共生細菌によるフェニルプロパノイドの産生と腸内環境の安定化
共生細菌によるフェニルプロパノイドの産生と腸内環境の安定化
Geng Hu,Liying Liu,Xiuxiu Miao,Yanan Zhao,Yanan Peng,Xianyao Li
初出：2022年11月30日
https://doi.org/10.1111/1751-7915.14180
について
セクション
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概要
Salmonella Enterica serovar Enteritidis（S.Enteritidis）は鶏の腸管に定着し，ヒトに感染する可能性がある。S. Enteritidisに対する鳥類の抵抗性機構を解明するために、我々は2つの中国地方鶏品種を利用し、相互交配（CrossおよびReverse-cross）を実施した。2系統の交雑種にS. Enteritidisを2日齢で経口接種し、接種後3日目にサンプリングしたところ、2系統ともS. Enteritidisに対する抵抗性を示した。マルチオミクス、微量代謝物、機能パスウェイ、相関微生物の解析方向に沿って、12種の微生物がS. Enteritidisチャレンジで繁栄し、おそらくフェニルプロパノイドの生産を高めることでクロスの腸内安定性に寄与することを見出した。この結果は、腸内細菌叢に由来する共生・抵抗機構の解明に役立つと思われる。
はじめに
Salmonella Enterica serovar Enteritidis (S. Enteritidis) は、卵や鶏肉への感染により、過去40年間に世界中で最大の疫学的変化をもたらした (Barrow et al., 2012)。非宿主特異的な血清型として、S. Enteritidisは鶏の消化管に侵入し、疾患の兆候をほとんど、あるいは全く伴わずに一定期間コロニーを形成します（Kogut & Arsenault, 2017; Wigley, 2014）。この静かな侵入のため、汚染された動物を分離することは困難であり、その後、家禽の水平および垂直伝播をもたらす（Beaumont et al.、2009）。
同定された約2600の血清型のうち、S. Enteritidisはヒトおよび家禽の最も一般的な臨床分離株に現れる（Knodler & Elfenbein, 2019; Stevens et al, 2009）。動物とヒトの健康のためには、宿主におけるS. Enteritidisのコロニー形成と病原性をさらに理解することが必要である。鳥類の消化管は多様な微生物が高度に生息しており、宿主と共生関係を保ちながら、腸管全体の健康状態や疾病状態に貢献している（Mon et al.） 3週齢以上の鶏の糞便微生物叢を接種した孵化したばかりの鶏は、その後のS. Enteritidisチャレンジから保護できることが報告されており（Varmuzova et al.、2016）、微生物叢に由来するコロニー形成抵抗性が示唆されています。
コロニー形成抵抗性に関する研究は、条件（酸素、栄養、ニッチ）および細菌の抗生物質（例えばバシトラシン）のための競争に関して豊富であるが、腸内細菌叢の複雑さのために、この生態系の理解は、特に感染の文脈では不完全なままである（Eckburgら、2005；Hooper & Gordon、2001；Hu、Liu、Miao、Zhao、Peng、ら、2022；）。サルモネラ感染症の基礎生物学に基づき、新しいテクノロジーと慎重な実験デザインを組み合わせることで、免疫のメカニズムを定義するための探索パイプラインが加速されます (Barrow et al., 2012)。ここでは、中国の2つの地鶏（広西八尾と済寧百合）を利用して、相互交配を行った。この2系統の雑種は、遺伝的背景が類似している。S. Enteritidisに対する相互交配鶏のトランスクリプトーム、マイクロバイオーム、メタボロームの違いを比較することにより、宿主と腸内細菌叢の共生関係を探り、宿主由来の耐性ではなく、微生物叢由来の病原細菌に対するコロニー形成耐性に着目している。
材料と方法
動物および実験デザイン
ニワトリは、相互交配による2つの集団［交雑種（広西八尾♂×済寧八利♀）および逆交雑種（広西八尾♀×済寧八利♂）］から得られた。各雑種について、性別混合、サルモネラ菌陰性の鶏100羽を孵化当日に無作為に2群（1群50羽）に分け、2つの独立したアイソレーター（32〜35℃、50〜60％RH、24時間照明）で水と抗生物質を含まない飼料に自由にアクセスできるように飼育した。敷材は約0.5cmの開口部を持つ単層のプラスチックメッシュであった。S. Enteritidis（CVCC3377）株は中国獣医文化収集センター（中国、北京）から購入した。栄養ブロス（Hopebio, Qingdao, China）で37℃、220rpmの振盪で一晩培養後、菌液を1531gで5分間遠心分離し、滅菌PBSで1.0 × 108 cfu/mlに懸濁した。生後2日目に1群にサルモネラ処理群としてS. Enteritidisを1羽当たり0.3ml経口接種し、もう1群には対照群として同量のPBSを模擬接種した。サルモネラ感染に対するニワトリの防御戦略の3段階（Kogut & Arsenault, 2017）によると、感染後2-4日は抵抗性から耐性に変容する時期であるとされている。そこで、接種後3日目（dpi）にサンプルを採取した。各群9～12羽のニワトリを頸椎脱臼により犠牲とした。中節の盲腸組織は RNA 解析のために無菌的に採取し、16S rRNA 遺伝子解 析とメタボローム解析のために盲腸内容物全体を混合して採取した。この実験手順を別のハイブリッドで繰り返した。こうして、Cross Control (CC, n = 3 for transcriptome, 11 for microbiome and 4 for metabolome), Cross Treatment (CT, n = 3, 11 and 7), Reverse-cross Control (RC, n = 3, 9 and 6) and Reverse-cross Treatment (RT, n = 3, 9 and 7) という 4 群が生成された。サンプルの偏在は、主にサンプル重量によって制限された。糞便内容物は、Majorbio Biotech Co. (中国、上海)に送付し、マイクロバイオームシーケンスとメタボローム解析を行った。このとき、マイクロバイオームシーケンス（n = 40）の消費により、後者の必要性を満たす重量のサンプルは少なくなった（n = 24）。動物実験は、山東農業大学実験動物管理使用委員会の承認を得た（許可番号：SDAUA-2018-058）。動物の苦痛を軽減することに努めています。
トータルRNA単離、ライブラリー調製、シークエンス
詳細は、私たちの以前の研究（Hu, Liu, Miao, Zhao, & Li, 2022）に記載されています。簡単に説明すると、mirVana™ miRNA Isolation Kit (Ambion, AM1561)を用いて盲腸組織からtotal RNAを抽出した。RNAサンプルの品質は2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) とNanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA) で確認した。ライブラリーは、TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold (Illumina, RS-122-2301) を用いてメーカーの説明書に従って構築し、Illumina HiSeq X Tenプラットフォームで配列決定した。各サンプルの平均98.57 Mクリーンリードを保持し、HISAT2を用いてニワトリゲノム（GRCg7b）にマッピングした。各遺伝子のFPKMはCufflinksで算出し、各遺伝子のリードカウントはHTSeq-countで取得した。全体として、RNAシーケンスのQ30 baseは92.23-94.02%、GC contentは45.63-47.48%、サンプルとゲノムの比較率は93.51-94.45%であった。RNA配列決定と予備解析は、Shanghai OE Biotech Co. (中国、上海)で実施した。
細菌 DNA 抽出と 16S rRNA 遺伝子配列の決定
詳細は、我々の以前の研究（Hu, Liu, Miao, Zhao, Peng, et al., 2022）に記載されている。簡単に説明すると、Soil DNA Kit (Omega, D5625-01) を用いて、製造者のプロトコルに従って、糞便内容物の試料から細菌DNAを抽出した。DNAサンプルの品質はNanoDrop 2000および1%アガロースゲル電気泳動で確認した。細菌16S rRNA遺伝子のV3-V4領域は、以下のプライマーペアを用いて増幅した。338F, ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, および806R, GGACTACHVGGTWTCTAAT。PCR産物は、標準プロトコルに従って、Illumina MiSeqプラットフォーム（Illumina、米国サンディエゴ）でペアエンドシーケンス（2×300）された。予備的な品質管理とマージの後、operational taxonomic unit (OTU)はUPARSEを用いて類似度99%カットオフでクラスタリングし、キメラ配列はUCHIMEを用いて同定・除去した。各16S rRNA遺伝子配列の分類は、Silva138 16S rRNAデータベースに対してRDP Classifierアルゴリズムにより信頼度閾値70%で分析した。すべてのサンプルは30,221リードに希釈された。16S rRNA 遺伝子の配列決定と予備解析は、Majorbio Biotech Co. (中国、上海)で行った。
液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（LC-MS）分析
各サンプルの糞便内容物50 mgに、400 μlのメタノール：水（4：1、v/v）溶液を添加した。この混合物をハイスループット組織破砕機Wonbio-96c（Wanbo, Shanghai, China）により-10℃で6分間、続いて40 kHzで30分間5℃で超音波処理した。試料を-20℃で30分間静置し、タンパク質を沈殿させた。13,000 g、4℃で15分間遠心分離した後、上清をサンプルバイアルに慎重に移し、LC-MS分析に供した。品質管理サンプルは、アリコートを混合して調製し、それに従って分析した。これらの試料は、再現性を評価するための一連のデータを提供するために、分析期間中、一定の間隔で注入されました。
代謝物のクロマトグラフィー分離は、ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm × 2.1 mm i.d., 1.8 μm; Waters, Milford, USA) を搭載した Thermo UHPLC システムで行われました。移動相は，水：アセトニトリル（95：5，v/v）（溶媒A）およびアセトニトリル：イソプロパノール：水（47.5：47.5：5，v/v）（溶媒B）中の0.1％ギ酸から構成されていた。溶媒のグラデーションは、0～0.1分、0%B～5%B、0.1～2分、5%B～25%B、2～9分、25%B～100%B、9～13分、100%B、13～13.1分、100%B～0%B、13.1～16分、0%B～0%Bの条件で変化させて系の平衡をとりました。サンプル注入量は2μl、流速は0.4ml/minとした。カラム温度は40℃に保たれた。分析期間中、これらのサンプルはすべて4℃で保存された。質量分析データは、ポジティブまたはネガティブイオンモードで動作するエレクトロスプレーイオン源を備えたThermo UHPLC-Q Exactive質量分析計を使用して収集されました。最適条件は、ヒーター温度400℃、キャピラリー温度320℃、シースガス流量40arb、Auxガス流量10arb、イオンスプレー電圧フローティング、ネガティブモード時-2800V、ポジティブモード時3500V、MS/MS用正規化衝突エネルギー20、40、60eVローリングに設定されました。Full MSの分解能は70,000、MS/MSの分解能は17,500であった。データ取得は、データ依存の取得モードで行った。検出は70-1050 m/zの質量範囲にわたって行った。
UHPLC-MS/MS分析後、生データをProgenesis QI 2.3 (Nonlinear Dynamics, Waters, USA) に取り込み、ピーク検出とアライメントを行った。前処理の結果、保持時間、質量電荷比（m/z）値、ピーク強度からなるデータマトリックスが生成されました。どのサンプルセットでも80%以上検出された代謝物の特徴は保持されました。フィルタリング後、代謝物レベルが定量下限を下回った特定のサンプルについて、代謝物の最小値をインプットし、各代謝物フィーチャーの合計で正規化しました。QCの相対標準偏差が30％を超える代謝フィーチャは破棄されました。正規化処理とインピュテーションの後、log2変換したデータで統計解析を行い、比較群間の代謝物レベルの有意差を明らかにした。これらの代謝的特徴のマススペクトルは、Human metabolome database (HMDB) (http://www.hmdb.ca/), KEGG compound database (https://www.kegg.jp/kegg/compound/) and Metlin database (https://metlin.scripps.edu/) などの信頼できる生化学データベースで検索し、精密質量、MS/MSフラグメントスペクトル、同位体比の差を使用して同定しました。
統計解析
DESeq2, PICRUSt, Wilcoxon rank-sum test, Student's t testの解析は、OEBiotech Cloud (https://cloud.oebiotech.cn), Majorbio Cloud (www.majorbio.com), Microsoft EXCEL 2016で実行した。図中の有意水準は、* (0.01 ≤ p < 0.05), ** (0.001 ≤ p < 0.01), *** (p < 0.001) と表記した。棒グラフはGraphPad Prism 8.0ソフトウェアで作成し、平均値±SEMで表示した。
データの入手方法
トランスクリプトームシーケンス、マイクロバイオームシーケンス、メタボローム測定の生データは、それぞれBioProject Accession Number CRA005292、CRA004605、OMIX718でNational Genomics Data Center (https://ngdc.cncb.ac.cn/) に寄託されました。
結果
メタボロームにおける表現型の相互交配間の不一致
前回の研究（Hu, Liu, Miao, Zhao, Peng, et al., 2022）で述べたように、16S rRNA 遺伝子配列決定の結果、サルモネラ群（CT および RT）では S. Enteritidis が平均 1.09%（0.01%～4.27% ）検出されたが対照群（CC および RC）では検出されず、 S. Enteritidis が鶏の糞便中にコロニー形成する可能性が示唆された。他の臓器のコロニー形成単位は測定していない。いくつかの関連研究は、S. Enteritidisの経口接種が肝臓や脾臓などの鶏の内臓に感染することを示していた（Matulovaら, 2013; Schokkerら, 2012）。
トランスクリプトーム（n = 12）、マイクロバイオーム（n = 40）、メタボローム（n = 24）の研究において、それぞれ 15,205 遺伝子、943 OTU、1348 既知代謝物を取得しました。トランスクリプトームデータと定量的検証の結果、サルモネラ菌群では炎症反応項（GO enrichment）に富む30個の発現差異遺伝子全てが発現上昇したことから、チャレンジ時にmRNAレベルで炎症反応が引き起こされることを確認した（Hu、Liu、Miao、Zhao、& Li、2022年）。制御遺伝子ACOD1、TNIP3、IL-10の急激な発現上昇を考慮すると、3dpiで炎症反応が抗炎症耐性に変化していると推察された（Hu, Liu, Miao, Zhao, & Li, 2022）。
その後、3つのオミックスデータセットに基づき、主成分分析（PCA）を実施した。予想通り、サルモネラ群は対照群から第1主成分（PC1）で分離され（図1A）、これはサルモネラチャレンジの因子と推測され、全差異の41.09%に寄与していました。同時に、特にマイクロバイオーム（図1B）およびメタボローム（図1C）において、相互交配の2つの実験間でバッチ効果が見られ、それぞれ36.87％および37.20％のPC1によって反映されている。鶏の遺伝子型は、2つの近交系間でS. Enteritidis感染に対する抵抗性に限定的な影響を及ぼすことが報告されている（Monら、2015）。理論的には、相互の交配は病原体に対する遺伝的抵抗性が類似しており、環境や微生物要因に依存しにくいことを提案した。
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図1
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バッチ効果を無視すると、S. Enteritidisチャレンジは、トランスクリプトームとマイクロバイオームに関して、Reverse-crossと同様にCrossにも大きな影響を与えることが分かった（図1A,B）。興味深いことに、メタボロームに関しては、Reverse-crossではまだ有効であったが、Crossではチャレンジの影響はわずかであった（Figure 1C）。この状況は、差分代謝産物の数によって裏付けられています。False Discovery Rate (FDR) < 0.05 および Variable Importance in the Projection (VIP) > 1の閾値で、交差種には60、逆交配種には251の代謝物があった（Table S1）。CCとRC間の糞便内容物の接近物質組成を考慮すると（図2）、相互交配間の外的要因はかなり排除された。遺伝的・環境的背景が類似していることから、メタボロームの表現型は主に糞便微生物叢に起因するものと思われる。
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図2
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十字架におけるフェニルプロパノイドの異常な発現上昇
さらに、CrossとReverse-crossでそれぞれ60個と251個の代謝産物を分析した。HMDB分類によると、脂質とフェニルプロパノイドが最も多くの化合物を含む2つのスーパークラスであった（図3）。脂質に関しては、コントロールと比較して、Crossでは13種類（アップレギュレーション11種類、ダウンレギュレーション2種類）、Reverse-crossでは76種類（アップレギュレーション57種類、ダウンレギュレーション19種類）の代謝物が差分として検出された。頻度（13/60対76/251）または傾向（11/2対57/19）のデータは、相互のクロスの間で近似していた。しかし、フェニルプロパノイドに関しては、コントロールと比較して、Crossでは12種類（アップレギュレーション11種類、ダウンレギュレーション1種類）、Reverse-crossでは36種類（アップレギュレーション12種類、ダウンレギュレーション24種類）の代謝物の差異が見られた。また、Crossでは11/1が、Reverseでは12/24と異常に高い発現量傾向を示した。また、相互交配のフェニルプロパノイドの差分には、同じ代謝物が3つだけ存在したが、チャレンジ時の変化は全く逆であったことに注意が必要である。このことから、互いの交配種のフェニルプロパノイドの変化は全く異なり、交配種のフェニルプロパノイドの複数の代謝物がReverse-crossのそれと比べて顕著に増加していることが分かりました。
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図3
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クロスにおけるフェニルプロパノイド生合成経路の一貫したアップレギュレーション
フェニルプロパノイドは、植物の二次代謝産物の一群である（KEGG: map00940）。異種物質であることと、CCとRCの間で糞便内容物にこの種のものがおおよそ含まれていることから（103対102で98共通、図2）、相互の交配間でのフェニルプロパノイドの相違は、糞便微生物相に起因するものと推測された。16S rRNA遺伝子配列のデータをもとに、PICRUStツールを用いて、糞便微生物相の機能パスウェイを予測した（表S3）。その結果、フェニルプロパノイド生合成経路（KEGG: map00940）は、Crossではコントロールに比べて有意に増加したが（p = 0.010）、Reverse-crossでは増加しなかった（図4）。このことから、Crossに含まれる特定の微生物がこの機能的経路に寄与している可能性が示唆された。
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図4.
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フェニルプロパノイドと微生物との密接な相関関係
フェニルプロパノイドの代謝物12種と、Crossに最も多く含まれるOTU50種の間のスペアマン相関解析を構築しました（図5）。このように、図中の一番上の代謝物は、Crossでチャレンジした際に唯一減少したため、他の代謝物とは異質なものであった。他の代謝物では、12 の OTU（サルモネラ OTU607 を除く）が少なくとも 1 つの代謝物と有意かつ正の相関を示し（アスタリスクと赤い背景でマーク）、フェニルプロパノイド生成に関与していることが示唆された。これらの OTU は、1 つの Bacilli クラスを除き、ほとんどが Clostridia クラスに属していた。16S rRNA遺伝子配列の解像度が低いため、これらのOTUの情報は最大でも属レベルにしか達しない（図6）。Erysipelatoclostridium属の1OTU（OTU485）、 [Eubacterium] coprostanoligenesグループのノランク属（OTU710）1OTU、およびBlauti属の7OTUが含まれる。LachnospiraceaeのBlautia属（OTU263）、Ruminococcus属（OTU627）、未分類の属（OTU886、OTU328、OTU761、OTU368、OTU439）から7OTUを抽出。OscillospiraceaeのColidextribacter (OTU449) に属する1つのOTU、RuminococcaceaeのNegativacillus (OTU269) および未分類の属 (OTU391) に属する2つのOTU。
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図5
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図6
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続いて、12個のOTUの存在量を相互の交配間で比較した（図7、表S4）。その結果、交雑種では、12個のOTUはすべて存在し、チャレンジにより発現量が増加する傾向が見られた。5つのOTU（OTU710, OTU328, OTU368, OTU449, OTU269）の増加はかなり有意であった（p < 0.10）。一方、Reverse-crossでは、12個のOTUのうち7個（OTU263, OTU269, OTU368, OTU627, OTU439, OTU391, OTU485）は散発的であるか全くない。3個のOTU（OTU761、OTU710、OTU449）はチャレンジによりダウンレギュレーション傾向を示し、2個（OTU886、OTU328）だけが豊富で有意な増加が見られた（p＜0.001）。この12個のOTUの増加は、クロスのフェニルプロパノイド生合成経路とフェニルプロパノイドの生産を促進する可能性がある。一方、Reverse-crossでは、一部の種が減少したためか、フェニルプロパノイド生合成経路および関連代謝物の増加は見られなかった。
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図7
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考察
本実験で用いた相互交配は、1400km以上にわたって地理的に隔離された2つの中国地鶏品種、広西姚と済寧百合から作出されたものである。地鶏は長い間、地理的・生殖的に隔離されているため、相対的にホモの遺伝子型を持つ自然近交系と見なすことができる。互恵交配は親株を逆にした交配法である(Vaiserman et al., 2013)。互恵交配による2つの雑種は、実は同じ遺伝源を共有している。鶏の遺伝子型は、2つの近交系間でS. Enteritidis感染に対する抵抗性に限定的な影響を与えることが報告されている（Mon et al.、2015）。2つの地域のニワトリと比較すると、その相互の交配は遺伝的背景の影響を受けにくく、我々の新しい研究に反映されていた、ハイブリッド間で共通の反応を見つけるのに役立つでしょう（Hu、Liu、Miao、Zhao、& Li、2022；Hu、Liu、Miao、Zhao、Peng、et al,2022)。
マルチオミックス解析と代謝物の差分数から、サルモネラ菌チャレンジは交配種よりもむしろ逆交配種に大きな影響を与えたと推論されました。さらに、フェニルプロパノイドの11種類の代謝物が、Crossではチャレンジにより有意に増加することがわかりましたが、Reverse-crossではこの増加は見られませんでした。フェニルプロパノイドは、フェニルアラニンから誘導され、フェニルプロパン（C6-C3）骨格を持つことが特徴の植物二次代謝物群で、桂皮酸、クマル酸、カフェー酸、フェルラ酸、シナピン酸、フラボノイドなどがあります（KEGG：map00940）。これらは植物やある種の微生物によって代謝されることができます。私たちが注目する11種類のフェニルプロパノイドは、桂皮酸（5）、クマル酸（1）、フラボノイド（5）に属しています。フェニルプロパノイドとその誘導体は、Salmonella属とその近縁のEnterobacteriaceae科、Escherichia、Shigellaなどのヒト病原体に対して幅広い抗菌スペクトルを有するとレビューされている（Neelam et al.、2020）。フェニルプロパノイドの抗酸化能力は、おそらくフリーラジカル消去、金属キレート、タンパク質結合を通じて、多くのin vitroアッセイで評価されている（Amoratiら、2006年；Silvaら、2000年）。前述の機能に加えて、フェニルプロパノイドとその誘導体は、抗炎症の可能性が提案されている。4-ヒドロキシ桂皮酸の投与は、実験用マウスのタバコの煙やLPS曝露によって誘発される肺の炎症を抑制し、炎症細胞の蓄積、サイトカインの産生、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナルが減少した（Park et al.、2017年）。
フラボノイドは、11種類のフェニルプロパノイドの主成分として、ファイトアレキシンまたは抗酸化剤の役割を介して、植物を生物的および生物的ストレスによるダメージから保護し、ヒトにおいて様々な有益な効果を発揮すると報告されている（Liuら、2021年）。フラボノイドは、フラバン、フラバノン、フラボン、イソフラボンなどいくつかのサブグループに分類される。ダイゼインは最も研究されているイソフラボンの一つであり、我々の11化合物の中に存在しています。このエクオールは、腸内の特定の微生物叢によって変化し、エストロゲン受容体への親和性、ユニークな抗アンドロゲン特性、優れた抗酸化活性により、大豆イソフラボンの作用を高めることができます（HMDB: 0003312）。重要なことは、ダイゼインからエクオールに代謝できるのは人口の約3分の1から2分の1であることが、ヒトでの研究により明らかになったことである。エクオール産生能は腸内細菌叢によって決定されると推定される（Jackman et al.） 以上の文献から、これら11種のフェニルプロパノイドは、抗菌作用、抗酸化作用、抗炎症作用を通じてサルモネラ挑戦後の定常状態の維持・回復に関与し、その結果、Reverse-crossと比較してCrossのメタボロームの変動が小さく、代謝物の差も少ないと推察された。
さらに、12個のOTUが11個のフェニルプロパノイドと有意かつ正の相関があることを見いだした。また、12 OTU のうち 11 OTU は、複雑な有機物を触媒する能力が高いと報告されている Clostridia クラスに属していた (Tracy et al., 2012)。我々の知る限り、フェニルプロパノイドを代謝する具体的な細菌株は知られていない。いくつかの研究では、Clostridium、Eubacterium、Ruminococcusの種がフラボノイド（フェニルプロパノイドの一群）代謝に関与していると言及されている（Hurら、2000；Křížováら、2019；Schoeferら、2002；Tamuraら、2007）。Schoeferら（2002）の研究では、ダイゼインは、Eubacterium ramulusによって6′-ヒドロキシ-O-デスメチルランゴレンシンに一部分解され、この段階はさらなる分解に重要であった。また、Eubacteriumの未分類の種であるOTU710は、ダイゼインと有意かつ正の相関を示した（図5）。最近の論文（Sun et al., 2022）では、LachnospiraceaeとRuminococcaceaeのColidextribacterといくつかの未分類の属の変化は、フェニルプロパノイド生合成経路の代謝物の濃縮に関連していることがわかり、これは我々の結果に近かったです。常在菌は宿主の免疫寛容反応を積極的に調整することが知られている（Fava & Danese, 2011）。本研究では、サルモネラ菌の侵入や炎症に対する反応として、主にClostridia属の細菌が増殖し、フェニルプロパノイドを代謝することで外部病原体に対するコロニー形成抵抗性に関与していると推定された。
このようなフェニルプロパノイドの発現量の増加は、一部の微生物とその機能性酵素が増加し、フェニルプロパノイド生合成経路が増加したことに起因していると考えられる（図4）。しかし、Reverse-crossでは生合成経路が比較的安定しているにもかかわらず、差分フェニルプロパノイドの多くが著しく減少したのはなぜか。私たちは、その原因を2つ考えました。第一に、いくつかの重要な細菌や酵素が欠落し、ボトルネック効果をもたらしている。第二に、酵素の作用条件（pHなど）が最適な範囲になく、機能経路の予測値に大きな変化がないまま、実際の生産性が低下していること。後者の理由は、胆汁酸の代謝物カタログがヒントになると思われる。Reverse-crossでは、N-[(3a,5b,7b) -7-hydroxy-24-oxo-3-(sulfooxy)cholan-24-yl]-Glycine, Polyporusterone F, Glycocholic Acidという3種類のカタログの差分があり、いずれもチャレンジでアップレギュレートした (Table S2), Crossでは1種類のカタログの差分があり、チャレンジでダウンレギュレートした (Table S1)。胆汁酸およびその誘導体は胆汁酸サイクルに関与しており、後腸で吸収されるはずである（KEGG: map04976 ）。Reverse-crossでは有意に増加したが、Crossでは増加しなかったことから、Reverse-crossのグローバルな吸収機能が低下し、おそらく栄養分の濃縮、pHの変化、酵素活性の減少につながったことが示唆された。
最後に、炎症指標の測定や相互間の比較は行っていないが、オミックスプロファイル、微量代謝物の数、物質再吸収、炎症バイオマーカーであるエイコサノイドなど、いくつかの手がかりから、Reverse-crossの腸内環境の変動がCrossより大きいことが示された。エイコサノイドは炎症性バイオマーカーの一種です（de Cássia da Silveira E Sá et al.、2014）。我々は、エイコサノイドの1つの代謝物（イロプロスト）が、リバースクロスで有意に増加し、クロスでは増加しないことを見出した。これらのデータは、S. Enteritidis侵入の状況下では、特殊な微生物相が産生するフェニルプロパノイドにより、Crossの腸内環境はReverse-crossの腸内環境よりも安定しているという我々の推測をさらに支持するものであった。
結論
プロバイオティックなフェニルプロパノイドを産生し、鶏の腸内環境の安定化に寄与している可能性のある共生細菌12種を同定することができた。この結果は、腸内細菌叢が宿主の抗感染反応に関与しているという免疫学的なコンセンサスを強化するものであった。このような宿主との共生関係やサルモネラ菌に対する抵抗性により、腸内環境の恒常性が維持されていると考えられる。両者の臨床症状には明らかな差は見られなかったが、我々が発見した潜在的なメカニズムは、動物やヒトの慢性疾患やより強毒な病原体に直面した際に、極めて重要な意味を持つ可能性がある。