イヌの妊娠・授乳期におけるメタボロミクス

イヌの妊娠・授乳期におけるメタボロミクス

https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0284570

Sebastian P. Arlt, Claudia Ottka, Hannes Lohi, Janna Hinderer, Julia Lüdeke, Elisabeth Müller, [...view 2 more...], Alexander Bartel
要旨
妊娠・出産期の雌犬は、胎児の成長に必要な栄養素の供給、ホルモンの変化、出産、授乳、乳汁分泌、子宮収縮など様々な課題に対処する必要がある。メタボローム研究は、個体間・個体内要因、摂食、加齢、品種間差、薬物作用、行動、運動、遺伝要因、去勢状態、病的過程など、いくつかの要因が代謝に及ぼす影響を特徴づけるために利用されている。本研究の目的は、妊娠期と授乳期の異なる時期に血清中で特異的な変化を示す代謝物を同定することである。21犬種27頭の個人所有の雌犬を、発情期、妊娠初期、中期、後期、授乳期のピークと思われる時期、離乳後の6つの時期にサンプリングしました。検証済みで高度に自動化された犬特有のNMRメタボロミクス技術を利用して、123の測定項目を定量化した。異なる時点の間でどの代謝物濃度が有意な変化を示すかを評価しました。そして、代謝物の濃度パターンと代謝物間の生化学的関係から、妊娠中期に高い、妊娠中期に低い、妊娠後期に高い、授乳期に高い、授乳期に低いという5つのクラスターに分類されました。アルブミン、糖タンパク質アセチル、脂肪酸、リポタンパク質、グルコース、アミノ酸のようないくつかの代謝物は、ヒトで示されたように妊娠中および授乳期に同様のパターンを示した。しかし、分岐鎖アミノ酸、アラニン、ヒスチジンなど、いくつかのパラメータは、これらの種間でパターンが異なるようです。ほとんどの代謝物について、観察された変化が腸からの再吸収の変化によるものなのか、生産の変化によるものなのか、母体や胎児の組織での代謝によるものなのかは、まだ研究されていない。したがって、種特異的なメタボローム研究をさらに進めることで、胎児の正常な成長と発達に重要であると考えられる妊娠による生理的変化について、より幅広い理解が得られる可能性があります。今回の研究結果は、健康なイヌの妊娠・分娩時の正常な代謝変化のベースラインを提供するものです。今後のメタボローム解析と組み合わせることで、分娩前、分娩中、分娩後の雌犬の重要な機能をモニターし、病気の早期発見を可能にする可能性があります。
引用元：日本経済新聞 Arlt SP, Ottka C, Lohi H, Hinderer J, Lüdeke J, Müller E, et al. (2023) Metabolomics during canine pregnancy and lactation. PLoS ONE 18(5): e0284570. doi:10.1371/journal.pone.0284570
編集者 Mükremin Ölmez（カフカス大学、トルコ
Received： 2022年12月22日; 受け入れられた： 2023年4月3日; 公開された： 2023年5月10日発行
Copyright: © 2023 Arlt et al. 本論文は、原著者および出典をクレジットすることを条件に、あらゆる媒体での無制限の使用、配布、および複製を許可するクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。
データの利用可能性 すべての関連データは、本論文およびそのSupporting informationファイル内にある。
資金提供 費用は、特に資金を提供することなく、ベルリン自由大学（検査、サンプリング）が負担し、PetBiomics Ltdが材料提供（Analyses）した。PetBiomics Ltdの社員Claudia OttkaとPetBiomics Ltdの会長Hannes Lohiが解析と原稿作成に携わった。資金提供者は、試験デザイン、データ収集、出版決定には一切関与していない。
競合する利益 ジャーナルの方針を読み、本原稿の著者は以下の競合利益を有している： Claudia Ottkaは従業員、Hannes Lohiはメタボローム検査を開発・提供するPetBIOMICS Ltdの株主であり取締役会会長である。その他の著者は、競合する利害関係がないことを宣言しています。このことは、データおよび資料の共有に関するPLOS ONEポリシーの遵守を変更するものではありません。
はじめに
妊娠と分娩は、胎児の要求をサポートするためにホルモンと代謝が大きく変化する [1, 2] という特徴があるため、哺乳類にとって難しいものです [3, 4] 。妊娠中、母体は胎盤を通して受精卵に適切な栄養素を供給する必要があり、その後、生まれたばかりの子犬は数週間にわたって授乳に依存する [5] 。これらのプロセスは、複雑なホルモンおよび神経学的相互作用によって支配され、母体の代謝に大きな変化をもたらし [5]、その結果、微量および多量栄養素に対する栄養需要が変化する [6, 7]. 妊娠中の代謝の標準からのわずかな逸脱でさえ、母体と子孫に深刻な結果をもたらすと主張されている [8] 。
犬では、妊娠期間が平均63日であるため胎児の発育が早く、雌犬が多数の受胎卵を持つ可能性があるため、代謝パラメータにおける妊娠関連の変化は、他の多くの哺乳類種よりもさらに集中する可能性があります。分娩は通常数時間続き、手間がかかり、しばしば疲弊する [9]。ホルモンの変化、子宮の肥大、痛み、不安、子宮収縮のため、妊娠中や分娩中に他のパラメータが変化することがあります [10]。さらに、イヌの内皮細胞性胎盤のタイプは、他の種に比べて子宮の退縮過程が長く、より集中的に行われます [11]。最後に、乳汁分泌や食事の変更を含む子犬の看護などの作業も、雌犬にとって困難なものである[1]。
妊娠、分娩、授乳期の生理、内分泌、代謝の特徴を理解することは、正常および異常な状態を理解し診断し、最適な支持的管理を行うために必要です[1, 5]。この点で、妊娠、分娩、授乳期に生理学的に変化するパラメータがあることを認識することが重要である[10]。しかし、主要な代謝物の供給不足は、胎児の成長異常や心臓[12]や神経組織[13]などの臓器の発達障害につながることが示されている。
メタボロミクスはオミックスに基づくアプローチで、血中血清中の代謝物に関する包括的な情報を生成し、個人の全身代謝の現状を広範囲に把握することができます[14、15]。ヒトでは、妊娠・授乳期の生理的・病態的な代謝の変化について、いくつかのメタボロミクス研究が行われていますが、犬での先行研究は行われていません。本研究では、妊娠・授乳期にイヌで起こる代謝の変化を明らかにし、ヒトで起こる変化との共通点や相違点を考察することを目的とした。
材料と方法
動物たち
本研究では、21種類の品種の個人所有の雌犬を合計27頭サンプリングしました（表1）。雌犬は、2018年3月から2019年12月まで登録された。登録するためには、牝犬は交配前の過去6カ月以内に一般的に健康であり、駆虫以外の投薬を受けていない必要がありました。さらに、犬は妊娠し、6つの時点でサンプリングに提示される必要があった。婦人科系疾患の既往を問いただしたが、サンプリング時にはどの雌犬にもなかった。飼い主の同意と承諾を得た。犬には、飼い主が選んだ個別の飼料を与えた。血液サンプルの採取は、ベルリン連邦州の動物福祉委員会の承認を得た（LAGeSo Berlin O 0095/18）。
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表1. 犬の妊娠・授乳期のメタボロームに関する研究に参加した雌犬の属性。
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牝犬は当初、排卵時期の提示を受けた。彼らは包括的な基準を満たした後、膣鏡検査と膣細胞診を含む最初の臨床検査と婦人科検査を実施した。
血液サンプリングとサンプル処理
本研究では、Hindererら[16]に従い、イヌの妊娠の3段階を定義した。血液サンプルを採取するために、合計6回の予約が行われた。最初のサンプルは、発情期（E）の排卵タイミングのための訪問で採取された。妊娠中（P）の3回のサンプリングは、すなわち、交配後11日目から19日目の間（P1）、23日目から32日目の間（P2）、および52日目から60日目の間（P3）に予約された。P2の検査では、雌犬が妊娠しているかどうかを判定するための超音波検査が行われた。この検査は、同じ予約時間内に試験検査を完了させながら、むしろ早く妊娠診断を受けたいという飼い主の希望を尊重するため、第2回目の第3回目の途中には予定されていなかった。5回目のサンプリングは、分娩後18〜24日目に行われた。最後の臨床検査（A）は、子牛の離乳から18〜24日後に実施した。
すべての血液サンプルは午前中または午後の早い時間に採取された。
分娩後、分娩（自然分娩または帝王切開）、子犬の数および体重（生存および死産）、3週間後の生存に関するデータが記録された。
血液サンプルは、頭静脈または伏在静脈からプラスチックチューブ（Sarstedt Tube 4.5 mL, Clotting Activator/Serum, 75 × 13 mm, Sarstedt AG & Co KG, Nümbrecht, Germany）に静脈穿刺により収集した。試料を室温で30～60分放置して凝固させ、5000rpmまたは2884gで5分間遠心分離した（Hettich Centrifuge EBA 20, Hettich, Tuttlingen, Germany）。血清は血清チューブ（Simport Cryovial sterile with lip seal design, external threads, 2 mL Tubes, Boloeil QC, Canada）に移し、出荷まで80℃の冷蔵庫に入れた。保管温度は毎日チェックし、測定温度の変動は-80℃から-83℃の間に保たれた。80℃での保存期間は11ヶ月から30ヶ月の範囲であった。
核磁気共鳴（NMR）分析には、血清が十分にあり、溶血が見られない完全なサンプルセットのみが提出されました。
出荷準備のため、チューブを1～3時間解凍し、0.3mlの量を2番目の血清チューブ（Simport Cryovial sterile with lip seal design, external threads, 2 mL tubes, Boloeil QC, Canada）に移し、両方のアリコートを再び直ちに80℃で凍結しました。フィンランドのPetBiomics社への一晩の輸送は、ドライアイスをたっぷり入れた発泡スチロールの箱で行われた。
核磁気共鳴（NMR）メタボロミクス解析
収集した血清サンプルのメタボローム解析には、検証済みで高度に自動化された犬固有のNMRメタボローム技術を利用しました[14]。この方法では、包括的なリポタンパク質分析、脂肪酸、トリグリセリド、コレステロール、アミノ酸、解糖および体液バランス関連の代謝物、新規炎症マーカーの糖タンパク質アセチル（GlycA）など、さまざまな分子グループから123種類の測定項目を定量化しました[14]。同様の方法は、ヒトの妊娠による代謝の影響に関する研究[2]など、ヒトのメタボロミクス研究[17-19]で大きく利用されています。この方法の技術的な詳細については、別の場所で説明されています[17-19]。
統計解析
すべての統計解析は、Rバージョン4.1.3（R Foundation for Statistical Computing, Vienna）を用いて実施した。まず、データの欠測をチェックした。データには、ランダムに欠落する代謝物の値は含まれていなかった。検出限界以下の値は、以下の統計解析でゼロ値として扱われた。
代謝物の選択には、Friedman-Test（反復測定ANOVAのノンパラメトリック代替法）を用いて、どの代謝物濃度が異なる時点間で有意な変化を示し、したがって妊娠の経過に影響されるかを決定しました。Friedman-Testでは、各動物の反復測定（1動物につき6時点）を考慮することができ、対応する帰無仮説は、妊娠の過程で各動物内の代謝物レベルに変化がないことです。観察されたデータに基づき、123のパラメータのすべてについて、正規性の仮定を確実にチェックすることはできなかった。そのため、より堅牢性の高いノンパラメトリックアプローチが選択された。すべてのp値は、Benjamini-Hochberg法を用いて多重比較のために補正され、調整p値のカットオフはp<0.05に設定されました。
オブザベーションの数が変数の数よりもはるかに少ない（27動物 << 123代謝物）オミックスデータでは、p値の解釈が限られるため、k-means Clusteringを使用して次元を削減した[19]。 k-means Clusteringは、各代謝物のzスケール値を使用して行われました。最適なクラスター数は、「gap」統計量（Rパッケージ「cluster」バージョン2.1.3、[20]）を用いて決定した。その後、代謝物間の生化学的関係（スーパー/サブカテゴリ、同じ代謝物の絶対値/相対値）に基づいてクラスターを修正し、123変数から5クラスターを効果的に作成した。クラスターで定義された代謝物の類似した変化は、共有または関連する生物学的プロセスによるものであると仮定しています。代謝物に対する時間点の影響を可視化するために、「局所推定散布図平滑化」（LOESS）を使用しました。また、代謝物の典型的な濃度を参照し、変化の大きさを強調するために、解析の基準間隔[9]をプロットに追加しました。
結果
本研究に登録された27頭の犬（表1）は、21種類の犬種に属し、体重中央値は22.8kg（最小：9.0、Q1：15.1、Q3：32.6、最大：56.4kg）であった。年齢中央値は4.35歳（Min: 1.98, Q1: 2.9, Q3: 5.77, Max: 8.1歳）であった。
図1は、妊娠中期（P2）に高値を示した代謝パラメータを示したものである。妊娠中期に低い、妊娠後期に高い、授乳期に高い、授乳期に低いという異なるパターンを示した代謝物をFig 2に示す（クラスター2、3、4、5）。
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図1. 妊娠中期に高い代謝パラメータ（クラスター1）。
イヌの妊娠期間中の代謝パラメータの変化（E＝発情期、P1-3＝妊娠初期/中期/後期、L＝授乳期、A＝離乳食後）。点は個々の測定値を示す。実線は、平均代謝物量の変化（LOESS）を示しています。破線は代謝物参照区間の上限と下限を示す[9]。p値はBenjamini-Hochberg補正を伴うFriedman-Testを用いて算出した。調整後のp値のカットオフはp< 0.05とした。
doi:10.1371/journal.pone.0284570.g001
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図2. 妊娠中期に低い代謝パラメータ、妊娠後期に高い代謝パラメータ、授乳期に高い代謝パラメータ、授乳期に低い代謝パラメータ（Cluster 2,3,4,5）.
イヌの妊娠期間中の代謝パラメータの変化（E＝発情期、P1-3＝妊娠初期／中期／後期、L＝授乳期、A＝離乳期後）。点は個々の測定値を示す。実線は、平均代謝物量の変化（LOESS）を示しています。破線は代謝物参照区間の上限と下限を示す[9]。p値はBenjamini-Hochberg補正を伴うFriedman-Testを用いて算出した。調整後のp値のカットオフはp< 0.05とした。
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ディスカッション
妊娠中および授乳期の代謝は、ダイナミックで正確にプログラムされたプロセスである[8]。このライフステージは、胎児または新生児の急速な成長と発達によって定義されるため[2、21]。肝グルコース出力の増加、末梢インスリン感受性の低下、肝インスリン感受性の変化、末梢インスリンレベルの低下などの代謝物適応により、ダムは妊娠中に低血糖を維持し [7, 22] 、栄養要求の増加にもかかわらず胎児の成長を支えることができる [7]. とはいえ、ダムと子犬の健康を確保するためには、それぞれの妊娠期に合わせた栄養補給が必要です [6]。母体および胎児の組織におけるタンパク質の沈着は、妊娠期間を通じて増加し、最も多いのは妊娠第3期であることが示されている [21] 。さらに、レプチンは妊娠中の食物摂取量の増加に比例して増加しますが、明らかな体重増加は60日目にのみ観察されました[23]。牝の血清中の代謝物の濃度は、羊水とアラントイン液の対応する濃度と組成に影響を与えます [7]。これらの液体は妊娠中に不可欠であり、代謝物、保護、正常な胎児の発達のための環境を提供する[24]。
評価されたパラメータのパターンの分析において、5つの明確なクラスターが観察されました。同定されたクラスターは、妊娠中期にパラメータが高い（クラスター1/図1）/低い（クラスター2/図2）、妊娠後期にパラメータが高い（クラスター3/図2）、授乳期にパラメータが高い（クラスター4/図2）/低い（クラスター5/図2）。クラスタリングは、各クラスタ内で代謝物濃度の上昇と低下が同じような時期に起こる、代謝物濃度の類似パターンに基づいて行われました。
クラスター1：妊娠中期にパラメータが高い
総脂肪酸は、有意差はないものの、他の時点よりも妊娠中の方が高い傾向にありました。しかし、個々の脂肪酸のモル濃度の上昇も観察され、これが総脂肪酸の変化を説明していると考えられる。さらに、総脂肪酸の上昇は、イヌを対象とした別の研究[5]や、胎児の要求を満たすために高濃度の脂肪酸が必要であることから、ヒトの妊娠においても観察されています[3]。脂肪酸は胎児の発達に重要な役割を果たし、母親の免疫系に対する調節作用にも関与している可能性があります[25]。オメガ3脂肪酸が抗炎症作用を持つことはよく知られており[26]、DHAなどの脂肪酸が、炎症解消と抗炎症に作用するレゾルビンと呼ばれる物質を増やすことが示されている[27]。代謝と免疫系の間のもう一つの強い結びつきは、免疫細胞の膜の脂肪酸組成が、貪食能力、T細胞シグナル伝達、抗原提示能力に影響を与えることです[28]。
遊離コレステロールの濃度（有意）は、妊娠中期に最も高くなった。同じパターンは、総コレステロールとエステル化コレステロール（いずれも有意ではない）にも反映された。これらの結果は、血漿中の総コレステロール濃度が妊娠初期に低下し、その後食事とは無関係に後期に上昇した、4つの異なる食事群に割り当てられた12匹の犬を評価した別の研究とは異なるものである[29]。これらの違いは、主に42日目に採取したサンプルについて言及しています。この時点では、我々は犬をサンプリングしていない。別の研究では、変化は見つかりませんでした[5]。しかし、サンプルは妊娠中の様々な、正確に指定されていない時点で採取されました。人間の妊娠中にもコレステロールが増加することはよく知られている[30]。
リポ蛋白は、カイロミクロン、超低密度リポ蛋白（VLDL）、低密度リポ蛋白（LDL）、高密度リポ蛋白（HDL）の4つに大別され、犬ではHDLが最も多く含まれるリポ蛋白です[31]。カイロミクロンとVLDLは血清トリグリセリドの主な担体であり、HDLとLDLは主にコレステロールを含んでいます[32]。
我々の結果は、リポタンパク質パラメータが、犬の妊娠と授乳の過程で異なるパターンを示すことを示している。HDL粒子（HDL-P）およびVLDL粒子（VLDL-P）の濃度は変化を示さないが、HDLサイズ、超大型HDL中の総脂質（XL-HDL総脂質）、LDL粒子（LDL粒子）濃度、LDLコレステロール、LDL中の総脂質（LDL総脂質）など、他の多くの項目は妊娠中期をピークにその後低下する。その他のリポ蛋白のパラメータは妊娠後期にピークを迎えます（クラスター3参照）。犬の妊娠中のリポタンパク質濃度の上昇は、他の研究でも示されている[29]。犬はユニークな脂質代謝を持ち、高コレステロール血症では実質的にコレステロールの多いHDL粒子を生成することがよく知られている。イヌ以外では、ヒトでは、これらのコレステロールは通常、よりアテローム性の高いLDL粒子に変化し、ヒトの動脈硬化のリスクを高めると考えられている[32]。
多価不飽和脂肪酸（PUFA %）（有意）およびPUFA（有意でない）の割合は、妊娠中期に高かった。同じ現象は、ヒトでも示されている[3, 25]。ヒトでは、多価不飽和脂肪酸（PUFA）は妊娠初期に母体の脂肪デポに蓄積され、胎児の成長速度が最大となりPUFAに対する胎児の要求が大きく高まる妊娠後期に胎盤移行が可能となる［33］。PUFAに対する高い需要は、犬でも示されている[13]。
オメガ3不飽和脂肪酸とオメガ3%は妊娠中期に高く（ともに有意）、オメガ6（有意ではない）とオメガ6%（有意）でも高かった。オメガ3およびオメガ6 PUFAは、神経組織、網膜組織、腎臓、肝臓、皮膚機能の生理的発達を確保するために必要です[29]。
ドコサヘキサエン酸（DHA）はオメガ3脂肪酸に属し、DHA％と同様に妊娠中期に有意に上昇した。脳の発達に寄与し、脳内脂肪酸の10％以上を占めるため、妊娠・授乳期に重要な役割を果たします[34]。DHAは、ヒトの妊娠中に増加しますが、総脂質に占める割合は減少します[35]。これは、DHAが胎盤を通過して胎児に優先的に移行することを示すと著者らは指摘している[35]。
オメガ6脂肪酸であるアラキドン酸（AA）およびAA％は、妊娠中期に有意に上昇した。同時に、同じくオメガ3脂肪酸でDHAとAAの前駆体であるリノール酸（LA）は、犬ではわずかに上昇するのみでした。LAとAAの濃度は、妊娠中の女性でも上昇します[35]。
パルミチン酸（PalA）とステアリン酸（SteA）を含む総飽和脂肪酸（SFA）は、犬では妊娠中にわずかに上昇した。ヒトでは、SFAとPalAの増加は、第3期まで顕著に高い[25]。
糖タンパク質アセチル（GlycA）は、いくつかの急性期タンパク質のN-アセチルメチル基プロトンシグナルを組み合わせた、全身性炎症の新しい分光学的マーカーである。犬では妊娠中期に顕著なピークを示し、これは他の最近の知見と一致する[5]。ヒトでは、このマーカーの個体内生物学的変異は少なく、そのシグナルに寄与する主な急性期タンパク質は、α1-酸性糖タンパク質、ハプトグロビン、α1-アンチトリプシン、α1-アンチキモトリプシンです[36]。GlycAは妊婦の方が非妊婦より高いことが示されている[3]。胎盤形成の過程で、このパラメータが上昇し、妊娠中期にピークに達することが説明できるかもしれません。フィブリノゲンやCRPなどの急性期タンパク質が妊娠後期に増加することはよく知られている[37, 38]。妊娠中の急性期タンパク質の増加は、12頭の妊娠した雌犬でも示されています[39]。
これらの知見は、妊娠中のビーグル犬8頭を対象とした研究に続くもので、「GlycAシグナルに寄与するα-1-酸性糖タンパク質は犬の妊娠中に上昇し、妊娠45日頃にピークを迎える」ことが示されています［40］。ヒトでは、同じくGlycAシグナルの一因であるα-1-アンチトリプシンが妊娠中に増加する[41]。
妊娠中期に顕著なピークを示すアミノ酸は、フェニルアラニンだけである。ヒトでは、フェニルアラニン、アラニン、ヒスチジンが妊婦で増加することが証明されている[3]。犬では、アラニンとヒスチジンは妊娠中に増加しないようです。フェニルアラニンはタンパク質合成に必要で、細胞内でチロシンに変換され、チロシンはタンパク質合成に使われるか、酸化されるか、重要な神経伝達物質のエピネフリン、ノルピネフリン、ドーパミンに変換される[42]。ラットにフェニルアラニンを過剰に与えると、その胎児の脳の増殖と肥大が損なわれることが示されている[43]が、健康なヒトの妊娠中やイヌの妊娠中のフェニルアラニンの食事による必要量はまだ決定していない。食事性フェニルアラニンの必要量は、成犬種と非妊娠犬種で異なることはないようである[44]。
クラスター2：妊娠中期に低いパラメータ
オレイン酸は、一価不飽和のオメガ9脂肪酸である。他の不飽和脂肪酸（クラスター1参照）と比較して、その濃度は妊娠中期にわずかに低下する。ヒトでは、オレイン酸は妊娠中に増加する[25]。
大型VLDL（L-VLDL）中の遊離コレステロールとリン脂質、および大型VLDL中の総脂質（XL-VLDL総脂質）は妊娠中期に大きく減少し、妊娠末期には増加する。妊娠中の全パラメータの増加は、ヒトでも観察されている[45]。
クラスター3：妊娠後期に高くなるパラメータ
様々なメカニズムにより、妊娠はインスリン抵抗性を引き起こし、グルコースの細胞内輸送を抑制し、イヌの血中グルコース濃度を上昇させる [4, 46, 47]. グルコース濃度は妊娠後期に著しく上昇し、離乳後まで高濃度のままである。妊娠していない雌犬に比べ、妊娠中の雌犬ではインスリン抵抗性が顕著であるにもかかわらず[38]、犬の妊娠糖尿病はまれである[48]。インスリン抵抗性のメカニズムはヒトでも同じである[49, 50]が、いくつかのグループが非妊娠時に比べて妊婦のグルコース濃度が低いことを発見している[3]。この低下を引き起こすメカニズムはよく分かっていない。潜在的な寄与因子としては、希釈効果、胎児胎盤ユニットによる利用の増加、β細胞機能の増加による母体への取り込みの増加、および/または不十分な肝生産がある [50]。
総トリグリセリド、LDLトリグリセリド、およびVLDLトリグリセリドは、妊娠後期に有意にピークに達する。これは、正常なヒトの妊娠における所見と一致する。Shenら[51]は、TG、TC、LDLコレステロールなどの脂質量は、妊娠中に徐々に増加し、出産前にピークに達することを明らかにした。一方、HDLコレステロール量は、第1期から第2期にかけて増加し、第3期にはわずかに減少した。さらに、ヒトの妊娠では、妊娠中のトリグリセリドの異常増加は、妊娠糖尿病と関連している[51]。イヌの妊娠中にトリグリセリドが異常に高くなることによる疾患相関の可能性については、さらなる研究が必要です。妊娠糖尿病と同様に、高血圧性疾患は犬の妊娠の一般的な合併症ではありません。興味深いことに、ヒトと異なり、犬のHDLトリグリセリドは妊娠や授乳期によって影響を受けない。
クラスター4：授乳期で高くなるパラメータ
乳酸とピルビン酸は、妊娠していない女性よりも妊娠中の女性でより高くなることが示されている[3]。乳酸、ピルビン酸、酢酸の濃度は妊娠後期から授乳期にかけて著しく上昇し、おそらくエネルギー代謝の高い要求を反映していると思われるが、その中央値はすべての時点で基準区間に収まっている。乳酸は、ヒトで使用されているように、犬の敗血症やその他の妊娠関連障害の指標として使用できるかどうか[52]、本研究に含まれるすべての雌犬は、乱れのない妊娠をしていたので、さらなる研究が必要です。
ロイシン、イソロイシン、バリンを含む分岐鎖アミノ酸（BCAA）の総濃度は、授乳期に顕著な上昇を示す。興味深いことに、イソロイシンとバリンは同じパターンを示すが、ロイシンは授乳期には低濃度を示す（クラスター5参照）。アミノ酸のグリシンも同様である。グルタミン、グリシン、バリン、チロシンは非妊婦と比較して妊婦で低く、イソロイシンとロイシンは妊婦と非妊婦の間に差は見られなかった[3]。
クレアチニンは妊娠中期に有意な減少を示し、これは犬[5]や妊婦における他の所見と一致する。妊娠中の糸球体濾過量の生理的な増加により、血清クレアチニンの濃度が低下することが述べられている[53]。さらに、妊婦では非妊婦と比較してクレアチニンが低いことが示されている[3]。
クラスター5：授乳期に低くなるパラメータ
妊娠後期から授乳期にかけて観察されるアルブミンの著しい低下は、イヌ[5]やヒトの正常妊娠時および妊娠後にもよく報告されています[3、54]。この減少は、生理的な血液希釈によって引き起こされると考えられていますが、生理的な浮腫につながる可能性があり、さらには子癇のような状態に関連する可能性もあります [54] 。また、イヌの妊娠後期には、アラント液中のアルブミン濃度が上昇することが示されている[24]。
ドコサペンタエン酸（DPA）も妊娠中に有意に上昇しますが、授乳期には有意に低下し、これはDPA％というパラメータでも確認できます。
アミノ酸であるヒスチジンの濃度は、授乳期に有意に低下する以外は、どの時点でも安定したままです。ヒスチジンを補給するとエネルギー補正後の乳量が増加することが牛で示されているように、ヒスチジンは乳生産に関与している可能性が高い[55]。
アミノ酸のロイシンは、妊娠初期にその濃度が有意に上昇し、妊娠中期、後期、泌乳期に低下することが示されました。これは他の分岐鎖アミノ酸とは対照的である（クラスター4参照）。牛で示されているように、ロイシンは乳汁分泌に重要な役割を果たすため、この減少は乳汁分泌と関連していると考えられる[56]。
研究の限界
メタボロームは、遺伝子やタンパク質の活性などいくつかの内部要因と、食事や環境要因などの外部要因によって影響を受けます[15]。本研究では、個人所有の犬を使用し、異なる条件下で飼育され、餌を与えられていた。さらに、21犬種、2～8歳の犬を対象とした。このような異質な条件が結果にどの程度影響したかは未解決である。しかし、実験動物よりも、妊娠中の犬に見られる現実の異質性をよりよく反映している可能性がある。ほとんどの犬は経験豊富なブリーダーが飼育しており、雌犬の生殖状態を考慮した適切な飼育と給餌が行われていると思われる。
さらに、妊娠中や授乳中の犬には許容されないため、サンプリング前に絶食させなかったという制限もある。また、血液サンプルの採取時期も数時間の軽い変動が見られたため、日中の影響を排除することはできない。しかし、通常は午前中に採血しているため、日内変動は小さいと予想される。また、1つの地域から採取された犬の数が少ないことも、潜在的な限界である。
また、ヒトの妊娠に関する知見との比較は、慎重に解釈する必要がある。犬の妊娠期間は約63日であり、かなり短く、子孫は通常よりはるかに大きい。子犬は生理的に未熟な状態で生まれ、母親の世話とミルクの供給に依存する[57]。この研究では、犬は1～12匹の子犬を出産した。
また、妊娠中の犬に関する研究では、いくつかの矛盾した結果が得られており、実際の代謝や血液学的所見の解釈は困難である[1]。例えば、妊娠中期から進行性の正常色性貧血を発症する雌犬がいることは40年以上前に報告されている[9]。これを正常と考える著者もいますが、ヘマトクリットは正常な基準範囲にとどめるべきであり、貧血のある雌犬は他の病気を併発していないか検査すべきであるとするグループもあります [58] 。
この研究のためのサンプルは、年間を通して採取された。しかし、同じ方法を用いた先行研究では、大半の代謝物には最小限の季節変動しか存在しないことが示されています[59]。したがって、データ解析の際に季節は考慮されませんでした。
今回の研究では、サンプルは分析前に-80℃で最大30ヶ月間保存されました。NMRプラットフォームの検証を行った以前の研究では、すべての研究代謝物が-80℃で少なくとも12ヶ月間安定でした[14]。しかし、より長期間の保存がイヌのサンプルに与える影響については不足しています。
多くの動物種では、妊娠中に検出された変化が、受精卵の存在とプロゲステロン濃度の上昇のどちらに関連しているかを判断することは困難な場合があります[39]。
結論
アルブミン、GlycA、脂肪酸、リポタンパク質、グルコース、アミノ酸のようないくつかの代謝物は、ヒトで示されたのと同様にイヌの妊娠と授乳期にパターンを示した。しかし、分岐鎖アミノ酸、アラニン、ヒスチジンのような他のいくつかのパラメータについては、そのパターンが異なるようである。
現在までのところ、ほとんどの代謝物について、観察された変化が腸からの再吸収の変化によるものか、母体組織での生産または代謝の変化によるものか、胎盤を通過することによるものかは不明である。また、特定の代謝物の胎児体液濃度が母体濃度の影響をどの程度受けるかについては、これまでほとんど調べられていない[7]。したがって、これらの疑問に光を当てるためには、さらに生物種を特定した研究が必要である。
妊娠中の分子変化と胚の発生や胎盤形成といった個別の生物学的事象との関係を理解することは、これらのプロセスの理解を助け、不妊や病気の原因についてより深く知り、これらの状態の治療法を特定するのに役立つと考えられる [59]. 妊娠中や授乳期の生理的変化を理解することは、これらの変化が病気や栄養失調の指標として誤解されないようにするために不可欠である。さらに、生理学的な変化に関する知識は、代謝物に関する研究を設計する際に、妊娠中または授乳中の雌犬を含めるかどうかなど、含める基準を調整したり、結果を解釈するために重要である。
さらに研究を進めることで、有害な妊娠転帰に関する研究との関連で、正常な妊娠における分子基準範囲を提供する必要があります[3]。また、メタボローム解析の結果は、産前・産後・産婦の生命機能のモニタリングや病気の早期発見に役立つと思われます[1]。
参考資料
謝辞
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