Akkermansia muciniphilaとBifidobacterium bifidumはFXR発現と腸内細菌叢を制御することでNAFLDを予防する

本論文
OPEN ACCESS
Akkermansia muciniphilaとBifidobacterium bifidumはFXR発現と腸内細菌叢を制御することでNAFLDを予防する

https://www.xiahepublishing.com/2310-8819/JCTH-2022-00415

Akkermansia muciniphila and Bifidobacterium bifidum Prevent NAFLD by Regulating FXR Expression and Gut Microbiota

フリン・ニャン
呉龍雲（ウー・ロンユン）さん
Qiaoyun Xia、
ペイイン・ティアン（Peiying Tian）、
丁春美（ディン・チュンメイ）と
Xiaolan Lu* （シャオラン・ルー
著者情報
Journal of Clinical and Translational Hepatology 2023年版
doi: 10.14218/JCTH.2022.00415

アブストラクト
背景と狙い
非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）は腸内細菌叢と密接な関係があり、世界的に最も多い慢性肝疾患となっているが、特定の菌株とNAFLDの関係については十分に解明されていない。我々は、Akkermansia muciniphilaとBifidobacterium bifidumがNAFLDを予防できるかどうか、それらの単独または組み合わせによる作用効果、考えられるメカニズム、腸内細菌叢の変調を調べることを目的としました。
方法
マウスを高脂肪食（HFD）で20週間飼育し、その際、実験群は4種の抗生物質で前処理した後、対応する細菌液またはPBSを投与した。糖脂質代謝指標、肝臓、腸管ファルネソールX受容体（FXR）、腸管粘膜タイトジャンクション蛋白質の発現を検出した。また、マウスの炎症・免疫状態や腸内細菌叢の変化も解析した。
結果
両株は、体重増加（p<0.001）、インスリン抵抗性（p<0.001）、肝脂質沈着（p<0.001）を抑制することができました。また、炎症性因子のレベル（p<0.05）とTh17の割合（p<0.001）を低下させ、Tregの割合（p<0.01）を上昇させました。両菌株は、肝FXRを活性化する一方、腸FXRを抑制し（p<0.05）、タイトジャンクションプロテイン発現を上昇させました（p<0.05）。また、腸内細菌叢の変化を感知し、両菌株は有益な細菌叢を相乗的に機能させることができることがわかりました。
結論
A. muciniphilaまたはB. bifidumの単独または併用投与は、HFD誘発NAFLD形成に対して保護的であり、さらなる探索を経てNAFLDの代替治療戦略として使用できる可能性があります。
グラフィカルな要旨
キーワード
非アルコール性脂肪性肝疾患、ファルネソイドX受容体、プロバイオティクス、Akkermansia muciniphila、Bifidobacterium bifidum
はじめに
非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）は、インスリン抵抗性（IR）や遺伝的感受性と密接に関連する代謝ストレス性肝障害であり1、病理組織学的特徴は、単純な脂肪症から非アルコール性脂肪肝炎（NASH）、進行した線維化、肝硬変にまで及ぶ2）。疫学的データによると、NAFLDは世界で最も一般的な肝臓疾患となっており、米国では肝移植患者および移植待機者の肝細胞がんの原因として急増しており、社会に大きな負担を課しています3、4。腸内細菌叢はNAFLD発症の病因であるとともに、NAFLDの病的過程の調節に関与している。腸内細菌叢は、核内受容体のファルネソイドX受容体（FXR）と結合することでNAFLDやNASHの発症を制御する胆汁の重要な成分である胆汁酸と相互作用し、様々な代謝過程に影響を与えるが5、糖脂質代謝異常における異なる組織のFXR発現量の役割は結論が出ておらず、特定の菌株との関係もまだ検討されていない。NAFLD患者および高脂肪食（HFD）により誘導されたNAFLDラットでは、FXRシグナル伝達経路が阻害されていた6。しかし、ヒョコール酸は腸管FXR発現を阻害することにより、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）分泌を促進し、グルコースホメオスタシスを改善した7。腸管粘膜バリアは病原体に対する第一の防御線であり、その中でも機械的バリアが最も重要で、無傷の腸管粘膜上皮細胞と上皮細胞間のタイトジャンクションが構造基盤となっています8。腸管バリアが破壊されると、腸内細菌叢の代謝産物であるリポポリサッカライド（LPS）が腸管吸収後に肝臓に入り、肝酸化ストレスを誘導して代謝関連物質を生成し、NAFLDを形成しやすくする。
さらに、免疫系のアンバランスがNAFLDの発症を促進する。腸由来の病原性微生物産物はTh17の分化を促進し9、Th17の過剰な活性化も腸内細菌叢の異常と炎症レベルのアンバランスを助長し、高血糖とIRにつながる10。前向き研究では、Th17/Treg比はNASHの進行と正の相関があり、NASH患者の末梢血Th17/Treg比増加は肥満手術後1年で正常化できる11、NAFLD進行の評価指標として有効である可能性がある。Tregは、CD4+T細胞やCD8+T細胞の増殖や機能を直接抑制し、過剰な炎症反応を抑制することができる。Tregを欠失したマウスでは重度の脂肪肝炎が観察され、Tregを順次移植することで肝臓の炎症と傷害が緩和されたことから12、NAFLDの進行防止にTregが直接的に関与していることが示唆された。このように、Th17とTregは免疫系の制御に深く関与しており、免疫状態やNAFLDの進行を反映することができる。
Akkermansia muciniphilaは嫌気性ムチン分解菌で、代謝、炎症、免疫に機能する13。HFD食のNAFLDマウスモデルでは、A. muciniphilaの存在量の減少を伴うことが分かっている14。また、A. muciniphilaは肝臓での胆汁酸合成・排泄遺伝子の発現をも促進する15。また、外膜タンパク質であるAmuc_100は、タイトジャンクションタンパク質を介して腸管透過性を調節することが示されている17。これらはすべて、NAFLDとの関連性を示すものである。Bifidobacterium bifidumは典型的な嫌気性プロバイオティクスであり、加齢とともに減少する傾向がある。B. bifidumは、脂質代謝と腸管透過性を調節し、最終的に肝臓の炎症と脂肪蓄積を抑制することができる18。また、Toll様受容体2（TLR2）経路を標的とし、腸管上皮タイトジャンクションバリアを強化し、腸の炎症から保護できる19。さらに、B. bifidumは腸内細菌叢の乱れを改善し、マウス糞便中のA. muciniphilaおよびVerrucomicrobiotaの存在量の増加に寄与している20。同様に、我々の以前の研究でも、NAFLDマウス糞便中のA. muciniphilaの存在量が減少していた。しかし、NAFLDは複雑であるため、これら2つの菌株がNAFLDを緩和することができるかどうかという疑問は十分に検討されていない。そこで、NAFLDマウスモデルを構築し、A. muciniphilaとB. bifidumの単独または併用投与により、両菌株がNAFLDの発症を抑制できるかどうか、その効果の強さ、両菌株と異なる組織におけるFXR発現、NAFLDとの関連、介入後の腸管粘膜透過性や炎症免疫状態の変化、腸内細菌叢の変化について調べ、NAFLDの病因のより良い理解と将来の治療アプローチの可能性に実験的証拠を与えることを目指してきました。
研究方法
細菌株の調製
A. muciniphilaとB. bifidumは、それぞれ中国工業文化センターとBeNa Culture Collectionから入手した。蘇生後、A. muciniphilaとB. bifidumをそれぞれチョコレート色の血液培地とBBL液体培地で培養した。両菌株を嫌気培養台にて37℃で培養後、4℃で18,000×gで5分間遠心分離し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄して、次のステップで使用する濃度109CFU/mlの細菌溶液を調製しました。
動物実験
SPF雄性C57BL/6マウス60匹を上海スラック実験動物有限公司から購入した。動物はSPF動物室で温度と湿度を一定に保ち、餌と水を自由に与えることができた。7日間の適応給餌後、動物を10匹ずつの6群に分けた。グループは、NDグループ（普通食）、HFDグループ（高脂肪食）、Akkグループ（抗生物質＋HFD＋A. muciniphila）、Bifiグループ（抗生物質＋HFD＋B. bifidum）、コンビグループ（抗生物質＋HFD＋A. muciniphila＋B. bifidum）およびPBSグループ（抗生物質＋HFD＋PBS）だった。HFDは40％の高脂肪実験飼料である。Akk群、Bifi群、Combine群、PBS群には、菌液投与前にまず4種の抗生物質を投与し、擬似無菌モデルを構築した。具体的な方法は以下の通りであった： Ampicillin Na（Aladdin, A105483, China）1g/L, Vancomycin HCL（Aladdin, V105495, China）500mg/L, Neomycin sulfate（Aladdin, N109017, China）1g/L, Metronidazole（Aladdin, M109874, China）1g/L（AVNM）を毎日の飲料水に混合し2日ごとに交換しながら4週した 21,22．適用4週間後、Akk群、Bifi群、Combine群、PBS群に、対応する菌液またはPBSを、濃度109 CFU/ml、投与量1回あたり0.2ml、週3回、8週間にわたって胃内投与を開始した23、24 Combine群は、A. muciniphila菌液およびB. bifidum菌液を各0.1mlとした。PBS群ではNAFLDモデルの確立に成功するまで、すべてのマウスを20週間継続飼育した。動物手順の概略図は、図1Aで見ることができる。マウスは12時間の絶食とイソフルラン麻酔を行った後、臓器と血液を採取した。各群の5匹のマウスの血液を血清学的分析に使用し、他の5匹のマウスの追加の血液をフローサイトメトリーに使用した。すべての実験プロトコルは、SHRMのInstitutional Animal Care and Use Committee（承認番号20210308(22)）によって承認された。
図1 A. muciniphilaまたはB. bifidumの投与が糖脂質代謝指標に及ぼす影響。
(A)動物実験の手順模式図。(B)4種混合抗生物質投与後の体重。(C）HFD20週間飼育後の犠牲前のマウスの最終体重である。(D）肝臓重量。(E）空腹時血糖値。(F)算出された肝臓指数。肝臓inde=肝臓重量/体重。(G)空腹時インスリン値。(H）HOMA-IRを算出した。HOMA-IR=空腹時血糖値×空腹時インスリン値/22.5. (I) 血清ALT値。(J)血清AST値。(K)血清TG値。(L)血清TC値。データは、平均値±SEMで表した。B）（C）（D）（E）（F）は1グループあたりN=10。(G) (H) (I) (J) (K) (L)では、1グループあたりN=5である。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. NDグループ. #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs. PBS group. ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ；AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；TC、総コレステロール；TG、トリグリセリド。
血清学的解析
血清肝酵素と脂質指標は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）（C009-2-1）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）（C010-2-1）、トリグリセリド（TG）（A110-1-1）、TC（A111-1-1）キット（すべて南京建成生物工学研究所）で検出しました。空腹時インスリン（FINS）値は、インスリンエリザキット（Solarbio, SEKM-0141, China）により検出し、インスリン抵抗性指数（HOMA-IR）を算出した。炎症因子レベルの検出には、Tumor necrosis factor-α (TNF-α) Elisa kit (KE10002), Interleukin-6 (IL-6) Elisa kit (KE10007), IL-17A Elisa kit (KE10020), IL-10 Elisa Kit (KE00170) を用い、Proteintech Group, Incから購入した。
組織学的検査
切除後、肝臓と回腸の組織を10％ホルマリンで48時間固定した。処理後、ヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡で撮影した。凍結した肝臓組織切片を作成し、改良型オイルレッドO（Solarbio、G1261、中国）およびヘマトキシリン染色液で染色し、最後に封をした。肝組織を正確に秤量し、無水エタノールを1：9の割合で加え、氷水浴条件下で機械的にホモジナイズし、遠心分離後に検出用の上清を回収した。
RNA抽出およびリアルタイム定量PCR(qRT-PCR)
肝臓組織からTrizol（Invitrogen, 1596-026, USA）を用いてTotal RNAを抽出し、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific, K1622, USA）を用いてcDNAの第1鎖を合成し、SYBR Green PCR kit（Thermo Scientific, K0223, USA）を用いて増幅し、関連するテンプレートとプライマーの追加、PCR増幅システムの構成、およびリアルタイム検出機（RBI, 7300, USA）で増幅を実行した。関連するプライマー配列は、補足表1に示す。
ウェスタンブロット解析
タンパク質の定量結果に応じて適量のサンプルと電気泳動バッファーを加えて電気泳動を行った後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。この膜を5％脱脂乳で1時間室温でブロッキングし、一次抗体の異なる希釈液で一晩インキュベートした。膜を洗浄した後、希釈した二次抗体とインキュベートした。最後に、発光液（Millipore, WBKLS0100）を調製し、イメージングシステムに入れ、免疫複合体を検出した。イムノブロット解析のデンシトメトリーは、Image Jソフトウェアを用いて実施した。関連する抗体情報は、補足表2に示す。
フローサイトメトリー
Th17比率検出のため、コントロールチューブをセットしながら、無血清培地、PMA、BFAをチューブに添加した。その後、Anti-Mouse CD3ε, Anti-Mouse CD4, fix & perm medium A, flow cytometry staining buffer, Fix & perm medium B, Anti-Mouse IL-17Aを段階的に加え、再懸濁して検出した。Treg割合の検出には、Anti-Mouse CD4とAnti-Mouse CD25をチューブに加えた後、FCM溶解液を加え、遠心分離後に上清を廃棄した。その後、Anti-Mouse CD16/CD32、Anti-Mouse FoxP3、透過化バッファー、フローサイトメトリー染色バッファーを加え、ステップに従って再懸濁しました。各抗体はアイソタイプIgGコントロールを設定し、アイソタイプIgGコントロールの蛍光シグナルを陰性閾値とした。関連試薬はすべて中国のMulti Sciences Biotech Co., LTDから購入した。
細菌DNAの抽出と16S rDNAの塩基配列決定
DNA Extraction Kitを使用して全ゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAをテンプレートとして、バーコード付きプライマーとTks Gflex DNA Polymerase (Takara, Japan)を用いてPCR増幅を行った。細菌の多様性解析のために、16S rRNA遺伝子のV3-V4可変領域をユニバーサルプライマーを用いて増幅した。アンプリコンの品質はゲル電気泳動で可視化し、AMPure XP ビーズ（Agencourt, U.S.A）で精製した後、もう一回PCRを行い増幅させた。AMPure XPビーズで精製した後、Qubit dsDNAアッセイキットを用いて最終アンプリコンを定量化した。等量の精製アンプリコンをプールして、その後のシーケンスに使用した。ライブラリーの配列決定とデータ処理は、OE Biotech Co.Ltd.が行った。
統計解析
データはGraphPad Prism 9.0 Software (GraphPad Software Inc., USA)を用いて分析・プロットし、結果は平均値±SEMとして表した。正規分布および分散の均質性に適合するデータは、Student's t-testを用いて分析した。分散の均質性に矛盾がある場合は、Welchのt-testを使用した。複数のグループ間の比較は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて分析した。複数グループ間の微生物の多変量統計解析を行い、正規分布や統計的集計を満たさないデータについては、Kruskal Wallisアルゴリズムを用いて差種解析を行った。腸内細菌叢と関連指標の共同解析には、スピアマンの相関分析を採用した。差はp<0.05で統計的に有意とみなした。
結果
A. muciniphilaまたはB. bifidumは糖脂質代謝および肝機能を改善した。
AVNM抗生物質投与終了時、どの群でも統計的に有意な体重は認められなかった（図1B）。合計20週間のHFD連続飼育後、マウスの体重、肝臓重量、空腹時血糖値、肝臓指数は、すでにHFD群がND群より有意に高くなり、PBS群でも同様の成績が確認された。PBS群と比較して、Akk群、Bifi群、Combine群では、これらの指標に統計的に有意な改善が見られました（図1C-F）。次に、血清中のFINS濃度を測定し、HOMA-IR指数を算出しました。その結果、重度のIR状態に陥ったHFD群およびPBS群では、FINS濃度が有意に高いことがわかりました。一方、A. muciniphilaまたはB. bifidumの投与は、PBS群と比較してIR状態を改善しました（図1G、H）。さらに、ALTおよびAST値を解析すると、HFD群およびPBS群のマウスは、より明らかな肝細胞の損傷と肝機能の低下を示し（図1I、J）、血清TGおよびTC値も両群で脂質レベルの上昇を示したが、A. muciniphilaまたはB. bifidumはこれらの指標の抑制に寄与した（図2K、L）。ただし、B. bifidumの投与はASTを低下させるものの、統計的な有意差は認められなかった。これはサンプル数が少ないことが関係していると考えられ、サンプル数を増やすことでより有意差を示すことができるかもしれない。
図2 A. muciniphilaまたはB. bifidumの投与によるマウスの肝脂肪症および腸管バリア機能への影響。
(A) マウス肝臓のHE染色の代表的な顕微鏡写真、200倍。(B）マウス肝臓のオイルレッドO染色の代表的な顕微鏡写真、200x。(C) 肝臓組織のTGおよび(D) TCレベル。(E)マウス回腸組織のHE染色の代表的な顕微鏡写真、200x。データは、平均値±SEMで表した。C）（D）では1群あたりN=5。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. ND群。#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs. PBS group. TC, 総コレステロール;TG, トリグリセリド.
A. muciniphilaまたはB. bifidumはHFD誘発肝脂肪症を緩和し、腸管粘膜バリア障害を改善した
HE染色の結果、ND群マウスの肝小葉は正常な構造を持ち、肝細胞が整然と並んでおり、肝脂肪症は認められませんでした。HFD群およびPBS群では、肝構造は乱れ、核はしぼんで変性し、肝細胞は明らかに腫れ、大きさの異なる円形の脂質滴が拡散し、一部の細胞では風船状の変化が見られ、NAFLDのHE染色結果と一致し、NAFLDのモデル化に成功したことを証明しました。Akk群、Bifi群、Combine群のマウスの肝細胞は、腫れが少なく、整然と並んでいた。また、脂質滴の数は著しく減少し、脂肪症の程度も低下していた（図2A）。オイルレッドO染色の結果、ND群では明らかな赤色染色された脂質滴は見られなかったが、HFD群およびPBS群の両肝細胞では、異なる大きさと拡散した分布で赤い脂質滴が見られ、肝細胞に脂質沈着が存在することが示された。Akk群、Bifi群、Combine群では、赤色に染色された脂質滴の数が減少し、脂質滴の体積が小さくなり、ND群の染色結果に近い結果となった（図2B）。また、肝組織のTGおよびTCレベルの結果は、A. muciniphilaまたはB. bifidumが肝脂肪症および脂質沈着をうまく緩和するという病理学的所見と一致した（図2C、D）。また、回腸組織のHE染色では、ND群のマウスの腸絨毛は整列し、構造的に無傷であり、前膜の充血を伴う炎症は観察されなかった。一方、HFD群およびPBS群のマウスでは、腸絨毛の配列が乱れ、明らかな粘膜破壊が見られ、薄層プロペアの毛細血管の拡張と充血が見られた。A. muciniphilaまたはB. bifidumの投与後、乱れた腸絨毛の配列は改善され、欠陥はほとんどなく、薄層プロプリアの構造も正常化した（図2E）。以上の結果から、A. muciniphilaまたはB. bifidumは、HFD誘発肝脂肪症を緩和し、脂質沈着を減少させ、腸粘膜バリア障害を改善できることが示された。
A. muciniphilaまたはB. bifidumは、炎症性サイトカインの分泌を減少させ、T細胞のTregへの変換を誘導した。
ND群と比較して、HFD群およびPBS群のマウスでは、血清TNF-α、IL-6、IL-17Aレベルが異なる程度に上昇し、IL-10レベルは低下していた。このことは、先行研究におけるNAFLDモデルの特徴とも一致する。PBS群と比較して、Akk群、Bifi群、Combine群では、血清炎症性因子レベルの低下とIL-10レベルの上昇が見られた（図3A-D）。一方、HFD群ではTh17の割合が有意に増加し、Tregが有意に減少し、PBS群も同様だが弱い結果となった。一方、A. muciniphilaまたはB. bifidumの投与後、Th17の割合の減少とTregの増加が変化して観察され（図3E-H）、両株はマウスの免疫状態を改善し、T細胞のTregへの変換を誘導し、Akkグループは免疫状態の調節効果が最も顕著であることが示唆されました。
図3 A. muciniphilaまたはB. bifidumの投与が、マウスの炎症および免疫状態に及ぼす影響。
(A）血清TNF-α値。(B)血清IL-6値。(C)血清IL-17Aレベル。(D)血清IL-10レベル。代表的な（E）Th17および（F）Tregのフローサイトメトリー結果。(G)Th17の割合。(H)Tregの割合。データは平均値±SEMで表した。N=5/グループ。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. NDグループ。#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs. PBS群。TNF-α、腫瘍壊死因子-α；IL-6、インターロイキン-6；IL-17A、インターロイキン-17A；IL-10、インターロイキン-10；Th17、Tヘルプセル17；Treg、制御性Tセル。
A. muciniphilaまたはB. bifidumは、肝FXRを活性化し、腸FXRを抑制し、タイトジャンクション蛋白の発現を増加させた
FXRは胆汁酸を天然リガンドとする転写因子で、肝臓や腸に多く発現し、胆汁酸代謝や糖脂質代謝に重要な役割を担っています。多くの研究により、胆汁酸とFXRの不均衡がNAFLD患者の代謝的特徴の一つであることが示されている25,26。qRT-PCRおよびWB技術により、肝FXR発現はND群に比べHFD群で抑制されており、その直接標的small heterodimer partner（SHP）および下流のcytochrome P450 family7 subfamily a member-1 (CYP7A1) の発現も抑えられている。PBS群と比較して、A. muciniphilaまたはB. bifidumの投与後に肝FXR発現が増加し、Combine群で最も強くFXR発現を活性化する効果が見られた（図4A-C、E）。しかし、腸管FXRの発現量はHFD群で有意に高く、PBS群でも同様の傾向が見られ、下流産物の線維芽細胞増殖因子15（FGF15）も活性化されて発現量が増加した。Akk群、Bifi群、Combine群では、腸管FXRの発現が抑制され、統計的に有意であることがわかった。FGF15の発現も低下したが、統計的有意性は見られなかった（図4D、F、G）。並行して、ZO-1とOccludinは腸管上皮細胞間の重要なタンパク質であり、腸管粘膜バリアの維持に重要な役割を担っている。ZO-1およびOccludinのmRNAおよびタンパク質発現は、HFDグループおよびPBSグループで有意に減少し、より深刻な腸管粘膜バリアの損傷および破壊を示唆した（図4D, H, I）．一方、A. muciniphilaまたはB. bifidumを介入させると、これらの発現は有意に増加した。以上の結果から、A. muciniphilaおよびB. bifidumは、腸管粘膜透過性を改善しながら、肝FXRを活性化し、腸内FXRの発現を抑制することで効果を発揮しているとの見解を得た。
図4 A. muciniphilaまたはB. bifidumの投与が肝・腸のFXRおよび腸のタイトジャンクション蛋白発現に及ぼす影響
肝の（A）FXRおよび（B）CYP7A1のmRNAおよびタンパク質発現量である。(C）肝ウェスタンブロット画像。(D)回腸ウエスタンブロット画像。(E）肝SHPのタンパク質発現レベル。回腸の（F）FXR、（G）FGF15、（H）ZO-1、（I）OccludinのmRNAおよびタンパク質発現量である。データは平均値±SEMで表した。mRNAを測定した場合、1群につきN=8。タンパク質発現を測定した場合は、N=3。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. ND群。#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs. PBSグループ。FXR、ファルネソールX受容体、CYP7A1、チトクロームP450ファミリー7サブファミリーAメンバー-1、FGF15、線維芽細胞増殖因子15、GAPDH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、SHP、小型ヘテロダイマーパートナー、ZO-1、タイトジャンクションプロテイン-1．
A. muciniphilaまたはB. bifidumの投与による腸内細菌叢の変化
α多様性は、腸内細菌叢の多様性の違いを評価する指標である。本研究では、Chao1、観察種指数、Shannon指数、Simpson指数を用いて評価した。分離比較の結果、腸内細菌叢のα多様性はND群とHFD群で有意差はなく（図5A）、Chao1指数ではAkk群とPBS群で、観察種指数ではBifi群とCombine群で統計的に有意な差異が認められた（図5B）。以上の結果から、群集の豊かさではAkk群とPBS群に、種数ではBifi群とCombine群に差が見られたが、全体として腸内細菌叢のα多様性については、実験群間にそれ以上の有意差は見られなかったと考えられる。α多様性とは異なり、β多様性は、グループ間の微生物群集組成に違いがあるかどうかを反映するために用いられた。まず、ND群とHFD群を重み付けなしのユニラック距離ヒートマップで比較すると、異なる群間でもサンプルの類似性はあるものの、全体的な観察では2つのクラスターとして示され、色が青いほどサンプル同士が近く、類似性が高いことを示し、赤いほどその反対であった。一方、主座標分析（PCoA）プロットは、データ変換後の2群間の違いをより直接的に示しています（図5C）。同様に、PBS群と3つの実験群を比較すると、PBS群の異なるサンプルはそれぞれ異なる実験群のサンプルと類似しているものの、4群間で異なるクラスタリングが残っていることが確認された。PCoAプロットでは、3つの実験グループ内ではサンプル距離が近く、より良いクラスタリングが観察され、PBSグループとの間には大きな距離があった（図6A）。さらに、アドニス解析により、サンプルのグループ分けが妥当であるかどうかを評価した。表1に示すように、各グループ比較のp値は0.05以下であり、グループ間差がグループ内差よりも大きく、全体として実験的なグループ分けは合理的で有効であることが示されました。
図5 腸内細菌叢のα多様性とβ多様性。
(A）ND群とHFD群とのα多様性の比較。(B）Akk群、Bifi群、Combine群、PBS群におけるαの多様性の比較。(C）ND群とHFD群との重み付けなしユニラック距離ヒートマップおよびPCoAプロットに基づくβ多様性の比較。各群N=6。PCoA、主座標分析。
図6 腸内細菌叢のβ多様性とLEfSeプロット。
(A）Akk群、Bifi群、Combine群、PBS群における重み付けなしユニラック距離ヒートマップとPCoAプロットに基づくβ多様性の比較。(B）グループ間のLEfSe解析プロット。各群N=6。LDA、線形判別分析、PCoA、主座標分析。
表1
腸内細菌叢のアドニス解析
Vs_groupSumsOfSqsMeanSqsF.ModelR2p-value(>F)ND-HFD0.28843 (1.26611)0.28843 (0.12661)2.27810.18554 (0.81446)0.006Akk-PBS0.3255 (1.2721)0.3255 (0.12721)2.55880. 20375 (0.79625)0.003Bifi-PBS0.30843 (1.10826)0.30843 (0.11083)2.7830.21771 (0.78229)0.005Com-PBS0.20243 (1.12925)0.20243 (0.11292)1.79260.15201 (0.84799) 0.002
MeanSqsは二乗平均、SumsofSqsは二乗和。
次に、種の相対的な存在量と異なるグループ間の差の分析について検討した。線形判別分析効果量（LEfSe）プロットを用いて、異なるグループ間で存在量に有意差がある種をさらに分析し、棒グラフの長さは有意差がある種の影響値を表す（図6B）。図から、Akkグループでより影響力のある種は、FaecalibaculumとLactobacillalesであった。Bifiグループでより影響力のある種はRhizorhapis、CombineグループでProteobacteria、PBSグループでDesulfovibrioであった。各グループの門、属、種レベルでの腸内細菌叢の相対存在量のヒストグラムを示す（補足図1）。上記の結果から、Akk群はBifi群に比べて顕著な効果があることがわかったので、Akk群、Bifi群、PBS群について、属レベルの細菌の違いをスクリーニングし、指標と合わせて相関分析を行った（図7A）。その結果、Adlercreutzia、Rikenellaceae、Sphingobacterium、Sulfitobacter、AllobaculumはNAFLDマウスのグルコースや脂質の上昇、肝機能の低下、炎症状態と正の相関があり、Parabacteroides、Lactobacillus、Mvcoplasma、Romboutsia、Clostridia UCG-014はこれらの指標と負の相関、保護因子IL-10と正の相関があることがわかった。Adlercreutziaの存在量は、Akk群、Bifi群、PBS群で順次高くなり、NAFLD形成に負の役割を果たすことが示唆され、これがBifi群に対するAkk群の優れた効果の理由のひとつと考えられる。一方、Romboutsia、Lactobacillus、Parabacteroidesの量は、Akk群、Bifi群、PBS群で順次減少し、NAFLD形成の保護作用に寄与しており、これもBifi群よりAkk群が優れている理由であると思われる。最後に、Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）予測機能プロットによると、A. muciniphilaは主に代謝性疾患、脂質代謝、糖質代謝、エネルギー代謝などの複数の代謝プロセスに濃縮されていることが判明した。一方、B. bifidumは、シグナル伝達、二次代謝産物の生合成、翻訳に富んでいた（図7B）。
図7 相関解析とKEGG予測機能プロット。
(A) 検出された指標と差分属のスピアマン相関分析。(B)KEGG予測機能プロット。ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ、AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、IL-6、インターロイキン6、IL-10、インターロイキン10、IL-17A、インターロイキン17A、TC、総コレステロール、TG、トリグリセリド、TNF-α、腫瘍壊死因子-α．
ディスカッション
腸内細菌叢は、脳腸軸や肝腸軸の役割など、様々な疾患に直接的・間接的に影響を及ぼしていると言われています。高アルコール生産が可能な腸内細菌HiAlc Kpnを同定し、糞便移植によりNAFLDマウスモデルの誘導に成功した研究23があり、腸内細菌叢とNAFLDの密接な関係がさらに明らかになりました。肝炎の発症、進行、退縮には、炎症反応と免疫反応が重要な役割を果たします。一部の学者は、LPSとTLR4の組み合わせがNAFLDの進行において最も早く、最も重要なリンクであると考えている27。LPSは、生体内で炎症性因子の放出を誘導し、脂肪組織にマクロファージをリクルートすることができる。脂肪細胞に存在するマクロファージは、白色脂肪組織では脂質滴の合成を促進し、褐色脂肪組織では熱発生を抑制して消費を抑える、肥満の元凶とみなされているが28。複合代謝関連疾患として、NAFLDの発症には複数の異なるタイプや機能の細胞集団が関与し、自然免疫と適応性免疫が相互にリンクするネットワークとフィードバックシステムはNAFLD/NASHの発症に重要な影響を与える。炎症性肝CXCR3 + Th17の連続的な移行は、NAFLDの増悪を加速させる可能性がある29。逆に、NAFLD患者では健康な人に比べてTregレベルが低く、その減少はNASH患者の末梢血単核細胞でより顕著になる11,30。また、NAFLD患者の腸内細菌叢をマウスに移植すると、肝内B細胞凝集体の活性化を通じてNASH肝炎と線維化を促進する31。したがって、腸内細菌叢を調節すると、腸のバリア機能を高め、肝性脂肪症を減らし、炎症反応と免疫障害を改善し、NAFLDに活発に機能する。
3つの実験グループはいずれも、グルコ脂質代謝障害と肝機能障害の改善において有望な結果を示しました。Akk群とCombine群はいずれもAST値を有意に低下させたが、Bifi群はPBS群と比較して統計的に有意な低下は見られなかった、明らかな低下傾向は見られたものの、サンプルサイズを大きくすればその差はより大きくなる可能性があり、B. bifidumによる重度の肝細胞壊死の改善効果は比較的弱いことも示唆された。病理学的な結果と合わせると、A. muciniphilaが肝脂肪症の改善と脂質沈着の抑制に最も効果的であることが観察されます。3つの実験群はいずれもマウスの炎症状態を積極的に緩和したが、Bifi群では血清IL-10濃度が、傾向は明らかだが統計的に有意な増加は見られなかった。驚くべきことに、プロバイオティクス溶液の適用後、末梢血Th17の減少とTregの増加が観察され、A. muciniphilaは最も顕著な傾向を示した。両菌株がHFD飼育マウスの免疫状態を調整する上でポジティブな効果を示したことは、本研究のハイライトの一つであり、NAFLDプロセスにおける腸内細菌叢とT細胞応答の関係を支持するものです。
次に、A. muciniphilaとB. bifidumがNAFLDを緩和するメカニズムの可能性について検討しました。これまでの研究から、FXRのアンバランスがNAFLD発症の重要なメカニズムの一つであることは明らかですが、菌株ごとの関係は解明されておらず、異なる組織での発現や役割も不明で、代謝性疾患における機能も特定されていません。変数を制御した合理的な設計を行った結果、PBS群と比較して、3つの実験群すべてが肝FXR経路産物発現を上昇させ、腸FXR経路産物発現を低下させたことに驚き、両株が異なる部位でFXRに対して異なる役割を果たすことを示唆しましたが、全体としては良好な結果となっています。今回の結果は、これまでの研究であまり取り上げられていなかった、部位ごとのFXR発現の違いを明らかにしたものです。その理由として、FXRの制御タンパク質が肝臓や腸で異なる発現を示し、異なる作用を発揮することで、介入した際に多様な変化をもたらす可能性があると推察しています。もちろん、実験設定や背景を変えることで生じる他の根本的な変化も否定できないので、より詳細な検討が必要である。腸管バリアの損傷もまた、NAFLD発症の初期中核事象であり、必須メカニズムである。生理的な条件下では、腸粘膜バリアは、副細胞経路からの栄養の吸収を制御し、また有害物質を遮断する32。しかし、炎症刺激、低酸素、腸内細菌叢の異常などの病的条件下では、腸粘膜透過性が高まり、細菌の移動が起こり、LPSが血流に吸収されて炎症カスケード反応を活性化させることがある。ZO-1とOccludinという2つのタイトジャンクションタンパク質を検出したところ、すべての実験群でその発現量を増加させることができ、両菌株が腸管透過性を改善することでNAFLDに確かにプラスに寄与することが検証された。最後に、腸内細菌叢の変化を調べたところ、αの多様性には有意な差は見られなかったが、βの多様性には有意な差が見られた。A. muciniphilaは腸内をコロニー化することで作用し、B. bifidumは他の種類のビフィズス菌やプロバイオティクスの存在量を増やすことで作用すると考えられる。Lactobacillusは過敏性腸症候群患者の排便回数と負の相関があり、コレステロールを下げ、腸内細菌叢と炎症経路を調節することでNAFLDの進行を改善することができた33,34Parabacteroidesは腸の炎症を抑え、IRを改善し、肥満と負の相関があった宿主アミノ酸代謝異常を回復することができた35,36。すべての実験群でLactobacillusとParabacteroidesの増加が観察され、両者はNAFLDの糖脂質代謝指標と有意な負の相関、IL-10レベルと正の相関を示したことから、A. muciniphilaとB. bifidumは両属の増殖とコロニー化を促進できることが示され、LactobacillusとParabacteroidesがNAFLD形成に中心的役割を果たし、BifiグループよりAkkグループの効果が優れていた理由の1つになるかもしれないと示唆しました。
この結果から、実験グループによって調節作用の傾向に違いがあることがわかりました。今回の研究では、Akk群とBifi群には0.2mlの菌液を毎回経口投与し、Combine群ではA. muciniphilaとB. bifidumの投与量をそれぞれ半減して、同じ濃度で投与しました。菌液の総量と菌数の総量を同じにして、2つの菌株の個別の効果と相互作用を調べようとしました。FXRタンパク質の発現を制御するという点では、AkkグループやBifiグループよりもCombineグループの方が効果的であった。総菌数と菌液量の一致から、A. muciniphilaとB. bifidumは、両者の投与量を半減しても効果が強いことから、FXRの発現を調節する相乗効果があると考えています。他の指標でFXRタンパク質の発現調節と同じ傾向を示さない理由については、一方では、他の経路の関与により、ほとんどの下流の検出指標に違いが生じたと考えられる。一方、これらの指標において、A. muciniphilaの正の制御はB. bifidumよりも優れていたが、A. muciniphilaの投与量を半減させたために生じた結果であると推測している。また、A. muciniphilaとB. bifidumは細菌の分類レベルが異なり、代謝過程や生成される代謝物が異なるため、代謝物の変化も効果の違いの重要な理由のひとつと考えられ、次のステップとして取り組みたいところである。したがって、今回の実験結果を出発点として、プロバイオティクスの複合的な適用について、より深く考えていく必要があるのです。併用する菌株の用量、濃度、期間などは、異なる菌株の特徴や所属する細菌分類のレベルに応じて最適化する必要があります。菌株間の相互作用は、完全に相乗的または拮抗的なものではなく、作用する局面が異なる結果を生む重要な要因の一つであると考えられる。腸内細菌叢の環境、疾患の特異性、研究の背景などを、腸内細菌叢の分野ではより重要視していく必要があると思われる。
おわりに
A. muciniphilaまたはB. bifidumは、HFD誘発NAFLD形成を予防し、高脂血症、抗炎症、免疫調節、IR改善効果を発揮することができた。両株は、肝FXRの活性化、腸内FXRの発現抑制、腸内細菌叢の調節、腸管粘膜透過性の改善によりNAFLDを予防した。また、プロバイオティクスの組み合わせは必ずしも良い結果を生み出さないことがわかりました。今後、A. muciniphilaまたはB. bifidumをNAFLDの代替治療戦略として使用することが可能である。
参考情報
補足表1
定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に使用した遺伝子のプライマー配列。
(DOCX)
追加データファイルはこちら
補足表2
関連する抗体情報です。
(DOCX)
追加データファイルはこちらをご覧ください。
補足図1
腸内細菌叢の変化。ND群およびHFD群の（A）門レベル（B）属レベル（C）種レベルの相対存在量のヒストグラム。
Akk群、Bifi群、Combine群、PBS群の（D）門レベル（E）属レベル（F）種レベルの相対的存在量のヒストグラム。N=6/グループ。
(TIF)
追加データファイルはこちらをご覧ください。
略号
ALT
アラニンアミノトランスフェラーゼ
AST
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
AVNM
アンピシリンNa、バンコマイシンHCL、ネオマイシン硫酸、メトロニダゾール
CYP7A1：
チトクロームP450ファミリー7サブファミリーaメンバー-1
FGF15：
繊維芽細胞増殖因子15
FINSです：
空腹時インスリン
FXRのこと：
ファルネソールXレセプター
GAPDHのこと：
グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ
GLP-1：
グルカゴン様ペプチド-1
HFDのこと：
高脂肪食
HOMA-IR．
インスリン抵抗性指数
IL-6です：
インターロイキン6
IR
インスリン抵抗性
KEGG
京都遺伝子・ゲノム百科事典
LEfSe：
線形判別分析効果量
LPSのこと：
リポポリサッカライド
NAFLDのこと：
非アルコール性脂肪性肝疾患
NASHのこと：
非アルコール性脂肪性肝炎
ND．
ノーマルディート
PBS：
リン酸塩緩衝生理食塩水
PCoAです：
主座標分析
SHP：
スモールヘテロダイマーパートナー
TC
総コレステロール
TGのことです：
トリグリセリド
Th17のこと：
Tヘルプセル17
TLR2：
トールライク・レセプター2
TNF-α：
腫瘍壊死因子-α
Treg（トレグ）：
制御性T細胞
宣言文
謝辞
グラフィカルアブストラクトはFigdrawで描きました。
エシカルステートメント
すべての実験プロトコルは、SHRMのInstitutional Animal Care and Use Committee（承認番号20210308(22)）によって承認されました。
データ共有に関する声明
本研究の結果を裏付けるために使用した配列データは、NCBI Sequence Read Archive (PRJNA867305)に寄託されています。その他のデータは、対応する著者から xiaolan_lu@163.com でリクエストに応じて入手可能です。
資金提供
本研究は、上海自然科学基金（20ZR1450100）、上海浦東新区特性分野（PWYts2021-11）、上海浦東病院重点分野（Zdxk2020-07）の支援を受けている。
利益相反
なお、著者らは本書に関連する利益相反はない。
著者の貢献
研究計画（FN、XL）、実験の実施（FN、LW）、データの解析と解釈（FN、LW、QX）、原稿執筆（FN）、重要な修正（XL）、統計解析（FN、PT、CD）、重要資金（XL）、管理（XL）、技術または材料の支援（PT、CD、XL）。
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2023年2月22日
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Nian F, Wu L, Xia Q, Tian P, Ding C, Lu X. Akkermansia muciniphilaとBifidobacterium bifidumはFXR発現と腸内細菌叢を制御することによりNAFLDを予防する。J Clin Transl Hepatol. オンラインで公開されました： 2023年2月22日、doi: 10.14218/JCTH.2022.00415.
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