軽症/無症状COVID-19後に再活性化した潜伏ウイルスの唾液抗体指紋は、筋痛性脳脊髄炎/慢性疲労症候群の患者において独特である

哉百名


ORIGINAL RESEARCHの記事
Front. Immunol.、2022年10月20日
第2部 ウイルス免疫学
https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.949787
この記事は、Research Topicの一部です。
A year in review: ヒトにおけるコロナウイルス感染とウイルス免疫学

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軽症/無症状COVID-19後に再活性化した潜伏ウイルスの唾液抗体指紋は、筋痛性脳脊髄炎/慢性疲労症候群の患者において独特である
Eirini Apostolou1*、Muhammad Rizwan1、Petros Moustardas1、Per Sjögren2,3、Bo Christer Bertilson2,3、Björn Bragée2,3、Olli Polo3、Anders Rosén1* （敬称略
1スウェーデン、リンショーピン、リンショーピン大学、生物医学・臨床科学科、細胞生物学部門
2カロリンスカ研究所神経生物学・ケア科学・社会部門家庭医学・プライマリーケア部門、スウェーデン、ストックホルム
3MEセンター、ブラジェクリニック、ストックホルム、スウェーデン
背景 筋痛性脳脊髄炎／慢性疲労症候群（ME/CFS）は、多くの場合、ウイルス感染が引き金となって発症すると考えられている慢性疾患である。症状はCOVID-19/long-COVIDの急性後遺症と大きく重複しており、共通の発症機序が示唆されている。SARS-CoV-2感染は，持続的な潜伏ウイルス再活性化の危険因子であり，ウイルス感染後の疲労症候群の症状を説明することができる．本研究の目的は、まず、ME/CFS患者と健常者（HD）の軽度／無症状SARS-CoV-2感染に対する抗体反応に差があるかどうかを検討することである。第二に、COVID-19が両コホートにおいて潜在的なウイルスの再活性化を促すかどうかを解析することである。

方法 抗SARS-CoV-2抗体を、ワクチン非接種のME/CFS（n=95）およびHD（n=110）の血漿および唾液で、可溶性多重免疫測定法を用いて分析した。ヒトヘルペスウイルス1-6（HSV1, HSV2, VZV, EBV, CMV, HHV6）およびヒト内在性レトロウイルスK（HERV-K）の再活性化を唾液中の抗ウイルス抗体のフィンガープリントで検出した．

結果 SARS-CoV-2感染後3-6カ月で、唾液中のウイルス特異的抗体が大幅に増加し、両コホートで潜伏ウイルス（EBV、HHV6、HERV-K）の強い再活性化を示唆することが明らかになった。ME/CFS患者では、抗体反応は著しく強く、特にEBV-encoded nuclear antigen-1 (EBNA1) IgGはME/CFS患者で上昇し、HDでは上昇しなかった。また、EBV-VCA IgGは、SARS感染前のベースラインで、HDと比較して、患者において上昇していた。

結論 ME/CFSでは、潜伏ウイルスに対する抗ウイルスプロファイルが変化し、慢性的に覚醒していることが示唆された。SARS-CoV-2感染は、その軽症/無症状型であっても、口腔粘膜（唾液サンプル）の局所的な抗体指紋によって検出されるように、潜在性ヘルペスウイルス（EBV、HHV6）および内因性レトロウイルス（HERV-K）の再活性化の強力な引き金となる。これは、循環・血漿中では抗体の上昇が全身的に検出されないため、これまで示されなかったものである。

はじめに
筋痛性脳脊髄炎/慢性疲労症候群（ME/CFS）は、労作後倦怠感（PEM）、起立性頻脈症候群（POTS）、ブレインフォグ、認知障害、非リフレッシュ睡眠、筋肉痛、頭痛などの様々な症状を呈する、病因・病態不明の異質の慢性疾患である（1, 2）。すべてではありませんが、大半の場合、ウイルスまたは細菌感染後に発症し（3、4）、最初の感染症が治癒した後も症状が持続し、患者の健康状態が悪化します。特に、Epstein-Barrウイルス（EBV）による伝染性単核球症、Coxiella burnetii（Q熱）、Ebolaウイルス（エボラ出血熱）、SARS-CoVウイルス（ポストSARS症候群）などの重症感染症がME/CFS発症の引き金になります（5-7）。ME/CFSに似た症状のクラスターは、流行性感染症のアウトブレイク後に記録されている(8)。

感染後疲労症候群、特にME/CFSの症状は、SARS-CoV-2感染の重症度とは無関係に感染者の約30％に生じるCOVID-19の急性後遺症（PASC、ロングCOVIDとも呼ばれる）の症状と類似している(9). ウイルス感染症は、即時的および長期的な合併症を引き起こす可能性があります。急性感染期には、SARS-CoV-2（10）、EBV（11）、HHV6（12）のように、特定のウイルスが標的細胞に侵入し、ミトコンドリアを含む細胞機構を自らの都合の良いように乗っ取ります。その結果、細胞のエネルギー産生が損なわれ、広範囲の細胞機能に影響を与え、免疫反応や自己免疫反応が長引く可能性がある(9)。ME/CFSの疾患モデルとして、慢性感染症、慢性炎症、自己免疫、エネルギー代謝障害、自律神経系機能障害、ホルモン調節異常などが提案されている(6)。しかし、いずれのモデルも、感染症発症後のME/CFSの臨床像と長期にわたる健康状態の悪化を包括的に説明するものではない。

健康な人でも、肉体的・精神的ストレスやトラウマ的な出来事があると、潜伏ウイルスが再活性化することがよくある。しかし、これは機能的な免疫系による対抗作用によってバランスが保たれている。SARS-CoV-2感染は、持続的な潜伏ウイルス再活性化の潜在的な危険因子である(13-15)。これまでの研究で、入院中／集中治療室（ICU）治療中の重症SARS-CoV-2感染症例における持続的な潜伏ウイルス再活性化が報告されており、患者の生命に深刻な脅威を与えるものである。重症COVID-19患者の血清学的分析では、ヒト単純性1型（HSV1）（16）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、EBV、サイトメガロウイルス（CMV）に対するIgG抗体レベルの上昇、および血中のEBVおよびCMVウイルス血症の検出が確認され、ヘルペスウイルスの再活性化が確認された（17）。ICUに入院したSARS-CoV-2患者では、HSV1、VZV、EBV、CMV、ヒトヘルペスウイルス6（HHV6）が再活性化することが報告されている（18）。特にEBVの再活性化は回復の遅れと関連しており、PASCの根本原因として提案されている(19)。一方、HSVとCMVでは同様のウイルス感染後の疲労症候群が報告されている(16)。SARS-CoV-2感染では、幼少期に獲得する共生型ヘルペスウイルスとは別に、気管支肺胞洗浄液細胞および末梢血単核細胞（PBMC）において特定のヒト内在性レトロウイルス（HERVs）の発現が上昇することが報告されている(20)。HERVsは、ヒトの進化の過程で獲得されたユニークな内在性レトロエレメントであり、ヒトゲノムのかなりの割合（8%）を占めている。HERVsは複製欠損であるが、内在性レトロエレメントの転写は明らかである。HERVは、SARS-CoV-2のようなウイルス感染を含む、細胞内外のシグナルに反応する(21, 22)。

ME/CFS患者では、病気のイニシエーションと永続化における潜伏ウイルスの関与が集中的に研究されているが、対処は困難である。EBVの高率な活動性感染が報告されており、少なくとも一部の患者では、EBVが疾患発症の重要な因子であることが示唆されている(23)。さらに、HHV6BとHHV7のウイルス量は、健常対照者と比較してME/CFS患者の唾液サンプルで高いことが報告されており(26)、HHV6の部分再活性化（全血中のHHV6 small noncoding RNA U14）は患者の40%で証明されている(12)。

生物学的および臨床的マーカーは、重症SARS-CoV-2感染における後天性免疫抑制の状態を示しており、これらの患者における非監視下での長期にわたる潜在的ウイルス再活性化を説明できるかもしれない(27、28)。しかし、ほとんどの感染者は軽症か無症状であり(29)、長期CoVID症例に関する報告は必ずしも重症の初感染と相関していない(19)。本研究の目的は、ME/CFS患者およびマッチさせた健常ドナーの軽度あるいは無症状のSARS-CoV-2感染後の（再）活性化ユビキタスヘルペスウイルスおよび内在性レトロウイルスに対する抗ウイルス免疫応答について検討することであった。

結果
ME/CFS患者および健康なドナーの唾液および血漿中のSARS/CoV-2に対する抗体反応
SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）に対する抗体反応を、ワクチン接種前の全参加者の血漿と唾液で分析した（図1）。COVID-19参加者は、症状が軽度または全くなく、入院を必要としなかった。パンデミック開始から3～6カ月後のサンプリング時点で、ME/CFSコホートの18/95人（19%）が血漿RBD IgG陽性だったのに対し、HDの35/110人（32%）は陽性でした（図1、平均MFI 19,678 vs 18,071, p=0.94）。健康な血液ドナー（BD2015、n=50）から2015年に収集した血漿サンプルを使用して、カットオフレベルを定義しました（平均MFI+3SD; 5,889 MFI）（図1A）。この比較的高いカットオフレベルは、マルチプレックスアッセイで使用されるスパイクタンパク質上の複数の結合部位、および非感染プレパンデミック（2015年献血者）血漿中の低親和性IgGの存在によって説明することができます。

図1
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図1 SARS-CoV-2-RBD（RBD）に対する血漿および唾液の抗体反応 （A）2015年中、COVID-19前に採取したME/CFS患者（ME）、健康なドナー（HD）および献血者の血漿中のIgG（BD2015年）。ME、HD、および研究期間中にセロコンバージョンした研究参加者のグループ（感染前ドナー、pre-inf）の唾液中のRBDに対する抗体反応、（B）IgG、（C）IgM、（D）IgAクラスについて。SARS-CoV-2陽性/陰性のサブグループを定義するために使用されたカットオフ閾値は、破線の横線で示されている。血漿中のIgG反応については、カットオフレベルはBD2015のIgGレベル（BD2015、n=50；平均MFI + 3SD = 5889 MFI）から算出された。唾液中の抗体反応については、カットオフレベルは、プレインフドナーの抗体価から計算した（n=19；平均MFI + 3SD = IgGは820 MFI、IgMは1582 MFI、IgAは14303）。 E） ME患者（n=95）およびHD（n=110）の唾液中の総 IgG 濃度（ng/ml）。線は平均MFI（median fluorescence index）を表す。統計学的有意差はノンパラメトリックWilcoxon検定により算出した。

Dobanoら(30)は、成人非感染者でも同様の抗体価を観察している。IgG, IgM, IgAクラスのRBD抗体が口腔粘膜に局所的に放出されており、両コホートとも唾液中の抗体の「フィンガープリント」によって検出された。ME/CFSドナーの42/95 (44%) はRBD IgG+であったのに対し、HDの28/110 (25%) はRBD IgG+であった (図1B)。唾液中RBD抗体のカットオフ値は、研究参加時に血漿中RBD IgG陰性、唾液中RBD IgG, IgM, IgA陰性の19人（HD 15人、ME/CFS 4人、平均MFI+3SD）から推定され、その後この研究の過程でPCR結果陽性および/またはCOVID-19症状の立証で感染、さらに感染後唾液中RBD-抗体陽性となった。

唾液中のRBD IgMとRBD IgAを合わせると（図1C、D）、ME/CFSの58%とHDの41%が唾液中のRBD-抗体を有していた。RBD-抗体陽性のME/CFSの42%とHDの31%は無症候性感染者であった。さらに、ME/CFSでHDに比べて高いRBD IgG値が観察されたことが、唾液量、唾液分泌量、ドライマウスの違いによるものかどうかを評価するために、2つのコホートの唾液中の総IgG値を分析した。唾液中の総IgGは、ME/CFSと比較してHDで高いことがわかった（*p=0.0499、図1E）。

唾液および血漿中のSARS-CoV-2に対する抗体反応の違い：コホートの全身および局所反応者への層別化
血漿ではなく唾液で高いSARS-CoV-2特異的抗体価を示す研究参加者や、唾液と血漿の両方で陽性のドナーが多数存在したため、各コホートを次の3群に層別化した：1.全身性反応者（唾液RBDを伴うか伴わない血漿RBD抗体、全身性MEおよび全身性HDとする）、2.局所反応者（唾液RBD抗体のみ、局所MEおよび局所HDとする）および3.局所反応者（唾液のRBD抗体と局所HDの両方に反応）、および1.全身性反応者（血漿ME：SARS RBD抗体および唾液ME抗体、および局所HDの両方に反応）とした。RBD陰性反応者（陰性-MEおよび陰性-HDとする）。

SARS-CoV-2 RBDおよびNP抗体は、MEおよびHDの全身および局所反応者において解析された。唾液中のRBD-IgG値は、局所反応者と全身反応者の両方で、HDと比較してME/CFS患者で有意に高かった（それぞれp=0.0176とp=0.0136）（図2A、表S3、S7）。SARS-CoV-2核蛋白（NP IgG、IgM、IgA）については、群間差は認められなかった（図2D、E、F）。HDのコホート内では、全身性反応者と比較して、局所性反応者において高い唾液RBD IgM/IgA-反応が観察された：局所-HD vs 全身-HD：IgM.IgA.IgM: 局所HD vs 全身性HD: IgM: **p=0.0062, IgA: **p=0.0069; Figure 2B, C, Table S2B）。この観察は、自然粘膜B細胞抗ウイルス防御におけるIgAおよびIgMの重要性を強調するものである。

図2
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図2 MEおよびHDの全身および局所反応者におけるSARS-CoV-2 RBDおよびNP抗体。(A）IgG、（B）IgM、（C）IgAクラスのSARS-CoV-2-RBD（RBD）。SARS-CoV-2 NP（NP）：(D)IgG, (E)IgM, (F)IgAクラス. 全身性。血漿中の全身性反応についてRBD陽性の参加者。局所的。唾液中の局所反応にRBD陽性の参加者。陰性。血漿と唾液の両方でRBDが陰性であった参加者。データは中央値、25％および75％の箱ひげ図として表示されます。MFIは、中央値蛍光指数。ノンパラメトリックのクラスカル／ウォリス法および偽発見率調整（5%）による統計的に有意な差は、*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 で示される。(A-C)のC/Oと書かれた破線の横線は、図1の凡例で説明したように、唾液のカットオフ値を示している。

軽症/無症状COVID-19後の口腔粘膜における潜伏ヘルペスウイルスEBVとHHV6Aおよびヒト内在性レトロウイルスHERV-Kの再活性化
SARS-CoV-2感染が潜在的なウイルスの再活性化に寄与している可能性は、唾液中の抗体「フィンガープリント」分析によって明らかにされた。具体的には、6種類のヒトヘルペスウイルス1〜6（HHV1〜6：HSV1、HSV2、VZV、EBV、CMV、HHV6A）およびヒト内在性レトロウイルスK（HERV-K）に対する抗ウイルス抗体のIgG、IgMおよびIgAクラスについて調査した。その結果、ME/CFS患者では、HDと比較して、軽度/無症状のSARS-CoV-2感染後の唾液中の潜伏ウイルス再活性化のパターンが異なることが示された（図3および図4）。

図3
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図3 ME/CFS患者（ME）と健常者（HD）におけるヘルペスウイルスおよび内在性レトロウイルスHERV-Kに対する唾液中の抗体反応性。(A）エプスタインバーウイルスウイルスカプシド蛋白（VCA）IgG、（B）VCA IgM、（C）VCA IgA、（D）エプスタインバー核抗原1（EBNA1）IgG、（E）EBNA1 IgM、（F）EBNA1 IgA。(G）ヒトヘルペスウイルス6A（HHV6A）IgG、（H）HHV6A IgM、（I）HHV6A IgA、（J）ヒト内在性レトロウイルスK（HERV-K）IgG、（K）HERV-K IgM、（L）HERV-K IgA. Sys、血漿中の全身反応にRBDが陽性であった参加者。Locは、唾液中の局所的な反応にRBDが陽性であった参加者。Negは、血漿と唾液の両方でRBDが陰性であった被験者。データは、中央値、25％および75％の箱ひげ図として表示されます。MFI、中央値蛍光指数。ノンパラメトリックのクラスカル・ワリス法と偽発見率調整（5%）により、統計的に有意な差を*p < 0.05, **p < 0.01, p < 0.001; ns, non-significantで表示した。薄暗い点および破線は、抗体がないことを示す（アッセイバックグラウンドレベル）。薄暗い/灰色のp値asteriksは、Benjamini, Krieger, Yekutieliに従って、多重線形回帰と5%のFDRの調整による交絡因子（年齢と性別）分析後の有意性の喪失を示す。赤のp値asteriksは調整後に有意になったことを示し、黒のp値asteriksは調整後に変化がないことを示す。

図4
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図4 ME/CFS患者（ME）と健常者ドナー（HD）におけるヘルペスウイルスに対する唾液抗体反応性。(A) 単純ヘルペス-1ウイルス（HSV1）IgG、（B）HSV1 IgM、（C）HSV1 IgA、（D）単純ヘルペス-2ウイルス（HSV2）、（E）HSV2 IgM、（F）HSV2 IgA, (G）水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、（H）VZV IgM、（I）VZV IgA、（J）ヒトサイトメガロウイルス（CMV）IgG、（K）CMV IgM、（L）CMV IgA。全身性。血漿中の全身性反応についてRBD陽性の参加者。Sys、血漿中の全身性反応にRBDが陽性であった参加者。Loc：唾液中の局所反応にRBDが陽性であった参加者。Neg、血漿と唾液の両方でRBD陰性の参加者。データは、中央値、25％および75％の箱ひげ図として表示されます。MFI、中央値蛍光指数。ノンパラメトリックのクラスカル・ワリス法と偽発見率調整（5%）による統計的に有意な差は、p < 0.05, **p < 0.01 で示される。薄暗い点および破線は、抗体が存在しないことを示す（アッセイバックグラウンドレベル）。薄暗い/灰色のp値asteriksは、Benjamini, Krieger, Yekutieliに従って、多重線形回帰と5％のFDRの調整による交絡因子（年齢と性別）分析後の有意性の喪失を示す。

全身性反応性ME群は、陰性ME群と比較して、EBVウイルスカプシド抗原（VCA）およびEBNA1、ならびにHHV6Aに対するIgGおよびIgMの有意な上昇を示した（図3A、D、G、H、J；表S2A、S6）。一方、対応する全身性HD群では、陰性HDと比較して抗ウイルス抗体の上昇は認められなかった（図3、表S2B、S5）。

局所反応性ME群では、陰性ME群に対してEBV（VCA IgG、VCA IgA、EBNA1 IgG）、HHV6A（IgGおよびIgM）およびHERV-K（IgG）に対する抗ウイルス抗体レベルの有意な上昇が認められた（図3A、C、D、G、H、J、表S2A、S6）。対応する局所HD群では、陰性HDと比較して、EBV（VCA IgG、VCA IgM、VCA IgA）、HHV6A（IgM、IgA）、HERVK IgG、IgM、IgAに対する抗ウイルス抗体レベルの有意な上昇が認められた（図3A-C、H-L、表S2B、S5）。

潜伏ウイルス再活性化はHDと比較してME/CFSでより顕著である
SARS-CoV-2感染がME/CFSとHDの2つのコホート間で潜伏ウイルス再活性化に及ぼす影響の違いを、全身性または局所性反応者のいずれかのペアを比較することで検討した。まず、全身性MEでは、VCA IgG、HHV6A IgG、HERV-K IgGレベルが、全身性HDと比較して有意に高いことが分かった（図3A、G、J、表S3）。また、唾液分泌反応群では、HSV1 IgGおよびHSV2 IgGの力価は、局所-MEでは局所-HDに比べ有意に高かった（図4D、表S3）。しかし、年齢と性別を交絡因子として調整した後では、HSV1 IgGとHSV2 IgGについて統計的な差は検出されなかった（図4、表S7）。IgM抗体価の解析でも差は認められなかった。EBNA1 IgM、HSV1 IgM、VZV (IgG, IgM, IgA)、CMV (IgM, IgG) に対して、両コホートは特異的な抗体を持たない（例えば、バックグラウンドレベルを測定する）ことが分かった（図3、図4）。

年齢と性差が抗ウイルス抗体レベルに及ぼす影響の検証
ME/CFSとHDのコホートは、性別分布（ME/CFSは女性82％、HDは65％）と年齢分布（ME/CFSは平均年齢52±11歳、HDは44±13歳）が異なっていた。そこで、Benjamini, Hochberg, Yekutieli FDRを5%として、それぞれの従属変数（抗体）に対して重回帰分析を行った（n=16）。表S5、S6、S7は、年齢と性別で補正した後のHDコホート内およびME/CFSsコホート間の統計解析のデータを示す（図3、図4も参照）。まず、Neg-HD vs Loc-HDを見出した。RBD IgGは男性で高く（**p=0.0027）、RBD IgMは年齢が上がるほど低く（**p=0.0016）なっている。Loc-HDsとSys-HDsの比較。男性でRBD IgAが高い（*p=0.0172）。Neg-ME vs Loc-ME。男性でRBD IgAが低い（*p=0.0257）。Loc-ME vs Sys-ME。RBD IgMは男性で低い(*p=0.0337)。次に、ME/CFSおよびHDコホートの全参加者を対象とした解析では、16種類の抗体反応のうち2種類は性別が有意な交絡因子でしたが、14/16では性別は統計的に有意ではありませんでした。HERV-K IgGとHHV6A IgMについては、女性と男性で異なる抗体プロファイルが見られた（図5A、B）。特に、ME/CFSの女性は、男性に比べてHERV-K IgGの上昇が強かった。しかし、サンプル数が少ないので、これは慎重に解釈されなければならない。2/16の抗体において、年齢が有意な交絡因子であった。HSV1 IgGとHSV2 IgGである。また、年齢を連続変数として挿入し、交絡因子としての年齢を分析した。年齢が交絡因子であることが判明した。年齢分布の詳細な解析の結果、HDでは30〜40歳の年齢層の参加者が複数いたのに対し、ME/CFSコホートではそうでなかった。このため、2つのコホートを年齢間隔で層別化したところ、抗ウイルス力価に関する年齢差はすべて40歳未満の参加者に見られ、40歳以上の参加者ではサブグループによる違いは見られなかった（図5C〜E）。また、伝染性単核球症（IM）の既往、および／または抗ウイルス剤や副腎皮質ステロイドの投薬が、本研究で対象とした潜伏ウイルスに対する抗体反応に影響を与えるかどうかについても分析した。病気の引き金となったIMの既往があるME/CFS患者39人（病気の平均期間13.0年）と既往のない患者を比較しました。有意差は認められませんでした。ME/CFS参加者の14％が、アシクロビルおよび/またはコルチコステロイドなどの抗ウイルス剤による薬物療法を報告しているのに対して、HDコホートでは3％であった。これらの薬剤を使用している人と使用していない人の抗ウイルス剤の力価の統計的検定では、差は認められなかった（p>0.05）。

図5
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図5 ME/CFS患者（ME）と健常者ドナー（HD）における女性 vs 男性唾液および年齢ベースの抗体プロファイルの比較。(A) ヒト内在性レトロウイルス K (HERVK) に対する男性/女性の IgG 反応、および (B) ヒトヘルペスウイルス 6A (HHV6A) に対する女性および男性の全参加者での IgM 反応。(C) 40歳未満（左グラフ）と40歳以上（右グラフ）の単純ヘルペスウイルス1（HSV1）に対する年齢依存性IgG反応。単純ヘルペスウイルス2型（HSV2）に対するIgG反応（D）40歳未満（左グラフ）および40歳以上（右グラフ）。(E）40歳未満（左のグラフ）と40歳以上（右のグラフ）の参加者のVCAに対するIgAレスポンス。Sysは、血漿中の全身性反応にRBDが陽性であった参加者。Loc, 唾液中の局所反応にRBDが陽性であった参加者。Negは、血漿と唾液の両方でRBDが陰性であった被験者。データは、中央値、25％および75％の箱ひげ図として表示されます。MFI、中央値蛍光指数。ノンパラメトリックのクラスカル・ワリス法と偽発見率調整（5%）による統計的に有意な差は、*p < 0.05, **p < 0.01 と表示されている。

対応する陰性グループと比較した、局所および全身反応における唾液抗体価の差（倍数変化）は、EBV、HERV-KおよびHHV6に対する増大した反応を強調して、表S5、S6、S7に示されている。SARS-CoV-2感染の影響のまとめとして、各コホート内および各コホート間の潜伏ウイルス再活性化（口腔粘膜のIgG、IgM、IgA抗体反応指紋に基づく）については、それぞれのコホート内での違いはあるがコホート間では差がない（図6A、B）。対応する陰性グループに対する局所的および全身的反応における唾液抗体価の変化の倍数を示す階層的クラスタ化ヒートマップは、EBV、HERV-KおよびHHV6に対する反応の増大を強調しています（図6B、表S5、S6、S7）。

図6
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図6 SARS-CoV-2感染による潜伏ウイルス再活性化の影響のまとめ。(A）口腔粘膜のIgG、IgM、IgA抗体反応フィンガープリントに基づく各コホート内の比較。統計的に有意な差のある抗体反応のみをグラフに表示。局所反応者。(B) 階層的クラスター化ヒートマップは、各グループ内およびグループ間の局所的および全身的反応における唾液抗体価の変化（p値を含む）を示しています。ノンパラメトリックのクラスカル・ワリス法と偽発見率調整（5%）による統計的に有意な差は、*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 として示されている。

SARS-CoV-2感染前後の個人を追跡することにより、潜在ウイルスの局所再活性化をペア解析で確認した。
SARS-CoV-2感染前後のヘルペスウイルスに対する唾液抗体反応性のペア解析は、第1回サンプリング後、本研究の期間中（2020年12月から2021年1月の第2回パンデミックウェーブ）にSARS-CoV-2に感染した参加者のサブグループ（n=19、HD15名、ME/CFS4名）に対して行われた。感染は、PCRおよび/または確立された特異的症状のいずれかによって記録され、ペアサンプルにおけるRBD IgG（データなし、p=0.03）およびIgM反応の有意な上昇によって確認された（データなし、p=0.04）。SARS-CoV-2感染前後の抗体量を比較すると、同一人物内でVCA IgG, HSV1 IgG, HERV-K IgM, CMV IgGの有意な上昇を認めた（図7A-D）。サンプル数が限られているため、HDと比較してME/CFSで増加が見られるかどうかについての結論は得られない。

図7
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図7 SARS-CoV-2感染前後のヘルペスウイルスに対する唾液抗体反応性のペア解析。(A) SARS-CoV-2感染前後の同一人物におけるエプスタインバーウイルスカプシド抗原（VCA）IgG、（B）単純ヘルペス1ウイルス（HSV1）IgG、（C）内在性レトロウイルス（HERV-K）IgM、（D）サイトメガロウイルス（CMV）IgG (n=19)．データは、感染前後の19人のSEM付き平均抗体値で表示されている。MFI、中央値蛍光指数。Paired Wilcoxon-signed rank testによる統計的に有意な差はグラフに示されている。

ME/CFS患者では，口腔粘膜局所に潜伏するウイルスに対するベースライン抗体応答が増強されている．
SARS-CoV-2感染とは無関係に潜伏ウイルス再活性化の状態を評価するために、ME陰性者とHD陰性者を比較した。陰性MEでは、VCA IgGのみが陰性HDと比較して有意に高値を示した（図3A、表S7）。

SARS-CoV-2感染では、唾液中に潜伏ウイルス再活性化の明確な抗体フィンガープリントが生成されるが、血漿中では生成されない
最後に、SARS-CoV-2および潜伏ウイルスに対する抗体反応が、口腔粘膜の局所（唾液）および血漿中の全身で同等であるか否かを判定した。RBD IgG、NP IgG、VCA IgGおよびHSV1 IgGをこの2つの領域で分析した。SARS-CoV-2反応に関しては、血漿中のRBD IgGおよびNP IgG（図8A、B、表S4A、B）は、全身反応者の唾液中のRBD IgG反応（図2A、D、表S2A、B、S3、S5、S6、S7）と相関があった。一方、血漿中ではVCA IgGとHSV1 IgGは有意差を示さなかったが（図8C、D）、唾液中ではVCA抗体の上昇により、潜在性EBV再活性化と一致する明確な抗体フィンガープリントが生成されていることが確認された。HSV-1 IgG値の中央値は上昇したが、有意差には至らなかった。(図3A、4A、表S5、S5、S7）。

図8
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図8 SARS-CoV-2感染では、唾液中に潜伏ウイルス再活性化の明確な抗体フィンガープリントが生成されるが、血漿中には生成されない。(A) ME/CFS患者（ME）と健康なドナー（HD）におけるSARS-CoV-2-RBD（RBD）、（B）SARS-CoV-2 NP（NP）、（C）Epstein-Barウイルスカプシド抗原（VCA）、（D）HSV-1（Herpes simplex virus 1）。Sys、血漿中の全身反応にRBDが陽性であった参加者。Locは、唾液中の局所的な反応にRBDが陽性であった参加者。Negは、血漿と唾液の両方でRBDが陰性であった被験者。データは、中央値、25％および75％の箱ひげ図として表示されます。MFI、中央値蛍光指数。ノンパラメトリックのクラスカル・ワリス法と偽発見率調整（5%）による統計的有意差は、**p < 0.01, ****p < 0.0001で示される。

考察
SARS-CoV-2の軽度・無症状感染は、口腔粘膜の局所的な抗体反応として検出されるように、潜在的な共生ウイルスの再活性化を誘発する証拠を提供するものであった。この反応は血漿中では観察されなかった。抗ウイルス抗体の特徴は、ME/CFS患者とHDs患者で異なっている。第一に、抗EBNA1抗体の上昇はME/CFSに特有のものである。第二に、ME/CFSでは、潜伏ウイルスの再活性化が、局所反応者と全身反応者の両方に見られる。HDと比較して、ME/CFS患者では、SARS-CoV-2感染がなくても、ベースライン時にVCA IgGの抗体上昇が見られた。

最近、無症状感染の頻度が予想以上に高いと推定されている。我々の研究では、ME/CFS患者の42％、HDの31％が無症候性感染者であることが判明している。2020年12月まで、COVID-19が確認された世界人口のうち40.5％が無症状であった(29)。唾液中にSARS-CoV-2特異的な抗体があるが血液中にはない研究参加者が何人かいたので、コホートを局所反応者と全身反応者に層別化した。ME/CFS患者のコホートでは、35%が局所反応者、19%が全身反応者であった。HDの場合は、16％と32％であった。驚くべきことに、HDの局所反応者は誰一人として症状を訴えず、自然界における第一線の防御機構が有効であることを示しています。ME/CFS患者については，インフルエンザ様症状が頻繁に見られるため，COVID-19関連症状については結論を出すことができず，無症状/未知の感染の定義については，血液と唾液の抗体価に依存した。局所粘膜-鼻腔免疫はインターフェロン活性を含む明確なサインを示し、SARS-CoV-2防御に重要な役割を持つことが次第に明らかになってきている(30, 31)。

SARS-CoV-2に対する局所粘膜抗体特異的反応は、唾液中の総IgGレベルが同程度であっても、HDと比較してME/CFS患者においてより顕著に観察された。これは、複数の慢性疾患を持つ患者では、SARS-CoV-2 spike protein-1を含む病原体関連分子パターン（PAMPs）に対する炎症反応が亢進しているという仮説と一致する（32）。しかし、細胞媒介性免疫応答に関しては、ME/CFS患者は、反応のないナチュラルキラー細胞（33）、CD8+T細胞の細胞傷害性の低下（34）および活性化、ならびに制御性T細胞の増加（24）割合（35）などの障害を示している。ME/CFS患者は、SARS-CoV-2に対する局所応答が増強されているが、血漿中の全身応答はHDのそれと同様であった。最近の研究では、ME/CFS患者からのサンプルは、ACEおよびACE2遺伝子座のメチル化および遺伝子発現レベルの変化を示し、この患者がSARS-CoV-2に感染するリスクが高い可能性が示唆された(36)。

注目すべきは、性別が2/16の抗ウイルス反応に有意な影響を及ぼしたが、16のうち14では統計的な有意差は認められなかったことである。ME/CFSの女性参加者におけるHERV-K IgGおよびHHV6A抗体反応は、男性に比べてより顕著な上昇を示した。この観察は、さらなる研究を必要とし、サンプルサイズが小さいため、性別のデータは慎重に解釈されるべきである。唾液中の抗ウイルス反応に対する年齢の影響は、2/16抗体で有意であった。HSV1 IgGおよびHSV2 IgGについては、重回帰分析および40歳未満と40歳以上のサブグループ化によって検出された（図6）。しかし，伝染性単核球症の既往，抗ウイルス薬や副腎皮質ステロイドの服用は，再活性化した潜伏ウイルスに対する抗体反応に影響を与えなかった．年齢が局所粘膜の抗ウイルス反応に影響を与えることは、他の研究者によって観察されているが(24)、さらなる詳細な研究が必要である。

潜伏ウイルスの再活性化は、外因性ウイルス感染、外傷、環境要因、精神的ストレスなど多くの要因によって、また老化現象の一部として引き起こされる可能性がある。最近，重症のSARS-CoV-2感染が，入院中やICU治療中の患者におけるヘルペスウイルス（HSV1，VZV，EBV，CMV，HHV6）の再活性化に関連していた（19）．本研究では，感染者全員が軽症・無症状を呈していた．しかし，COVID-19は，ME/CFSとHDの両方でEBV，HHV6およびHERV-Kの再活性化を誘発した（図6）．EBVとHERV-Kに対する抗体の有意な上昇も、COVID-19の前後で分析された個体で観察された（図7）。

EBVは、一生の間にほぼすべてのヒトに感染し、急性期を経て、生涯にわたってウイルスが持続する。EBVはB細胞に感染し、エピソームとして非分裂の安静時メモリーB細胞に潜伏します。再活性化すると、ウイルス粒子が口腔粘膜に放出されます。これらは、B細胞のポリクローナルな活性化を引き起こし、免疫グロブリンの分泌を引き起こすことが知られている(37)。長期にわたるB細胞の活性化は、自己免疫反応を引き起こす危険性を高めると考えられています(38) (39)。ME/CFS患者では、高い確率でEBVの活性化が観察されており、少なくとも一部の症例では、EBVが疾患発症の重要な要因であることが示唆されている(23)。EBVがME/CFSの単なる「イニシエーター」なのか、それとも病気の「ドライバー」なのかは、まだ解明されていない。しかし、この仮説は、最近EBNA1が「ドライバー」として同定された多発性硬化症におけるEBVの関与を思い起こさせるものである(40)。驚くべきことに、本研究でも、EBNA1はME/CFSコホートにおいてユニークな存在として際立っており、COVID-19後に有意な局所抗EBNA1 IgG放出を引き起こしている。HDでは抗EBNA1の上昇が認められなかったため、この知見を追跡調査することは非常に重要である。高いVCA力価は現在または過去の被曝を示し、高いEBNA1 IgGはアポトーシスEBV+ B細胞からのEBNA1-DNA複合体の長期放出を示す可能性がある(41)。いくつかの疑問が残されている。抗EBNA1抗体によって、多発性硬化症に見られるような交差反応性自己抗体（抗原擬態）が生成されるのか？(40）、ME/CFS患者では抗ウイルス反応が増強されているにもかかわらず、免疫防御がEBVの再活性化を厳密に監視・制御できないという事実の背後にあるメカニズムは何であろうか？

我々のグループが以前に行った研究では、ME/CFS患者と健常者ドナーのヘルペスウイルスに対する全身性のIgG抗体反応を評価した(25)。有意差は認められなかったが、抗体反応性のわずかな相対的差異から、一部の患者の免疫系が健常対照者とは異なる方法でユビキタスヘルペスウイルスと相互作用していることが示唆された(25)。EBVとHHV6AのdUTPaseの産生が増加していることが最近ME/CFS患者で証明され、高親和性抗体と長寿命プラズマ細胞に不可欠なT濾胞ヘルパー細胞の分化を誘導することが示唆された(42)。本研究では、全身性MEおよび局所性MEの両方において、COVID-19後に潜伏ウイルスに対する唾液抗体反応が有意に強くなることを示す証拠を提供するものである。重要なことは、非感染のME/CFS患者では、非感染のHDと比較して、潜在的なEBV VCAに対するIgG応答が有意に上昇しており、ウイルスの再活性化の「ベースライン」状態が高いことを意味していることである。ME/CFS患者におけるヘルペスウイルスに対する抗体反応の上昇は、さらに注目されるべきものである。ME/CFS患者、そしておそらくPASC患者の免疫細胞は、老化を思わせる状態にあるというのが、もっともらしいシナリオである。老化細胞は、PAMPsに対する反応を変化させ、免疫反応を高めるが異常な状態にすることが示唆されている。これらの免疫応答は、自然免疫細胞による炎症性サイトカインやケモカインの産生を増加させ、老化の表現型をさらに増幅させる(32)。Satoら(43)は、最近、ME/CFS患者のB細胞レパートリーが偏っていることを発見し、感染性/ウイルス性疾患の引き金になっていることを報告した。この所見はまた、ウイルス感染の特徴である抗体産生形質芽細胞におけるインターフェロン（IFN）誘導性遺伝子（IFNシグネチャー）のアップレギュレーションと相関している。

本研究では、軽度／無症状のSARS-CoV-2感染が、HERV由来のタンパク質に対する抗体反応を局所的および全身的にアップレギュレートすることが明らかになった。このことは、SARS-CoV-2を含む外来性ウイルス感染がHERVの転写を誘発し、新たに侵入してくる病原体に対する防御を助けることが示唆される並行研究によって支持されている(44)。逆に、以前からの特徴的なHERV発現パターンは、外因性SARS-CoV-2感染を調節することができ、SARS-CoV-2の重症度や症状の違いを説明することが提案されている (45)。我々の研究では、HERV-Kに対する免疫応答は、ME/CFS患者でより顕著であった。HERV-Kに対するIgG応答は、ME/CFS患者の3つのサブグループすべてで、それぞれのHDに対して一様に有意に高いことがわかった。このことは、ME/CFS患者のPBMCにおけるHERV-K遺伝子発現の上昇に関する以前の報告（46）、および非コード化遺伝要素の広範な低メチル化を示すエピジェネティック研究（47）と一致する。HERV-Kに対する抗体反応の上昇の生理的意義は、まだ決定されていない。HERVは生殖細胞系列に組み込まれ、メンデル方式で遺伝し、HERV抗原に対するIgM抗体反応は自然抗体であると提唱されてきた(48)。祖先のレトロウイルスのエンベロープタンパク質は、ヘルペスウイルスの再活性化と潜伏状態の持続を制御することが示唆されており（49）、ME/CFS患者におけるヘルペスウイルスのシグナルの変化と関連する可能性を示している。最近、EBV、HERV-K/W、HHV-6が多発性硬化症の炎症カスケードを促進する累積的な役割を担っていることが提唱された（41）。SARSワクチンが、移植患者で観察されるのと同様に、潜在的なウイルスを再活性化するかどうかを分析するために、さらなる研究が必要である(50)。

本研究の主要な発見の一つは、唾液中に見出された潜伏ウイルス再活性化の明確な抗体指紋が、血漿中では検出されなかったことである。このことは、唾液では統計的に強い差があったのに反して、群間比較では有意差がないことからも明らかである（図3、4、8）。ヘルペスウイルスは口腔内に多く存在するため（51）、我々の研究で示されたように、その再活性化とその後の免疫反応は唾液中で容易に追跡可能である。ウイルスの再活性化の引き金となる事象は、軽症/無症状と重症のSARS-CoV-2感染の場合では、十分に強固でない可能性がある。したがって、軽症/無症状感染後の抗体シグナルは局所的であり、血漿中に検出されない可能性がある。潜在的なウイルス反応とは対照的に、唾液中のSARS-CoV-2に対する反応は血漿中の反応と相関している。この結果は、抗SARS-CoV-2抗体を調べる際に、唾液検体を使用することをさらに支持するものである(52-54)。さらに、我々は、潜伏ウイルスに対する抗体反応を分析する場合、唾液検体が望ましいことを提案する。

我々の発見は、SARS-CoV-2感染がその軽症／無症状型であっても、潜伏ヘルペスウイルスおよび内在性レトロウイルスの再活性化の強力な引き金となることを示すものである。このことは、潜伏ウイルスに対する免疫応答が亢進しているME/CFS患者にとって特に重要である。さらに、ME/CFSにおけるSARS-CoV-2感染では、抗体のフィンガープリントがユニークなものと増大したものがあり、この症候群における免疫反応の変化を示す証拠がさらに追加された。これらの変化は、COVID-19を含む一次/外因性ウイルス感染に遭遇した際に、宿主の防御を損なう可能性がある。もし、PASCでも同じ現象が証明されれば、症状を長引かせるメカニズムの候補となる可能性がある。この結果は、臨床的にも重要な意味を持つと思われる。私たちの結果は、採取しやすい免疫学的検査の設定に貢献し、ME/CFSや場合によってはPASCの診断を強化する可能性があります。さらに、我々の結果は、抗ウイルス免疫反応を高めるための治療法が、潜伏ウイルスの再活性化と適切な免疫反応の間の微妙なバランスを調整することによって、ME/CFS患者に恩恵をもたらす可能性があることを強調している。

材料と方法
研究デザイン。研究参加者はワクチン非接種者で、2020年後半に登録された。健康なドナーは、Linköping大学・病院での発表によって登録された。ME/CFSコホートは、Brageé ClinicでME/CFSと診断された患者の中から、スウェーデン国家デジタルヘルスケア1177.seの調査用ガイドを使用して登録された。すべての患者は、COVID-19の流行以前に診断されたものである。両コホートとも、3か月間隔でフォローアップのサンプリングとインタビュー、アンケート回答が行われた。この追跡調査のデータは、その間に陰性からSARS-CoV-2陽性にセロコンバージョンした個体の判定に使用された。これらの感染前の唾液サンプルは、SARS-CoV-2抗体陽性のカットオフベースライン基準として使用された。

研究対象者 コホート1は、ME/CFS患者95名からなり、軽度のSARS-CoV-2感染から回復したCOVID後の患者と非感染患者を含んでいる。この研究に含まれるME/CFS患者は、ストックホルムのブラゲー・クリニックで2003年カナダ合意基準（1）に従って診断され、他の内科的または神経学的疾患を除外した。コホート2は、ME/CFSの診断歴のない110人の健康なドナー（コホート名：HDs）からなり、COVID-19の症状が軽度から中等度の参加者と、非被曝者が含まれている。COVID-19前の血漿サンプル（n=50）は、2015年にLinköping University Hospitalの匿名健康血液ドナーから収集され（BD2015と呼ぶ）、SARS-CoV-2陰性および陽性サンプルのカットオフレベルを定義するために使用された。

参加者登録の除外基準は、現在活動中の感染症および/または感染症症状の存在と18歳未満とした。したがって、参加者はサンプリング時に活発なSARS-CoV-2や他の感染症の証拠がなかった。すべての参加者は積極的にアプローチし、連続した順序で登録された。COVID-19の回復者は、発病時に軽症か無症状の感染症を呈しており、入院した者はいなかった。ME/CFS患者の疾患の重症度は、医師により1（軽度）〜4（非常に重度）の尺度で評価された。ME/CFSの引き金となる出来事（感染、外傷、ストレス、ワクチン接種、その他）、罹病期間、過去の感染症に関する情報は、自己申告式のアンケートで検索された。人口統計学と臨床的特徴は、表1にまとめてある。研究参加者は、偏り／選択のない連続的（ランダム）な登録が行われた。女性/男性の比率（4/5）および年齢分布（51±11歳）は、少なくとも2/3の症例が人生の最も生産的な時期の女性であると記述したヨーロッパでのME/CFSに関する疫学研究（55、56）と一致する。

表1
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表1：人口統計学的および臨床的特徴。

血液サンプル。末梢血は10mL EDTAチューブ（Cat#10331254, BD Vacutainer, Fisher Scientific, Göteborg, Sweden）で採取された。10 mL までの全血を遠心分離（2,000 g、15 分、4℃）による血漿分離に使用し、アリコートはさらなる分析まで -80℃ で保存した。血液サンプルは、唾液サンプルと同じ訪問先で採取された。

唾液サンプル。唾液採取に先立ち、参加者は水で口をゆすぎ、前1時間に絶食、喫煙を控えたこと、ガムを噛んだことを確認するよう指示された。また、口腔内の病気や怪我を記録するよう求められた。内服薬を服用していないこと、サンプリングの最低1時間前から歯磨きをしていないこと、サンプル採取前24時間以内に歯科治療をしていないことが条件とされた。ドナーには、受動的流涎により、50mLの滅菌円錐チューブに5mLの唾液サンプルを提供するよう依頼された。フォローアップサンプリングは1年間、3ヶ月ごとに行われ、その後、唾液サンプルは製造元の指示に従ってSaliva Bio Swabs (Salimetrics, Carlsbad, CA) を使用して収集された。簡単に説明すると、参加者は綿棒を口の中に4分間置くように指示された。その後、飽和した綿棒を15 mLの保存チューブに移し、直ちに凍結するか、実験室で処理するために受け取り次第、氷上で保存/輸送した。サンプルは遠心分離（2600g、30分、4℃）して、細胞と不溶物を分離した。上清を除去し、1/1000 v/v complete™ protease (Cat#11836170001, Sigma-Aldrich Sweden AB, Stockholm, Sweden) および Pierce™ phosphatase inhibitor cocktails (Cat#88667, Thermo Scientific, Göteborg, Sweden) で補完し、続いて分析まで-80℃で分注、保管した。アッセイ当日、サンプルは解凍し、分析前に微量遠心分離（2600 g、30分、4℃）を行った。

血液および唾液中の抗体分析 製造元のプロトコールに従い、抗原のカップリングにMagPlex® microspheres (Luminex Corp., Austin, TX) を使用してSuspension multiplex immunoassay (SMIA) 分析を実施した。簡単に言うと、200 µL のマイクロスフェア原液 (1.25 × 107 ビーズ/mL) に、0.05% (v/v) Tween 20 を含むリン酸緩衝食塩水 (PBS: 0.15 M塩化ナトリウム、10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.4) で薄めた 10 μg の組み換えタンパク質抗原 (表 S1) のいずれかを加えてカップリングし、室温 (RT) でロッキングシェーカー上で 15 分インキュベーションした。その後、ビーズを磁気分離器（Cat#40-285, Milliplex® MAG handheld magnetic separation block for 96-well plates, Millipore Corp.）を使用して0.5 mL StabilGuard solution（Cat#SG01-1000, SurModics, Eden Prairie, MN）で洗浄し、0.05%（v/v）Tween 20を含む400 mLのリン酸塩溶液に再懸濁した。MO）を使用し、400 µLのStabilGuard溶液に再懸濁した。このビーズを4℃、暗所にて保管した。結合した組換えタンパク質抗原、抗体、二次抗体の完全なリストを表S1に示す。

血液サンプルについては、1/1000に希釈した血漿50μL、唾液サンプルについては、1% (v/v) BSA (Cat# SRE0036, Sigma-Aldrich Sweden AB, Stockholm, Sweden) (PBS-T+1% BSA) を含むPBS-Tで2倍希釈したサンプルを平底96ウェルμClear non-binding microtiter plate (Cat#655906, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) の1ウェルに50μL追加した。次に、ボルテックスし超音波処理した抗原結合ビーズ混合物（50ビーズ/μLをPBS-Tに懸濁）50μLを各ウェルに添加した。プレートを暗所で、800rpmのプレートシェーカーで、1時間インキュベートした（RT）。その後、磁気プレートセパレーター（Cat#40-285, Milliplex® MAG handheld magnetic separation block for 96-well plates, Millipore Corp.）を用い、100 µLのPBSでウェルを2回洗浄した。MO)を使用した。ビーズを、PBST+1% BSA中の1 µg/mLのヤギ抗ヒトIgG-PEまたはヤギ抗ヒトIgM-PE標識抗体（表S1）100 µLに再懸濁し、800 rpmで回転しながら暗所で30分インキュベートした。その後、ビーズをPBS+1% BSAで2回洗浄し、100 µLのPBS+1% BSAに再懸濁し、FlexMap 3D® 装置 (Luminex Corporation, Austin, TX) で製造者の指示に従って分析した。各ビーズ番号について最低100イベントを読み取るように設定し、中央値を求めてデータの解析を行った。ブランクとして抗原結合していない裸のビーズを、ネガティブコントロールとしてPBS-T+1% BSAウェルを入れた。

唾液中の総IgGの分析 唾液中の総IgG量は、自社開発のSMIAを用いて評価した。ヤギ抗ヒトIgG-Fcアフィニティー精製未添加抗体をMagPlex® マイクロスフィアーに結合させた。1%(v/v)のBSAを含むPBS-Tで希釈した2.5 µlの唾液と検出ステップにヤギ抗ヒトIgG-PEを用いて、上記のようにSMIAを実施した。唾液中の総 IgG 濃度 (ng/mL) は、既知濃度 (ng/mL) のヒト gamma-globulin の最適化標準曲線に対して算出されました。

統計学 データは、観察された群間の差の統計的有意性の決定のために分析され、p値＜0.05は有意であるとみなされた。すべての統計解析は、SAS Institute JMPプログラム（v 13.2.1）またはGraphPad Prismソフトウェア（v.9.1.2）を使用して行われた。ME/CFS群とHDs群の比較には、ノンパラメトリックのクラスカル・ワリス検定を用いて多重比較を行い、2段階のBenjamini, Krieger and Yekutieli（BKY）手順（57）で偽発見率（5%）を制御した。交絡因子（年齢、性、単核球症）の決定のために重回帰を行い、BKYに従って偽発見率5％にコントロールした。感染前後の比較には、検証群でペア分析およびWilcoxon signed rank testを用いた。統計的に有意な差は、図中に *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 と表示した。

研究の承認 すべての参加者登録手順および血液/唾液サンプリングは、確立された倫理基準に従い、地域倫理委員会（Dnr. 2019-0618）に提出し承認された研究プロトコルに従って実施された。人口統計学的特性、医療データおよびサンプルは、研究参加者が研究プロトコルを理解したことを認めた後、インフォームドコンセントを提供した後に収集された。

データの利用可能性に関する声明
本論文の結論を裏付ける生データは、著者により、不当な予約なしに利用可能となる予定である。

倫理に関する記述
ヒト参加者を含む研究は、スウェーデン倫理審査局、地域倫理委員会（Dnr.2019-0618）によって審査・承認された。患者/参加者は、この研究に参加するために、書面によるインフォームド・コンセントを提供した。

著者による貢献
EAは、研究調査の設計、サンプリングの実施、実験の設計と実施、データの分析、原稿の執筆を行った。MRは、実験の設計と実施、データ解析を行った。PMは、サンプルの収集とデータの解析を行った。PS、BCB、OP、BBは研究設計に参加し、患者との接触を担当し、サンプルと臨床データを提供した。ARはプロジェクトのコンセプト立案、監督、資金提供、設計を行い、データを分析し、原稿を執筆した。すべての著者が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。

資金提供
本研究は、Swedish Research Council (4.3-2019-00201 GD-2020-138), Swedish Cancer Society (no. 211832Pj01H2/Infection-Autoimmunity-B-lymphoma grant to AR) および Linköping University (AR) から資金援助を受けている。

謝辞
リンショーピン大学での試料採取にご協力いただいたIngela Jacobsson氏、患者との面談にご協力いただいたKent Nilsson氏（医学博士）、ストックホルムのBragée ClinicでME/CFS患者からの試料採取を行ったSusanne Faxell氏、Susanne Belboul氏に感謝いたします。Linköping大学のフローサイトメトリーコア施設のスタッフ、統計解析にご協力いただいたMats Fredrikson博士、ヒートマップ作成にご協力いただいたBjörn Gylemo氏に感謝いたします。最後に、すべての研究参加者に感謝したい。

利益相反
PS、BCB、BB、OPはブラジェクリニックからの収入があり、BBは一部オーナーであることから、利益相反の開示を宣言する。

残りの著者は、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言している。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.949787/full#supplementary-material に掲載されています。

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キーワード COVID-19、潜伏ウイルス、ヘルペスウイルスの再活性化、筋痛性脳脊髄炎/慢性疲労症候群、ME/CFS、EBV、HERV、HHV6A

引用元 Apostolou E, Rizwan M, Moustardas P, Sjögren P, Bertilson BC, Bragée B, Polo O and Rosén A (2022) Saliva antibody-fingerprint of reactivated latent viruses after mild/asymptomatic COVID-19 is unique in patients with myalgic-encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome. Front. Immunol. 13:949787。doi: 10.3389/fimmu.2022.949787

Received: 2022年05月21日; Accepted: 2022年10月07日
公開：2022年10月20日

編集者

ジョージ・アンダーソン（CRCスコットランド＆ロンドン、イギリス
査読者

Nuno Sepulveda, ワルシャワ工科大学, ポーランド
Sarah Jane Annesley, La Trobe University, オーストラリア
Copyright © 2022 Apostolou, Rizwan, Moustardas, Sjögren, Bertilson, Bragée, Polo and Rosén. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。


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