メラトニンの腸内炎症に対する微生物叢依存的な悪化作用について

2023年4月29日 09:58

https://www.mdpi.com/2076-2607/11/2/460

で
ジェファーソン・ルイス・ダ・シルヴァ
1,†,
リア・ヴェゼンファード・バルボサ
1,†,
カミラ・フィゲイレド・ピンサン
1,2,
ヴィヴィアーニ・ナルディーニ
1,
イリスレーヌ・シモンイス・ブリゴ
1,
カシア・アパレシダ・セバスティアン
1,
ジェファーソン・エリアス-オリベイラ
2,
Vânia Brazão（ヴァニア・ブラザン
1,
ジョゼ・クロヴィス・ド・プラド・ジュニオール（José Clóvis do Prado Júnior
1,
ダニエラ・カルロス
2と
クリスティーナ・リベイロ・デ・バロス・カルドーゾ
1,*
1
サンパウロ大学リベイラン・プレト薬学部臨床分析・毒物学・食品科学科、Av. do Café, s/n, Ribeirão Preto 14040-903、SP、ブラジル
2
サンパウロ大学リベイラン・プレト医学部生化学・免疫学教室、リベイラン・プレト14040-903、SP、ブラジル
*
著者名：Author who correspondence should be addressed.
†
これらの著者は、この仕事に等しく貢献した。
微生物 2023, 11(2), 460; https://doi.org/10.3390/microorganisms11020460
受理されました： 2022年12月22日／改訂：2023年1月31日／受理された： 2023年2月9日 / 発行：2023年2月11日
(この記事は特集「腸内細菌叢：健康・臨床・ビヨンド」に属しています）。
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アブストラクト
腸内細菌の異常や腸内環境の乱れは、炎症性腸疾患（IBD）に共通する反応異常を引き起こす可能性があります。このような状態は、通常の治療法に対して難治性である可能性があり、腸管免疫をよりうまく制御するためには、新しい治療法が必要です。メラトニン（MLT）は、免疫反応や腸内細菌叢との相互作用が知られているため、代替治療薬として注目されているホルモンです。そこで、我々は、腸内環境の悪化、炎症、細菌の移動を伴って進行する実験的大腸炎におけるMLTの効果を評価した。C57BL/6マウスにデキストラン硫酸ナトリウムを投与し、MLTを投与した。急性大腸炎では、このホルモンにより、臨床的、全身的、腸の炎症パラメータが増加した。寛解期には、MLTの継続投与により回復が遅れ、TNF、メモリーエフェクターリンパ球の増加、脾臓制御細胞の減少が見られた。MLT投与により、マウスの糞便中のバクテロイデーテス属は減少し、アクチノバクテリア属とベルコミクレビア属は増加した。微生物叢の枯渇により、MLT投与後の大腸炎の表現型が顕著に回復し、対抗的な免疫反応、TNFおよび大腸マクロファージの減少が見られた。また、回復したマウスでは、放線菌、ファーミキューテス、そして最も顕著なのはVerrucomicrobia門の減少がみられた。これらの結果から、MLTの腸内細菌叢に依存した腸内炎症の増強作用が示唆された。
キーワード
微生物叢、IBD、メラトニン、腸内細菌異常症、炎症

はじめに
腸内細菌叢は、食物の消化、腸管免疫系の発達、病原性微生物に対する防御など、数多くの生理的プロセスに不可欠です [1,2,3] 。したがって、腸内細菌叢の異常や腸内環境の恒常性の破綻は、免疫反応の異常や組織障害をもたらす可能性があります[4,5]。潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患（IBD）は、遺伝的感受性、環境因子、腸内微生物に関連した制御不能な粘膜反応から生じる消化管の慢性疾患です [6]。
IBDに罹患した患者は、腸内の細菌、真菌、ウイルス、その他の集団に変異があり、常在菌と病原性微生物の間のバランスが崩れています [7]。免疫寛容の破壊と腸内環境の異常の結果、炎症細胞が組織に蓄積し、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン1β（IL-1β）、IL-17、IFN-γなどのサイトカインによって引き起こされる結果反応の悪化 [7,8,9] により白血球の活性化、上皮破壊、腸の破壊につながる。
IBDの治療では、腸の炎症増悪を抑制することを目的に、免疫抑制剤や生物学的製剤を使用することが必要です。しかし、中等症や重症の患者さんの中には、治療介入に十分な効果が得られず、腸管の外科的切除が必要となる場合があります [10] 。したがって、腸の反応を制御するためのより保守的なアプローチを実施する試みとして、IBDに対する新規または補助的な治療法が望まれるところである。様々な調節分子の中で、メラトニン（MLT）などのホルモンは、免疫反応や腸内細菌叢との相互作用が知られているため、腸の炎症を調節する選択肢として注目されている[11,12]。
MLTは、視床下部の刺激により、主に夜間に松果体から合成されます。その毎日の分泌は、明暗サイクルに同期した概日リズムに依存するが、松果体以外からのMLT分泌は、光周期とは無関係のようである [13] 。消化管では、高濃度のMLTが存在し、これは腸に存在するエンテロクロマフィン細胞によって合成されると考えられる[14]。
興味深いことに、腸内のMTLの濃度は、松果体を含む他の臓器で見られる濃度よりも高く、このホルモンが消化管で重要な役割を果たしていることが示唆されています[14,15,16,17]。免疫系細胞への影響に加え、最近の研究では、腸内細菌Enterobacter aerogenesなどの微生物叢の構成要素も、MLTの作用に影響を受けることが示唆されている[18]。しかし、消化管免疫におけるMLTの関連性が明らかであるにもかかわらず、このホルモンのIBD制御への適合性はまだ不明です[19,20]。
そこで、ここでは、腸内環境の異常、細菌の移動、免疫反応の悪化をコースとするマウス大腸炎モデルにおけるMLT治療の効果、および腸の炎症からの回復におけるこのホルモンの役割を評価しました。
材料と方法
2.1. 動物編
野生型C57BL/6雄性マウス（6-8週齢）は、サンパウロ大学リベイラオプレト薬学部（FCFRP/USP）の免疫内分泌・制御研究所（LIR）の動物施設で、湿度と温度が通常の条件で、12時間の明暗サイクルを持つ、清潔で静かな環境下で飼育しました。実験中、マウスには餌と水を自由摂取させた。手順は、FCFRP/USPの動物使用倫理委員会（CEUA）によって承認された動物研究の倫理の原則に従って行われた（プロトコル17.1.1073.60.3)。
大腸炎モデルにおけるMLTの潜在的な効果を評価するために、マウスを異なる実験デザインで評価した。最初の研究プロトコルでは、動物を2つのグループに分け、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）に10日間曝露し、3日目から15日目まで、ビヒクル溶液（グループ1；n = 5）またはMLT（グループ2；n = 5）で毎日治療しました。この条件下で、マウスの体重および臨床的疾患スコアを36日目まで分析した。グループ3は、実験的介入を行わないナイーブコントロール動物（グループ3；n＝5）であった。第二の研究は、大腸炎誘発の急性期におけるMLTの影響を調べることを目的としたものである。プロトコールは、DSSに7日間暴露したマウスに、大腸炎症状の発現（3日目）から6日目まで、ビヒクル溶液（グループ1；n＝5）またはMLT（グループ2；n＝5）を毎日投与することで行われた。サンプルは7日目に採取した。第3のプロトコルは、DSSを中止した後、腸の炎症の回復におけるMLTの効果を評価するために設計された。マウスは、DSSを除去した後、7日間、このコリトジェニック・トリガーに曝露された。MLT（グループ1；n＝5）またはビヒクルの生理食塩水（グループ2；n＝5）による処置は、3日目（症状発現）から12日目の実験日まで毎日行われました。サンプルは13日目に採取された。第4のプロトコルは、腸の炎症に対するMLT効果における腸内細菌叢の役割を調査するために設計された。そのために、マウスは、毎日生理食塩水（グループ1、n＝10）または微生物叢枯渇のための広範囲の抗生物質療法（グループ2；n＝10）を10日間受け、その後7日間DSSに曝露し、大腸炎誘発を行った。なお、腸炎誘発3日目から12日目までは、ビヒクル液またはMLTによる対照処理を行った。同様に、13日目にマウスを安楽死させ、サンプル採取と評価を行った。
2.2. 実験的腸管炎症の誘発
大腸炎は、上記のように、7日または10日の期間、マウスが利用できる3％のデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を含む飲料水を独占的に投与する1サイクルで誘発した。
2.3. コントロールおよびメラトニン処理
MLTは、以前に記載されたように[21,22,23]、10mg/kgの濃度で、毎日、午前8時に経口投与した。メラトニン投与のタイミングは、補足図S1に描かれているように、治療に対する臨床反応の特徴づけを目的とした最初の実験に基づいて選択した。MLTの希釈は、1％エタノールを含む0.9％等張食塩水で行った。対照のために、マウスは、MLTを含まないビヒクル溶液を受け、これもまた経口投与された。
2.4. 腸内細菌叢の枯渇
腸内細菌叢を枯渇させるため、マウスを滅菌水で希釈した以下の5種類の抗生物質の組み合わせで処理した：アンピシリンナトリウム（New Farm, Farmaceutical Industry, Anápolis, Goiás, Brazil-1 g/L）、硫酸ネオマイシン（Chemical and Farmaceutical Galena LTDA, Campinas, São Paulo, Brazil-1 g/L）、メトロニダゾール（Embrafarma Chemical Products and Farmaceutical、サンパウロ、ブラジル-1g／L）、硫酸ゲンタマイシン（ファーマノストラ、リオデジャネイロ、ブラジル-1g／L）、L）および塩酸バンコマイシン（ニューファーム、ファルマインダストリー、アナポリス、ゴイアス、ブラジル-0. 5g/L）を使用した。抗生物質療法は、黄砂およびMLT曝露の前に、10日間連続で、毎日ガベージすることにより行った。
2.5. 臨床的疾患スコアの評価
マウスは毎日、体重の変化と大腸炎の臨床症状について評価された。各シグナル（肛門周囲の湿潤、下痢、膿、血便の有無、活動低下、毛細血管拡張）は1点とし、マウス1匹あたりのそれらの合計が日々の臨床疾患スコアに相当した。また、24時間以内に体重が5％以上10％未満減少したマウスを1点、10％以上減少したマウスを2点とし、1日のスコアに加算した。体重減少や他の大腸炎の徴候がない場合は、スコアは0点とした。総スコアは、実験プロトコルの期間中、各マウスについて、1日あたりの全ポイントの合計に相当する。要約すると、マウススコアの定量化は、我々のグループによって以前に記述されたように、通常、少なくとも2人の盲検化された検査者によって、毎日、各マウスで別々に、兆候の視覚的評価によって行われた[24、25、26]。
2.6. 安楽死とサンプル採取
実験プロトコルの終了時に、マウスを安楽死させた。血清保存のために血液を採取し、またパノチコ染色による全細胞および特異的細胞の計数を行った。大腸は、免疫学的および組織炎症評価のために断片に分割され、その後、ELISA、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）およびN-アセチルグルコサミニダーゼ（NAG）アッセイ用に液体窒素で直ちに凍結した。また、脾臓と腸間膜リンパ節（MLN）を採取し、培養、サイトカイン測定、細胞表現型解析を行った。
2.7. FITC-Dextranによる腸管透過性評価
腸管透過性アッセイは、FITC-Dextran定量法を用いてバリアの完全性を評価するために行った。要約すると、安楽死の12時間前に食物と水を抜き、その後、透過性マーカーを44mg/100g体重の濃度で経口投与した（FITC-Dextran、MW 4000; FD4; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）。4時間後に血清を採取し、蛍光測定（励起、483nm；発光、525nm）により蛍光強度を測定した。血清FITC-Dextran濃度は、本化合物の連続希釈により作成した標準曲線を用いて、0.06から2000μg/mLまでの範囲で決定した。
2.8. 総白血球数および差分白血球数
全血をターク液で希釈した後、ノイバウアーチャンバーでグローバルセルカウントを実施した。結果は血液1mLあたりで表し、スライドスミアはRomanowsky血液学的染色原理を用いたrapid panotic (Laborclin, Pinhais, PR, Brazil)で染色した。細胞は、油浸対物レンズを備えた顕微鏡（DM750、Leica、Wetzlar、Germany）を用いて定量化した。検査は、拡張部の最も薄い部分で行い、合計100個の白血球（好中球、単核球、好酸球、好塩基球）を数えた。
2.9. 好中球およびマクロファージ活性の間接的な定量化
大腸断片における好中球とマクロファージの存在の間接的な定量化は、それぞれミエロペルオキシダーゼ（MPO）とN-アセチルグルコサミニダーゼ（NAG）という酵素の活性を測定することによって行われた。簡単に説明すると、腸管片をホモジナイズし、赤血球を溶解した。残りの細胞は酵素抽出のために溶解され、細胞抽出上清で定量された。MPOの測定は、上清をテトラメチルベンジジン（TMB）（BD Bioscience, San Diego, CA, USA）とインキュベートし、450nmで吸光度を読み取った。NAGの測定には、同じMPO上清を用い、p-ニトロフェニル-2-アセトアミド-β-D-グルコピラノシドとクエン酸バッファーとを添加した。インキュベーション後、反応を405 nmで読み取った。すべての結果は、グラム（g）単位の組織重量で補正した光学密度（OD）として表した。
2.10. ELISAによるサイトカイン測定のための酵素免疫測定法
腸管片を秤量し、プロテアーゼ阻害剤（Complete ®-Roche, Pharmaceuticals, Mannheim, Germany）を含む500μLのバッファー中でホモジナイズした。サンプルを5000×gで15分間、4℃で遠心分離し、上清をELISA反応に使用した（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, BD PharmingenTM, San Diego, CA, USA）。製造元の推奨に従って、IL-17AおよびTNFの捕捉抗体および検出抗体とともにインキュベートした（BD BiosciencesTM-San Jose, CA, USA）。反応はTMBの添加で現像し、4M H2SO4で停止した。読み取りは分光光度計で450nmで行い、最終濃度をアッセイに使用した腸管断片の重量で正規化し、pg/mL/g組織として表した。
2.11. 脾臓細胞および腸間膜リンパ節のイムノフェノタイピング
脾臓とMLNから採取したTエフェクターメモリー細胞（TEM）と制御性T細胞（Treg）の表現型の特徴づけのために、CD3、CD4、CD8、CD62L、CD44に対する抗体を使用した。Tregについては、表面抗原（CD3、CD4、CD25）および細胞内抗原（Foxp3転写因子）を標識しました。Tリンパ球によるサイトカイン産生を定量化するために、CD3、CD4、IL-4およびIL-10マーカーの検出のために細胞を染色した。標識に使用した抗体は、それぞれのアイソタイプコントロールを含む蛍光色素FITC、PE、PeCy-7、BV510、BV421、APC、ALEXA 647またはPERCP（BD PharmingenTM, San Diego, CA, USA）にコンジュゲートされていた。細胞の取得はフローサイトメーター（LSRFortessa-BD BioscienceTM, San Diego, CA, USA）で行い、解析はFlowJoTM v10ソフトウェアを用いて実施した。
表面の免疫染色については、細胞を特定のチューブに分け、50μLのPBS/1%変性乳とともに4℃で30分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。次に、CD3、CD4、CD8、CD62LまたはCD44に特異的な抗体と、4℃で30分間インキュベートした。その後、細胞をPBSで洗浄し、PBS 1%ホルマリンで固定し、後にフローサイトメーターで取得した。
Tregについては、BD PharmingenTM Mouse FoxP3 Buffer Set（BD PharmingenTM, San Diego, CA, USA）を用いて固定および透過化した後、製造者の指示に従ってサンプルを免疫染色した。
サイトカイン（IL-10およびIL-4）の産生を評価するために、白血球をin vitroで4時間再刺激し、50 ng/mL のphorbol-12-myristate-13-acetate (PMA-Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）および500ng/mLのイオノマイシン（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）、1μL/mLのブレフェルディン（Golgi stop, BD BioscienceTM, San Diego, CA, USA）の存在下で37℃および5％CO2で行った。白血球を表面マーカーで染色し、BD PharmingenTM Transcription Factor Buffer Set (BD PharmingenTM, San Diego, CA, USA) を用いて固定および透過処理を行い、その後、細胞内染色のために抗サイトカイン抗体とインキュベートした。
2.12. 腸内細菌叢の解析
腸内細菌叢における細菌フィラの相対的な存在量を定義するために、DSSに曝露し、抗生物質、MLTまたはビヒクル溶液で処理または処理しないマウスの糞便サンプルを、定量PCR（q-PCR）アッセイに使用しました。簡単に説明すると、糞便DNA抽出はDNeasy® PowerSoil®キット（Qiagen, Hilden, Germany）の推奨事項に従って行われました。PCR分析には、10 ngのDNAと1 uMのフォワードおよびリバースプライマー（Eubacteria-normalizer gene16S rRNA primer, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria and Verrucomicrobia）を使用した［27］。プライマー配列は表1に記載されている。Eubacteriaのサイクル閾値（CT）値と評価菌門との差（ΔCT）を用いて、各菌門の正規化レベルを求めた（2-ΔΔCT）。DSSのみを投与した実験群は、各菌門の相対的存在量を定義するためのノーマライザーとして使用された。
表1. リアルタイムPCRで使用したプライマー配列。
2.13. 統計解析
統計解析は、Graphpad Prism® 6ソフトウェア（バージョン6.0）を用いて実施した。すべての変数について、正規分布と均質な分散を検定した。分布が正規分布で均質分散と考えられる場合、3群以上の場合はパラメトリックANOVA検定とTukeyのポストテスト、2群の場合はStudentのT検定が用いられた。分布がガウス型でない場合は、ノンパラメトリックのKruskal-Wallis ANOVA testと3群以上の場合はDunnのpost-test、2群の場合はMann-Whitney testを使用した。結果は、平均値±SEM（平均値の標準誤差）で表した。観察された差は、pが<0.05(5%)のとき、有意とみなされた。
結果
最初のプロトコールでは、実験的な腸の炎症におけるMLTの全体的な効果を特徴付けるために、このホルモンを急性期と修復期に投与したC57BL/6マウスに大腸炎を誘発した。長期間の追跡調査により、MLTは黄砂による腸炎を悪化させ、特に臨床的な疾患スコアを増大させることが明らかになった（補足図S1）。次に、これらの既知の知見に基づき、大腸炎の調節におけるMLTの役割を評価するために、追加のモデルを確立しました。
第二のプロトコールでは、マウスを黄砂にさらし、炎症徴候の発現時にMLTを投与した（図1）。その結果、MLTを投与したマウスでは、体重が減少し、疾患の進行を通じて大腸炎の重症度が著しく上昇し、臨床的な総スコアが高くなった（図1B-D）。また、これらのマウスは、単核球（図1F）および好中球（図1G）を含む循環総白血球数（図1E）の増加を示し、DSSによって誘導された全身性炎症作用がMLT処理によって増強されたことが確認された。実際、これらのマウスは、炎症を起こした結腸におけるIL-17Aの有意な減少および顕著なTNF産生とともに、腸管透過性の増加傾向（図1H）を示した（図1I、J）。
図1. メラトニン（MLT）は、実験的大腸炎における急性炎症を増強させる。腸炎は、飲料水中の3％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）に7日間曝露することで誘発した。(A）マウスにMLT（10mg/Kg）を3日目から6日目まで経口投与し、7日目に安楽死させてサンプル採取を行った（第2実験プロトコル）。B）において、大腸炎誘発の初日に関連する体重の変化。(C）実験期間中の毎日の臨床疾患スコアと（D）総スコア。(E）循環白血球、（F）単核細胞、（G）好中球。H）では、血清サンプル中のFITC-デキストランの検出により腸管透過性を評価した。(I）MLTで処理した、または処理しない大腸炎マウスの腸内のIL-17Aおよび（J）TNFレベル。サイトカインはピコグラム/ミリリットルで描かれ、結腸重量で正規化されている。結果は、5匹/グループの3つの独立した実験の代表である。* p < 0.05.
次に、MLTが腸の炎症の回復に役割を果たし得るかどうかを検証するために、MLT治療を13日目まで延長し、一方、DSSトリガーは7日目に撤回した（図2A）。この第3のプロトコルのシナリオでは、MLTは大腸炎の結果に対してより顕著な影響を及ぼした。ホルモン剤を投与したマウスは、MLTを投与しなかったマウスに比べて、体重減少や臨床症状のスコアが高くなった（図2B、C）。臨床症状の悪化は、単核球（図2E）や好中球（図2F）などの循環総白血球数（図2D）の上昇を伴っていた。さらに、MLT治療は、腸粘膜における好中球およびマクロファージの活性の増大をもたらした（それぞれ図2G、H）。IL-17A産生に統計的な差は認められなかったが（図2I）、MLT処理群では腸の炎症が寛解する間、大腸のTNFレベルが顕著に増大したことが確認された（図2J）。
図2. メラトニン（MLT）は腸の炎症からの回復を阻害する。大腸炎は、飲料水中の3％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）に7日間曝露することにより誘発した。マウスにMLT（10mg/Kg）を3日目から12日目まで毎日、経口投与し、13日目に安楽死させてサンプル採取した（（A）、第3実験プロトコル）。B）では、大腸炎誘発の初日に関連する体重の変化。(C）実験期間中の毎日の臨床疾患スコアと（D）総スコア。(E）循環白血球、（F）単核細胞および（G）好中球。H）では、血清サンプル中のFITC-デキストランの検出により腸管透過性を評価した。(I）MLTで処理した、または処理しなかった大腸炎マウスの腸内のIL-17Aおよび（J）TNFレベル。サイトカインはピコグラム/ミリリットルで描かれ、結腸重量で正規化されている。結果は、5匹/グループの3つの独立した実験の代表である。* p < 0.05.
腸管排出リンパ節における免疫応答の調節は、大腸炎のMLT治療によっても影響を受け、抑制性サイトカインIL-10を産生するCD3+CD4+集団が減少したにもかかわらず、制御性T細胞の頻度が重要に増加した（図3Aおよび補足図S2）。MLNとは別に、全身の脾臓の応答は、MLT処理によって顕著に変化し、Foxp3制御マーカーを発現する制御性T細胞の頻度が減少したのとは対照的に、TCD4およびTCD8エフェクター記憶細胞（図3Bおよび補足図S3）の集積が増加した（図3Bおよび補足図S2）。最も興味深いことに、大腸炎から回復し、MLTで治療したマウスの脾臓TNF産生は、このホルモンで治療しなかったマウスと比較して著しく高く（図3B）、細菌制御に関連する全身性免疫機構が、腸の炎症のMLT治療に直面して長期的に維持または増強されたことを示唆した。
図3. メラトニン（MLT）治療大腸炎における脾臓および腸間膜リンパ節（MLN）の反応。大腸炎は、飲料水中の3％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）に7日間曝露することで誘発した。マウスにMLT（10mg/Kg）を3日目から12日目まで毎日ガベージ投与し、13日目に安楽死させてサンプル採取を行った。MLN（A）および脾臓サンプル（B）において、様々な免疫細胞サブタイプの頻度（％）をフローサイトメトリーで評価した。エフェクターメモリーTリンパ球（TEM）の特徴付けのために、CD4+CD62L-CD44+およびCD8+CD62L-CD44+集団が評価された。制御性T細胞は、CD3+CD25+Foxp3+およびCD3+CD25-Foxp3+の染色によって特徴付けられた。IL-4またはIL-10を産生するCD4 T細胞の同定は、CD3+CD4+IL-4+およびCD3+CD4+IL-10+集団でも行われた。両方のリンパ系器官におけるTNFの濃度を決定し、器官の重量に関連して、1ミリリットルあたりピコグラムで表現した。これらの結果は、1グループあたり5匹のマウスによる2回の独立した実験の代表的なものである。* p < 0.05.
その後、腸内細菌異常が大腸炎の主な特徴の一つであることを考慮し、腸内細菌叢の組成に対するMLTの影響を評価しました。その結果、糞便微生物叢の構成において、ホルモンの直接的または間接的な影響が顕著であり、バクテロイデーテス門の減少とは対照的に、放線菌が増加した（それぞれ図4A、C）一方、固形化菌やタンパク質細菌の集団には差がなかった（それぞれ図4B、E）。興味深いことに、MLTは、このホルモンを投与した大腸炎マウスの修復期において、Verrucomicrobia門の顕著な増加につながった（図4D）。
図4. 実験的大腸炎の回復期にメラトニン（MLT）によって誘導された全身的かつ持続的な炎症は、微生物叢の枯渇によって回復する。腸炎は、飲料水中の3％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）に7日間曝露することで誘発した。マウスにMLT（10 mg/Kg）を3日目から12日目まで毎日、ガベージ投与し、13日目に安楽死させて糞便を採取した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により、糞便サンプル中のActinobacteria（A）、Firmicutes（B）、Bacteroidetes（C）、Verrucomicrobia（D）、Proteobacteria phyla（E）の検出を行った。F）では、材料と方法（第4の実験プロトコル）に記載されているように、大腸炎誘発の前に、微生物叢枯渇のために抗生物質（ABX）で10日間マウスを毎日処置した。その後、3％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を含む飲料水に7日間連続して曝露することにより、腸炎を誘導した。マウスにMLT（10mg/Kg）を3日目から12日目まで毎日、経口投与し、13日目に安楽死させてサンプル採取を行った。(G）体重変化（％）；（H）臨床疾患スコア；（I）総循環白血球；（J）末梢血単核球の頻度；（K）血中好塩基球。L,M）において、それぞれIL-4またはIL-10を産生する脾臓Tリンパ球。結果は、1群5〜10匹のマウスによる3回の独立した実験の代表的なものである。* p < 0.05.
MLT投与による腸内炎症の悪化とマウスの回復遅延における腸内細菌異常の役割をより深く理解するために、4番目の実験プロトコルでは、DSS曝露前に、微生物叢枯渇のための広域抗生物質療法を動物に施した（図4F）。その結果、MLTを投与したマウスでは、体重の回復が早く、大腸炎の臨床スコアが改善し、疾患表現型の顕著な逆転が見られた（それぞれ図4G、H）。この疾患改善は、単核球（図4J）を含む血中総白血球の減少（図4I）および好中球数の増加（図4K）を伴っていた。最も重要なことは、腸内細菌叢の枯渇は、MLTで処理したマウスの脾臓でIL-4およびIL-10サイトカインを産生するCD4 Tリンパ球の増加（それぞれ図4L，M）で観察されるように、対抗調節性の全身反応をもたらすことである。
それに伴い、腸内のマクロファージ活性の低下（図5B）、および腸内細菌叢枯渇後のMLTで処理したマウスの大腸における炎症性サイトカインTNF産生の著しい減少（図5D）も観察された。好中球活性とIL-17応答は、抗生物質治療後の両群で影響を受けなかった（それぞれ、図5A,C）。腸内細菌叢については、Bacteroidetesの差はなくなり（図5F）、Proteobacteria phylumの有意な検出はなかった。それにもかかわらず、他の門の構成は明らかに逆転しており、Actinobacteria門（図5E）、Firmicutes門（図5G）、そして最も顕著なのはVerrucomicrobia門（図5H）の減少が見られ、これは腸内細菌叢が枯渇していないときにMLTで治療した大腸炎グループで顕著に増加しました。図5Iは、大腸炎における腸内細菌叢の変化をまとめたヒートマップで、ホルモン療法によって変調をきたしたことを表している。全体として、我々のデータは、黄砂によって誘導された腸の炎症の増強におけるMLTの腸内細菌叢依存的な効果を示している。
図5. 長年の腸の炎症とディスバイオシスに対するメラトニン（MLT）効果は、腸内細菌叢に依存している。マウスは、材料と方法に記載されているように、大腸炎誘導の前に、微生物叢枯渇のために抗生物質（ABX）で10日間毎日治療されました。その後、3％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を含む飲料水に7日間連続暴露することにより腸炎を誘発した。マウスは、3日目から12日目まで毎日、MLT（10mg/Kg）をガベージ投与し、13日目に安楽死させてサンプル採取した。A,B）において、大腸ミエロペルオキシダーゼ（MPO）およびNアセチルグルコサミニダーゼ（NAG）活性。(C）微生物叢枯渇後に大腸炎を誘発し、MLT処理を行ったマウスの腸内におけるIL-17Aおよび（D）TNFレベル。サイトカインはピコグラム/ミリリットルで描かれ、結腸重量で正規化されている。糞便サンプルにおける（E）放線菌、（F）バクテロイデーテス、（G）ファーミキューテス、（H）ベルコミクロンビアのフィラの相対発現。(I) DSS大腸炎におけるMLT処理によって誘発された微生物叢組成の変化をまとめたヒートマップ。結果は、1グループあたり10匹のマウスによる3回の独立した実験の代表的なものである。* p < 0.05.
考察
宿主の微生物叢の乱れは、組織障害や免疫反応の悪化を引き起こす腸疾患と関連している。IBDのような従来の治療法に対する反応性が低い再発性の慢性疾患の治療には、粘膜炎症の調節を目的とした代替アプローチが不可欠である。そこで、炎症と腸内細菌叢の関係においてMLTが重要な役割を果たしていることを示唆する証拠が増えていることから[28]、腸のホメオスタシスにおける調節効果の可能性について検討した。
MLTはトリプトファン由来の分子で、概日リズムだけでなく、微生物の代謝や、B細胞やT細胞の活性化制御を含む白血球の反応にも影響を及ぼす[29]。MLTを腸疾患の補助的治療薬として使用する可能性が報告されているが、コンセンサスは得られておらず、IBDに対する効果については議論の余地があると指摘する研究もある。さらに、このホルモンが腸管免疫に作用する正確なメカニズムもまだ不明である。今回、我々は、実験的大腸炎にMLTを投与すると、腸の炎症が改善されるどころか、悪化することを明らかにした。
大腸炎の実験モデル[30,31,32,33]において、短期間または低用量のMLTの利用は、炎症を抑制するのに有益であると述べられている。しかし、TNBS誘発大腸炎の慢性的な治療や、UCやCDを呈する患者のいくつかのケースでは、MLTの利用により腸の炎症が悪化した [19,34,35] 。実際、文献に記載されているいくつかの有益な効果にもかかわらず[36]、我々はMLT処理マウスにおいて、宿主の腸内細菌叢に依存する腸の炎症の増強を観察した。
2つ目の実験デザインでは、症状発現時に開始した4日間のMLT投与後、炎症の急性期においてマウスを評価しました。ホルモン投与群では、臨床症状、全身および腸の炎症が強調され、大腸炎への有害な影響が示唆されました。また、TNBSに曝露したWistarラットでは、MLTの予防投与と急性炎症時の短期投与により、大腸炎が改善された[35]。一方、慢性投与は逆の結果をもたらし、DSS離脱後の体重回復が明らかに困難になるなど、第3の実験デザインにおけるより顕著な疾患悪化の知見と一致するものであった。
MLTを投与したマウスでは、大腸炎の急性期と修復期の両方で臨床的回復が損なわれたことから、細菌量の制御において腸管免疫の基本であるIL-17サイトカインが減少したにもかかわらず、大腸の循環白血球とTNF産生が増加したことに関連すると考えられます［9］。我々のデータを裏付けるように、MLTは壊死性腸炎の実験モデルにおいてTh17細胞の分化を抑制することができました[37]。また、自己免疫性ぶどう膜炎において、MLTは活性酸素種-TXNIP-HIF1α軸を通してTh17分化を抑制しています[38]。一方、炎症性プロファイルを持つサイトカインは、粘膜エフェクター反応を強めるが、その結果、過剰な炎症による腸管前膜の悪化が起こることがある[39]。
DSSに曝露しMLTを投与したマウスの腸内では、ミエロペルオキシダーゼとマクロファージの活性の増強に加えて、血中単球と好中球の数が増加しており、炎症の誘発とその長期持続が示唆される。TNFの上昇と合わせて、これらの知見は、腸内環境の悪化と細菌の増殖に対する宿主の重要な反応であると考えられる。実際、マクロファージは、傷ついた腸関門を通過する微生物群の移動に対する抵抗や細胞内感染の制御など、腸における基本的な機能を担っている。さらに、循環血中の単球は、炎症を起こした大腸に移動する前にIL-1β産生を増加させることができ、これらの細胞はIL-1βとTNFの両方の重要な供給源となる [40] 。さらに、細菌の排除を担う好中球は、IBD患者の血液や粘膜、あるいは実験的大腸炎で著しく増加するが、その過剰な反応や制御不能な反応は、組織の損傷につながる可能性がある [41,42,43].
エフェクター、メモリー、制御性Tリンパ球集団のバランスは、炎症と抗原除去に関連する主要な細胞応答を駆動する [44,45] 。ここで、我々は、疾患寛解期に、MLTを投与したマウスは、脾臓におけるエフェクターメモリーCD4およびCD8 Tリンパ球（TEM）の頻度が高いことを示したが、この所見は、同じリンパ系器官におけるFoxp3+細胞による制御性応答の低下に関連していると考えられる。また、実験的な大腸炎においても、循環する大腸原性CD4 TEM細胞が観察されており、腸以外の部位にも慢性炎症を維持する病原性リンパ球が存在する可能性があることが示されている[46]。しかし、CD3+Foxp3+ MLN細胞は減少したものの、これらの排出リンパ節におけるIL-10産生リンパ球の減少に伴い、脾臓のTNF産生が顕著であることから、実験的大腸炎におけるMLTの炎症誘発性が改めて明らかになりました。それに伴い、TNFは腸の炎症だけでなく、他の免疫介在性疾患においても基本的な役割を果たす[47,48]。
遺伝的および環境的要因によって影響され得る制御不能な免疫反応に加えて、微生物叢はIBDの病因における重要な要素である[49]。これらの疾患は通常、微生物の多様性の低下と腸内細菌の異常が見られます [50]。クローン病患者では、健常人と比較して、Firmicutes門とBacteroidetes門のFaecalibacterium prausnitziiが頻繁に減少し、ProteobacteriaとActinobacteriaが一般的に増加する [51,52]. これらの細菌は腸管上皮を通過して複製し、炎症を引き起こす[53]。
今回、大腸炎回復マウスにMLTを投与したところ、投与したマウスと比較して、バクテロイデーテス属が減少する一方で、アクチノバクテリアが増加したことから、ホルモンによる腸の恒常性障害が確認された。また、不思議なことに、MLT投与によりVerrucomicrobia門の発現が一貫して増加したことから、ムチン分解菌であるAkkermansia muciniphilaがホルモン補充によるマウスの大腸炎炎症の悪化に関与している可能性が示されました[54]。実際、MLT治療前の広範囲な抗生物質治療による微生物叢の枯渇は、大腸炎の悪化に関連する主な炎症および臨床パラメータを逆転させた。これらの所見は、Actinobacteria、FirmicutesおよびVerrucomicrobia phylaの減少を伴っていた。
腸内細菌によるムチンの分解は、微生物や抗原が腸粘膜に到達しやすくなるため、IBDの発症を促進し、そこで局所的な炎症反応が急速に引き起こされると考えられる。Verrucomicrobia門の代表的な細菌であるA. muciniphilaは、局所粘液の恒常性を阻害することにより、S. typhimuriumによって引き起こされる腸の炎症反応を悪化させます[55]。興味深いことに、最近の研究では、Akkermansia muciniphilaの菌株によって腸の炎症が異なる変調を示すことが報告されている。すなわち、FSDLZ36M5分離株は大腸炎から保護したが、FSDLZ39M14、ATCC BAA-835 およびFSDLZ20M4株はこれらの有益な効果を誘導できなかったというものである。つまり、DSS大腸炎におけるA. muciniphilaの保護効果は、菌株特異的である[56]。実際、A. muciniphilaは腸管免疫において2つの役割を担っている。これらの細菌は炎症反応を抑制することが広く知られているにもかかわらず、大腸がんを発症したマウス、特定の病原体を保有するgnotobiotic動物、あるいはIL-10をコードする遺伝子を持たないマウスなど特定の遺伝子欠失では、逆の効果が生じることがある[57]。さらに詳しく述べると、これらの細菌は無菌のIL10-/-マウスで自然大腸炎を誘発することができるが、NLRP6はそのコロニー形成を制限して大腸炎から保護する[57]。さらに、大腸癌に伴う大腸炎で抗生物質を投与した後にA. muciniphilaをマウスに補充すると、腸管バリアの損傷、細菌（LPS）のトランスロケーションの増加、局所および全身の炎症反応の増強が見られた[58]。そして、このような条件下では、A. muciniphilaは腸の炎症を悪化させる可能性があり[59]、このことは我々の証拠を裏付けるものであった。
以上のように、我々の知見は、いくつかの先行研究とは異なり、腸管免疫に対するMLTの活性化効果を指摘するものであり、その効果は局所微生物叢に依存するものであった。異なる施設で飼育されたマウスは、その微生物相が異なる可能性があることが知られており、今回示された相反する結果を考慮すると、この可能性を否定することはできません。本研究のもう一つの革新性は、大腸炎徴候の最初の確立後、すなわち粘膜免疫の破壊後、しかし最も重篤な疾患の前にのみホルモン補充を行うことである。さらに、このホルモンの抗酸化作用が知られているにもかかわらず、MLTを投与したマウスでは、免疫学的パラメータが腸の炎症の悪化を裏付けているという点で、我々のデータは一致している[60]。興味深いことに、ホルモンを投与したマウスは、大腸炎の悪化や回復の遅れの顕著な兆候を示しただけでなく、炎症反応の悪化のマーカーも増加しました。このことから、MLTは腸内細菌叢や免疫反応を形成し、局所的な腸内細菌の異常を抑制する直接的または間接的な役割を担っている可能性が示唆されました。とはいえ、局所的な炎症の増幅は、持続的な組織障害や腸管障害を引き起こす望ましくない可能性を持っているかもしれない。
結論として、MLTは特定の炎症状態において保護的な役割を果たす可能性があるにもかかわらず、宿主や宿主の保有する腸内細菌叢によっては、ホルモン補充が炎症反応を悪化させる可能性があるため、IBD治療に広く用いることに関しては、やはり慎重であるべきだと思われます。
補足資料
以下のサポート情報は、以下からダウンロードできます：https://www.mdpi.com/article/10.3390/microorganisms11020460/s1、図S1：実験的大腸炎に対するメラトニン（MLT）効果の予備的特徴づけ。飲料水中の3％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）に10日間曝露することにより、腸内炎症を誘発した。マウスにMLT（10mg/Kg）を3日目から15日目まで毎日、経口投与し、36日目まで追跡した（A、第一実験プロトコル）。B）では、MLT投与初日に関連する体重の変動。(C）実験期間中の疾患臨床スコア。* 図S2：制御性T細胞および細胞内サイトカインの解析に使用したゲーティング戦略（フローサイトメトリー取得のために染色したもの）。リンパ球は、サイズ（FSC）および粒度（SSC）パラメータに従って画定され、次いでCD3およびCD25ゲーティングによって制御プロファイルを評価した。Foxp3の細胞内発現は、CD3+CD25-およびCD3+CD25+細胞において、ヒストグラム解析により評価した。CD3+およびCD4+Tリンパ球は、SSC xサイトカインパラメータに従って、細胞内サイトカインIL-10およびIL-4の定量化のためにゲーティングされた；図S3：フローサイトメトリー取得のために染色した、メモリーT細胞の解析に使用したゲーティング戦略。リンパ球は、サイズ（FSC）および粒度（SSC）パラメータに従って画定され、その後、CD3ゲーティングが行われた。細胞のサブポピュレーションについては、CD4 x CD8のドットプロットが用いられた。CD44の発現をCD62L+およびCD62L-集団で評価し、セントラルメモリーT細胞（TCM、CD4+CD62L+CD44+またはCD8+CD62L+CD44+）およびエフェクターメモリーT細胞（TEM、CD4+CD62L-CD44+またはCD8+CD62L-CD44+）を定義しました。
著者寄稿
概念化、J.L.d.S., L.V.B., C.F.P., J.E.-O., V.B., J.C.d.P.J., D.C. and C.R.d.B.C.; Data curation, J.L.d.S., L.V.B., V.N.、 D.C.およびC.R.d.B.C.；形式分析、J.L.d.S., L.V.B., J.C.d.P.J., D.C. and C.R.d.B.C.； Investigation, J.L.d.S., L.V.B., C.F.P., V.N., I.S.B., C.A.S., J.E.O.．V.B.およびC.R.d.B.C.、方法論、J.L.d.S.、L.V.B.、C.F.P.、V.N、 I.S.B., C.A.S., J.E.-O. およびV.B.、資源、C.R.d.B.C.、バリデーション、 V.N..、 I.S.B.およびC.A.S.、執筆-原案、J.L.d.S.、執筆-レビューおよび編集、J.C.d.P.J、 D.C. および C.R.d.B.C. すべての著者がこの原稿に読み、掲載版に合意しています。
資金提供
本研究は、サンパウロ研究財団（Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP）の助成金#17/08651-1の支援を受けています。また、本研究は、C.R.B.C.に対して、国立科学技術開発評議会（CNPq）#309583/2019-5-CNPq、および高等教育人材向上のための調整（CAPES-財務コード001）からの財政的支援を受けている。
データの利用可能性に関する声明
この研究で発表されたデータは、対応する著者からのリクエストにより入手可能です。
謝辞
リベイラオプレト大学薬学部バイオサイエンス・バイオテクノロジー研究科免疫内分泌・制御研究室（LIR）、およびサンパウロ大学リベイラオプレト医学部基礎・応用免疫学研究科（FCFRP-USP）の全チームに感謝したい。また、FCFRP/USPのフローサイトメーター施設（LIAREC）でフローサイトメトリーを取得した実験技術者、Fabiana R. de Moraisに感謝する。
利益相反
著者らは利益相反のないことを宣言している。
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