イヌリンは母親の腸内細菌叢の組成を変化させ短鎖脂肪酸を増加させることで子孫の喘息を緩和させる

イヌリンは母親の腸内細菌叢の組成を変化させ短鎖脂肪酸を増加させることで子孫の喘息を緩和させる

https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0283105

Inulin alleviates offspring asthma by altering maternal intestinal microbiome composition to increase short-chain fatty acids

袁貴芳、宋文、中秀明、楊暁東、謝林瑞、呉秀莉、李暁瑜
アブストラクト
子宮喘息の症状は、母親の食物繊維の多い食事や腸内細菌叢に深く依存していることが知られています。果物や野菜にはイヌリンが豊富に含まれており、この天然の水溶性食物繊維は、母親が摂取することで子供の喘息コントロールに貢献する可能性がありますが、そのメカニズムはまだあまり研究されていません。本研究では、ラットにイヌリンを含む飲料水を与え、一方、通常群には通常の飲料水を与え、イヌリンを含む飲料水を摂取させました。その後、喘息モデル確立に向けた子孫の腸内細菌叢の形成と、母親の腸内細菌叢をハイスループット配列で、短鎖脂肪酸（SCFAs）をメタボローム解析で解析しました。その後、Elisaにより肺の炎症指標を検出し、qPCRアッセイにより喘息モデルの子孫における短鎖脂肪酸受容体（GPR41、GPR43）の発現を評価した。イヌリン摂取により母体の腸内細菌叢組成が変化し、SCFAs産生菌（主にビフィドバクテリウム）が有意に増加し、子孫の喘息性炎症反応を減弱させました。一方、妊娠中のイヌリン摂取は、子孫の腸内細菌叢の組成を調節し、この変化は喘息発症前に現れることから、子孫の腸内細菌叢が喘息発症に与える影響についてさらなる研究を行う必要がある。
引用元 Yuan G, Wen S, Zhong X, Yang X, Xie L, Wu X, et al. (2023) Inulin allevates offspring asthma by altering maternal intestinal microbiome composition to increase short-chain fatty acid. PLoS ONE 18(4): e0283105. doi:10.1371/journal.pone.0283105
編集者 カトリーヌ・ムニエ（ケベック大学モントリオール校、カナダ
受理された： 2022年5月28日、受理された： 2023年3月1日、発行： 2023年4月4日
Copyright: © 2023 Yuan et al. この記事は、原著者と出典がクレジットされていることを条件に、あらゆる媒体での無制限の使用、配布、および複製を許可するクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。
データの利用可能性 すべての関連データは、原稿とそのSupporting Informationファイル内にあります。
資金提供 本研究は、重慶医科大学科学研究革新実験プロジェクト（助成番号：202001、www.cqmu.edu.cn）およびThe Student Innovation and Entrepreneurship Program of China（助成番号：202010631001、http://gjcxcy.bjtu.edu.cn/）から資金提供を受けました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の作成には一切関与していない。
競合する利益 著者らは、競合する利害関係が存在しないことを宣言している。
はじめに
喘息は、気道過敏性（AHR）を主な病態生理的変化とする気道の慢性炎症性疾患である [1]。過去数十年にわたる疫学調査の結果、小児における喘息有病率は顕著に増加しており、公衆衛生を脅かす深刻な問題になりつつあることがわかりました[2]。最近、食物繊維の多い食事と腸内細菌が喘息の病態に関係する可能性があることが報告されました。高脂肪で低繊維の食事は喘息リスクを高め、おそらく最終的には喘息患者の気道炎症と肺機能を悪化させる。逆に、果物や野菜のように高繊維で低脂肪の摂取は喘息リスクを下げる[3、4]。Herbstら[5]は、腸内細菌叢がアレルギー性気道炎症に及ぼす影響を明らかにし、高繊維食が腸内細菌叢組成を変化させることでアレルギー性喘息の病態のみならず、短鎖脂肪酸（SCFA）などの腸内細菌叢代謝物にも影響を及ぼすとしています[6]。
イヌリンは、果物や野菜に広く含まれる水溶性食物繊維の一つで、主に単子葉植物科と双子葉植物科から抽出される。そして、チコリはイヌリンを豊富に含んでおり、従来の抽出に最適なソースです[7]。イヌリンの摂取は腸内細菌叢の組成に変化をもたらし、ビフィズス菌や乳酸菌に様々な影響を与えることから、幅広いプレバイオティクスとみなされている[8-10]。いくつかの研究では、イヌリンが腸内細菌叢を拡大し、短鎖脂肪酸などの代謝産物の産生を促進する能力があることが明らかになり、免疫調節による強力な抗腫瘍効果が立証されました[11]。予備的な臨床試験では、成人喘息患者の呼吸器系炎症の緩和におけるイヌリン経口補給の改善効果が、喘息コントロールへの恩恵と腸内細菌叢の調節という形で明らかにされており、短鎖脂肪酸の可能性を利用した喘息治療の補助手段としての役割を示唆しています [12]．
短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸）は、主に食物繊維を発酵させる大腸内の細菌によって生産されます[13、14]。SCFAは体の代謝を調節し、肥満を予防し、グルコースと脂質の代謝を調節し、インスリンに影響を与えることができることが示されている［15］。さらに、SCFAは免疫、炎症、腫瘍において重要な役割を担っています[16]。SCFAsは、主にGタンパク質共役受容体（GPCR）の活性化経路（主にGPR41、GPR43）とヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）の阻害経路を通じて抗炎症作用を発揮する[17]。SCFAの中でも酪酸は、免疫細胞を活性化することにより、アレルギー性喘息を治療する可能性を持っています[18]。Maslowskiら[19]は、SCFAによるGPR43の刺激が、大腸炎、関節炎、喘息のコントロールにおいてマニピュレーターとして機能することを発見しました。Aurélien Trompetteら[20]は、高繊維食がSCFAレベルを増加させ、肺の免疫環境を形成することで肺のアレルギー炎症の重症度を軽減することを示し、アレルギー炎症に対するプロピオン酸の効果はGPR43ではなくGPR41に依存していることを明らかにしました。水田健太郎によるin vitroの研究では、ヒトの気道平滑筋細胞でGPR41の発現が確認され、SCFAが気管支細胞に直接作用する可能性が強調されています[21]。
喘息への感受性は、大多数の患者において、生後早期に決定されると思われる[22]。妊娠中の母親の食事が胎児や将来の子供の健康に与える影響は、懸念される問題である[23]。多くの研究が、胎児の発達と健康が、母親の高繊維食と腸内細菌叢に関連していることを実証しています [24, 25] 。母親の腸内細菌叢は、子孫の出生後早期の自然免疫の発達を駆動し、胚の神経、末梢および腸管免疫の発達を制御する上で重要である[26、27]。Russellら[28]は、周産期および新生児期のマウスにバンコマイシンを介入させると、その後の人生で喘息への感受性が高まることを発見しました。ある研究では、母親の腸内細菌が産生するSCFAが胎盤バリアを通過して、子孫マウスの交感神経、腸上皮、膵臓B細胞のGPR43とGPR41を調節し、成人後の肥満に対する抵抗性を高めることがわかりました [29]. Alison N. Thorburnの研究では、妊娠中のマウスに高繊維食を与えると、子孫のアレルギー性気道疾患に対する感受性が有意に低下し、この効果は腸内微生物の発酵産物であるSCFAに由来することが示されました[30]。しかし、食物繊維の一種であるイヌリンが子孫の喘息を修飾し、母体と子孫の健康を結びつける具体的なメカニズムは不明であった。
材料と方法
動物たち
本研究は、重慶医科大学倫理委員会承認委員会の承認を得て実施した。すべての手術はウレタン麻酔下で行われ、苦痛を最小限に抑えるよう努力した。14匹のSPF雌Sprague-Dawley（SD）ラットおよび28匹の雄SDラット、9wは、重慶医科大学実験動物センター［SCXK-（Chongqing）2018-0003］から提供された。すべての実験プロトコルは、実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って行われ、重慶医科大学の機関倫理委員会によって承認された。標準的な条件下で1週間の適応給餌を行った後、各雌ラットは2匹の雄と一晩交配させた。膣栓検出の朝を胚性日（E）0.5（E0.5）と定義した。14匹の雌ラットを2つのグループ：通常母体グループ（NM）およびイヌリン母体グループ（IM）に均等に分けた。E12.5から、IM群には10％のイヌリンを含む飲料水（Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai, China）を1週間与え、NM群には精製水を与えた。E18.5で、2つのグループの母動物から別々に糞を採取する。実験中、NMのラット1匹が死亡し、もう1匹は死産となった。いずれも補食はしなかった。
2つのグループの子孫は、通常の子孫グループ（NO）とイヌリン子孫グループ（IO）として記録され、それぞれ16の子孫、半分のオスと半分のメスがいた。子孫が3週齢になった時点で糞を採取し、喘息カビを行った。日目と8日目に、すべての子孫に、1mgのOVAと200mgのAl（OH）3を、無菌生理食塩水で乳化し、総量1mlとなるように注射した。特に、乳化処理した0.4mlを腹腔内に、0.2mlを両前足指に、0.4mlを両側鼠径部に注射した。15日目には、すべての子供に、エアロゾル化したグレードII OVA（生理食塩水で希釈した1％wt/vol）を毎日30分間、2週間曝露した。グレードIIおよびVのOVAは、Sigma（MO、USA）から購入した。Al(OH)3はAladdin(中国・上海)から入手した。組織は、最終日のネブライゼーション終了後24h以内に採取した。ラットは、チャンバー内で3Vol%のイソフルラン（Veteasy® 100%(V/V), RWD life science, Shenzhen, Guangdong Rrovince, China）を5分間吸入して麻酔し、ノーズコーンを介して0.8L/分の空気をキャリアとして、1.5Vol%のイソフルランで麻酔を維持しました。麻酔中は空気源としてエアポンプ（R510-25, RWD life science）を使用した。ラットの胸部および腹部の皮膚の滅菌にはアルコール（75％）を使用した。心臓穿刺により血液を採取した後、頸椎脱臼により犠牲とし、無菌状態下で解剖した。左葉はqPCRアッセイに使用し、右下葉はヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色用に10％ホルマリン液で保存した。血液を3,000rpm、4℃で10分間遠心分離し、血清を採取し、分析まで-80℃で保存した。
子孫のIgE、IL-4、INF-γ、IL-17レベル、およびH&E染色の決定
IgE、IL-4、INF-γ、IL-17値の測定には酵素結合免疫吸着法（ELISA）キット（Ruixin Biotechnology Co.Ltd. Quanzhou, China）を用い、キットの指示は；「血清サンプルを冷蔵庫から取り出し、徐々に室温に戻し、血清IgE、IL-4、INF-γ、IL-17値を測定する」。肺組織を10％ホルマリン液で24時間固定した後、パラフィンに包埋し、切片化（3μm）し、HE染色を行った。ラットの肺における炎症性細胞の浸潤を顕微鏡で観察した。
母体ラットの短鎖脂肪酸の抽出と解析
約50mgの糞便サンプルを2mlの粉砕管に入れ、スチールボール、メタノール450μl、内部標準物質（2-エチル酪酸1000μg/ml、メタノール構成）50μlを加え、冷凍粉砕機50HZ 3で1分間に2回粉砕する。その後、氷水浴で30分間超音波処理し、-20℃で30分間静置した後、13000gで15分間遠心分離する（4℃）。上清を1.5ml遠心分離管に移す。無水硫酸ナトリウム50mgを加え、ボルテックスし、13000gで15分間遠心分離（4℃）し、上澄み液をガスクロマトグラフ分析用の機械に取る。使用した分析装置は、Agilent Technologies Inc. (CA, USA) 8890B-5977B GC/MSD GC/MSDである。HP FFAPキャピラリーカラム（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm、Agilent J&W Scientific、Folsom、CA、USA）である。使用したプロトコルは、キャリアガスが高純度ヘリウム（純度99.999％以上）、流量が1.0ml/分、入口温度が260℃、注入量が1μl、分割注入、分割比10：1、溶媒延長3分です。プログラム昇温：カラムオーブンの初期温度は80℃、40℃/分ステップで120℃まで昇温し、10℃/分ステップで200℃まで昇温し、最後に230℃で6分間運転するようプログラムした。マススペクトルは、電子衝撃イオン源（EI）、イオン源温度230℃、四重極温度150℃、透過線温度230℃、電子エネルギー70eVで収集した。スキャンモードはフルスキャンモード（SCAN）、品質スキャン範囲：m/z：30〜300である。得られたデータは、Masshunter定量ソフトウェア（Agilent, USA、バージョン番号：v10.0.707.0）を用いて、デフォルトパラメータで各イオンフラグメントを自動的に識別・統合し、手動検査を補助することにより評価した。マススペクトルのピーク面積を縦軸に、分析対象物の濃度を横軸に、線形回帰標準曲線が描かれました。サンプル濃度は、サンプル分析物の質量スペクトルピーク面積を線形方程式に代入して濃度結果を算出しました。
子孫の肺組織におけるGPR41およびGPR43に関するqPCR検出について
14 SPF Total RNAはRNAiso Plus（Takara、東京、日本）を用いて抽出した。cDNAは単離したRNAサンプルをテンプレートとして、Goldenstar™ RT6 cDNA Synthesis Kit（清華生物技術有限公司、北京、中国）を用いて逆転写した。発現解析は、2 ×T5 Fast qPCR Mix (SYBR Green I) (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Beijing, China) とApplied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR Systemを用いて実施した。リアルタイムPCRのサイクリング条件は、以下のように設定した： 95℃、30秒、95℃、5秒、55℃、30秒、72℃、30秒のサイクルを40回繰り返した後、GAPDH遺伝子を内部コントロールとして使用した。各サンプルは、平均Ct値について二重に試験した。相対的mRNA発現量は、2-DDCt法を用いてGAPDH参照遺伝子に正規化した後に算出した。各遺伝子のプライマー配列は表1に示す通りである。
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表1. qPCRに使用したプライマー配列。
doi:10.1371/journal.pone.0283105.t001
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DNA抽出、PCR増幅
凍結した糞便サンプルを室温で解凍し、500μlの無菌生理食塩水を用いてビーズビート（FastPrep bead matrix E, MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA）により均質化した。1000μlの容量が得られるまで無菌生理食塩水を加え、製造者の指示に従って細菌ゲノムDNA抽出キットを用いて細菌DNAを抽出した。DNA濃度を測定した後、1μlのDNAを超純水で100ng/μlに希釈し、-20℃で保存した。
16s rDNA V4-V5領域を増幅するためのユニバーサルプライマー338F/806Rが合成された。フォワードプライマーとリバースプライマーの配列は、それぞれ5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′と5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′だった。簡単に説明すると、PCRは、4μlの5×FastPfu Buffer、2μlのdNTPs（2.5mM）、0.8μlのフォワードプライマー（5μM）、0.8μlのリバースプライマー（5μM）、0.4μlのFastPfu polymerase、テンプレートDNA10ng、20μlとなるように加えた超純水からなっていた。反応条件は以下の通りである： 95℃で5分、95℃と53℃で各30秒、72℃で45秒のサイクルを27回、72℃で10分とした。
メタゲノミックシークエンスとデータ解析
ペアエンドライブラリー構築のため、Covaris M220 (Gene Company Limited, China) を用いてDNA抽出液を平均約400bpのサイズに断片化した。ペアエンドライブラリーは、NEXTFLEX Rapid DNA-Seq (Bioo Scientific, Austin, TX, USA)を用いて構築した。配列決定プライマーのハイブリダイゼーション部位をすべて含むアダプターを断片の鈍端にライゲーションした。ペアエンドシーケンスは、Illumina Novaseq 6000 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA)で、Majorbio Bio-Pharm Technology Co. (上海、中国）において、製造者の指示書（www.illumina.com）に従ってNovaSeq Reagent Kitsを使用して行った。
データは、Majorbio Cloud Platform（www.majorbio.com）の無料オンラインプラットフォームで解析された。簡単に説明すると、ペアエンドのイルミナリードはアダプターをトリミングし、低品質リード（長さ<50 bpまたは品質値<20またはN塩基を持つ）はfastp（https://github.com/OpenGene/fastp、バージョン0.20.0）により除去された。
統計解析
データの統計解析には、Prismソフトウェア（GraphPad）を使用した。正規分布と分散の均質性に適合する2つのデータセットに対してStudent t testを適用した。分散がグループ間で不均等な場合は、Welchのt検定を使用した。(*, p <0.05; **, p <0 .01; **, p <0 .001). フローラ組成のグループ間差の分析には、ウィルコクソン順位和検定を行った。
結果
子孫の炎症の指標となるもの
肺の病理切片から、NO群とIO群を比較すると、気道上皮構造が比較的完全であり、気管支や血管周囲の炎症細胞浸潤の程度が有意に減少していることがわかった。また、肺の間質および肺胞腔の滲出液も有意に減少していた（図1A）。IO群のIgE、IL-4、IL-17のレベルはNO群より統計的に有意に高かったが、IO群のINF-γのレベルはNO群より有意に低く、その結果は性別に関係なかった（図1B-1E）。
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図1. イヌリンは子孫の肺の炎症と関連サイトカイン産生を抑制することができる。
(A）NO群の肺炎症はIO群より有意に悪化した；NO群のIgE（B）、IL-4（C）、IL-17（D）レベルはIO群より高かった（B：p＜0.0001、C：p＜0.05、D：p＜0.05）；（E）INF-γレベルはNO群のそれよりIO群の方が高かった（p＜0.05）.
doi:10.1371/journal.pone.0283105.g001
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短鎖脂肪酸（SCFA）に関する分析
イヌリンのヒトの健康や病気に対する効能は、腸内での短鎖脂肪酸の生成の経路を通じて達成される。我々は、GC-MSを用いて母体ラットの糞便中のSCFAs含有量を検出した（図2）。驚くべきことに、イヌリン母体群では、酢酸、プロピオン酸、イソヘキサン酸を除く各種SCFAsの濃度が正常母体群よりも低かったのです。その中でも、イソ酪酸とイソ吉草酸は統計的に有意であった。
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図2. 母体ラットの糞便中の短鎖脂肪酸含有量の解析。
(A-H) E18.5における母体糞中の短鎖脂肪酸に関する定量的分析。
doi:10.1371/journal.pone.0283105.g002
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子孫の肺におけるGPR41およびGPR43の発現量について
さらに、子ラットにおける短鎖脂肪酸とアレルギー性喘息への感受性との関係を調べるために、喘息モデル化後のイヌリン母体群と正常母体群の肺組織において、短鎖脂肪酸受容体のGPR41とGPR43の相対発現をqPCRにより検出した（図3）。その結果、GPR41とGPR43の相対的なmRNA発現量は、イヌリン母体群の子孫の方が正常群の子孫よりも高く、中でもGPR41が統計的に有意であったことに驚かされた。
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図3. 喘息モデルの子孫の肺におけるGPR41およびGPR43の発現量。
(A）IO群の肺におけるGPR41 mRNAの相対発現量は、NO群のそれよりも高かった（p＜0.05）。(B）IO群の肺におけるGPR43 mRNAの相対発現量は、NO群のそれよりも高かった（p >0.05）。
doi:10.1371/journal.pone.0283105.g003
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微生物多様性解析
短鎖脂肪酸は、腸内細菌叢が産生する食物繊維の代謝産物である。短鎖脂肪酸の測定結果とその受容体のmRNAの相対発現量が一致しなかったため、さらに母体ラットと子ラットの微生物多様性の解析を行いました。
α-ダイバーシティ
細菌のDNAとゲノムのデータにstudent`s T-Test分析を適用した。Shannon指数、Simpson指数、Chao指数を表2に示した。その結果、IM群とOM群のシャノン指数には有意な差が見られたが（p＜0.05）、各群のシンプソン指数に差は見られなかった。このことは、IM群とOM群の間で群集の多様性に差があることを示している。Chao指数は、IM群とOM群の間に有意な差があることが示された（p <0.05）。これらの結果から、IM群と水溶性食物繊維を含まない食餌の間で、群集の豊かさに有意な差があることが確認された。
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表2. 母体ラットと子ラットの糞便中のマイクロバイオームのα多様性解析。
doi:10.1371/journal.pone.0283105.t002
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コミュニティ-構成とβ-多様性
4つのグループにおける総ASV配列と特定のASV配列をRプログラミング言語を用いて計算した（図4Aおよび4B）。合計241個のASVが母体グループによって共有されていた。NMとIMには、それぞれ合計54個と34個の特定のASVが存在した。合計235個のASVが子孫のグループによって共有されました。NOとIOには、それぞれ37個と53個の特定のASVが存在した。この結果から、イヌリンを摂取した母体ラットでは、通常のラットよりも特定のASVの数が多く、その子孫ではその逆であることが示された。
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図4. 母体ラットと子孫の糞便微生物組成分析。
(A,B)母体グループと子孫グループの共有ASV分析。ベン図により、異なるグループにおけるユニークなASVと共有ASVが明らかになった；（C、D）母子グループの糞便微生物組成を家族レベルおよび属レベルで解析した結果。
doi:10.1371/journal.pone.0283105.g004
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群集バープロット解析の結果、ファミリーレベルでは（図4C）、NMグループの優勢ファミリーは乳酸菌科、ペプトストレプトコックス科、うどんこ病菌科、IMグループの優勢ファミリーはビフィドバクテリウム科、乳酸菌科、うどんこ病菌科、IMグループのビフィドバクテリウムの存在量は著しく増加し、新たに優勢ファミリーの出現となったことが明らかになりました。また、NO群では乳酸菌科、ビフィズス菌科、IO群では乳酸菌科、腸内細菌科が優占していた。
属レベルでは（図4D）、IM群ではNM群に比べビフィドバクテリウムの割合が有意に高く、優勢な属であった。さらに、Lactobacillus、Blautia、PrevotellaといったSCFAsを産生する属もIM群で増加した。一方、子株では、NO群ではLactobacillus、Bifidobacteriumが、IO群ではLactobacillus、Escherichia-Shigellaが優勢であった。IO群では、乳酸菌、ビフィズス菌の割合が減少し、Escherichia-Shigellaの割合が高くなった。
PCoA解析とAdonis法により、それぞれファミリーレベルと属レベルで細菌集団を解析した（図5）。PCoA解析の結果、ファミリーレベル、属レベルともに、NM群とIM群のマイクロバイオーム構成は重なるが、母体ラットの2群のマイクロバイオームが凝集する傾向が見られた。アドニスの結果、ファミリーレベルでは、2群間の差は有意ではなく（R2 = 0.1476、P = 0.0680）、属レベルでは、2群間の差は有意でした（R2 = 0.1738, P = 0.0170）。そして、ファミリーレベルと属レベルの両方で、2つのグループの子孫の間に有意な差があった（R2 = 0.1729, P = 0.0310; R2 = 0.1787, P = 0.0250）．これらのデータは、分析の規模（家族レベル、属レベル）に関係なく、2つの子孫グループが統計的に有意な差異を持つことを示している。しかし、母方の2つのグループは、属レベルでしか統計的に有意な差異がない。
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図5. 母体ラットと子孫の糞便微生物組成解析とβダイバーシティ解析。
(A、B）PCoA解析は、各グループの家族レベル、属レベルでのマイクロバイオームの組成の相関を探るためである。
doi:10.1371/journal.pone.0283105.g005
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属レベルでのグループ間の有意差に関する解析。
次に、ウィルコクソン順位和検定を適用して、子孫の喘息発症に関連すると思われる主要な細菌をスクリーニングしました（図6）。母体ラットの2群間では、ビフィドバクテリウムに極めて有意な差が見られた（p＜0.01）。そして、その2群の子孫の間では、Bifidobacterium、Romboutsia、Blautia、Prevotella、unclassified_c__Bacilli、Dubosiella、Streptococcus、Allobaculumにおいて、有意差が認められたのです。
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図6. 属レベルで有意に異なる種に関する分析。
(A)母集団における有意差のある種の解析、(B)子孫における有意差のある種の解析 (, p <0.05; **, p <0 .01; ***, p <0 .001).
doi:10.1371/journal.pone.0283105.g006
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ディスカッション
食物繊維は重要な栄養素であり、喘息と密接な関係があることが判明しています。高繊維は喘息のリスクを低減するだけでなく、寿命も延ばします[3, 31]。高繊維を与えた妊娠ラットから生まれた成虫は、重度のアレルギー性気道疾患に対して強固な抵抗力を付与されていることが報告されており、これは母体の腸内で短鎖脂肪酸が生成されることに起因していると考えられる[29、30]。本研究では、妊娠中のイヌリン群に10%イヌリンを含む水溶液を与え、母体のイヌリン摂取が肺の炎症に及ぼす影響を、NM群とIM群の喘息児をモデルにして検討しました。その結果、INF-γの発現量は統計的に有意に減少し、IL-4、IgE、IL-17は増加した。このことは、妊娠中のイヌリン摂取が喘息児の肺炎を改善し、この効果は性別に依存しないことを示唆している。Th1/Th2の不均衡は喘息の主なメカニズムである。Th1サイトカインの代表であるINF-γは炎症を抑制し、Th2サイトカインの代表であるIL-4は炎症を促進する [32] 。今回の研究では、血清IgE濃度も有意に上昇した。この所見は、IL-4がB形質細胞の分泌を促進することに起因していると考えられる。Ig Eはマスト細胞からヒスタミンを分泌させる引き金となる。IL-17は、アレルギー反応に関与し、気道炎症を刺激する重要なサイトカインである[1]。今回の研究では、H&E染色により、肺に多数の炎症細胞が浸潤していることが確認されました。
ハイスループット配列から、イヌリンの摂取により、母体ラットの腸内細菌叢のα多様性が低下し、腸内細菌の総ASV数が減少することがわかり、Song Xの研究結果 [8] と一致することがわかりました。シークエンスデータをさらに解析することで、2群の妊娠ラットにおける腸内細菌叢の構成に有意な差があることがわかりました。属レベルでは、ビフィドバクテリウムの割合がNM群で有意に高く、新たな支配属となった。一方、イヌリンが腸内マイクロバイオームのビフィドバクテリウムの数を増やすことは広く確認・認識されている[8、10、33]。
短鎖脂肪酸は、ビフィズス菌の糖質代謝の主要な最終産物である[34]。Bifidobacteriumに加えて、Lactobacillus [35]、Blautia [36]、Prevotella [37]などの短鎖脂肪酸産生属の割合も増加したが、統計的に有意ではなかった。PCoA解析とAdonis解析を組み合わせた結果、両群間の差異は属レベルで有意であった。我々の結果では、IM群の糞便中に短鎖脂肪酸が減少しており、子ラットの肺組織におけるGPR41アッセイの結果や妊娠ラットの微生物組成分析の結果と矛盾していることは、熟考する価値があると思われる。SCFAは大腸の微生物叢や結腸細胞によって速やかに消費され、その結果、盲腸から肛門にかけて濃度が大きく低下した可能性があり[38]、これはPeter J Vuillerminら[39]と一致していた。
妊娠中の食事で摂取される食物繊維は、母体の腸内細菌叢の形成に重要な役割を果たします[40]。さらに、妊娠中の母親の食事が子孫の腸内細菌叢に影響を与えることを報告した研究もあります[41]。そこで、さらに子孫の腸内細菌叢を解析したところ、IO群はASV総腸内細菌数を多く産生することがわかりました。また、α-diversityには差がなかったが、群集組成には変化が見られた。
母体群と異なり、IO群はNO群よりもビフィズス菌の割合が有意に低く、これはSara N Lundgrenらの疫学実験の結果と一致する[42]。また、IO群では分類不能_c__Bacilli、Dubosiella、Allobaculumなどの属が減少し、Romboutsia、Blautia、Prevotella、Streptococcus、Parabacteroides、Phascolarctobacteriumなどの属が増加することが分かった。中でも、Bifidobacterium、Romboutsia、Blautia、Prevotella、Phascolarctobacteriumは、抗炎症作用を発揮する短鎖脂肪酸を生成すると考えられている[43, 44] 。異なる短鎖脂肪酸産生菌の増減は、2群の子孫の間で完全に一致したわけではないが、IO群の短鎖脂肪酸産生菌の全体的な存在量は増加しなかった。衛生仮説[45]によれば、人生の早い時期に病原体にさらされることは、実際に人間の免疫系の訓練と発達を促進する。この実験では、IOグループの方がASVの総数が多く、免疫の発達に影響を与える微生物に多く触れることで、アレルギー疾患のリスクが低減することが示唆されました。Holly Bachusらの実験[46]では、高用量のLPSが乳児のアレルギー性Th2細胞反応の発生を抑制することが示され、衛生仮説を支持する潜在的なメカニズムが明らかになりました。しかし、異なる腸内細菌が合成するLPSは、免疫系に対する促進または抑制効果が異なることも判明している[47]。
イヌリンの経口投与は腸内フローラの組成を変化させ、フローラの代謝物であるSCFAsのレベルも上昇させます[11]。SCFAsはGPR41とGPR43のリガンドであり、母体腸内のそれらのSCFAsは、GPR41とGPR43に影響を与えることにより、胎盤バリアに浸潤し、子孫の疾患感受性を緩和する能力もある[48]。そこで、E18.5における両群の妊娠ラットの腸内細菌叢と、その子孫の肺組織におけるGPR41とGPR43のレベルを調べた。さらに、イヌリンを摂取した母体ラットの糞便中のSCFAs含有量は、通常食を摂取したラットのそれよりも低い値を示した。しかし、両群の子孫の肺組織におけるGPR41とGPR43の相対発現量は、イヌリンを与えた母体ラットの子孫の肺組織が通常食の妊娠ラットの子孫の肺組織よりも高く、そのうちGPR41が統計的に有意でした。GPR41は、主に酢酸、プロピオン酸、酪酸によって活性化される短鎖脂肪酸受容体で、Gi/oタンパク質と結合してcAMP産生を抑制し、ERK1/2のリン酸化を促進する [49]. 水溶性食物繊維の摂取により、喘息患者の喀痰中のGPR43およびGPR41の遺伝子発現が増加し、気道炎症が改善することが示されている[50]。水溶性食物繊維であるイヌリンは、酢酸、プロピオン酸、酪酸の血清濃度を上昇させます[51、52]。その生成物の一つであるプロピオン酸は、気道アレルギー性炎症に対する保護効果についてGPR41に依存するが、GPR43には依存しない[53]。2020年の研究では、胚が母体由来の短鎖脂肪酸の変化を血液循環を通じて知覚できることが報告された[20]。これらの研究は、短鎖脂肪酸のレベルと子孫におけるGPR41の高発現の間の逆説的な結果を説明することができるかもしれない（図7）。この進行には、母親の短鎖脂肪酸がより大きな役割を担っているのかもしれない。明仁は、母体のマイクロバイオームが子孫の免疫系の発達に大きな影響を与えることを報告している。高繊維食を与えたマウスの子孫は、胸腺微小環境で発現する転写因子である自己免疫制御因子（Aire）の発現量が高く、SCFAがAireの発現量の増加を通じて胸腺Tregの分化を促進することを示唆している[54]。
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図7. 母親のイヌリン食が子孫の腸内細菌叢とGPR41発現に与える影響。
doi:10.1371/journal.pone.0283105.g007
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結論
本研究は、妊娠中のイヌリンの摂取が母体の腸内細菌叢組成を変化させ、SCFAs産生菌が有意に増加し、子孫の喘息性炎症反応を減弱させることを初めて実証した。時間的制約や外力不可抗力の制限により、具体的なメカニズムについてはそれ以上検討しなかったが、今回の結果や文献報告から考えられるメカニズムを推測した。母体の高イヌリン食によって生成されたSCFAが胎盤バリアを通過し、T細胞の分化を調節してTH1/TH2のアンバランスを改善し、子孫の肺の炎症を抑制する可能性がある。今後、GPR41モジュレーター（アゴニストまたはアンタゴニスト）を用いて、肺組織のTH1/TH2細胞の変化を検証することで、喘息の炎症制御におけるGPR41の作用機序を検証していきます。
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