細菌病原体のハイスループット機能形質検定

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意見・仮説
13 2023年9月
細菌病原体のハイスループット機能形質検定
https://journals.asm.org/doi/full/10.1128/msphere.00315-23?af=R


著者 Zachary R. Stromberg https://orcid.org/0000-0002-1137-1128, Shelby M. B. Phillips, Kristin M. Omberg, Becky M. Hess https://orcid.org/0000-0003-1093-5478 becky.hess@pnnl.govAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/msphere.00315-23
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オンライン・ファースト
概要
意見／仮説
競争
抗生物質耐性
接着と侵襲
毒素産生
免疫系の回避
細胞死の誘導
限界と結語
謝辞
参考文献
情報と貢献者
指標と引用
参考文献
図表とメディア
表
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ABSTRACT
機能的形質とは、微生物のフィットネスや代謝機能に影響を与える特性である。機能的病原性形質に基づいて細菌病原体を特徴付けるために、ハイスループット法を用いることへの関心が高まっている。単一の病原性形質について単一の生物を表現型解析する従来の方法は、時間と労力を要することがある。あるいは、全ゲノム配列（WGS）の機械学習は、病原性の予測にある程度の成功を示している。しかし、WGSのみに依存すると、特に古典的な病原性因子を持たない生物では、機能的形質を見逃す可能性がある。われわれは、機能的病原性形質を同定するためのハイスループットなアッセイが、個体群スケールで細菌病原体の特徴を明らかにする有力な手法になることを提案する。この研究は、疾病に関連する細菌種のリストを作成することから、新規微生物を検出できる病原体診断アプローチへと移行する上で極めて重要である。我々は、機能的形質検定における6つの重要な領域と、ハイスループット法の進歩がどのように病原体の理解を深める可能性があるかについて議論する。
意見・仮説
細菌を病原体、非病原体、常在菌に分類することは、しばしば宿主の反応の大きさを無視することになる。すべての微生物が何らかの病原性を有することは認識されているが(1)、一般に細菌性病原体を宿主に疾患を引き起こす生物と呼んでいる。病気を引き起こすために、細菌性病原体は様々な因子を用いて、宿主の反応をコロニー形成、回避、克服する。古典的には、コッホの定説と分子コッホの定説が、病原体を理解し、病原体がどのような因子を用いて病気を引き起こすかを解明するために用いられてきた(2)。
微生物の機能形質とは、特定の条件下で生物のフィットネス、パフォーマンス、行動に影響を与える測定可能な特性のことである(3 - 5)。機能的形質は、細菌自身（例：毒素産生）、細菌と宿主との相互作用（例：細胞死）、または環境（例：他の微生物との競合）によって産生される可能性がある。個々の細菌の形質は、複雑な系では同定が難しく、主にプラスミドにコードされている場合、水平遺伝子転移によって細菌間で移動する可能性がある(6)。群集内の種については、機能的形質には環境的制約、系統的シグナル、生理機能に関する情報が含まれている(4, 7, 8)。
従来、微生物学者は表現型検査に基づいて機能的形質を解析していたが、ハイスループットシーケンスにより、ゲノムから機能的形質を推定する大規模な取り組みが可能になった。表現型形質検査は手間がかかり、培養が困難な微生物もいるため、微生物の表現型形質に関するデータは遺伝子型形質に関するデータよりも少ない。したがって、細菌病原体の特徴を徹底的に解明するためには、遺伝子型がどのようにして機能形質に変換されるのかをよりよく理解し、酵素や形態物理学的形質を機能形質とみなす必要がある(9)。
過去30年間で、DNAとRNAの塩基配列を決定する能力は飛躍的に向上した(10)。しかし、ゲノムアノテーションが不完全で制約が多いため、配列から推測されることを理解する能力は限られている。さらに、病原性細菌、環境、および感受性のある宿主（植物、動物、ヒトなど）が相互作用する際に生じる物理的、化学的、生物学的ダイナミクスは、その進歩に追いついていない。新しく塩基配列が決定されたゲノムの遺伝子は、通常、特徴付けられたタンパク質との配列類似性に基づいて機能注釈が付けられますが、可能性のあるタンパク質の数が膨大であるため、予測の精度には限界があります。データベースには現在、機能未知の仮説的タンパク質として分類されたタンパク質が多数含まれている(11)。米国エネルギー省の生物・環境研究局（Office of Biological and Environmental Research）が最近発表した報告書では、新たに発見された微生物や新たに出現した微生物の挙動を予測的に理解できるようにするために、「ゲノム配列の作成に匹敵する規模とペースで、微生物や微生物群集を調査し、その特徴を明らかにする」必要性が指摘されている(12)。病原体のすべての機能的特徴を明らかにすることは、大変な挑戦である。したがって、ゲノムのアノテーションに加え、ハイスループットスクリーンによって重要な機能形質を検証することは、ゲノム情報と病原性形質を結びつける能力を向上させるだろう。ここでは、細菌性病原体に関する知見を提供する機能検査技術について、非網羅的な例をいくつか紹介する。従って、このオピニオンでは、病原体の機能的形質の特徴づけにおける最近の進歩と、感染プロセスの特徴である6つの重要な領域（(i)競合、(ii)抗生物質耐性、(iii)接着と侵入、(iv)毒素産生、(v)免疫系の回避、(vi)細胞死の誘導）における重要なギャップを理解することに焦点を当てる（図1）。
図1

図1 細菌病原体が感染時に利用する6つの主要な機能特性。臨床検査、環境検査、食品検査は、病原体検査の一般的なサンプルタイプである。これらのサンプルタイプから、病原体は寒天プレート上の純粋培養で、あるいはセルソーターやマイクロ流体プラットフォームなどの装置を用いて単離することができる。ハイスループット形質検定法では、96ウェルプレート、リキッドハンドラー、迅速検出システム（光学イメージングや電気化学など）、レポーター細胞株、マイクロフルイディクス、ミニチュア組織などを利用する。病原体は、競争、抗生物質耐性、接着・侵入、毒素産生、免疫系の回避、細胞死の誘導など、一部またはすべての形質を利用して病気を引き起こす。
競争
宿主に侵入する際、病原体は機能的形質を利用して、既存の微生物と競合し、栄養やニッチを奪い合い、感染を確立し、宿主組織をコロニー化しなければならない。競合的排除は、既存の微生物が病原体のコロニー形成を阻害する主要な原理である(13)。生態系にもよるが、現存するメンバーの体力、ニッチ、到達時間など、いくつかの要因が微生物間の競争に影響を与える可能性がある(14)。表1に示すように、競争やその他の機能形質を評価するための、従来の実験室的アプローチ、遺伝学的アプローチ、ハイスループットアプローチの利点と限界を比較した。ゲノムスケールモデルなどの遺伝学的手法は、細菌のフィットネスの予測を可能にし、大腸菌の遺伝子型の表現型の可能性を解析するのに用いられた（15）。実験室では伝統的に、数株（多くの場合、野生型1株対変異株1株）を用いて競合を測定し、競合指数として報告してきた(16)。従来の競合指標は、混合して一緒に増殖させた後の菌株の比率の変化として計算される、低スループットのアッセイである(17)。これまでの研究では、数世代から最大60,000世代にわたる大腸菌株の適合性を評価するために、in vitroのアプローチが用いられてきた(18, 19)。スループットを向上させるために、トランスポゾンライブラリーを用いた変異誘発法とシークエンシングが、競合指標アッセイにおいて複数の菌株に適用され、病原性に必要ないくつかの遺伝子、機能的冗長性、病原性因子の機能的独立性が同定された(20)。さらに最近では、トランスポゾン挿入シークエンシングが、単純な増殖ベースの選択アッセイから、〜107株の変異株を用いた、他の微生物と競合するために重要な機能的形質の評価へと移行している(21 - 23)。
表1
表1 細菌病原体の機能的形質を調べる技術の比較
代表的なアッセイ 結果までの時間(h) スループット 新規微生物または形質の解 明 利点 限界 参考文献.
コンペティション 従来型 In vitro fitness screen 24 12 テストあり 新規微生物形質を決定的に同定 微生物同定には至らず、手間のかかる 遺伝子改変が必要(18)
ゲノムスケールモデル 168 1回のテスト 有 確実に新規微生物遺伝形質を同定する が、微生物の表現型を予測 することはできない(15)
96試験 有 確実に新規微生物形質を同定 アッセイには高価なロボットが必要 (24)
抗生物質耐性 従来型ディスク拡散法 24 12 テスト 無回答に迅速なサンプルが必要。
Genetic PCR Xpert (Cepheid) 6 96 テスト 回答までの迅速サンプルなし テストパネルでは人工微生物や新興微生物は同定できない(26)
ハイスループット ダイレクト・オン・ターゲット・マイクロド ロプレット MALDI-TOF MS ≤6 96 テスト 回答に至る迅速なサンプルなし 微生物の同定は可能であるが、微生物の表現 型は予測できない(27)
付着・浸潤 従来型 In vitro 付着・浸潤アッセイ 72 12 試験 有 新規微生物形質を決定的に同定 微生物同定は不可能(28)
遺伝学的手法 接着・浸潤のマルチプレックス PCR法 6 96 試験 無 目的の表現型を同定するが、微生物は同定しない(29)
ハイスループット 仮想コロニー計数感染アッセイ 48 96 試験 有 新規微生物形質を決定的に同定 微生物同定せず(30)
毒素産生 細胞単層での従来型毒素活性 48 6試験 有 確実に新規微生物形質を同定 微生物同定せず(31)
既知の毒素遺伝子の遺伝的PCR 6 96試験 いいえ 目的の表現型を同定 微生物同定せず(32)
ハイスループット 自動パッチクランププラットフォーム 48 384 テスト なし 目的の表現型を同定するが、微生物は同定しない(33)
免疫系回避 従来の動物モデル 168 24 テスト 対象となる表現型を同定できない 労力とコストがかかる；倫理的懸念(34)
バイオインフォマティクスの知識ベース が必要。
ハイスループット Organ-on-a-chip 168 12 テストなし 目的の表現型を同定 手間がかかる(36)
細胞死 従来型 染料排除試験 24 96 試験 無回答 サンプルが迅速 微生物を特定できない(37)
アポトーシス核酸の遺伝学的 qPCR 6 96 テスト 回答まで時間がかかるサンプルなし 微生物を特定できない(38)
ハイスループット リアルタイム蛍光 DNA 染料 6 96 テスト 回答に至る迅速なサンプルなし 微生物の同定はできない(39)
競争と細菌の増殖は、しばしば有意な関係があると考えられている。Atoliaらは、ハイスループット・スクリーニングによる増殖の評価にはノイズの最小化が重要であり、寒天プレート上で増殖した細菌コロニーから多数の培養物を接種する際に一貫した増殖が困難であることを明らかにした(40)。自動化されたロボットのコロニーピッキングシステムは、細菌のコロニーから出発して複数の培養を接種するという難題を軽減する可能性がある(41)。機能試験で微生物間の競合を評価するために、96の競合アッセイを同時に試験できるハイスループット細菌間競合アッセイがアグロバクテリウム・ツメファシエンス用に開発され、その結果、A. tumefaciensが他の細菌を殺すことができるという観察結果が得られた(24)。このハイスループット細菌間競合アッセイは、96ウェルプレートなどの一般的な実験材料を必要とするが、自動ピペッティングシステムも使用する(24)。Omnilogのような他の表現型ハイスループット・スクリーニング技術により、栄養競合に関連する2,000近くの表現型を調べることが可能になった(42)。これらのシステムの限界は、不均一な細菌集団の増殖を測定することである。集団を分析するという問題を克服するため、マイクロ流体プラットフォームに基づく新しい手法により、現在では105以上の並列細胞系列のスケールで、単一細胞を独立して評価・追跡することが可能になっている(43)。
ハイスループット評価でさらに考慮すべきことは、病原性と増殖の関係が容易に予測できない場合があるということである。例えば、61種類のヒト細菌病原体を評価したところ、増殖速度は病原性と負の相関関係があった(44)。増殖速度は競合アッセイの限界と考えられる。細菌病原体の中には、増殖特性、封じ込め手順、バイオセーフティへの配慮、試験間の機器滅菌の容易さなどの点から、ハイスループットでの特性解析に適しているものがある。ハイスループット競合アッセイを進歩させるためには、複数の菌株を迅速に評価できる標準化されたシステム、異なる環境や宿主サイトに関連する微生物の標準化されたコンソーシアム、競合に関する定義された測定基準を開発する必要がある。
抗生物質耐性
抗生物質耐性は、微生物が抗生物質ストレスのある環境にコロニーを作ることを可能にする(45)。近年、抗生物質耐性菌による感染症が増加している(46)。細菌の病原性と抗生物質耐性の相互作用は複雑で、微生物と環境に関連する因子に依存している(47)。従来、抗生物質感受性試験は、1つの分離株について数回の培養を行い、許容されるブレイクポイント値を評価して、その微生物が感受性か耐性かを判定していた(48)。最近、Yangら（49）は、付着性、毒性、免疫活性化、抗生物質耐性について細菌病原体を特徴付ける、表現型ベースの脅威評価パイプラインを開発した。この先行研究では、表現型データを用いた機械学習により病原性を評価する機能を開発し、細菌性抗生物質耐性は従来のディスク拡散アッセイを用いて評価した。ディスク拡散アッセイのような従来の方法では、寒天平板あたり数種類の抗生物質（例えば8種類の抗生物質）しか試験できず、純粋培養で細菌を分離することに依存しているため、抗生物質感受性試験のボトルネックとなっている(25)。そのため、核酸増幅技術や全ゲノムシークエンシング（WGS）技術と機能検査が併用されている。広範囲の抗生物質を検査できる市販の核酸増幅キットが存在する（26）。しかし、核酸増幅法による抗菌薬耐性の検出について、感度は全体的に低いが特異度は高いという研究結果もあるため、遺伝子情報を解釈する際には注意が必要である（50）。さらに、抗生物質耐性遺伝子を含む病原性プラスミドが広く報告されるようになってきており、治療に影響を及ぼす可能性があるほか、特定のプラスミドを監視してその拡散を抑えるべきかどうかを判断する必要がある(51, 52)。抗生物質耐性の機能検査は、病原性プラスミドで見つかった抗生物質耐性遺伝子の関連付けに役立つ。
機能検査は、細菌が新規化合物にどのように反応するか、そしてどの既存化合物が新規株に対して有効かを決定するために重要である。迅速でハイスループットな抗菌薬感受性試験のために、広く受け入れられ、世界的に利用可能な単一の抗菌薬感受性試験技術は存在しない(53)。それに伴い、新薬や薬剤の組み合わせに対する強固なスクリーニング法が台頭しているにもかかわらず、新しく開発された抗生物質が不足している(54, 55)。人工知能を活用した探索により、試験に必要な化合物の数は大幅に減少したが（56）、複数の化合物を複数の微生物で同時に試験することは依然として困難である。抗生物質による治療の約50％は、病原体を診断することなく誤った抗生物質から始まるため（48）、効果的な化合物の同定は極めて重要である。
抗生物質耐性の機能を検査するための従来の培養法は、時間と労力がかかる。そのため、結果を得るまでの時間を短縮し、試験可能な培養細菌の多様性を高めるために、ハイスループット法が開発されている。最近の技術の進歩は、マイクロフルイディクスやラボ・オン・ア・ディスクシステムを用いた装置の構築に依存しており、液滴内で最大100菌株の増殖を試験する能力を有している(57 - 59)。別のアプローチでは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）の進歩を利用して、1アッセイあたり96サンプルのスケールで、ダイレクト・オンターゲット微小液滴増殖アッセイにより抗生物質耐性の機能セットを迅速にスクリーニングしている（27, 60）。これらのアッセイが現在直面している課題は、スループットを向上させ、ルーチン検査に利用しやすくすることである。さらに、MALDI-TOF MSやWGSのような異なるデータタイプを統合することは困難である。様々なタイプのデータを統合するためには、最小発育阻止濃度へのオープンアクセスを提供するAntimicrobial Testing Leadership and Surveillanceのような既存のデータベースを活用し、ゲノム情報と統合すべきである(61)。
接着と浸潤
接着は、微生物が宿主をコロニー化し、細胞応答を誘導し、宿主のシグナル伝達を操作することを可能にする細菌病原体の重要な特徴である。細菌は細胞に接着するために、繊毛、フィンブリア、鞭毛、その他のアドヘシンなど様々な因子を利用する(62 - 64)。従来の付着アッセイは手間がかかり、寒天培地上や染色した細胞から細菌を数えることに基づいている(28, 65)。マルチプレックスPCRのような遺伝学的方法は、1回の反応で複数のアドヘシン遺伝子の存在を調べるが、機能性の証拠は得られない(29)。宿主細胞への細菌の接着の程度を定量化するために、いくつかのハイスループットアッセイが開発されている。例えば、細菌と真核細胞との相互作用を定量化するフローサイトメトリーベースの接着アッセイは、高速で再現性のある測定ができるように設計されている(49, 66, 67)。最近では、蛍光タグを付けた菌株、プラスミド上に蛍光タンパク質を持つ細菌、生きた蛍光染色を使用して、1アッセイあたり96サンプルのスループットで付着レベルを定量化している(49, 66, 67)。もう一つの方法は、吸光度ベースの測定法であるバーチャル・コロニー・カウントを用いるもので、複数の真核細胞株を用いたサルモネラの従来のプレート・ベースのコロニー・カウントと良好な相関性を示している(30)。さらに、ハイスループットスクリーンによるコロニー計数により、96ウェルプレート内の生菌細胞数の測定が可能になった(68)。結合していない細菌を除去するための大規模な洗浄と固定剤処理は、ハイスループットアッセイや従来のアッセイでは依然として問題である(66)。より微細な結合を解決するために、宿主リガンドをハイスループットアッセイでスクリーニングすることもできる(69)。
ある種の病原体は宿主細胞に侵入し、細胞内で生活する。従来の接着アッセイと同様、侵襲アッセイも手間がかかるため、複数の条件や時点をテストすることは困難である。古典的には、細菌の侵入は、内在化した細菌がゲンタマイシンによる死滅を回避し、数を数えることができるゲンタマイシン保護アッセイによって定量化されてきた(70)。迅速な評価のために、蛍光タグを付けたサルモネラ菌を用いた侵入のスクリーニングシステムがHeLa細胞を用いて評価され、1アッセイあたり24サンプルを試験することができ、化学ライブラリーや潜在的な薬剤試験に応用できる(71)。付着性アッセイと同様に、バーチャル・コロニー・カウント・ハイスループット法がサルモネラ菌の侵入の研究に応用されており、1アッセイあたり96サンプルを検査することができる(30)。バーチャル・コロニー・カウンティング法のように、複数の機能的形質を特徴づけることができるツールは、より有用性が高い。
毒素産生
いくつかの細菌病原体は、シグナル伝達を混乱させ、生化学物質を分解し、宿主組織を損傷して感染を確立するために、タンパク質毒素を使用する(72)。様々な細菌種で多数の毒素が報告されている。毒素は単なる破壊的な道具ではなく、環境中の単細胞真核生物からの生存や逃避に寄与している可能性がある(73)。臨床的に重要な毒素を特異的に検出する方法としては、酵素結合免疫測定法（ELISA）、ラテラルフローテスト、ウェスタンブロット、細胞培養、質量分析などがある(74)。しかしながら、既知の毒素、新規毒素、毒素の力価を同時に特徴付け、他の機能的形質やゲノム情報からのデータを統合する方法は、まだ十分に研究されていない。
従来、細菌毒素は、真核細胞の破壊や死滅を引き起こす細菌培養濾液の観察に基づいて発見され、機能的に特徴付けられてきた(31)。細菌毒素は重要な病原因子であるが、新たな毒素も絶えず発見されている。例えば、間隙形成毒素エクソリシン（ExlA）は、出血性肺炎を引き起こす緑膿菌の強毒株から2014年に初めて報告された（75）。既知の毒素については、毒素によって切断される発色基質を含む選択寒天培地が、活性毒素を産生する株と産生しない株を区別するために開発されている（32）。発色培地を使用する場合のスループットは、寒天培地1枚につき1株に制限されることが多く、菌株の培養時間に応じて時間がかかることがある。また、PCRのような遺伝学的手法は、毒素の特性解析やサブタイプ分類のためのフォローアップ検査に用いられることが多く、結果までの時間が長くなる可能性がある。また、PCR法では機能に関する独立した結果が得られないことが多く、むしろ遺伝子の存在だけを調べることになる(32)。我々の知る限り、ハイスループット・スクリーニングは主に化学毒素を対象として開発されたものであり、細菌毒素についてはそれほど強固に開発されていない(76, 77)。しかし、細菌毒素がしばしば作用するイオン電流や電位依存性イオンチャネルの状態（例えば、開閉）を測定する自動パッチクランププラットフォームが存在し、機能測定に使用することができる。SyncroPatchのような自動パッチクランププラットフォームは、384および768サンプルを評価できる高スループットプラットフォームであり、PseudomonasやVibrio種などの病原性細菌が産生するテトロドトキシンの検出に応用された(33)。自動化されたパッチクランプのスループットは選択培地よりもかなり高いが、細菌毒素が作用するレポーター細胞株におけるチャネルの構築と安定発現が制限要因となっている。
免疫系の回避
多くの病原体は、宿主の自然免疫系を回避するための防御を発達させてきた。病原性細菌の中には、エフェクターと呼ばれるタンパク質を、細菌膜と宿主膜を横断する特殊な分泌系を介して標的宿主細胞に直接注入し、宿主細胞の機能を操作するものがある。最もよく知られた分泌システムのひとつが、III型分泌システム（T3SS）である(78)。T3SSは病原体に特異的で多様なエフェクタータンパク質を注入し、病原性メカニズム、特に免疫系の破壊を誘導する。病原体はT3SSのエフェクターを用いて、宿主のシグナル伝達カスケードやパターン認識レセプターを活性化したり、自然および適応的防御の回避を抑制したりするなど、いくつかの方法で宿主の免疫を回避する(79)。
病原性細菌のエフェクターを同定する効率的な方法が必要とされている。Genome Search for Effectors Tool（GenSET）は、細菌のエフェクター配列を予測することができる(35)。このツールは、研究者が下流のウェットベンチで実験的検証を行うための情報を提供できるが、GenSETの予測率は低い。これは、異種エフェクターが特定の微生物に適用されると別の属性をもたらす可能性があるため、異なる生物種に見られる様々なT3SSファミリーが原因である可能性がある。予測率が低いと不正確な結果が得られる可能性があるため、下流での検証が必要となる(35)。注釈のない塩基配列やタンパク質配列から新規エフェクターを正確に同定するためには、改良された計算アプローチや機械学習アルゴリズムが必要である。
実験室では、自然免疫系を回避する細菌因子の能力を調べるために、しばしば動物モデルが用いられる(34)。対照的に、in vitroのプラットフォームは費用効率が高く、迅速である。HEK-Blue TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9細胞（InvivoGen社）や、以前使用された核因子κBレポーター株（49）など、免疫系の活性化を検出するためのレポーター細胞株がいくつかある。免疫系の回避を検出するためには、上皮細胞と免疫細胞の共培養など、関連するin vitro系で細菌病原体の特徴を明らかにすることが不可欠である。最近の研究では、生体内の微小環境を再現する試みとして、構造と機能をシミュレートする「ガット・オン・チップ」が研究されている(80)。このような組織チップは、動物実験よりもハイスループットなスクリーニングで微生物と宿主の相互作用を研究するための有望なアプローチである。このチップには、常在細菌や病原性細菌に反応する単核食細胞を3D構成で組み込むことができる。異なる組織と細胞種を共培養する際の課題は、細胞種ごとに最適条件が異なる可能性があり、リアルタイムの相互作用が不正確になることである。その他の課題としては、免疫細胞の接着、材料の適合性、細胞外マトリックス（ECM）の選択、ECMを介した免疫細胞の移動などがある(81)。しかしながら、臓器オンチップ装置は、潜在的病原体に対する上皮細胞や免疫細胞の反応を理解する上で、有望な研究手段となる。
細胞死の誘導
感染中、宿主細胞は宿主から感染細胞を除去するために、細胞死を含む様々な方法で病原体に反応する。細胞死には死が始まる経路が規定されており、細胞の様々な形態学的、分子学的変化がそれぞれの経路を特徴づける。細胞死の一般的なメカニズムには、アポトーシス、ネクローシス、パイロプトーシスがあり、最も特徴的なのはアポトーシスである(82)。アポトーシスは非炎症性のプログラムされた細胞死であり、細胞膜の白化、細胞の収縮、DNAの断片化などの細胞形態の変化を特徴とする。Banfalviは、構造的・機能的変化に関連するアポトーシスを検出するいくつかのアッセイについて概説している(83)。加えて、非プログラム化細胞死が感染によって起こることもある(84)。
細胞死アッセイは、ハイスループットスクリーン用に開発されてきた。Cummingsらは、これらの方法論を詳しくレビューしている(85)。しかしながら、ほとんどのアッセイは病原体による細胞死を評価するためというよりは、むしろ創薬の観点からデザインされている。創薬アッセイは細胞死とどのような経路が活性化されるかを決定することができるが(85)、細菌病原体の特徴を明らかにするためには、もっと広く検討されるべきである。Yangら（49）によって開発されたプラットフォームでは、抗生物質耐性、免疫活性化、接着に加えて、細胞染色とフローサイトメトリーを用いて細菌による細胞死が検査された。
病原性細菌はいくつかの細胞経路を活性化することができる。われわれは以前、タンパク質キナーゼERK（細胞外シグナル制御キナーゼ）と転写因子Fra1（FOS関連抗原1）経路が活性化または阻害されるとシグナルを発する蛍光レポーター肺細胞株を作製した（86）。蛍光シグナルの変化は、宿主細胞のストレス応答／細胞障害作用の前に起こる。このハイスループット画像ベースのアッセイでは、生きた細菌株をインキュベートすることにより、細胞の健全性を機能的にスクリーニングすることができる。このアッセイの限界は、すべての病原性細菌がERK-Fra1シグナル伝達経路を阻害できるわけではないことである。この方法を用いて、細胞死や細胞タイプの蛍光レポーター経路の数を増やし、より広範な病原体を含める機会がある(86)。
限界と結論
遺伝子型と表現型の関連付けと統合は、病原体の特性解析を強化する。これまでのところ、遺伝子配列データの量は細菌性病原体の機能形質データを上回っている。したがって、遺伝子配列データと歩調を合わせるためには、高スループットの機能アッセイが必要である。最近、PathEngineは表現型に基づくパイプラインの統合戦略を用いて、付着性、毒性、抗生物質耐性、自然免疫活性化を含む病原性の可能性を評価した(49)。機能的アッセイ検査データを活用する際の大きなハードルは、これらのアッセイから得られた情報を、配列、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロームデータなどの既存の情報と統合することである。このようなデータを利用するためには、堅牢で機敏なデータベースが必要である。以前に提案されたように、病気の病原体診断シグネチャーを同定するためのマルチオミクスの統合は、微生物に関する事前の知識がなくても、潜在的な病原体を検出できる可能性がある(87)。
もう一つの限界は、個々のタンパク質がグローバルな感染モデルの一部としてどのように機能するかが不明確な場合があるため、病原体の機能データの統合が困難であることである。そのため、病原性を理解するために複数の細菌の機能的形質を統合することは、頑健には開発されていない。WGS、プロテオミクス、そして本研究で取り上げた機能検査など、複数の情報を利用する戦略を開発することで、既知および新規の生物を病原性の可能性で分類するための、より詳細な理解が生まれるであろう。
謝辞
本論文に記載された研究は、米国エネルギー省のためにバテル記念研究所が運営するマルチプログラム国立研究所であるパシフィック・ノースウェスト国立研究所で実施された。Battelle Memorial Instituteは、DE-AC05-76RL01830契約に基づき、米国DOEのためにパシフィック・ノースウェスト国立研究所を運営している。
図はBioRender.comで作成。
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感染免疫、2022年
大腸がんに対する微生物ベースの管理
Zi-Yun Gaoら、中国医学報、2021年
パイロプトーシスをかわす方法：Shigella flexneriからの教訓
Van Hauwermeirenら、Cell Research誌、2021年
大腸がん発症における細菌感染と腸内マイクロバイオームの影響
Jun Sunら、Chinese Medical Journal誌、2022年
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