359 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100); Lachnospiraceae(100);Blautia
Otu0009 0 1 0 0 21207 細菌(100);バクテロイデーテス目(100);バクテロイデス目(100);リケンテス科(100);アリスティペス属
Otu0010 0 1 0 0 199968 細菌(100);ファーミキューテス(100);クロストリジウム(100);クロストリジウム目(100);ラクベスピラ科(100);バラ科
Otu0015 1 1 0 0 14005 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100);フトモモ科(100);Incertae_Sedis
Otu0016 1 0 0 0 12866 細菌(100);ファーミキューテス(100);バチルス(100);ラクトバチルス(100);レンサ球菌科(100);連鎖球菌
Otu0017 1 1 0 0 12339 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100); Lachnospiraceae(100);Blautia
Otu0023 1 0 0 0 10890 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100);ルミノコッカス科(100);Oscillibacter
Otu0028 1 0 0 0 9568 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100);ルミノコッカス科(100);Subdoligranulum
Otu0033 1 0 0 0 8173 細菌(100);ファーミキューテス(100);Clostridia(100);Clostridiales(100);Lachnospiraceae(100);Incertae_Sedis
13 10 6 5 共有OTU数
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注釈 T0：ベースライン、T14：14日間の治療終了時、T56：6週間の追跡期間終了時。

略語： OTUs、operational taxonomic units、IBS、過敏性腸症候群、Seq、sequence、HS、健常者。

全サンプルを通して潜在的に有益な細菌の関連を評価するために、細菌の分類学的注釈間のスピアマンの順位相関検定を行い、得られた相関値の階層的クラスタリングを行った。スピアマンの順位相関検定により、2つの主要な分類群に分類された（図6）。1つ目はRuminococcaceae、Alistipes、Oscillibacterの分類群で、これらは互いに正の相関があり、主にEscherichiaとVeillonellaとは負の相関があり、OscillibacterはBlautiaとも負の相関があった。2つ目の主要クラスターは、Clostridium、Bifidobacterium、Lachnospiraceae incertae sedis（IS）、Blautia、Roseburia、Peptostreptococcaceae ISクラスター、Veillonella、Escherichiaクラスター（主に共通の負の関連性により形成）、Dialister、Subdoligranulum、Faecalibacterium、Prevotella、Bacteroidesと、より希少な分類群のクラスターである。3つのグループに属する分類群の相関の違いは、特定の正の相関よりも、異なる属や科の間で確認された負の相関に主に見られた。

写真やイラストなどを保持する外部ファイル。
オブジェクト名はceg-8-309Fig6.jpgです。
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図6
細菌の分類学的アノテーション間のスピアマンの順位相関検定と、得られた相関値の階層的クラスタリング。

略号： ISはincertae sedis、Uncはunclassified。

図7に示され、微生物叢組成の近似値として算出されたファーミキューテス/バクテロイデーテスの比率は、IBS被験者において特に注目された。しかし、T0におけるHSおよびIBS被験者の値の分散は、特にT14と比較して大きく観察され、リファキシミンによる治療後、低い比率値の周辺に全体的に凝縮していることが示された（図7）。T14では、図2A（細菌ファミリーの円グラフ）に示すように、治療後、ファーミキューテス（Firmicutes）属の成分はわずかに増加したが、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）属のグループは相対的な存在量においてより重要な増加を示した。T56では、ファーミキューテス/バクテロイデーテスから得られた結果は、T0とT14の中間と解釈できる。バクテロイデーテス（Bacteroidetes）のレベルは、リファキシミン処理後の3つの異なる時点で漸増を示した（図2A）。

画像やイラストなどを保持する外部ファイル。
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図7
Firmicutes/Bacteroidetes ratio box-plot（左）とdensity plot（右）。

注釈： 箱ひげ図は、サンプル採取時の中央値。T0：ベースライン、T14：14日間の治療終了時、T56：6週間の追跡期間終了時。

略号 HSは健常者。

T14で比率が低値付近に凝縮したのは、リファキシミン抗菌活性に非常に感受性が高いClostridium属（ファーミキューテス門に属する）の減少によって部分的に説明できるかもしれない。

古細菌
検索された配列のほぼすべて（99.9％）が科属レベルまで分類された。古細菌データセットの配列の大部分はMethanobrevibacter属に分類され、主要なOTUの代表的な配列は系統学的にMethanobrevibacter smithiiに属しました。分類学的解析によるサンプルのグループ分けは特に得られなかった。

HS患者とIBS患者（T0）の間に差は認められず、リファキシミン投与による変化は認められなかった。

考察
疫学的、生理学的、および臨床的データは、細菌がIBSの病因における重要な役割を担っていることを裏付けている40,41。新しい分子生物学的手法を活用した研究により、IBS患者における腸内細菌叢の質、量、および時間的安定性が、HSと比較して明らかに異なることが浮き彫りにされている4-8。

IBS患者では腸内細菌叢の変化も報告されており、ファーミキューテス/バクテロイデーテス比のアンバランスが、ガスや短鎖脂肪酸などの代謝産物産生、ひいては腸管運動や腹部膨満感に影響を及ぼしている可能性が高い42。

腸内細菌叢は個人差が大きいが41、ほとんどの研究で、IBS患者では腸内細菌が増加し、乳酸菌やF. prausnitziiが減少することが報告されている2-4。

この後者の現象は、F. prausnitziiが有意な抗炎症活性を有することが示されていることから、否定的な結果をもたらす可能性がある43。

われわれの研究では、異なる分子生物学的手法で得られたすべての結果から、リファキシミン投与は治療対象者の中核微生物叢の全体的な組成には影響を与えず、その代わりに、いくつかの細菌群に変動を引き起こし、その変動は、消失した菌種が類似の特徴を有する同族種や補完的な細菌群に置き換わることで均衡が保たれていることが指摘された。

リファキシミンは、ペプトストレプトコッカス科や大腸菌のほか、主にクロストリジウムなどの潜在的に有害な細菌に影響を与えるようであった。一方、リファキシミンを14日間投与すると、F. prausnitziiのような、酪酸を産生し抗炎症プロセスを誘導することによって腸の生理学的機能やホメオスタシスにプラスの影響を与えることが可能であると認識されつつある細菌の存在が増加するようであった44。

最近の文献で報告されているように、健常対照者と比較した場合、IBS被験者の大多数は腸内細菌叢に変化がみられたが、一部のIBSサンプルでは細菌叢組成に異常がみられなかった45。したがって、IBS-サブタイプの細菌叢組成には非常にばらつきがあり、その結果、本研究で確認されたように、被験者間で共通の特徴を特定することは困難である。

本研究の結果、IBS患者においては、HSおよびT0で検出されたものと比較して、T14でファーミキューテス/バクテロイデーテス比が減少していることが証明された。さらに、ハイスループット塩基配列決定およびDGGEにより推定されたように、T0およびT14と比較して、リファキシミン治療の経過観察中（T56）に採取されたサンプルでは、より高い生物多様性を有する細菌プロファイルが観察された（図2A、Bおよび図7）。しかし、これらのデータは統計学的有意性には至らなかった。これはサンプルサイズが限られており、個人間のばらつきが大きいためと考えられる。

過去数十年の間に、メタン生成菌の存在とヒトの特定の疾患（大腸がん、炎症性腸疾患、IBS、肥満、便秘）との間に存在する可能性のある関係を明らかにしようとする研究がいくつかあり、古細菌の役割について調査されたが、これらの疾患とメタン生成菌との間に一貫した関連性は確立されていない。M. smithiiの高い存在は、成人で検出される細菌46,47や腸内細菌型48と関連しており、メタン生成菌と腸内細菌叢の他のメンバーとの非特異的かつ共生的な相互作用を示唆している。本研究では、M. smithiiの有病率はよく示されたが、古細菌の個体数および研究期間中に有意な差は観察されなかった。第一に、メタン生成古細菌は、その膜および細胞壁の組成から、ヒトの治療で一般的に使用される抗生物質のほとんどに感受性がないことが知られている49,50。第二に、メタンガスは世界中の健康な成人集団の30％～50％から検出されるが、その産生は、疫学的および臨床的に、便秘優位型IBSや慢性便秘症などの便秘関連疾患と関連している。

われわれの研究は非C型IBSを対象として実施された。このことは、古細菌集団の有意な変化を検出する可能性に深く影響した可能性がある。さらに、リファキシム菌がどのような役割を果たすのか（有益なのか有害なのか）については、まだ明らかにされていない。

結論として、リファキシミンは被験者の微生物叢組成の急激な変化を誘発しなかったが、特に短鎖脂肪酸産生菌の間では、類似した代謝経路を保有したり、同じニッチを満たしたりする、種／OTUの観点から見てより多様な組成に向かって、いくつかの集団における微生物の再編成を刺激した。

この点で、IBS患者を対象としたわれわれの知見は、直接的な殺菌活性を伴わない別の作用機序によってリファキシミンの有効性を説明しうると結論づけたMaccaferriら51と一致していた：たとえば、腸内細菌の病原性因子の変化や、病原体の腸管上皮への付着および内在化の減少などである52,53。さらに、リファキシミンはヒトプレグナンX受容体を活性化し、その結果、宿主の解毒機構をアップレギュレートし、宿主のディスバイオシスに対する反応を調節すると考えられる炎症プロセスを制御する54,55。

リファキシミンが非C型IBS成人の治療に有効である正確な機序は不明であるが、リファキシミンの抗生物質効果は、その有益な効果を持続させる機序であると推定される。しかし、現在のin vitroおよびin vivoのデータに基づくと、IBSにおけるリファキシミンの臨床的有効性については、いくつかもっともらしい説明ができる56。

リファキシミン治療に対する反応は、ラクチュロース水素呼気試験の結果の正常化と相関していた。サンプル数が限られており、対照群も存在しないため、反応者と非反応者の間の糞便微生物叢の改変の違いを推測することはできず、上部消化管微生物叢の質的／量的改変と臨床的反応との相関を明らかにすることはできなかった。糞便培養の代わりに空腸吸引液の培養および分子解析が可能であれば、SIBOに対するリファキシミンの有効性と上部消化管細菌叢の質的／量的変化との相関の可能性を強調できたであろう。サンプル数が少なく被験者間のばらつきが大きいにもかかわらず、これは抗生物質治療後のIBS患者における腸内細菌叢の変化を評価した最初の研究の一つである。

今回の結果は、Pimentelら57がより高いサンプル数で示した予備的データとも一致しており、リファキシミンによる反復治療中、症状の持続的改善を経験した非C型IBS患者において、便微生物叢の持続的な障害は観察されなかった58。

さらに、リファキシミンは肝性脳症のような他の病態においても同様に作用する。実際、肝性脳症患者において、便微生物叢の組成にわずかな変化をもたらすのみで有効であった59-61。

結論として、リファキシミンは糞便微生物叢組成に劇的な変化をもたらすことなく有効である。

補足資料
次世代シーケンサー解析のためのDNA増幅
最初のステップで使用したプライマーセットは、細菌ではE343f-E802r、古細菌ではA787f-A1053rである。配列は表S1の上部に記載されている。次に、同じ表に記載されている5′配列延長でインデックスを付けた。第一段階のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、細菌と古細菌それぞれ0.1ngと1ngの鋳型DNA抽出物、12.5μLの2×濃縮Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific, Waltman, MA,USA）、0.5μMの各プライマーを含む25μLの容量で行った。第二段階のPCR混合物では、第一段階のPCR産物2 µLを鋳型として使用し、残りの試薬は第一段階のPCRと同じであったが、フォワードプライマーに示したようなインデックスを付けた点が異なっていた。インデックスされたPCR産物をもう一度定量し、各糞サンプルのDNA抽出物に対応する等しいPCR産物重量を多重化した。

表S1
本研究で使用したプライマーとプライマーインデックスのリスト

Bacプライマー Archプライマー

343f > arc787f
tacggraggcagcag attagatacccsbgtagtcc
802R >A1053R
tacnvgggtatctaatcc catgcaccwcctctc

バーコードリンカー バーコードF_bact_primer バーコードF_arch_primer

1 ttatccg ta ttatccgtatacggraggcagcag ttatccgtaattagatacccsbgtagtcc
2 ttatggc ta ttatggctatacggraggcagcag ttatggctaattagatacccsbgtagtcc
3 ttacacc ta ttacacctatacggraggcagcag ttacacctaattagatacccsbgtagtcc
4 ttacgtg ta ttacgtgtatacggraggcagcag ttacgtgtaattagatacccsbgtagtcc
5 ttagagg ta ttagaggtatacggraggcagcag ttagaggtaattagatacccsbgtagtcc
6 ttagctc ta ttagctctatacggraggcagcag ttagctaattagatacccsbgtagtcc
7 ttcttcc ta ttcttctatacggraggcagcag ttcttctaattagatacccsbgtagtcc
8 ttctcgt ta ttctcgttatacggraggcagcag ttctcgttaattagatacccsbgtagtcc
9 ttctgag ta ttctgagtatacggraggcagcag ttctgagtaattagatacccsbgtagtcc
10 ttcaacg ta ttcaacgtatacggraggcagcag ttcaacgtaattagatacccsbgtagtcc
11 ttcagtc ta ttcagtctatacggraggcagcag ttcagtctaattagatacccsbgtagtcc
12 ttccaga ta ttccagatacggraggcagcag ttccagataattagatacccsbgtagtcc
13 ttcgttg ta ttcgttgtatacggraggcagcag ttcgttgtaattagatacccsbgtagtcc
14 ttcgcaa ta ttcgcaatacggraggcagcag ttcgcaataattagatacccsbgtagtcc
15 ttgtcac ta ttgtcactatacggraggcagcag ttgtcactaattagatacccsbgtagtcc
16 ttgtgct ta ttgtgctatacggraggcagcag ttgtgcttaattagatacccsbgtagtcc
17 ttgaagc ta ttgaagctatacggraggcagcag ttgaagctaattagatacccsbgtagtcc
18 ttgactg ta ttgactgtatacggraggcagcag ttgactgtaattagatacccsbgtagtcc
19 ttgctag ta ttgctagtatacggraggcagcag ttgctagtaattagatacccsbgtagtcc
20 ttggtgt ta ttggtgtatacggraggcagcag ttggtgttaattagatacccsbgtagtcc
21 ttggtaca ta ttggacatacggraggcagcag ttggacataattagatacccsbgtagtcc
22 TATTGACC TATTGACTAACGRAGGCAGAG TATTGACTAATAGACCCSBGTAGTCC
23 tatagcc ta tatagcctatacggraggcagcag tatagcctaattagatacccsbgtagtcc
24 taaccac ta taaccactatacggraggcagcag taaccactaattagatacccsbgtagtcc
25 taaggag ta taaggagtatacggraggcagcag taaggagtaattagatacccsbgtagtcc
26 TACACAG TACACAGGRAGCAGCAG TACACTAATAGATACCCSBGTAGTCC
27 tacacag ta tacagtatacggraggcagcag tacagtaattagatacccsbgtagtcc
28 taccgaa ta taccgaatacggraggcagcag taccgaataattagatacccsbgtagtcc
29 tagtacc ta tagtacctatacggraggcagcag tagtacctaattagatacccsbgtagtcc
30 tagtgtg ta tagtgtgtatacggraggcagcag tagtgtgtaattagatacccsbgtagtcc
31 tagccta ta tagcctatacggraggcagcag tagcctataattagatacccsbgtagtcc
32 tctacct ta tctacctatacggraggcagcag tctaccttaattagatacccsbgtagtcc
33 tcaagca ta tcaagcatatacggraggcagcag tcaagcataattagatacccsbgtagtcc
34 tcacaag ta tcacaagtatacggraggcagcag tcacaagtaattagatacccsbgtagtcc
35 tcagact ta tcagacttatacggraggcagcag tcagacttaattagatacccsbgtagtcc
36 tgttgca ta tgttgcatatacggraggcagcag tgttgcataattagatacccsbgtagtcc
37 tgtactc ta tgtactctatacggraggcagcag tgtactaattagatacccsbgtagtcc
38 tgtgtagt ta tgtaggttatacggraggcagcag tgtaggttaattagatacccsbgtagtcc
39 tgtgtag ta tgtgtagtatacggraggcagcag tgtgtagtaattagatacccsbgtagtcc
40 attagcg ta attagcgtatacggraggcagcag attagcgtaattagatacccsbgtagtcc
41 attcctc ta attcctatacggraggcagcag attcctaattagatacccsbgtagtcc
42 attgacc ta attgacctatacggraggcagcag attgacctaattagatacccsbgtagtcc
43 Atctgca ta atctgcatatacggraggcagcag atctgcataattagatacccsbgtagtcc
44 atgagga ta atgaggatacggraggcagcag atgaggataattagatacccsbgtagtcc
45 AATTCCG TA AATTCCGTAACGRAGGCAGCAG AATTCCGTAATAGATACCCSBGTAGTCC
46 AATCGTG TA AATCGTGTAACGRAGGCAGAG AATCGTGTAATAGATACCCSBGTAGTCC
47 agttgag ta agttgagtatacggraggcagcag agttgagtaattagatacccsbgtagtcc
48 agcagaa ta agcagaatacggraggcagcag agcagaataattagatacccsbgtagtcc
49 cttgagt ta cttgagttatacggraggcagcag cttgagttaattagatacccsbgtagtcc
50 ctccaat ta ctccaattatacggraggcagcag ctccaattaattagatacccsbgtagtcc
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表S2
ハイスループットシーケンスサンプルの調製に適用したPCR条件

時間 度（℃） サイクル数
5分 94°C
30 秒 94°C
30 秒 50°C (Bacteria) - 54°C (Archaea) 35 サイクル
30秒 72°C
10 分 72°C
∞ 4°C
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略語： PCR、ポリメラーゼ連鎖反応、min、分、sec、秒。

表S3
PCRアーチファクト除去後のプライマーインデックス間のHTSリード分布（高品質リード）

高品質サンプル 高品質サンプル
BAC01 29761 BAC26 37393
bac02 29708 bac27 57539
BAC03 27533 BAC28 68118
BAC04 23447 BAC29 27879
BAC05 26269 BAC30 34715
BAC06 22519 BAC31 43111
BAC07 42972 BAC32 26945
BAC08 28754 BAC33 28970
BAC09 42469 BAC34 67655
BAC10 81998 BAC35 44615
BAC11 37997 BAC36 49898
BAC12 35660 BAC37 74207
BAC13 50894 BAC38 98923
BAC14 32841 BAC39 118117
BAC15 37212 BAC40 66590
BAC16 44458 BAC41 59178
BAC17 24837 BAC42 57761
BAC18 23354 BAC43 41991
BAC19 39225 BAC44 55732
BAC20 20806 BAC45 42920
BAC21 35816 BAC46 46154
BAC22 60753 BAC47 45903
BAC23 57433 BAC48 45227
BAC24 45390 BAC49 39880
BAC25 78093 BAC50 34257
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略語： PCR、ポリメラーゼ連鎖反応、HTS、ハイスループットシーケンス。

謝辞
本研究はAlfa Wassermann SpAの支援を受けた。ローマのジェメッリ病院、ピアチェンツァのカトリック大学微生物学研究所、スイスのプラン・レ・ワテにあるシークエンシングセンターFasteris SAのスタッフに感謝したい。また、本研究全体をサポートしてくれたAlfa Wassermann SpA.にも感謝する。

脚注
情報開示

Calanni博士、Fogli博士、Grimaldi博士はAlfa Wassermann SpAの従業員であることを報告した。他の著者は、本研究における利益相反はないと報告している。

参考文献

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