転移性細菌感染のクリアランスにおけるヒスタミンを介したマクロファージ分化の役割

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オリジナル研究論文
Front. 免疫学、2023年11月14日
Sec.分子自然免疫
第14巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1290191
転移性細菌感染のクリアランスにおけるヒスタミンを介したマクロファージ分化の役割

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1290191/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FIMMU_XXXXXXXX_auto-dlvrit

Kwang H. Kim1† Donghwan Park1† Soo Young Cho2† Yejin Cho1 Buhyun Lee1 Haengdueng Jeong1 Yura Lee1 Yourim Lee3 Ki Taek Nam1* 1．
1Department of Biomedical Sciences, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Republic of Korea
2漢陽大学校融合科学技術大学分子生命科学科（大韓民国・安山市
3大韓民国ソウル大学病院病理部
マクロファージは、組織の恒常性維持、特に細菌感染に対する防御反応の活性化において役割を果たす、高度に不均一な免疫細胞である。腹膜細胞のフローサイトメトリーおよびシングルセルRNAシークエンシング解析を用いて、我々はヒスタミン欠損（Hdc-/-）マウスにおいて小型腹膜マクロファージおよび未熟マクロファージ集団が濃縮され、それぞれCD11bmiF4/80loCCR2+MHCIIhiおよびCD11bloF4/80miTHBS1+IL-1α+の表現型によって特徴づけられることを示した。分子生物学的特徴から、未熟マクロファージは強い炎症特性を持つ大型腹膜マクロファージの異常分化型であることが明らかになった。さらに、ヒスタミンシグナルの欠損は、腹膜マクロファージ集団の貪食活性を著しく低下させ、細菌感染に対する高い感受性をもたらした。本研究は、組織の恒常性を維持するマクロファージ分化におけるヒスタミンシグナルの重要性を分子レベルで明らかにするものであり、細菌感染を介する疾患の治療標的となりうる。

1 はじめに
マクロファージは成熟し、分化した白血球であり、組織に侵入した細菌を排除することにより、組織の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしている(1)。マクロファージはまた、組織の修復や発生過程においても重要な因子であり(2)、感染症、慢性炎症性疾患、神経変性疾患、自己炎症性疾患、肥満、心血管疾患、がんなど、さまざまな疾患の病態において重要な役割を果たしている(3-5)。最近の証拠によると、マクロファージは非常に不均一な集団であり、隣接する環境からの様々な刺激に反応して可塑性を示す。例えば、腸管マクロファージは、微生物が接触しやすい場所として腸関門を防御するが、これは、管腔領域での細菌サンプリング、組織のリモデリング、侵入した細菌の排除によって達成される(6)。したがって、さまざまな組織におけるマクロファージの表現型とその機能を正確に理解することは、効果的な治療法の開発にとって極めて重要である。

腹腔は骨髄細胞ニッチであり、炎症反応において重要な役割を果たすマクロファージの様々な集団を含んでいる(7, 8)。腹膜マクロファージ（PM）は、骨髄や脾臓と並ぶマクロファージの最も一般的な供給源の一つとして、腹腔における自然免疫および適応免疫に役割を果たしている。腹膜細胞の約30％はPMで構成されており(9)、主にF4/80highMHCIIlow大型腹膜マクロファージ（LPM）とF4/80lowMHCIIhigh小型腹膜マクロファージ（SPM）として特徴づけられる(10)。PMは組織の恒常性維持に重要な役割を果たしており、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫などによる感染に対する防御機構を制御することが主な役割である(11)。感染したPMの貪食は、侵入した病原体の除去における主要なメカニズムであり、腹膜炎を予防するために重要である(12)。腹膜炎が起こると、細菌は急速に血液に広がり、敗血症を誘発し、最終的には多臓器不全により死に至る。炎症性腸疾患のモデルを用いた研究では、PMも腸壁に直接動員されることにより、腸の恒常性維持に重要な役割を果たしていることが示された(13, 14)。PMは腹膜で最も豊富な集団であり、内臓臓器（15）や腫瘍（16）のような他の組織に直接動員されうるマクロファージと密接に関連していることから、マクロファージの多様な機能と制御機構をより広く理解するためには、その分子同定と機能的／発生的特性解析が重要である。

ヒスタミンは、アンモニア（NH3）構造に基づく有機分子であり、免疫応答の制御（17）、神経伝達（18）、胃酸分泌（19）など、さまざまな生物学的役割を担っている。自然免疫系では、ヒスタミンシグナル伝達は肥満細胞によるアレルギー反応の主要因であり、さらにマクロファージ（20、21）、単球由来樹状細胞（DC）（22）、造血幹細胞（23）、ヒトM1型マクロファージ（24）の分化を促進する。内因性ヒスタミンは、ヒスチジン脱炭酸酵素（HDC）によるヒスチジンの脱炭酸によって生成される（25）。したがって、HDCはヒスタミン産生とマクロファージ分化に重要である。HDC欠損マウスを用いた研究では、骨髄系細胞の分化にヒスタミンシグナルが重要であることが示された。HDC欠損マウスでは、発がんを促進する免疫抑制性のCD11b+Ly6G+未熟骨髄系細胞が蓄積し（26）、グリオーマモデルではCD8+T細胞の増殖が阻害された（27）。ヒスタミン受容体欠損マクロファージを用いた研究では、ヒスタミンシグナルが貪食の活性化に必要であることが確認されたが（28, 29）、ヒスタミンシグナルがマクロファージの完全な分化を誘導し、貪食機能を発揮させる分子機構はまだよくわかっていない。

胃は、胃壁細胞による胃酸の分泌により、強い酸性状態にある(30)。我々の以前の研究では、ヒスタミンシグナルの欠乏が胃の慢性炎症と肥大性胃炎を引き起こすことが示唆され、これらの影響は胃特異的マクロファージの貪食活性の低下に起因するところが大きかった(31)。したがって、ヒスタミンシグナルの欠乏がPM集団の機能と表現型を変化させるという仮説を立てた。しかしながら、この先行研究は胃特異的マクロファージの役割だけに焦点を当てたものであり、ヒスタミンシグナルの抑制におけるマクロファージの一般的な重要性はほとんど見落とされていた。したがって、マクロファージの完全な分化にヒスタミンが必要であるかどうかを明らかにするためには、他の組織でも同様の研究が必要である。

ここで我々は、マクロファージ分化におけるヒスタミンの役割と、分化したマクロファージ集団の機能的特性を、PMにおける単一細胞RNA配列決定（scRNA-seq）とフローサイトメトリー解析を用いて明らかにした。具体的には、ヒスタミン欠損（Hdc-/-）マウスモデルにおいて、ユニークなPM集団と貪食遺伝子発現の変化を同定した。さらに、Hdc-/-マウスのマクロファージは機能と分化能が損なわれており、その結果、細菌感染に対する感受性が上昇していることを示した。この研究により、マクロファージが細菌の侵入を抑制する機能を発揮するためには、ヒスタミンを介したシグナル伝達が重要であることが明らかになった。

2 材料と方法
2.1 マウス
動物実験は延世大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（2021-0057）の承認を得ており、Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに準拠している。野生型FVB/NJマウスはThe Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME, USA）から購入し、Hdc-/-マウスはDr. Timothy C. Wang（Columbia University, NY, USA）から頂いた。マウスは特定病原体フリー施設またはバイオセーフティレベル-2施設（リステリア菌（L. monocytogenes）感染実験用）で飼育し、12時間の光サイクル下で維持し、PicoLab Rodent Diet 20（LabDiet, St.） 出生4週間後、Hdc-/-マウスの子孫をマザーケージから分離し、プライマーWT_S（GAGCACTGTCAGCGAATCCAC）、WT_AS（GGCCGTGAGATAAGC GTGACC）、HDC_AS（TGGGATTAGATAA ATGC CTGCTCT）を用いて遺伝子型を決定した。

2.2 フローサイトメトリー
マウスの全腹膜細胞を氷冷PBSで10mlシリンジを用いて単離し、100μLのFACSバッファー（0.5％FBS、1mM EDTA、0.05％NaN3 in PBS）で希釈したFc Block（BD）で2μL/106cells、4℃で10分間ブロッキングした後、FACSバッファーで洗浄して残存Fc Blockを除去した。細胞表面染色は、抗体カクテルを含むFACSバッファー中、氷上で1時間行った。FACSバッファーで3回洗浄後、細胞をBD LSR Fortessaフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーに供し、FlowJoソフトウェアを用いてデータを解析した。

FACSバッファーで洗浄後、Cytofix/Cytoperm溶液（BD Biosciences）を用いて氷上で20分間固定し、Perm/Wash溶液（BD Biosciences）で洗浄した。細胞内染色は、PE-IL-1α抗体（BioLegend）または一次抗THBS1抗体（Invitrogen）を用い、二次PE-抗ウサギ-IgG抗体（BioLegend）またはPE-アイソタイプコントロール抗体（BioLegend）を用いて氷上で1時間行った。細胞をPerm/Wash溶液で2回洗浄し、BD LSR Fortessaシステムを用いてフローサイトメトリーで解析した。

2.3 マウス腹膜細胞のScRNA-seq
10×Genomics Single Cell Protocols Cell Preparation GuideおよびGuidelines for Optimal Sample Preparation Flowchart（それぞれ文書CG00053およびCG000126）に従い、LUNA-FL Automated Fluorescence Cell Counter（Logos Biosystems）でscRNA-seq用のマウス腹膜単一細胞を調製した。最も明瞭な結果を得るために、腹膜細胞のフローサイトメトリーを行った。これらの結果に基づいて、雄のHdc+/+マウス1匹と雄のHdc-/-マウス1匹から単離した細胞を用いて、10× Single Cell 3′ v3 scRNA-seqプロトコルを実施した；各グループでそれぞれ5375個と5760個の細胞が最初にプロファイリングされ、細胞あたり約15,000遺伝子が検出された（中央値）。低品質細胞（ミトコンドリア遺伝子比0.1以上または発現遺伝子数500未満）を除去した後、4704個のHdc+/+細胞と5086個のHdc-/-細胞を品質管理に供し、さらなる解析を行った。ライブラリーは、10× Single Cell 3′ v3プロトコール（10× Genomics, Pleasanton, CA, USA）に従い、クロムコントローラーを用いて調製した。簡単に言うと、細胞懸濁液をヌクレアーゼを含まない水で希釈し、目標とする細胞数が10,000になるようにした。細胞懸濁液をマスターミックスと混合し、シングルセル3′ゲルビーズにロードし、シングルセル3′チップに分割した。単一細胞からのRNA転写物はバーコード化され、液滴内で逆転写された。cDNA分子はプールされ、末端修復プロセスにかけられ、次いで1個の'A'塩基が付加され、アダプターがライゲーションされた。産物を精製し、PCRを用いて濃縮し、最終的なcDNAライブラリーを作成した。精製されたライブラリーは、qPCR Quantification Protocol Guide (KAPA)に従って定量的PCRで定量され、Agilent Technologies 4200 TapeStationを用いて定性された。最後に、HiSeqプラットフォーム（Illumina, San Diego, CA, USA）を用いて、リード1（細胞バーコードおよびユニーク分子識別子[UMI]）に28 bp、インデックスリード（サンプルバーコード）に8 bp、リード2（RNAリード）に91 bpのリード長で、ライブラリーの塩基配列を決定した。

scRNA-seqデータはCellranger（リリース3）を用いて処理した。リードは10×Genomics社から提供されたmm10参照ゲノムにマッピングした。UMIから遺伝子数マトリックスを作成し、Seuratパッケージの関数を用いて低品質細胞を除去し、以下の基準に従ってscRNA-seqデータを正規化した(32)： 1) 発現遺伝子数が 500 未満または 5000 以上、2) ミトコンドリア遺伝子にマップされた UMI が 10%以上。次に、"normalizeData "関数を用いて、"LogNormalize "設定でデータを正規化した。最終的に、ノックアウト状態（Hdc-/-）では4704細胞と15,409遺伝子を同定し、野生型状態（Hdc+/+）では5086細胞と15,220遺伝子を同定した。

主成分分析を行って可変遺伝子を選択し、データの次元を下げ、UMAPを用いて2次元表現を構築した。次に、Seuratパッケージの "FindClusters "関数を利用し、主成分空間のグラフ構造に細胞を埋め込むことにより、細胞のクラスタリング解析を行った。最終的に、Hdc+/+とHdc-/-のデータセットから16のクラスターを同定した。各クラスタに関連するDEGを同定するために、標準的なAUC分類器を "FindAllMarkers "機能とともに使用し、AUC≧0.85の遺伝子を選択した。すべてのクラスターは、手動でキュレーションした既知の免疫細胞マーカー遺伝子の発現に基づいて、それぞれのDEG内の免疫細胞タイプに従ってアノテーションした。最終的に、11の免疫細胞タイプにアノテーションを行った。HALLMARKデータベース解析はMolecular Signatures Database (MSigDB)(33)から行った。

細胞の遷移状態を追跡するために、軌跡解析を行った。細胞はUMI数が少ない遺伝子を除去するために再処理され、ライブラリサイズに再正規化された。次元削減と軌跡の構築は、RパッケージMonocle (34)を用い、デフォルトのパラメータで行った。細胞は "orderCell "関数を用いて擬似時間軌跡上に配置した。

2.4 貪食アッセイ
PMをRPMI-1640培地（5％FBS）に2×105cells/mLの密度で懸濁した。細胞の各グループを12ウェルプレートに播種し、37℃、5％CO2インキュベーターで6時間インキュベートした。合計1×106個のFluoSpheresポリスチレンビーズ（1.0μm; 580/605、Invitrogen社製）を各ウェルに加え、穏やかに振盪しながら細胞とともに30分間インキュベートした。フローサイトメトリー解析のため、回収した細胞をFACSバッファーで洗浄し、Fcブロック（BD）で4℃で10分間ブロックした。細胞表面染色は、FITC-F4/80を含むFACSバッファー中、氷上で1時間行った。FACSバッファーで3回洗浄後、BD FACSverseサイトメーターを用いて細胞を分析した。FluoSpheresポリスチレンビーズはPE蛍光で検出した。

Hdc-/-マウスの腹膜マクロファージのin vivoでの貪食能を調べるために、我々は蛍光ビーズ貪食アッセイを行った（35）。アッセイには、4週齢のHdc+/+およびHdc-/-マウスに、1.0μmのFluoSpheresポリスチレンビーズ（580/605）/200μLを1×107個腹腔内注射し、30分または60分間反応させた。その後、すべてのマウスを犠牲にし、上記のようにFACS解析を行った。

2.5 L. monocytogenesの貪食作用
L.monocytogenes（10403S株、American Type Culture Collection）をbrain heart infusion broth（BD, 237500）で培養し、1μMのCFSE（eBioscience, 65-0850-84）で暗所、25℃で20分間細胞を標識した。CFSE標識細菌をPBSで洗浄し、1700×gで10分間遠心し、100％FBSとともに37℃で10分間インキュベートした。CFSE標識L. monocytogenesを再度洗浄し、1×108 CFUで各PM播種ウェルに添加し、37℃、5％CO2インキュベーターで30分間インキュベートした。その後の手順は、上記のフローサイトメトリー分析と同じであった。

2.6 肝臓のH&E染色と免疫組織化学染色
H&E染色では、マウスの肝臓組織を氷冷した4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。組織は5μmの厚さで切り出し、キシレンで20分ずつ3回、100％エタノールで10分ずつ3回、90％エタノールで10分ずつ2回、75％エタノールで10分ずつ脱パラフィンし、H&E染色した。染色した肝組織スライドを脱水し、Shandon Synthetic Mount（Thermo, 6769007）でマウントして観察した。

免疫組織化学のために、パラフィン包埋標本を3μmで切り出し、脱パラフィンし、PBSで水和した。その後、Target Retrieval solution（Dako、S1699）中で高圧下15分間抗原を回収した。その後、標本を氷上で1時間冷やし、PBSで5分間ずつ3回洗浄し、内因性ペルオキシダーゼをクエンチするためにPBS中3％H2O2で30分間ブロックした。スライドをPBSで再度洗浄し、Serum-Free Protein Block（Dako、X0909）で室温で2時間ブロックし、抗好中球抗体（Abcam、ab2557）（1/1,000希釈）で4℃で一晩プローブした。ワサビペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG二次抗体染色は、VECTASTAIN ABC HRP Kit（VECTA labs, PK-4004）を用い、Liquid DAB+ Substrate Chromogen System（Dako, K3468）で現像した。最後に、標本をMayer's hematoxylin (Dako, S3309)で対比染色し、Shandon Synthetic Mountでマウントして観察した。

2.7 定量化と統計解析
統計解析はPrismソフトウェア（GraphPad）を用いて行った。統計的有意性を評価するため、Student's t-testを用いて群間差を比較した。有意性はP < 0.05で判定した。各実験のサンプルサイズを含む統計的詳細は、関連する図の凡例に記載されている。

3 結果
3.1 Hdc-/-マウスにおける異常分化PMの生成
ヒスタミンシグナルの欠損が骨髄の成熟を抑制するという以前の報告(26)と同様に、Hdc-/-マウスではCD11b+F4/80+骨髄由来マクロファージ（BMDM）のGM-CSFを介した分化が障害されていることがわかった、 Hdc-/-マウスのBMDMsでは、MHCIIとCD64の発現も野生型（Hdc+/+）マウスのそれと比較して低下していたが、CD80とCD14の発現はヒスタミン欠乏の影響を受けなかった（図1A）。4週齢のHdc-/-マウスでは、LPM（CD45+CD11bhighF4/80high）の割合が減少し、SPM（CD45+CD11bmidF4/80low）の割合が増加した（図1B）。特に、Hdc-/-マウスでは、CD45+CD11blowF4/80 midの表現型を特徴とする、異常に分化した未熟マクロファージ（ImM）集団が濃縮されていた（図1B、C）。また、ヒスタミンを介したマクロファージ分化が、SPMではCD64、ImMではCD80とCD14の発現に必要であることもわかった（図1D）。これらのデータを総合すると、マクロファージの完全な分化にはヒスタミンシグナル伝達が重要であることがわかる。

図1
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図1 Hdc-/-マウスにおけるマクロファージ表現型の変化と新たな未熟マクロファージ集団の同定。(A）骨髄由来マクロファージ（BMDM）を特徴づけるフローサイトメトリーゲーティング戦略。4週齢のHdc+/+およびHdc-/-マウスから得たGM-CSF処理BMDMを、まず生細胞（DAPI-）、単一細胞、CD45+細胞でゲーティングした。CD45+細胞はさらにCD11b+F4/80+で区別し、CD80+、CD64+、CD14+、MHCII+細胞をそれぞれカウントした（n = 3マウス）。(B）マウス腹膜マクロファージ（PM）を特徴づけるフローサイトメトリーゲーティング戦略。Hdc+/+およびHdc-/-マウス腹膜細胞は、まず生細胞（DAPI-）、単一細胞、およびCD45+細胞でゲーティングし、続いてCD11bとF4/80の相対発現で定義した3つのゲートをオーバーラップさせ、大型腹膜マクロファージ（LPM）を定義した： CD45+CD11bhighF4/80high）、小型腹膜マクロファージ（SPMs：CD45+CD11bmidF4/80low）、未成熟マクロファージ（ImMs：CD45+CD11blowF4/80mid）を定義し、Hdc+/+およびHdc-/-マウス腹膜細胞（n = 4マウス）からLPM、SPM、ImM集団を定量した。(C）Hdc+/+およびHdc-/-マウス腹膜細胞からのt-distributed stochastic neighbor embedding（tSNE）投影。LPM、SPM、ImmM集団はハイライトされている。(D）MHCII、CD64、CD80、CD14の発現によってさらに同定されたLPM、SPM、ImmM集団。結果は平均値±SDで示した；*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

3.2 ヒスタミン欠乏下におけるPMのScRNAプロファイリング
ヒスタミン欠乏状態におけるマクロファージ表現型の変化を分子レベルでさらに特徴づけるために、4週齢のHdc+/+およびHdc-/-マウス（各群1匹ずつ）から単離した全腹膜細胞にscRNA-seqを適用した。分化発現遺伝子（DEG）パターンに基づいて細胞集団を同定するために、Seuratソフトウェアスイートを用いて教師なし細胞クラスタリングを行った。一様多様体近似と投影（UMAP）により、B細胞（B、クラスター2-4）、T細胞（T、クラスター7）、ナチュラルキラー細胞（クラスター8）、増殖マクロファージ（Mac-pro、クラスター10）、DC（クラスター11）を代表する合計16の細胞クラスターが同定された（図2A）、 増殖B細胞（B-pro、クラスター12）、マスト細胞（Mast、クラスター13）、単球（mono、クラスター14）、区別できないクラスター（Null、クラスター9と15）（図2B）、マーカー発現に基づく4つのマクロファージクラスター（クラスター0、1、5、6）（補足表S1）。好中球クラスターはこの実験条件では同定されなかったが、これは以前の報告(36)と同じである。クラスター0と1はそれぞれLPM1とLPM2と名付けた主要な集団を構成し、Hdc+/-マウスではHdc+/+マウスに比べて減少していた。逆に、クラスター5と6はHdc-/-マウスで濃縮され、それぞれSPMとImmMと特徴付けられた（図2B）。合計259のDEGがこれらのクラスターの細胞を最もよく特徴づけ、曲線下面積（AUC）値は0.85以上であった（図2C；補足表S2）。LPM1集団とLPM2集団は同様の遺伝子発現パターンを示したが、LPM2集団ではM2マクロファージ様マーカー遺伝子（Cbr2、Folr2、Sepp1）の発現が上昇した。ImM集団はLPM1およびLPM2と同様の遺伝子発現パターンを示したが、全体的な遺伝子発現レベルは低かった。SPMクラスターはマクロファージ集団として特徴づけられたが、遺伝子発現パターンはDCおよびmonoクラスターとより類似していた（図2C）。各クラスターの上位発現遺伝子のうち、Cd9はLPM1でより高発現していたが、他のマクロファージクラスターでも発現していた。ヒスチジンアンモニアリアーゼ（Hal）は典型的なマクロファージマーカーではないが、この遺伝子はLPM2、LPM1、ImM、Mac-proクラスターで高発現していた。Membrane spanning 4-domains A1 (Ms4a1)、Cd79b、early B-cell factor 1 (Ebf1)はB細胞クラスターで高発現していた。Ccr2とItga6は、それぞれSPMとImmMクラスターで最も高発現した遺伝子であった。増殖細胞クラスター（Mac-proとB-pro）はMcm5とStmn1を高発現し、DCクラスターは抗原提示関連遺伝子H2-Aaを高発現した（図2D）。

図2
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図2 マウス腹膜細胞の単一細胞トランスクリプトームアトラス。4週齢のHdc+/+およびHdc-/-マウス（各群1匹）から単離した全腹膜細胞にScRNA-seqを適用した。(A）4週齢のHdc+/+およびHdc-/-マウスの腹膜細胞から得られた均一多様体近似投影（UMAP）プロット。(B）割り当てられた細胞タイプの数と割合。LPM1および2、大型腹膜マクロファージ1および2；B 1-3、B細胞1-3；SPM、小型腹膜マクロファージ；ImM、未熟マクロファージ；T、T細胞；NK、ナチュラルキラー細胞；Mac-pro、増殖マクロファージ；DC、樹状細胞；B-pro、増殖B細胞；Mast、肥満細胞；Mono、単球；Null、未特性細胞。(C) (A)の各クラスターについて、曲線下面積(AUC)カットオフ≧0.85の差次発現遺伝子(DEG)のヒートマップ。(D) 14の主要クラスター（Nullクラスターを除く）における上位発現遺伝子の平均発現量（配色で表す）と細胞の割合（スポットサイズで表す）。(E）代表的なマーカー遺伝子の発現レベルのバイオリンプロット。Y軸は対数スケールで正規化したリードカウントを示す。マクロファージマーカー＝Adgre1、Itgam、CD68、Mrc1、Retnla、Sepp；B細胞マーカー＝CD19、Ms4a1、Blnk；炎症マーカー＝Ccr2、Il1b；T細胞マーカー＝Cd3d、Cd3g；NK細胞マーカー＝Nkg7、Klrc1； 増殖マーカー＝Mki67、Cdk1、Mcm6、Ccnb2；DCマーカー＝Itgax、Cd209a；抗原提示マーカー＝Cd74；肥満細胞マーカー＝Cma1；単球マーカー＝Csf1r、Cd44、Ly6c1、Cx3cr1。

SPMとImMを他のクラスターとさらに区別するために、マクロファージ、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー細胞、増殖細胞、DC、抗原提示細胞、肥満細胞、単球のよく知られた表現型および機能マーカーを用いて、グループ間のDEGを同定した（図2E）。クラスターLPM1とLPM2が優勢で、マクロファージマーカーAdgre1（F4/80）とItgam（CD11b）の発現が高いが、抗原提示細胞マーカーCd74（MHCII）の発現は低かった。そこで、LPM1とLPM2を、フローサイトメトリーで得られたCD11bhighF4/80highMHCIIlow（LPM）集団とマッチさせた（図1B、D）。SPMにおけるAdgre1の発現レベルは他のマクロファージクラスターよりも低かったが、Cd74の発現レベルはSPMクラスターで比較的高く（図2E）、これはフローサイトメトリーによってCD11bmidF4/80lowMHCIIhigh（SPM）集団で見つかったこれらの遺伝子の発現レベルと一致した（図1B、D）。DEGのヒートマップではImMは別のクラスターとして同定されたが（図2C）、このクラスターにおけるマクロファージマーカー遺伝子の発現パターンはLPM1およびLPM2と同等であった（図2E）。HALLMARKデータベース解析により、LPMクラスターではSPMクラスターと比較して、脂肪新生、解糖、ヘム代謝、血管新生、Notchシグナル伝達経路の発現が上昇していることが示された。このことから、LPMは主に組織の恒常性を維持する組織常在マクロファージで構成されていることが示された（図3A；補足図1A）。SPMクラスターでは、補体系がアップレギュレートされたのに対し、IFN-γ応答、IFN-α応答、移植片拒絶反応、IL-2-STAT5シグナル伝達、G2Mチェックポイントなど、活性酸素経路、凝固、免疫応答、細胞周期経路がダウンレギュレートされた（図3B、C；補足図1B、C）。ImmMクラスターに濃縮された全体的なシグナル伝達経路は、LPMクラスターに濃縮された経路と同様であった。しかし、炎症反応に関連する経路は、ナイーブな状態の他のクラスターと比較して、ImmMクラスターで最も有意に発現が上昇した（図3D）。これは、ImmMが組織常在マクロファージの存在にもかかわらず、潜在的に炎症を誘導することを示している。

図3
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図3 大腹膜マクロファージ（LPM）、小腹膜マクロファージ（SPM）、および未熟マクロファージ（ImM）の機能的特性。(A-D）LPM1、LPM2、SPM、ImMの脂肪形成（A）、IFN-γ応答（B）、G2Mチェックポイント（C）、炎症応答（D）経路のHALLMARK解析。各クラスターはバイオリンプロットで可視化されている。

3.3 SPMクラスターとImMクラスターの特徴づけ
SPMクラスターはマクロファージとして特徴づけられたが、他のマクロファージクラスターとは区別され、Cd209a、Itgax、Mgl2などのDCマーカー遺伝子が発現していないにもかかわらず、遺伝子発現パターンによるとDCおよびMonoクラスターに近かった（図4A）（補足図2A）。4週齢のHdc-/-マウスの全腹膜細胞のフローサイトメトリーでは、CD209a+CD11c+ DCが全CD11b+細胞の4％を占めたが、CD11bmidF4/80低SPM集団ではDC集団は確認されなかった（図4B）。SPMクラスターは、炎症性サイトカインTnfとIl6とともに、Hopx（原始造血の制御因子）(37)を高発現したが、細菌の貪食に関与するVsig4（補足図2B）(38)とSocs3（図S2C）は最小限の発現しか示さなかった。古典的単球(39)で推定的に発現しているCcr2もSPMクラスターで高発現しており、4週齢のHdc-/-マウスの腹膜細胞では、CD11bmidF4/80低下SPM細胞の約60％がCCR2を発現していた（図4C）。

図4
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図4 小型腹膜マクロファージ（SPM）と未熟マクロファージ（ImM）の表現型同定。(A）図2AのSPM、単球（Mono）、樹状細胞（DC）クラスターをハイライトしたもの。(B)4週齢のHdc-/-マウス腹膜マクロファージの単一、生細胞、CD45、CD11b、CD209a、CD11c細胞でDCをゲートした。DCはCD11bmidF4/80low集団と区別された。左と中：代表的なゼブラプロット。右：各集団におけるCD209a+CD11c+細胞のパーセンテージの棒グラフ（n = 5マウス）。(C) 一様多様体近似投影図（UMAP）およびバイオリンプロットにおけるCcr2の発現レベル（左）、CD11bmidF4/80low集団からのCCR2+細胞の代表的フローサイトメトリー同定（中）、およびCCR2+大腹膜マクロファージ（LPM）、SPM、ImmM集団の定量（n = 5マウス）。(D）図2AからLPM1、LPM2、ImM、Mac-proクラスターをハイライトしたもの。(E)ImMの起源に関する2つの可能なモデルの模式図。 (F)LPM1、LPM2、ImM、Mac-proに使用された単一細胞を順序付ける教師なし軌跡。(G)4週齢のHdc+/+およびHdc-/-マウスの腹膜細胞を100ng/mLのLPSおよび/または10-6Mのヒスタミンで2日間in vitro処理したもの。CD45+CD11bhighF4/80high細胞の割合を算出した（n = 4マウス）。(H) UMAPおよびバイオリンプロット上のThbs1およびIl1aの発現レベル。(I）4週齢のHdc-/-マウス腹膜細胞から採取したLPM1、LPM2、SPM、ImM集団において、フローサイトメトリーを用いて検証したTHBS1とIL-1αのタンパク質発現（n = 5 mouse）。結果は平均値±SDで示した。*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001。

LPM1、LPM2、ImM、およびMac-proクラスターは、UMAP空間で密接に関連し（図4D）、同様のDEGプロファイルを示した（図2C）。ImMではマクロファージマーカー遺伝子の発現がLPM1およびLPM2クラスターに比べて低いことから、2つの可能性が考えられた： 1）ImMがMac-proとImMの中間的な細胞型で、LPM1とLPM2に分化する能力を持つという中間型モデル、2）Mac-proが直接LPM1、LPM2、ImMに分化し、ImMは中間型ではなく、むしろ未熟マクロファージとして固定化された集団を表すという完成型モデルである（図4E）。これらのモデルを区別するために、LPM1、LPM2、ImM、Mac-proの集団を擬似的に時間再構成し、Monocleツールキットを用いて軌跡解析を行った。ImM細胞の大部分は、Mac-proクラスターとLPM1、LPM2クラスターの間ではなく、軌跡の終点に位置しており（図4F）、これはImMがLPMの終末分化した未熟型である可能性を示唆している。この可能性を検証するために、4週齢のHdc+/+およびHdc-/-マウスの全腹膜細胞をLPSおよび/またはヒスタミンで2日間in vitro刺激し、CD11bhighF4/80high細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。LPSとヒスタミンの二重刺激により、Hdc-/-マクロファージでは分化が部分的に回復したが、この回復はHdc+/+マクロファージで観察された回復よりはるかに低かった（図4G）。このことから、ImM集団は未熟な性質を持つマクロファージの終末分化型であることが示唆された。

ImMクラスターは、他のマクロファージクラスターにおけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、LPM特異的遺伝子として報告されているトロンボスポンジン-1（Thbs1）とIl1aをより高発現した（図4H）。同様に、PMのフローサイトメトリーでは、CD11blowF4/80mid ImMのThbs1およびIL-1αタンパク質のレベルが、他のマクロファージ集団のものと比べて最も高いことが示された（図4I）。

3.4 ヒスタミンを介したマクロファージの分化は貪食機能に重要である
これまでの報告では、ヒスタミンがヒスタミン受容体との相互作用を介して、さまざまなタイプのマクロファージの機能に重要であることが示されている。そこで次に、4週齢および1週齢のHdc+/+およびHdc-/-マウスのPMにおいて、マイクロビーズを用いた貪食アッセイを行った。各集団における貪食活性を定義するために、まずPMをCD45+CD11bhighF4/80high（LPM1およびLPM2と一致）、CD45+CD11blowF4/80mid（ImMと一致）、CD45+CD11bmidF4/80low（SPMと一致）でゲーティングし、さらに各集団をF4/80染色と赤色染色マイクロビーズで調べた。Hdc-/-LPMでは、Hdc+/-細胞に比べて劇的に貪食活性が低下していた。SPMとImmMの集団は少なかったが、Hdc+/+ PMでは細胞当たり1-5個のビーズの取り込みが検出された。Hdc-/-PMではSPMとImmMの集団が濃縮されているにもかかわらず、これらの細胞のほとんどはビーズを取り込むことができなかった（図5A、B）。

図5
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図5 ヒスタミンシグナルはin vitroでのマクロファージの貪食活性に重要である。 A, B）ポリスチレンビーズを用いたHdc+/+およびHdc-/-腹膜マクロファージ（PM）の貪食アッセイ。フローサイトメトリーは、生細胞（DAPI-）、単一細胞、F4/80+細胞、ビーズ+細胞にゲーティングして行った。大型腹膜マクロファージ（LPM）、小型腹膜マクロファージ（SPM）、未成熟マクロファージ（ImM）あたりのビーズ取り込み数が強調表示され（赤枠）（A）、取り込まれたビーズの総数が計算される（B）（n = 3マウス）。(C)Hdc+/-マウスとHdc-/-マウスの差次発現遺伝子(DEGs)のうち、Hdc+/-マウスで発現が増加した遺伝子を選び、4つのクラスター(LPM1、LPM2、SPM、ImM)間の分布と重なりをベン図に示した。(D）Hdc+/+マウスとHdc-/-マウスのLPM1とLPM2クラスターにおけるH2-Aa、Cd74、H2-Ab1、Cd81の発現レベルを比較したバイオリンプロット。(E）ビーズアレイを用いたIFN-γの細胞測定。Hdc+/+およびHdc-/-マウスの4週齢のPM（上のグラフ）またはGM-SCF処理骨髄由来マクロファージ（BMDM；下のグラフ）をPBS（コントロール）またはLPSで処理した。培養上清中の各群のサイトカイン濃度を測定した（n＝4マウス）。(F）CFSE標識L. monocytogenes（LM）を用いたHdc+/+およびHdc-/-PMのin vitro貪食アッセイ。PMを含むLM細胞を蛍光顕微鏡で可視化し、各PM中のLM数を定量した。結果は平均値±SDで示した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。

貪食に関与するヒスタミンシグナルを介する遺伝子を同定するため、各クラスターにおいてHdc+/-マウスと比較してHdc+/+マウスで発現が上昇したDEGを選び、ベン図解析で比較した。LPMクラスターでは、H2-Ab1、H2-Aa、Cd74 (41)、Cd81 (42)などの貪食および抗原提示関連遺伝子が発現上昇していた（図5C；補足表S3）。Violin plot解析でも、Hdc-/-マクロファージクラスターでは貪食関連遺伝子の発現が有意に低下していることが確認された（図5D）。IFN-γはマクロファージにおいて、貪食活性を増強することで抗菌活性を発揮することが知られている（43, 44）。ヒスタミンシグナルがマクロファージにおけるIFN-γに重要であるかどうかを同定するために、全PMおよびBMDMをLPSで刺激し、細胞測定ビーズアレイを用いてIFN-γの発現レベルを決定した。LPSで刺激したHdc-/-PMやBMDMs培養液ではIFN-γの発現は検出されず（図5E）、ヒスタミンシグナルがIFN-γの分泌に重要であることが示唆された。4週齢と1週齢のHdc+/-マウスのPMでCFSE標識L. monocytogenesを用いたin vitro貪食アッセイでは、ヒスタミン欠損は貪食活性の低下をもたらし、Hdc+/-マウスではHdc+/-マウスよりもPMあたりのL. monocytogenesの数が有意に減少した（図5F）。

ヒスタミンシグナルの欠損がin vivoでの貪食活性の低下にもつながるかどうかを調べるために、4週齢のHdc+/-マウスに蛍光ビーズを腹腔内注射し、ビーズ注射の30分後と60分後にフローサイトメトリー解析を行った（図6A）。in vitroの結果と同様に、Hdc-/-マウスのF4/80高値LPMでは貪食活性の低下が検出され、30分後および60分後の両方で、Hdc-/-マウスではHdc+/+マウスよりも総貪食ビーズ数および細胞あたりの貪食ビーズ数が有意に減少した（図6B、C）。また、フローサイトメトリー解析を用いて、Hdc+/+およびHdc-/-細胞のSPMおよびImM集団のin vivoでの貪食活性を比較した（図6D）。ヒスタミン欠乏ではSPMの貪食活性が部分的に損なわれ、Hdc-/-マウスのImMの貪食活性は完全に失われた（図6E、F）。これらの結果から、ヒスタミンシグナルを介したマクロファージの分化がPMの貪食能に重要であることが示された。

図6
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図6 ポリスチレンビーズを用いた4週齢のHdc+/+およびHdc-/-マウスの腹膜マクロファージ（PM）のin vivo貪食アッセイ。(A) 30分後と60分後のF4/80+(FITC) Bead+(PE)大型腹膜マクロファージ(LPMs)の代表的フローサイトメトリー画像 (B) 各フラクション中のLPMsの割合の測定。フラクション番号は1LPM中のビーズ数を示す。(C）取り込まれたビーズの総数。(D) 未熟マクロファージ（ImM）と小型腹膜マクロファージ（SPM）のフローサイトメトリーゲーティング戦略。F4/80mid Bead+(PE)ImMおよびF4/80low Bead+(PE)SPMの代表的なフローサイトメトリー画像を示す。(E, F)各画分の細胞比率の測定と、SPM(E)およびImM(F)における総取り込みビーズ数の算出；n = 3マウス。結果は平均値±SDで示した；*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

3.5 Hdc-/-マウスのマクロファージの異常分化は細菌を介する腹膜炎への感受性を高める
ヒスタミンシグナルの欠損が貪食に及ぼす影響を考慮し、次に、ヒスタミンを介したマクロファージの分化がin vivoでの細菌感染を抑制するのに重要であるかどうかを検討した。この可能性を探るため、Hdc+/+およびHdc-/-マウスにL. monocytogenesをi.p.注射した短期腹膜炎モデルマウスを作製した（図7A）。感染から2日後、Hdc+/+マウスの腹腔内ではL.monocytogenesの大部分が除去されていたのに対し、Hdc-/-マウスの腹腔内にはかなりの量の生菌が残存していた（図7B）。次にフローサイトメトリーを用いて、感染時の腹腔内の免疫細胞、特にマクロファージの動態を評価した（図7C）。CD3+T細胞の数は、Hdc-/-マウスではHdc+/+マウスに比べて減少していたが、L. monocytogenes感染後には有意に増加していた（図7D）。CSF1R+マクロファージは、Hdc+/+およびHdc-/-マウスの両方で、L. monocytogenes感染に応答して劇的に減少した（図7E）。注目すべきことに、Hdc+/+マウスでは感染後、LPMのほとんどが消失し、注射したL.monocytogenesはわずか10％しか残存しなかった（図7F）。このことは、Hdc+/+ LPMが侵入した細菌の除去に効果的に関与し、活性化誘導性の細胞死を受けていることを示している。Hdc-/-マウスでは、抗細菌活性の低下が明らかであった。SPMの数は、コントロール（非感染）条件下ではHdc+/-マウスがHdc+/+マウスよりも多く、このパターンはL. monocytogenes感染後に逆転した（図7F'）。Hdc+/+マウスでは、感染後もImmM集団数に変化はなかった（図7F''）。

図7
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図7 4週齢のHdc+/+およびHdc-/-マウスを用いたin vivo L.monocytogenes（LM）媒介急性腹膜炎モデルの樹立。(A）急性LMs感染モデルのスキーム。(B)左：感染2日後の腹腔からのLM CFUを測定するための代表的な脳心筋注入寒天平板像。右： 脳心筋寒天培地上のコロニー数から予想される腹腔内の LMs 数。(C）LMs感染後の腹膜マクロファージ集団の変化を特徴づけるためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。PBSコントロール処理またはLMs感染Hdc+/+およびHdc-/-マウス腹膜細胞を、まず生細胞（DAPI-）、単一細胞、CD45+、CD3-、およびCSF1R-細胞でゲーティングし、続いて図1に記載したように3つのゲートをオーバーラップさせた。(D-F）全CD45+細胞中の（D）CD3+ T細胞、全CD45+CD3-細胞中の（E）CSF1R+細胞、および全CD45+CD3-CSF1R-細胞中の（F）大型腹膜マクロファージ（LPM）、小型腹膜マクロファージ（SPM）、および未熟マクロファージ（ImM）の割合（％）の定量。(G）脾臓マクロファージのフローサイトメトリーゲーティング戦略。全脾臓細胞をまず、生きた（DAPI-）、単一の、CD45+、CD3-、およびCSF1R-細胞でゲーティングし、CD11b+F4/80+マクロファージを同定した。(H, I)全CD45+CD3-細胞中の(H)CSF1R+細胞の割合(%)、および全CD45+CD3-CSF1R-細胞中の(I)CD11b+F4/80+マクロファージの割合(%)の定量化。(J) PBS処置またはLMs感染Hdc+/+マウスおよびHdc-/-マウスの肝臓のH&E染色像。(K）抗好中球抗体で免疫組織化学的に染色した肝臓切片の画像。結果は平均値±SDで示した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。

L.monocytogenesはリステリア症の主な原因菌であり、循環系を介して脾臓や肝臓など様々な臓器に広がって転移感染を引き起こす可能性がある(45)。そこで、Hdc+/+およびHdc-/-マウスのL. monocytogenes感染に対する脾臓マクロファージのフローサイトメトリー解析を行った（図7G）。Hdc+/+およびHdc-/-マウスのいずれにおいても、CSF1R+マクロファージの数に変化は認められなかった（図7H）。F4/80+CD11b+脾臓マクロファージ集団は、L. monocytogenes感染Hdc-/-群で有意に増加したが、Hdc+/+脾臓マクロファージ数に変化はなかった（図7I）。興味深いことに、肝臓のH&E染色では、L. monocytogenes感染Hdc-/-群でのみ炎症病巣が認められ（4匹中2匹；図7J）、炎症病巣では好中球が最も豊富な細胞集団であった（図7K）。一方、L. monocytogenesに感染したHdc+/+群では、肝臓の炎症病巣は観察されなかった（図7J）。マウスはL. monocytogenes感染からわずか2日後に犠牲となったため、肝臓に一貫した炎症巣を観察することは困難であった。しかし、L. monocytogenes感染後、Hdc-/-群でより豊富な炎症巣が観察されたことは確かである。これらの結果から、ヒスタミン欠乏によるマクロファージの分化障害は、L.monocytogenes感染に対する感受性を高めることが示された。Hdc-/-マウスのPMは、L.monocytogenesの脾臓および肝臓への拡散を防ぐことができず、最終的に転移感染を引き起こした。

4 考察
貪食は自然免疫反応における主要な生物学的プロセスであり、侵入してきた病原体やアポトーシス細胞を除去することにより組織の恒常性を維持する(46)。マクロファージの貪食活性は、ヒスタミン受容体シグナルの活性化に必要である(28, 29)。したがって、ヒスタミンシグナル伝達は、侵入してくる病原体に反応して宿主の防御システムを活性化するのに必要である。

Lantzら(41)は、PMの単一細胞解析を用いて、LPMとSPMの分子プロファイルを明らかにし、またMerTKが排出細胞形成に重要な受容体であることを示した。この発見は、SPMクラスターはAdgre1の発現が低く、Cd74の発現が高いという特徴を示す本研究の結果と一致する。さらに、scRNA-seqおよびフローサイトメトリー解析により、ヒスタミンシグナル欠損PMではPMの貪食活性が低下し、CCR2陽性、THBS1陽性、IL-1α陽性マクロファージが増加することが示された。われわれの以前のscRNA-seq解析では、胃特異的マクロファージ集団の機能的欠陥しか示さなかったが（31）、今回のHdc-/-マウスのPMのscRNA-seq解析では、ヒスタミンシグナル欠損により、マクロファージ活性、特に貪食能が損なわれた新しいImM集団が生成されることが明らかになった。好酸球もCD11bを発現していることから、この新たに同定されたImM集団は好酸球である可能性がある。これまでの報告では、好酸球は感染症やチオグリコレート処理後などの刺激条件下では腹腔内に濃縮されるが、安静期ではほとんど検出されないことが示されている(47, 48)。われわれのscRNA-seqとフローサイトメトリーによる解析は静止状態で行われ、ImMクラスターは好酸球の重要なマーカーであるSiglecfを発現しなかった。

遺伝子発現パターンとUMAPの位置によると、SPM集団は単球に関連しているように見えたが、ImM集団はLPMにより密接に関連していた。ヒスタミンはH2受容体を発現する造血幹細胞を調節することが示されており（23）、我々の以前の研究では、骨髄細胞の段階でヒスタミンを介した胃マクロファージの分化が必要であることが示された（31）。LPMは卵黄嚢から発生し、組織常在マクロファージの増殖によって維持されるが、血中循環骨髄前駆体は特定の条件下で腹腔に局在し、LPMに分化することができる(49)。したがって、骨髄前駆体が腹膜マクロファージ集団を継続的に支持しており、ヒスタミン欠乏の骨髄前駆体では異常なマクロファージ細胞が発生し、ImMやLPMへの分化が阻害されている可能性がある。さらに、（骨髄前駆体によって支えられている）SPM集団は、Hdc+/-マウスではHdc+/+マウスに比べて有意に増加していた。このことは、ヒスタミン欠乏下でPMを維持できなくなったために、骨髄前駆体の流入が増加したことを示唆している。対照的に、in vivoのL.monocytogenes感染モデルでは、貪食能の高いHdc+/+ LPMが、侵入した細菌のクリアランスに積極的に参加し、その後、活性化による細胞死が起こることがわかった。LPM集団のこのギャップを埋めるために、Hdc+/+骨髄前駆体はSPMに分化する単球をより多く産生する。

様々な環境条件下で、ヒスタミンを介した様々なタイプの骨髄系細胞へのマクロファージ分化を調べるためには、さらなる研究が必要である。THBS1はGATA6依存性のLPM特異的因子として知られているが(40)、炎症にも関与しており(50)、骨髄由来抑制細胞様のTHBS1-マクロファージサブセットが腫瘍に濃縮されていることが報告されている(51)。我々の結果は、ヒスタミンシグナル欠損がImmM集団におけるTHBS1の高発現をもたらし、ImmMクラスターは炎症関連遺伝子セットのアップレギュレーションも示した。従って、ヒスタミンシグナル経路を標的とすることは、THBS1を阻害することにより、新規の抗炎症治療アプローチとなる可能性がある。

データ利用声明
本研究で発表された原著論文は一般に公開されている。このデータは、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/、GSE232834。

倫理声明
本研究は、延世大学保健システムのIACUCによって承認された。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。

著者貢献
KK：概念化、データキュレーション、調査、プロジェクト管理、原稿執筆、原稿執筆-校閲・編集、形式的解析、方法論、リソース、検証、可視化。DP: 概念化、データキュレーション、調査、視覚化、執筆-原案、執筆-校閲・編集。SC: 概念化、データキュレーション、視覚化、執筆-原案、執筆-レビュー＆編集、形式分析、方法論、リソース、ソフトウェア。YC： データキュレーション、方法論、視覚化、執筆-レビューと編集、検証。BL：方法論、検証、視覚化、執筆-校閲・編集、調査。HJ: 執筆-校閲・編集。YuL：執筆-校閲・編集、調査、検証、視覚化。YoL: 執筆-校閲・編集、方法論、検証、視覚化。KN: 概念化、データキュレーション、資金獲得、調査、プロジェクト管理、監督、執筆（原案）、執筆（校閲・編集）、方法論。

資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および/または出版のために金銭的支援を受けたことを表明する。本研究は、教育部（2017R1A6A3A04009690、2022R1A2C3007850、2022M3A9F3016364）およびKorea Mouse Phenotyping Project（NRF-2016M3A9D5A01952416）により、韓国国立研究財団（NRF）を通じた基礎科学研究プログラムの支援を受けた。

謝辞
言語編集はエディテージ（www.editage.co.kr）により提供された。scRNA-seqサービスについてはMacrogen社に感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が潜在的な利益相反と解釈されうる商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社メモ
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属機関、出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1290191/full#supplementary-material に掲載されている。

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キーワード：ヒスタミン、マクロファージ分化、細菌感染、単一細胞RNAシーケンス、腹膜細胞

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受理された： 2023年9月7日；受理：2023年10月27日；
発行：2023年11月14日

編集：アレクセイ・グラチェフ

アレクセイ・グラチェフ、ロシア癌研究センターNNブロヒン、ロシア
査読者

ファビオ・マルセロ・セルバン、国立コルドバ大学、アルゼンチン
Chi-Ming Li, アムジェン, 米国
Copyright © 2023 Kim, Park, Cho, Lee, Jeong, Lee and Nam. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*Correspondence： Ki Taek Nam, KITAEK@yuhs.ac

これらの著者はこの研究に等しく貢献している。

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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