アリール炭化水素受容体シグナルの障害は、がん悪液質における肝障害を促進する

2023年5月2日 18:21

悪液質・サルコペニア・筋疾患研究会
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アリール炭化水素受容体シグナルの障害は、がん悪液質における肝障害を促進する

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jcsm.13246

Adeline Dolly, Sarah A. Pötgens, Morgane M. Thibaut, Audrey M. Neyrinck, Gabriela S. de Castro, Chloé Galbert, Camille Lefevre, Elisabeth Wyart, Silvio P. Gomes, Daniela C. Gonçalves, Nicolas Lanthier, Pamela Baldin, Joshua R. Huot, Andrea Bonetto, Marília Seelaender, Nathalie M. Delzenne, Harry Sokol, Laure B. Bindels
初出：2023年5月1日
https://doi.org/10.1002/jcsm.13246
Sarah A. PötgensとMorgane M. Thibautは、この仕事に等しく貢献した。
について
セクション

アブストラクト
背景
アリール炭化水素受容体（AHR）は、腸や肝臓で発現し、多面的な機能と標的遺伝子を有しています。本研究では、がん死亡の一因となる炎症性・代謝性症候群であるがん悪液質におけるAHRの関与の可能性を探ることを目的としています。具体的には、AHRを標的とすることで、特に腸-肝臓軸を通じて悪液質を緩和することができるという仮説を検証した。
研究方法
AHR経路は、4種類のがん悪液質実験マウス（C26、BaF3、MC38、APCMin/+）と非悪液質マウス（偽注射マウス、非悪液質誘導[NC26]腫瘍保有マウス）の複数の組織、およびがん患者の肝生検で探索した。悪液質マウスには、AHRアゴニスト（6-formylindolo(3,2-b)carbazole [FICZ]）またはインターロイキン6（IL-6）中和抗体を投与しました。主要なメカニズムは、HepG2細胞を用いたin vitroで検証された。
結果
AHRの活性化は、2つの主要なAHR標的遺伝子であるCyp1a1およびCyp1a2の発現によって反映され、食欲不振とは無関係にすべてのモデル（C26およびBaF3、P < 0.001; MC38およびAPCMin/+、P < 0.05 ）で深く減少していた。この減少は、回腸と骨格筋（P < 0.01; 悪液質前段階）と比較して、肝臓で早期に起こり、悪液質と本質的に関連していた（C26 vs. NC26, P < 0.001）. 我々は、肝臓（IL-6/低酸素誘導因子1α経路を介する）、回腸（インドールAHRリガンドのレベルの低下に起因する）、および筋肉におけるAHR活性化の差変調を実証した。悪液質マウスにおいて、FICZ投与は肝炎を抑制した：タンパク質レベルで同様の傾向を示すサイトカイン（Ccl2、P = 0.005; Cxcl2、P = 0.018; Il1b、P = 0.088 ）の発現、急性期反応に関わる遺伝子の発現（Apcs、P = 0. 040; Saa1, P = 0.002; Saa2, P = 0.039; Alb, P = 0.003), マクロファージの活性化 (Cd68, P = 0.038) および細胞外マトリックスの再構築 (Fga, P = 0.008; Pcolce, P = 0.025; Timp1, P = 0.003) の各遺伝子の発現が見られた。また、悪液質マウスにおいて血糖値の低下が観察され（P < 0.0001）、これはFICZ投与により（P = 0.026）、肝転写による糖新生マーカーであるG6pcの促進を通じて改善した（C26対C26 + FICZ、P = 0.029 ）。驚くべきことに、血糖値異常に対するこれらの効果は、腸管バリア機能不全の改善とは無関係に生じた。がん患者において、G6pcの肝発現は、Cyp1a1（スピアマンのρ = 0.52, P = 0.089）およびCyp1a2（スピアマンのρ = 0.67, P = 0.020）と相関があった。
結論
これらの研究により、AHRシグナルの障害が、がん悪液質を特徴づける肝炎および代謝障害に寄与していることが明らかになり、この文脈における革新的な治療戦略への道が開かれました。
はじめに
アリール炭化水素受容体（AHR）は、肝ホメオスタシスと疾患における機能的役割から近年注目を集めています1。AHRは、肝性異種物質代謝におけるその確立された制御役割以外に、肝臓急性期反応（APR）、線維化、免疫プロセス3、脂肪と筋肉の生物学に影響を及ぼすタンパク質である線維芽細胞増殖因子21（FGF21）の生産阻害にも関与しています4、 S1 AHR核内トランスロケーター（ARNT）と結合することで、複合体AHR/ARNTは、チトクロームP4501A（Cyp1a）ファミリー、特にCyp1a1を含む正規の標的遺伝子の転写を促進します5.
AHRを活性化するリガンドは、様々な内因性または外因性の供給源から得られる可能性があります。腸内細菌は内因性AHRリガンドの主要な供給源です。インドール誘導体を含むいくつかのトリプトファン由来化合物は、トリプトファンの微生物代謝を通じて形成され、in vitroでAHR活性化特性を有することが示されています6、 S2 肝臓には、これらのトリプトファン代謝物以外にも、ビリルビン、ビリベルジン、修飾低密度リポタンパク質など、膨大な量のAHRリガンドが存在する。7, 8 多くの証拠が蓄積されているが、肝疾患におけるAHRの役割は依然として複雑だ。肝 AHR の活性化は、肝疾患の発症を促進（アセトアミノフェンによる急性肝毒性、肝感染、肝細胞癌）または減弱（アルコール関連肝疾患、急性免疫介在性肝炎）します3。肝線維症や非アルコール性脂肪肝炎においては、AHR シグナルの有益および有害の両方の効果に関する証拠があり、依然として議論の余地があります3。
AHRは腸管上皮に広く発現しており、タイトジャンクションタンパク質のアップレギュレーション10、11と炎症マーカーのダウンレギュレーションによりバリアーインテグリティーを促進します12。腸上皮細胞に特異的にAHRを欠損させたマウスでは、腸上皮バリアが破壊され、アルコール関連肝疾患が悪化することから14、肝臓疾患の制御における腸管AHRの重要な役割が浮き彫りになっています。
我々の知る限り、癌性悪液質で観察される変化にAHRが関与している可能性を発見するための研究は、これまで行われていません。この多因子性症候群は、主に骨格筋の消耗による不随意的かつ病的な体重減少を特徴とし15、患者のQOL、がん治療への反応、生存率を低下させます。肝代謝の変化は見過ごされがちで、膵臓がん患者で観察される肝APRの活性化18から、ミトコンドリア機能の変化19、肝脂肪症20、解糖と糖新生の減少21、肝コラーゲン沈着22まで、悪液質モデルで報告されています。私たちのチームは、最近の研究で、悪液質マウスの腸管透過性の増加、腸管通過の促進23、糞便中のトリプトファン濃度の上昇を示し、21 腸肝軸を通じて悪液質症候群にAHRが関与している可能性を提起しています。
本研究では、肝臓におけるAHR活性化の調節が、回腸や他の臓器と比較して異なることを明らかにした。また、癌性悪液質における肝炎と血糖値異常のマスタースイッチとして、腸管透過性とは無関係にAHRが重要な役割を果たすことを明らかにした。
実験手順
細胞培養
悪液質誘導性結腸癌26（C26）細胞、非悪液質誘導性結腸癌26（NC）細胞（TKG0518）およびHepG2細胞（HB-8065）は、10％ウシ胎児血清（Capricorn Scientific, Brazil）、ストレプトマイシンおよびペニシリン（Thermo Fisher, Belgium）を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地で37℃、5％CO2で維持した。
マウス実験
S3 1週間の順化後、雄性CD2F1マウス（7週齢、Charles River Laboratories、イタリア）を体重に基づいて実験グループに割り当て、生理食塩水、C26またはNC細胞（1×106細胞、0.1mL生理食塩水）を皮下に注入した。6-ホルミルインドロ(3,2-b)カルバゾール（FICZ）実験では、細胞注入後1、5、9日目にFICZ（Enzo Life Sciences, Switzerland, 1 μg per mouse）またはビークル（dimethyl sulfoxide [DMSO] 6.7% ）を腹腔内投与した。食物摂取量と体重を記録した。血糖値はグルコースメーター（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）を用いて測定し、剖検前に尾の先端から血液を採取した。門脈と大静脈からの血液サンプルは、麻酔（イソフルランガス、Abbott、ベルギー）後に採取された。組織の重量を測定し、液体窒素で凍結した。すべてのサンプルは、さらなる分析まで-80℃で保存した（補足の実験手順に記載）。追加のマウス実験は、補足的な実験手順に記載されている。
ヒト肝生検の分析
手術中に得られたがん患者の肝生検は、前臨床研究で同定された主要マーカーの遺伝子発現を解析するために、補足的な実験手順の詳細に従って使用されました。
統計解析
統計解析は、GraphPad Prism® for Windows (v.8.01, La Jolla, CA, USA)を用いて実施した。すべてのデータは、D'Agostino and Pearson omnibus normality testを使用して正規性を確認した。データは、2つのグループを比較する場合はStudentのt検定、適切な場合はBonferroniのポストホックテストを伴う一元配置分散分析（ANOVA）またはBonferroniのポストホックテストを伴う二元配置分散分析を用いて分析された。非正規と判断されたデータは、Mann-Whitney UテストまたはKruskal-WallisテストとDunnのポストテストを用いて分析された。外れ値はGrubbsの検定（α = 0.05）を用いて除外した。P≦0.05を統計的に有意とみなした。
結果
がん悪液質前臨床モデルでAHR活性化が低下する
悪性腫瘍マウスの糞便中にはトリプトファンの増加が認められ（図1A）、それに伴いトリプトファン由来の代謝物が減少していた（図1B,C）。また、いくつかのインドール誘導体やAHRアゴニスト（図1D,E）は、悪液質マウスの糞便中で減少した。同時に、主要なAHR標的遺伝子5であるCyp1a1の発現は、悪性腫瘍の食道組織で有意に減少していた（図2A）。このCyp1a1転写物の減少は、他の腸管セグメント（回腸と結腸）および末梢組織、すなわち肝臓、腓腹筋（GAS）、褐色脂肪組織（BAT）、皮下脂肪組織（SAT）でも見られた（図2A）。AHR活性化を反映するCyp1aファミリーのもう一つのメンバーであるCyp1a2については、そのmRNA発現が悪液質肝臓で7倍減少を示した（図2B）。Cyp1a1とCyp1a2の発現量の減少は、他のがん悪液質モデル、すなわちBaF3マウス、MC38マウス、APCMin/+マウスでも確認されました（図2C）。事象の動態を見ると、体重減少や食欲不振の発生前に肝臓でCyp1a1転写物が減少するのに対し、回腸やGASでのCyp1a1の減少は同時に起こるようです（図2Dおよび図S1）。食欲不振の影響を分離するために、2群の健常マウスをCT群（FR-CTマウス）またはC26群（FR-C26マウス）が摂取した餌の量に制限して食餌制限した。食餌摂取量の減少は、悪液質マウスにおける、食道および肝のCyp1a1の調節を完全に再現するものではなかった（図2E）。次に、Cyp1a1の発現低下が悪液質と関連しているのか、より一般的には腫瘍の存在と関連しているのかを明らかにすることを望んだ。この目的のために、悪液質を誘導するC26細胞（C26マウス）、非悪液質を誘導するC26細胞（NCマウス）、偽注射マウス（CTマウス）を接種したマウスを比較検討した。その結果、回腸および肝のCyp1a1の変調は、悪液質と本質的に関連しており、腫瘍の存在だけによるものではないことがわかりました（図2F）。
図1
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図2
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これらの結果を総合すると、がん悪液質前臨床モデルにおいて、食欲不振とは無関係にAHR活性化が低下し、肝臓で早期に発生することが明らかになりました。
悪液質マウスの回腸、肝臓、その他の臓器で、AHR活性化が異なる変調をきたす
AHRアゴニストの細菌産生の減少は、腸におけるAHR活性化の変調を論理的に説明するものである。しかし、大静脈、門脈、肝臓ではそのようなAHRアゴニストの減少は観察されなかった（図S2）ため、末梢臓器、特に肝臓におけるCyp1a転写物の減少を説明するための他の仮説を探ることになった。
アリール炭化水素受容体抑制因子（AHRR）とTCDD誘導性ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（TIPARP）は、AHRシグナルの負の制御因子として記述されている10。TIPARPはAHRをモノ-ADP-リボシル化してタンパク質分解に導き、一方AHRRはAHRのトランス活性を低下させる10、S4 AHRRは、悪性マウスの肝臓で発現量が変化しないことから、置いておいた（図S3A).。その結果、悪性腫瘍マウスの肝臓ではTiparpが誘導されていることがわかった（図S3B-E）。しかし、AHRタンパク質の発現は、悪性腫瘍マウスの肝臓で変化しなかった（図S3F）。したがって、TIPARPは分解を誘導することによってAHR活性化の減少に関与していないと結論づけた。
低酸素誘導因子1α（HIF1α）は、ARNTへの結合をAHRと競合させ、AHR/ARNT複合体の破壊とAHR転写活性の阻害につながる可能性がある。実験的に決定したHIF1α標的遺伝子リスト25を用いて過剰発現解析を行ったところ、C26肝トランスクリプトームで発現が上昇した遺伝子の中にHIF1α標的遺伝子が濃縮されていることがわかった（図3A）。したがって、悪液質肝臓において、悪液質と本質的に関連する主要なHIF1α標的（Hif1a、Serpine1およびDdit4）の発現増加が観察された（図3BおよびS4A）。このHIF1α標的発現の肝修正は、他の動物モデル（MC38およびAPCMin/+、図S4B、C）でも検証された。HIF1α経路のアップレギュレーションが、肝臓におけるAHR活性化の減少の原因となり得るかどうかを調べるために、最も使用されているヒト肝臓ベースのインビトロモデルの1つであるHepG2細胞をデスフェリオキサミン（DFO）で処理しました。この鉄キレート剤は、HIF1αのタンパク質分解を阻害することにより、HIF1αの活性化を模倣する27。処理した細胞では、HIF1α標的遺伝子の発現が増加し、Cyp1a1およびCyp1a2の発現が減少することが確認された（図3C）。これらの結果は、HIF1αがCyp1a1およびCyp1a2発現の調節因子であり、それによってAHR活性化の調節因子であることを実証している。興味深いことに、ARNTタンパク質の発現はC26肝臓で変化しないままであり（図3D）、これはARNTの分解ではなく、AHR/ARNT複合体の破壊という仮説に合致する。AHRとARNTの直接的な相互作用を調べるために、いくつかの共免疫沈降アッセイが実施された。しかし、これらのアッセイは、マウス肝臓におけるAHRの内因性発現レベルが低いため、結論が出ないことが証明された。
図3
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インターロイキン-6（IL-6）/シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子3（STAT3）経路は、HIF1αシグナルの活性化を促進することができる28。同様に、悪性腫瘍マウスの肝臓でSTAT3リン酸化の増加が観察され（図S4D）、STAT3経路の活性化を証明する。HIF1αシグナルの誘導におけるIL-6の役割を評価するために、悪性腫瘍マウスを中和IL-6抗体で処理した。このような処置は、3つのHIF1α標的の発現レベルを打ち消し、Cyp1a1の発現レベルを部分的に回復させた（図3E）。これらの結果から、IL-6/HIF1α経路は、Cyp1a1遺伝子の発現を制御し、それによって悪液質マウスの肝臓におけるAHR活性化を制御する重要なメディエーターであることが判明した。
その他の組織については、HIF1α標的遺伝子のmRNA発現は、悪性腫瘍マウスの回腸およびGASにおいて概ね変化していない（図S5A）。さらに、抗IL-6抗体の投与は、回腸とGASの両方においてCyp1a1の発現に影響を与えなかった（図S5B）。
これらの結果から、回腸ではおそらく細菌性AHRリガンドによって、肝臓では少なくとも部分的にIL-6/HIF1α経路によって、そして悪性腫瘍マウスの他の臓器ではAHR活性化の調節が異なっていることが判明した。
AHRアゴニスト投与は、骨格筋の萎縮と腸管透過性の変化を軽減させない
次に、CTマウスおよびC26マウスを薬理学的AHRアゴニストであるFICZで処理し13,S6、悪液質特徴に対するAHR経路の寄与を明らかにした。悪液質マウスでは、体重、摂餌量、GAS、SAT、BATの重量がCTマウスと比較して減少していたが、FICZ投与はこれらのパラメータに影響を及ぼさなかった（図S6）。肝臓重量は、グループ間で変化しなかった（図S6）。
様々な研究により、腫瘍のAHR発現量が高く、腫瘍の種類によってAHRの腫瘍促進または腫瘍抑制の役割が示されている29, 30ここで、C26およびC26-FICZマウスは、腫瘍重量、腫瘍のCyp1a1およびがん悪液質の発症に関与することが知られている炎症性サイトカインのmRNA発現レベルに関して差がない31, 32（図S7）。
FICZは、回腸、結腸およびGASにおけるCyp1a1の発現を改善し（図4A、BおよびS9A）、悪液質マウスの肝臓におけるCyp1a1およびCyp1a2の発現を改善し（図5A）、AHRアゴニストとしての有効性を実証した。FICZ処置は、腸透過性の変化（FITC-デキストランアッセイにより証明、図S8）および腸バリア機能のマーカーの発現低下（図4C，D）を軽減しなかった。また、筋肉における萎縮と炎症のマーカーの誘導を防ぐことはできなかった（図S9B〜F）。C26マウスでは、筋肉組織においてトリグリセリドレベルが変化しなかったため、筋肉内脂肪蓄積（骨膜症）の兆候を見出すことはできなかった（図S9G）。C26マウスの骨格筋において、FICZ処理とは無関係に、健常対照と比較して筋線維面積、中心核を有する線維の割合、またはコラーゲン含有量に変化がないことを確認した（図S10）。
図4
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図5
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また、FICZの投与がFGF21レベルを低下させるかどうかについても、後の脂肪熱産生を活性化する能力S1や、がん悪液質の2つの特徴である筋肉減少を促進する4ことを考慮して調べた17。悪液質やFICZが肝Fgf21 mRNA発現レベルや肝および血漿FGF21レベルに対して影響を及ぼすことは見られなかった（図S11）。
全体として、これらの結果は、FICZによるAHRの薬理学的活性化が、骨格筋萎縮および腸管バリア機能不全に対する保護効果を発揮しないことを示す。
AHRアゴニスト投与により、悪性腫瘍マウスの肝炎と血糖値異常が改善される
次に、FICZ投与が肝変化に与える影響について評価した。肝炎（Il1b、Ccl2、Cxcl2）、APR（Apcs、Saa1、Saa2、Alb）、マクロファージ活性化（Cd68）、細胞外マトリックス沈着とリモデリング（Fga、Pcolce、Timp1）、好中球接着（Icam1）に関わる遺伝子の発現がC26マウスと比較してC26-FICZマウスでは改善した（図5B-E）。また、FICZ投与は、インターロイキン-1β（IL-1β）の肝レベルを効率的に低下させ、有意ではないがIL-6とCXCL2の肝レベルにプラスの影響を及ぼした（図5F）。核因子-κB（NF-κB）またはSTAT3はIcam1転写の活性化因子として記載されていることから、FICZによるIcam1遺伝子発現の調節を媒介するかもしれないと仮定したS7。しかし、FICZ処置はSTAT3およびNF-κB核移行およびリン酸化に影響を与えなかった（図S12）。対照的に、肝炎（Cxcl1）、好中球の接着とリクルート（Vcam1およびMmp8）、マクロファージマーカー（Cd163およびAdgre1）、肝星状細胞の活性化（Acta2）および細胞外マトリックスの分解（Cx3cr1、Mmp9およびMmp12）に関わる他の遺伝子の発現はC26-FICZマウスでは変わらなかった（図5B-E）。一貫して、肝臓切片におけるAdgre1遺伝子によってコードされるマウスマクロファージの主要なマーカーであるF4/80タンパク質の陽性領域は、CTマウスと比較して、C26マウスで増加したが、C26-FICZマウスでは変わらなかった（図S13A,B）。それにもかかわらず、悪性腫瘍マウスは、ヘマトキシリンとエオシン（H&E）およびシリウスレッドベースの組織学的検査で明白な肝炎および線維化を示さず（図S13C-G）、これは肝炎の初期段階と一致するものである。 S8 炎症性サイトカインの血漿レベルを測定したところ、CTマウスと比較して悪液質マウスではIL-1β、IL-6、インターロイキン-10（IL-10）およびC-X-Cモチーフケモカインリガンド1（CXCL1）（IL-8のマウスオルソログ）の増加が認められた（図S14）。FICZ処置は、CXCL1のみの血漿レベルを有意に低下させ、AHR活性化の抗炎症作用は大部分が肝臓に限定されることを示唆した。全体として、これらのデータは、FICZ処置が悪液質マウスの肝臓の炎症を部分的に打ち消すことを示す。これらの結果は、2つ目の独立したin vivo実験でも確認され、我々の知見の頑健性が実証されました（図S15）。
私たちのチームの以前の研究で、肝グルコネーシスにおけるダウンレギュレーションが示されたことから、アミノ酸は主にグルコネーシスの燃料としてではなく、肝臓による急性期のタンパク質合成に使用されることが示唆された21。同時に、悪液質マウスでは、グルコネーシスに関わる主要遺伝子（G6PCとPck1）の発現障害に関連した血糖値の低下が観察された。FICZ投与により、血糖値と肝G6pc mRNA発現量が増加し、両パラメータは有意に相関した（図6A-C）。また、MC38マウスおよびAPCMin/+マウスの肝臓では、G6pcの発現が低下し、AHR活性化マーカーであるCyp1a1およびCyp1a2と強く相関しており（図S16A-D）、AHR活性化と糖新生に密接な関係があることが明らかにされた。
図6
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FICZ処理によるAHR活性化がC26マウスの糖新生に及ぼす影響を説明するために、いくつかの仮説を検討した。まず、CiiiDERを用いてマウスG6pcプロモーターの解析をインシリコで実施した。その結果、マウスG6pcのプロモーター領域にはAHR結合部位が見つからず、この仮説は否定された。次に、HIF1αの活性化はAHRの活性化を抑え、AHRの活性化はG6pcの発現を促進することから、HIF1αの活性化はG6pcの発現を抑制すると仮定した。その結果、DFOによるHepG2細胞の処理は、G6pc mRNA発現を減少させる傾向があり（図S16E）、おそらくAHR活性化の調節を介して、HIF1αと肝グルコネシスの間の関連性が明らかになった。第三に、AMPKの過剰発現は肝グルコネージョンの抑制と関連していることからS9、FICZによるG6pc発現の調節を媒介できるかどうかを調べたが、AMPKおよびそのリン酸化型のタンパク質発現レベルに対する処理の効果は認められなかった（図S17）。
次に、悪液質マウスで起こり、FICZによって是正される炎症および代謝の変化が、悪液質と本質的に関連していることを検証した（図S18）。以上のことから、この最後の一連の解析は、AHR活性化が悪液質マウスの肝臓で治療効果を発揮し、AHR経路の変化ががん悪液質における肝炎および血糖値の変化に強く寄与することを明確に示しています。
AHRの活性化は、がん患者の肝生検における糖新生マーカーの発現と相関する
最後に、今回の知見のトランスレーショナルバリューを探るため、がん患者から採取したヒト肝生検におけるCyp1a1、Cyp1a2、G6pcの発現を分析した。その結果、これらのマーカーには強い相関があることがわかりました（図6D）。
考察
がん悪液質は、特にがん罹患率の上昇に伴い、世界的に大きな公衆衛生上の懸念となっている。この複雑な多因子性症候群が未治療のままであるため、患者のQOLや生存率は低下し、がん治療への反応も危うくなる。骨格筋や脂肪組織以外に、腸や肝臓もがん性悪液質に深く影響されますが、科学研究や臨床の現場ではまだ見過ごされています。今回、我々は、複数のがん悪液質モデルにおいて、AHRの活性化が深く損なわれていることを初めて明らかにした。この低下は、食事摂取量とは無関係に起こり、悪液質と本質的に関連している。我々は、肝臓、回腸および他の臓器におけるAHR活性化の差異的調節、ならびに肝炎および血糖障害に対するAHR活性化の有益な効果について報告する。興味深いことに、この最後の側面は、我々のパイロット臨床分析によって支持されています。
驚くべきことに、肝機能の変化の抑制は、腸のバリア機能の改善とは関連していません。一方、この結果は、AHR活性化物質であるインドール投与が、腸から離れた場所で抗炎症作用と肝保護作用を有することを示した我々の研究室の以前の観察と一致している33、34。他方、これは、FICZ投与が、炎症性腸疾患35、メタボリック症候群13、腸閉塞に伴う腸壁機能不全を修正するのに十分であると報告した以前の研究とは異なる36。この食い違いは、腸壁機能変化の原因との関連が考えられる。実際、腸の炎症とHIF1αは、腸上皮のタイトジャンクションタンパク質の主要な制御因子として記述されている37。しかし、C26悪性腫瘍マウスは、局所的に腸の炎症反応を示さず23、回腸のHIF1α標的遺伝子が増加しないことから、両因子の関与はないと考えられる。我々の研究は、癌性悪液質における腸管バリア機能の変化について、AHRが関与していない別の原因がある可能性を提起しており、腸管バリア機能を回復させることで利益をもたらす可能性があるため、さらに調査する必要があります38。
我々の結果は、悪液質マウスの肝臓におけるAHR活性化の主要なメディエーターとしてIL-6/HIF1α経路を特定した。ARNTは、AHRとHIF1αの両方のDNA結合パートナーとして記載されている。したがって、悪液質肝臓におけるHIF1α経路のアップレギュレーションは、ARNTへの結合をAHRと競合させることにより、AHR活性化の減少に関与していると考えられる。C26マウスにFICZを投与すると、2つのHIF1α標的であるSerpine1およびDdit4の肝発現レベルが部分的に打ち消される（図S19）。FICZの投与によりバランスが変化し、おそらくHIF1α/ARNT複合体の破壊とHIF1α転写活性の低下をもたらすと考えられ、これは我々の仮説に合致している。HIF1はがん化学療法の有望な標的として提案されているので、39,S10,S11、HIF1の薬理学的阻害剤による治療が、抗がん効果を超えて、AHR活性化を促進し悪液質を緩和することができるかどうかを評価することは興味深いことであろう。
AHRアゴニスト治療による肝障害の軽減は、肝臓への直接作用に起因すると思われます。興味深いことに、我々は、代謝性脂肪肝疾患におけるインドールサプリメント投与後に、肝臓マクロファージおよびマクロファージのリクルートに関与するサイトカインに対する効果も観察しています。AHRの活性化は、肝臓でサイトカインによって誘導されるAPRを直接抑制することができるため40、AHRを介した抑制は、糖新生を促進し、低血糖に対抗するためのアミノ酸の利用を促進すると考えられます。これらの結果は、AHRが中心的な役割を果たし、糖新生を犠牲にして急性期タンパク質を生産するためにアミノ酸を使用する代謝的なシフトを示唆している。AHRアゴニストを投与したCTマウスでは、抗炎症作用や高血糖が観察されなかったことから、このメカニズムは悪液質マウスに特異的である。癌性悪液質においてAHRがどのように肝グルコネーションを改善するのかを明らかにするためには、さらなる研究が必要であろう。
AHR経路は、肝疾患において細胞種特異的な制御作用を持つ可能性があることが、最近のレビューで概説されています3。既存のデータセット41を用いると、AHRタンパク質は主に肝星状細胞で発現し、さらに肝類洞内皮細胞、クッパー細胞、胆管細胞および肝細胞でも少量ながら発現することがわかりました。このような肝細胞のサブタイプにおけるAHRの発現の差は、FICZ投与により肝炎に関与するいくつかの遺伝子の肝発現が改善され、他の遺伝子の肝発現が改善されないことの説明となりうる。
この結果は、膵管腺癌の悪液質患者のSATにおいて、非癌患者と比較してAHRシグナルの有意な阻害を報告したNarasimhanらの結果を裏付けるものであり42、ヒト悪液質の文脈におけるAHRシグナルの障害の関連性を確認するものです。今回の結果は、悪液質症候群におけるAHRの潜在的な関与を探ることを目的とした、さらなる研究の基礎となるものである。AHRとミトコンドリアのクロストークは文献で報告されています43。簡単に説明すると、AHR-/-マウスでは野生型マウスに比べて基礎ミトコンドリア活性酸素種（ROS）レベルが低く、マイトファジーによる損傷ミトコンドリアの除去はin vitroでのAHRノックダウンにより減少することが示されました。悪液質症候群では、いくつかの臨床および前臨床研究で、骨格筋15と肝臓でミトコンドリアが変化していることが示されていますが19、悪液質の文脈でミトコンドリアに対する異なるAHRモジュレーターの影響については、これまで調査されていません。AHRは悪液質マウスのすべてのモデルで広く抑制され、組織で異なる調節を受け、多面的な機能と標的遺伝子を持っていることを考えると、これは悪液質発生におけるAHR経路の細胞特異的役割をさらに明らかにする有望な研究軸となる可能性があります。
AHR活性化欠損を是正すると、肝悪液質特徴が改善され、悪液質マウスの筋肉萎縮には影響がない。しかし、FICZが筋肉機能に有益な影響を与えることを否定することはできない。S13,S14この「中等度悪液質」段階は、筋肉の組織学的およびトリグリセリド含量に明らかな変化が見られなかった理由を説明するかもしれませんS15。
骨格筋の衰えはがん悪液質の重要な特徴であるため、現時点では、悪液質患者に直接AHRアゴニストを単独で投与することの有用性を支持する結果にはなっていない。しかし、最近の悪液質症候群の治療法としては、栄養補給に運動や薬物療法を組み合わせた複合的なアプローチが行われています。AHRアゴニストを産生することが知られているLactobacillus reuteri、あるいは他の直接的なAHRリガンドであるトリプトファン誘導体やインドールが、動物モデルにおいてメタボリックシンドローム13やアルコール誘発肝障害9を改善することが示されていることから、AHR活性化を促進するプロバイオティクス的アプローチや栄養アドバイスは、がん悪液質に対する複合的アプローチの新しい治療要素になる可能性があります。
結論として、本研究は、癌性悪液質において、肝臓は他の臓器と比較して、AHR活性化が深く損なわれ、異なる変調を来していることを明らかにした。AHRの薬理学的活性化は、腸管バリア機能障害の改善とは別に、悪液質マウスの肝炎と血糖値障害の改善を媒介するのに十分であった。現在、がん性悪液質を改善する治療法は承認されていないため、今回の知見は、がん性悪液質を改善するための新たな戦略を開発する上で非常に重要であると考えています。プロバイオティクスや栄養学的アプローチを用いてAHRの活性化を促進することは、がん性悪液質を治療または予防するための新しい補完的な治療手段の開発において有望であると考えられる。
謝辞
Bouazza Es Saadi、Isabelle Blave、Martin Nicolasの熟練した技術支援に感謝する。Sébastien Pyr dit Ruys氏には、共免疫沈降アッセイに関する助言をいただいた。また、Caroline Bouzin博士とIREC Imaging Platform (2IP)の組織学的分析への協力、Ana Beloqui教授のMeso Scale Discoveryマイクロプレートリーダーへのアクセスに感謝する。また、マウス実験時のSabrina En Nouaimyの協力に感謝する。本原稿の著者は、Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle.S17の著者資格および出版に関する倫理ガイドラインを遵守していることを証明する。
資金調達情報
この研究は、Fonds De La Recherche Scientifique - FNRS (F.R.S.-FNRS) の Grant MIS F.4512.20 の支援を受けています。LBBはCollen-Francqui Research Professorであり、Fonds Spéciaux de la Recherche (FSR, UCLouvain, including the Action de Recherche Concertée LIPOCAN [19-24.096]), Télévie, the Walloon Region in the funding of the strategic axis FRFS-WELBIO (40009849), Excellence of Science (EOS) program (40007505) and the Fondation Louvainからの補助金を受けている。NMDはF.R.S.-FNRS（PINT-MULTI R.8013.19 [NEURON-ERANET, call 2019] and PDR T.0068.19）の助成金を受給しています。MMTは、Fonds pour la Formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (FRIA, F.R.S.-FNRS) から研究フェローとして参加した。ABは、米国癌協会（Research Scholar Grant 132013-RSG-18-010-01-CCG）および国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所（R01AR079379）から資金提供を受けました。JRHは、米国国立衛生研究所（NIH）のT32 Institutional Training Grant（AR065971）の支援を受けています。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、結果の解釈、発表の決定、原稿の作成に関与していない。
利益相反の声明
著者らは、本研究が潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
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