若齢マウスと高齢マウスの間で糞便微生物叢を交換すると、腸、目、脳の老化の特徴が回復することを発見
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公開日：2022年4月29日
若齢マウスと高齢マウスの間の糞便微生物叢の移行は、腸、眼、脳の老化の特徴を逆転させる
Aimée Parker, Stefano Romano, ...Simon R. Carding 著者紹介
Microbiome 10巻 記事番号：68 (2022) この記事を引用する
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指標詳細
概要
背景
晩年における腸内細菌叢の組成の変化は、炎症、組織機能の低下、および神経変性認知症を含む加齢に伴う慢性疾患への罹患率の上昇と関連している。ここでは、腸内細菌叢の操作が、加齢に伴う主要な併存疾患、特に脳や網膜に影響を及ぼす炎症の発症に影響を及ぼすという仮説を検証した。
研究方法
糞便微生物叢移植法を用いて、若齢（3ヶ月）、老齢（18ヶ月）、高齢（24ヶ月）のマウスの腸内細菌叢を交換した。ホールメタゲノムショットガンシーケンスとメタボロミクスを用いて、カスタム解析ワークフローを開発し、腸内細菌叢の組成と代謝能の変化を解析した。腸管バリア、網膜、脳に対する年齢と微生物叢の移入の影響を、タンパク質アッセイ、免疫組織学、行動学的検査を用いて評価した。
研究成果
若齢マウスと高齢マウスの間で、FMTにより微生物叢組成プロファイルおよび若齢マウスに濃縮された主要種の移行が成功し、FMTが結果として代謝経路プロファイルを調節することを示した。加齢ドナーの微生物叢を若齢マウスに移植すると、加齢に伴う中枢神経系（CNS）炎症、網膜炎症、サイトカインシグナルが加速され、目の主要機能タンパク質の損失が促進され、その影響は腸管バリアの透過性上昇と同時に起こる。逆に、これらの有害な影響は、若いドナーの微生物叢を移植することによって逆転させることができる。
結論
これらの知見は、加齢に伴う腸内細菌叢が腸-脳および腸-網膜の軸に有害な変化をもたらすことを示しており、微生物の調節が晩年の炎症関連組織の衰退を防ぐ上で治療上有益である可能性があることを示唆している。
動画抄録
図解抄録
背景
加齢は、細胞、組織、臓器の機能低下と、慢性疾患や衰弱性疾患に対する感受性の上昇を特徴とする。特に、代謝異常の影響を受けやすい中枢神経系（CNS）や眼の組織、そして、環境からの刺激に常にさらされながら、急速な細胞のターンオーバーとバリアーの完全性を維持しなければならない消化管（GI）上皮バリアは脆弱です[14, 85]。
細菌、ウイルス、真菌、原生動物、および古細菌からなる腸内細菌叢は、宿主の免疫系および腸管上皮バリアの発達および維持に重要な役割を果たし、宿主の生涯にわたる健康に寄与する [111]。加齢に伴い、腸内細菌叢の構造と機能に変化が生じ、高齢者のサンプルでは、異なる分類群の割合の変化、個体間変動の増大、および多様性の変化が認められる。これらの変化は、宿主の代謝や免疫に悪影響を及ぼし [25,26,27, 40, 64, 86, 110, 112, 118] 、心血管、自己免疫、代謝、神経変性疾患の発症と関連している [17, 90, 122, 132]。
加齢のハエおよび魚モデルにおける微生物叢の移転研究は、微生物叢が寿命および加齢に伴う疾患発症の制御に直接関与していることを示唆している。加齢ハエのホモジネートを与えた若いハエは、若い動物のホモジネートを与えたハエと比較して、著しく寿命が短く、腸管バリア機能不全の発生率が高かった[27]。短命のアフリカメダカでは、若いドナーの微生物叢を高齢の個体に移植すると、行動低下が改善され、寿命が延びた[110]。同様の有益な効果は、若いマウスから微生物叢を受け取った高齢マウスで、寿命の延長 [8, 61] や粘膜免疫系の機能低下を食い止める [112] ことが報告されている。
加齢や炎症によって悪影響を受ける主要な器官系の1つが脳であり、腸内細菌が様々なメカニズムで脳の健康に影響を与える「マイクロバイオータ-腸-脳軸」の証拠を示す様々な研究ラインが存在する。これには、宿主の複雑で連動したホルモンシグナル伝達、免疫シグナル伝達、神経シグナル伝達ネットワークが含まれ、これらは腸内細菌産物によって調節され、その結果、腸内細菌叢の組成と機能を変更することができる [90]. 特定の腸内細菌叢プロファイルとヒトの様々な疾患との関連を示す配列決定研究、及びプロバイオティクス投与又は微生物叢移植によって動物モデルの腸内細菌組成を変更する研究は、神経炎症及び行動障害を含む全身の恒常性の主要制御因子として腸内細菌叢を示唆している［16、106］。1つの可能性として、腸内細菌叢の組成または機能の変化が、正常な腸管上皮バリア機能の低下を誘発または助長し、その結果、体内の様々な組織に有害な影響を及ぼす全身性の慢性炎症が促進されるというシナリオが考えられる。加齢に伴い、腸内細菌叢の多様性、組成、機能に有害な変化が生じると、中枢神経系における神経炎症および機能低下が促進される可能性がある。
高齢の消化管では、上皮および粘膜細胞のターンオーバー、完全性および機能 [32, 36, 76, 83] の低下により、上皮バリアの透過性が高まり [19, 75, 118, 120] 、内腔の微生物および食物抗原が循環に入り込む可能性が高くなることがある。このことは、免疫細胞の機能低下や免疫老化と相まって、「炎症老化」と呼ばれる全身性炎症の上昇状態を促進し [39, 40, 118]、老齢期の腸や中枢神経系の機能低下を助長する [10, 13, 48]。
脳では、ミクログリア細胞が炎症反応と神経機能の調節に複数の役割を担っており、現在では神経変性疾患の病態の中心的存在と考えられている[48]。無菌マウス、抗生物質処理、選択的微生物コロニー化を用いた研究により、腸内細菌叢が腸および中枢神経系におけるミクログリアの成熟と機能を制御できることが示唆されている [37, 54]。アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、微生物を調節すると病態が減退することも、脳内の炎症における微生物叢の役割を裏付けている[57, 115]。
CNSの延長線上にある眼は、酸化ストレスを引き起こす紫外線や加齢に伴う免疫異常などの複数のストレス因子にさらされており、老年期の循環や代謝の変化から生じるエネルギー不足に脆弱である [72]。加齢に伴い、眼の外側の網膜は、炎症の増加とアミロイド種を含む細胞外の破片の広範な沈着を示す[55, 88]。加齢黄斑変性症（AMD）は、慢性炎症 [29, 65] および糞便中の微生物代謝物プロファイルの変化 [100] と関連しています。また、微生物組成の変化は、網膜疾患モデルにおける新生血管形成および免疫細胞の活性化とも関連している[4, 50, 99]。
年齢による微生物叢組成の炎症への影響と、腸、脳、網膜への影響を調べるため、若齢（3ヶ月）、老齢（18ヶ月）、高齢（24ヶ月）のマウスを使用した。異なる年齢層の微生物叢（ヘテロクロニック）の糞便微生物叢移植（FMT）を受けたマウスと、同じ年齢層の微生物叢を受けたマウス（同齢FMT）を比較しました。対照動物には、抗生物質のみ（抗生物質投与対照）またはPBSのみ（経口投与/処置対照）を投与した。脳と網膜の炎症と機能の全身および組織特異的バイオマーカー、腸管上皮バリアの完全性、循環炎症マーカー、行動への影響を比較検討した。本研究では、異なる年齢群の微生物叢に対する業者の影響が交絡するのを避けるため、同じコロニーで飼育され、寿命まで同じ環境で維持された3つの異なる年齢のマウスを使用しました。重要なことは、解析において、潜在的なケージ群や住居の影響も考慮したことである。
我々は、若齢マウスと高齢マウスの間のFMTが、レシピエントの微生物叢組成をドナーに似た組成に置き換え、特定の細菌種に富み、得られた腸内微生物組成の代謝能を変化させることを示した。その結果、老化した微生物叢は、腸管バリア透過性の変化と並行して、脳のミクログリア活性化、眼の炎症と機能性タンパク質発現の有害な変化を仲介することが明らかになった。また、加齢に伴う炎症性変化は、若いドナーの微生物叢を移植することで抑制された。
実験方法
実験モデルの詳細
マウス
すべてのマウスは、イースト・アングリア大学（UEA）の疾患モデリングユニット施設において、特定病原体フリー（SPF）条件下で飼育・維持され、1ケージあたり3～5匹のマウスを個別換気ケージに収容して使用した。マウスは標準的なチャウ食と水を自由摂取し、12時間明期：12時間暗期のサイクルで維持された。本研究では、3ヶ月、18ヶ月、24ヶ月の雄のC57BL/6Jマウスを使用し、すべて同じ部屋で飼育した。すべての実験は UEA Animal Welfare and Ethical Review Body によって承認された。
実験手順
微生物叢の移植
若齢（3ヶ月）、老齢（18ヶ月）、または高齢（24ヶ月）の雄マウスのグループを、実験開始の2週間前に実験ケージにランダムに再割り付けした。抗生物質／糞便微生物移植（FMT）介入用に指定された7匹のマウス群（図1A参照）は、ケージ占有率の制限のため、3匹または4匹の群として副飼育された。PBSのみの群も、必要に応じて3、4、または5人の群に分宿させた。微生物叢の調節は、単にマウスの異種群を同居させることによって誘導することができる［112］；しかしながら、我々は、ドナー微生物叢の移植の可能性を最大限にするために、事前に抗生物質カクテル投与によってホスト腸内細菌叢を枯渇させることを選択した。既存の微生物叢は、3日間の広域抗生物質カクテルの投与により枯渇させた。このとき、他の抗生物質は飲料水（アンピシリン1g/L、ネオマイシン0.5g/L）で供給できたが、味気ない抗生物質（バンコマイシン100μL、5mg/mL、メトロニダゾール10mg/mL）は経口投与で併用した。抗生物質洗浄後、レシピエントは汚れた寝具と糞便ペレットを含むヘテロクロニックドナーケージに再収容され、糞便スラリー調製物を72時間間隔で2回経口投与してヘテロクロニックドナー微生物叢を供給された。Pre-AbxサンプルとFMTスラリーは、Pre-Abx時点で採取したペレットから調製し、サンプルの半分はシーケンスに送り、半分はスラリーの調製に使用したという点で同等である。糞便スラリーは、Pre-Abxドナーマウスから、年齢群ごとに、1ケージあたり2匹のマウス（各ケージ内でランダムに選択）から糞便ペレット材料をプールすることにより調製された。したがって、若年ドナーの微生物相は、10ケージにわたって収容された37匹のマウスのうち20匹を表すプールであり、老齢ドナーの微生物相も、10ケージにわたって収容された34匹のマウスのうち20匹を表すプールであった。高齢者プールについては、4ケージにわたる16匹のマウスすべてからペレットが含まれていた。各マウスは、各給餌時に100μLの糞便スラリー調製物を受け取った。ペレット収集時に、マウスを個々の無菌箱に分け、ケージに戻る前に2つのペレットを収集した。図5に表されるPre-Abxサンプルは、各個体のマウスからの2つの糞便ペレットのうち1つを配列決定した結果を示している。糞便スラリーは、これらの同じマウスのランダムなサブセットからの2つ目のペレットを組み合わせることによって製造されたものである。このペレットは、各年齢群の「ベースライン」組成として、FMTのドナーペレットとして同じペレットを供給されたマウスの組成を表している。3ヶ月齢および18ヶ月齢のマウスでヘテロクロニック輸送を受けた対照群は、PBSのみのギャベッジ、抗生物質処理/PBSギャベッジのみ、および同齢（同じ年齢群のドナープール）汚れたケージとギャベッジを受けた群であった。24ヶ月齢のマウスの入手が困難なため、この年齢群ではヘテロクロニックFMTと無輸送対照のみが可能であった。汚れた寝具の移送は3日おきに繰り返した。糞ペレットは、「Pre-Abx」、「Post-Abx」、「Post-FMT」（移送後7日）、および「end」（移送後18日）の時点で配列決定のために収集した（図1Bを参照）。ペレットは、4つの時点で全てのマウスから、一人用の滅菌箱に簡単に分離した後、滅菌ピックとDNA/RNAフリー滅菌マイクロチューブを用いて収集し、DNA抽出まで-80℃で保存した。NMR分析では、「終了」時点のペレットサンプルを使用した。血液と組織も実験終了時に採取した。糞便ペレット、血液、組織の採取およびFMT介入は、摂食および微生物叢／代謝物組成の概日リズム変動を考慮し、すべてのケージで同じ時間帯に実施された。
図 1
図1
実験概要。Aマウスのグループ分け、B微生物叢移植の時系列概要。若齢（3m、青）、老齢（18m、白）、高齢（24m、オレンジ）のSPF C57BL/6雄を、実験開始2週間前に年齢群別に実験ケージに無作為に割り付けた。3日間の抗生物質カクテル（Abx; 経口ガベージと飲料水）により、既存の微生物相を枯渇させた。抗生物質洗浄後、レシピエントは汚れた寝具と糞便ペレットを含むドナーケージに再び収容され、3ヶ月、18ヶ月、24ヶ月齢のドナーの糞便スラリー調製物を経口摂取することによりドナー微生物叢を2回投与された。抗生物質投与群は元のケージに戻し、FMTは行わなかった。
フルサイズ画像
メタゲノムライブラリーの調製と塩基配列の決定
糞便サンプルからゲノムDNAをFastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) を用いて分離し、Qubit dsDNA BR Assay KitおよびQubit 3.0 fluorimeter (Invitrogen) を用いて定量、5 ng/μLに正規化した。Illumina Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina)を用いて小型化した反応をセットアップした。0.5 μL Tagmentation Buffer 1 (TB1) と 0.5 μL bead-linked transposomes (BLT) および 4.0 μL PCR-grade water をマスターミックスし、5 μL をチルド 96-well プレートに添加した。2μLの正規化DNA（合計10ng）をタグメンテーションミックス5μLとピペットで混合し、55℃に15分間加熱した。PCRマスターミックス（Kap2G Robust PCR kit, Merck）にP7およびP5 Nextera XT Index Kit v2インデックスプライマー（Illumina）およびタグメンテーションミックスを組み合わせ、PCRにより増幅した。ライブラリーはQuant-iT dsDNA Assay high-sensitivity kit (Invitrogen) を用いて定量し、GloMax® Explorer Multimode Microplate Reader (Promega) 上で実行した。ライブラリーは、定量後、等量でプールした。最終プールは、KAPA Pure Beads (Roche) を用いて 0.5 ～ 0.7× ビーズ容量の間でダブルSPRI サイズ選択し、Qubit 3.0 蛍光計で定量し、D5000 ScreenTape システム (Agilent) で Agilent Tapestation 4200 を用いて実行して最終ライブラリープールモル比を算出した。"Kitom "コントロール（すべてのサンプルと同じDNA抽出プロセスを経た水とPBSコントロール）は、DNA抽出プロセスとともに含まれたが、これらのコントロールサンプルはその後、利用可能な入力材料が非常に少ないためにライブラリ調製ステップで失敗した。このことから、このキットに起因するDNA汚染は、その後のメタゲノム解析に重要な意味を持たなかったか、あるいは不十分であったことが示唆される。ライブラリーは、英国Novogene社のNGS Illuminaシークエンスにより、10Gbp/サンプルの深さで配列決定されました。サンプルごとのリード数を補遺図S6に示す。
メタゲノム配列データの処理
生シーケンスリードをphred 20の品質にトリミングし、BBDuk v38.76 (sourceforge.net/projects/bbmap/) [20] を用いてアダプターおよびPhiX Illumina標準を除去した。Human read contaminationは、BBMap v38.76とBrian Bushnell (https://zenodo.org/record/1208052#.X9DiS6r7SHw)がリリースしたhg19データセットのマスクをかけたリファレンスを用いて除去しました。マウスゲノム（Mus musculus GRCm38）にマッピングされたリードは、BBMap v38.76 (parameters: minid=0.95; maxindel=3; bwr=0.16; bw=12; quickmatch; fast; minhits=2)で除去しました。MetaPhlAn (v3.0.0-alpha) [12, 107] を用いてフィルタリングしたリードに対して、データベース mpa_v30_CHOCOPhlAn_201901 を用いて未知数の割合の推定 (parameter: --unknown_estimation) を含む分類学プロファイリングを実施した。機能的リードプロファイリングは、MetaPhlAn、DIAMOND v0.9.24 [18] およびデータベース uniref90 (v201901) [116] と mpa_v30_CHOCOPhlAn_201901 を含む HUMAn3 (v3.0.0.alpha.1) [12, 41] によって実施されました。
アルファ・ベータ多様性解析
MetaPhlAn (v3.0.0-alpha) から得られた種の相対量を R [92] に取り込み、phyloseq package v1.30.0 [79] を用いて操作した。観測された種の数は、R パッケージ microbiome v1.8.0 [63]の richness 関数を用いて計算した。異なるグループ間での観察種の数の統計的な違いは、ケージをランダム効果として線形混合モデル（lmm）を用いて検定した（観察種〜時点＋（1|ケージ））。モデルはlme4 v1.1.21 [9] Rパッケージのlmer関数を用いて構築し、一対のコントラストはemmeans v1.4.5 [69] 関数を用いてデフォルトパラメータで抽出された。
ベータ多様性解析は、実験を通して得られたすべてのサンプルについて、Bray-Curtis (BC) および Jensen-Shannon divergence (JSD) インデックスを使用して最初に実行された。BC指標はデータの可視化に有効であったが、JSDはデータの分散をより多く説明したため、さらなる検証に使用された。時点間の分岐を検証し、同時にケージ効果を考慮するために、JSD距離行列を使用し、ケージのためにデータを条件付けし、時点ごとに制約を加えてdbRDAを作成した。得られたモデルは、vegan v2.5.6 [89] Rパッケージのanova.cc関数で、ケージ内の並べ替えを制限して（permutations = how (blocks = cage, nperm = 10,000)) Permutational ANOVAを実行するのに使用されました。PERMANOVA [5]は、pairwiseadonis v0.0.1を用いて、ケージ内の順列を10,000に限定し、P値補正にBenjamini-Hochberg（BH）を用いて時間点間で実施された。実験開始時に得られたサンプル（Pre-Abx）、若齢または高齢FMTを受けた若齢マウスと若齢FMTを受けた高齢マウスのサンプル（Post-FMT）について、追加のオーダリングを実施した。順序付けは、上記に示したようにJSDを用いた。BH P値補正を用いてグループ間の微生物相分岐を評価するために、ペアワイズPERMANOVAを使用した。FMT前後の比較では、並べ替えをケージ内に限定した（stratata = cage）。レシピエントはケージ内で交絡していたため、Pre-Abxデータセットの一対比較では自由な並べ換えが許可された。ベータ多様性分析でサンプルの分岐の主要なドライバーである種を推測するために、種の存在量はRveganパッケージのenvfit関数を使用して順列に相関させ、1万回の並べ替えを許可した。P値は偽発見率（fdr）を用いて補正され、P < .005 と軸に沿った最も強い変動度（≥|0.43|）を示す分類群のみが選択された。P < 0.05を示すすべての種は、代わりにPre-Abx時点に言及するサンプルだけを含む順序付けにプロットされた。最後に、プロクルステス検定を使用して、単一時点の順序付け間の相関を推定した。時点をまたいで共有されたサンプルについて得られたPCoA順序付けは、R veganパッケージで1万回の並べ替えを可能にするプロトタイプを実行するために使用された。
差分アバンダンス（Differential abundance）分析
科と種については線形混合モデル（lmm）を用いてDifferential abundance（DA）分析を行い、非階層化パスウェイはMetaPhlAn（v3.0.0-alpha）から取得した。分類学については、Pre-Abx、Post-FMT、実験終了時のサンプルを用いてlmmを構築した。各生物種の異なるデータ分布に対応するため、中心化対数比（RパッケージCodaSeq v0.99.6 の関数 codaSeq.clr）[44], log2, ArcSin, logit（いずれも0値に定数を追加して実行）, log2Zero（log 変換から得られた Na/Inf を 0 に変換）を用い、それぞれ lmm を構築して多重変換のテストを行い、残差はマニュアル検査した。残差がほぼランダムで正規分布しているlmm-変換の組み合わせをすべて選択した。次に、関心のある各対照（例えば、Pre-Abx vs. Post-FMT）に対して有意なP値を持つすべての種を選択した。最後に、結果を均質化するために、CLR変換したデータを最終的な図として報告した。代謝経路の解析では、再び複数の変換をテストし、この条件では残差がほぼランダムに正規分布するため、非変換データでlmmも構築した。差分存在量解析は、サンプルの5%以上で相対存在量>0のすべての種、およびサンプルの15%以上で相対存在量>0のすべての属と科を保持するデータセットをフィルタリングした後に実行された。グループ間で少なくとも1つの時点の全サンプルに存在する経路のみを考慮した（例：実験開始時にold FMTを受けたyoungの全サンプル）。lmmは以下のように構築した：taxa/path ~ receiver * donor * time point + (1|cage/mice). 特定のコントラストは、P値補正なしでemmeans関数（specs = ~ receiver:donor:time point）を使用して選択された。すべての分類群／パスウェイについて興味のあるコントラストを得た後、fdrを用いてすべてのP値を補正した。最後に、年齢グループ間の種Pre-Abxの存在量の差を調べるために、この時点に関連するサンプルだけを選択し、上記のアプローチを用いてlmm: taxa/path ~ receiver + (1|cage) を構築し、サンプルの10%以上で相対存在量> 0の種だけを考慮した。対照の抽出とP値の補正は、上記と同様に行った。
核磁気共鳴法（NMR）による糞便中の代謝物濃度の解析
糞便試料を1：12 w/vの生理食塩水リン酸緩衝液（1.9 mM Na2HPO4、8. 1 mM NaH2PO4、150 mM NaCl）に1 mM 3-トリメチルシリルプロピオン酸-d4ナトリウム（TSP-d4）を1：1 v/vで混合した重水素水（メルク）でセラミックビーズビート（Lysing Matrix E、MP Biomedicals）を用いて破砕し、15000g、5分の遠心をし、上清のろ過を0.2μmで実施した。1H NMR スペクトルは，5mm TCI プロトン最適化三重共鳴 NMR 逆クライオプローブおよびオートサンプラー（Bruker）を取り付けた 600MHz Bruker Avance 分光計を使用して記録した．スペクトルは0.3 Hzの線幅拡大とゼロフィリングで変換し、手動で位相調整、ベースライン補正を行い、TSP-d4シグナルを0 ppmに設定して参照した。代謝物は、既存の文献、マウス糞便代謝物スペクトルの社内データベース、Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca/) との比較、および 2 次元 NMR 1H-1H 相関分光法、1H-13C 異核単量子相関法、1H-13C 異核多重結合相関分光法 [67, 68, 121] を用いて同定されました。濃度はChenomx NMR Suite 7.0を使用して計算し、センタリング（CLR）し、対数変換した。
メタボロームデータ解析
10%以上のサンプルまたは1つの実験グループ内の少なくとも3つの動物個体に存在する代謝物のみを分析した。データは、0値に定数（0.001）を加えてlog2変換し、Rの関数scaleを用いてセンタリングした後、PCoAを用いてユークリッド距離データをプロットした。高齢のPre-Abxグループからの1サンプルは、明らかに順序付けの異常値を示すため、削除された。その後、dbRDAモデルを構築し、マウスグループのデータを拘束し、ケージのデータを条件付けた。そして、このモデル（anova.cca）に対して、ケージ内の10,000の並べ替えを制限したPermutational ANOVAを実行しました。同様に、ユークリッド距離行列のペアワイズPERMANOVAは、ケージ内で制限された10,000の並べ換えを使用して実行され、FDRを使用してP値を修正しました。スパースPLS-DAは、RパッケージmixOmics v6.10.9 [96]の関数splsdaを使用して実行されました。モデルの性能、コンポーネントと変数の選択は、mixOmics パッケージ内の関数 perf と tune.splsda を用いて、5 回のバリデーションと 75 回の繰り返しでテストされた。差分存在量解析は、最初にlmmを使用して、上記のようにスケール値で実行された。モデルの適合性が低い（残差がランダムまたは正規分布していない）ため、Kruskal-Wallisノンパラメトリック検定を用い、ケージのデータセットをブロックして解析を実施した。この目的のために、Rパッケージcoin v1.3.1 [51]のkruskal_test関数を使用した。P値はFDRを用いて補正した。
血清・腸管タンパク質の定量化
実験終了時に採取した血液サンプルを室温で30分間凝固させた後、1500gで10分間遠心分離を行った。血清は取り出し、さらに使用するまで-80℃で保存した。血清I-FABP、リポ多糖結合タンパク質（LBP）、およびIL-6を、特異的ELISAを使用して、またはマウス磁気Luminexパネルの一部として測定した（リソースファイルに詳述）。特異的 ELISA の検出下限値。I-FABP 0.15 ng/μL、LBP 0.8 ng/mL、IL-6 24.6 pg/mL、および TNF 0.29 pg/mL. 腸管溶解液は十二指腸の試料から調製した。組織サンプル（50 mg）を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を加えたCelLytic MT（Merck）中でFastPrep Bead BeaterとLysing Matrix Dチューブ（MP Biomedicals）を用いて均質化し、17000g、4℃で15分遠心分離した。十二指腸溶解物腫瘍壊死因子（TNF）を特異的ELISAを用いて測定した（主要なリソースに詳述）。血清および溶解液中の総タンパク質濃度は、ELISA/Luminexで使用する前にBradford assay（BCAタンパク質アッセイ）により正規化した。6 ポイントの標準曲線に対する 4 パラメータのロジスティック回帰フィット、サンプル濃度の補間（各群 n = 5 マウスの 3 重血清サンプル）。
網膜タンパク質の定量
40種類の標的サイトカインのレベルを、Proteome Profiler Mouse Cytokine Array (BioTechne) を用いて、老化したマウスの若いドナー微生物叢と老化したドナー微生物叢の網膜溶解物を用いてアッセイした（n = 8マウス／グループ）。ライセートは、PBS＋完全プロテアーゼ阻害剤（SigmaFast）での溶解、細胞膜を破壊するための超音波処理、洗剤（Triton X-100）による凍結融解、遠心分離による清澄化（17000gで10分、4℃、その後-80℃で保存）によって個々の網膜全体について作成された。プールした溶解液（n = 8網膜／グループ）を、抗体パネルをコートした膜とともに4℃で一晩インキュベートし、残りの手順は製造業者の説明書に従って実施した。膜の化学発光検出にはChemiDoc XRSシステム（BioRad）を使用し、画像を専用解析ソフト（ImageLab、BioTechne）にエクスポートして定量化した。バックグラウンド除去およびコントロールメンブレン（PBS、ライセートなし）除去後、各ターゲットスポットについて、ピクセル強度を老化＋若年FMT対老化＋高齢FMTメンブレンの変化率に変換した。検出の閾値を下回る、あるいはコントロール膜の強度を下回る9つのターゲットは表示しない。
網膜の免疫染色と定量化
眼球を4％パラホルムアルデヒド（PFA）中で20分間固定してから凍結保存し、OCTコンパウンド（Agar Scientific）に包埋した。凍結切片を5μmに調製し、補体C3に対するヤギポリクローナル抗血清（MP Biomedicals）またはRPE65に対するマウスモノクローナル抗体（Merck Millipore）および二次抗体ドンキ抗ヤギA488、ドンキ抗マウスA568（Invitrogen）核をDAPI（Merck）で染めた。画像は落射蛍光広視野顕微鏡を使用して収集した。RPEとブルッフ膜の界面の1280μmの領域の平均画素強度をAdobe Photoshop CS5で測定した。1群につき1年齢あたり5匹のマウス（網膜）を分析した。
脳内Iba-1細胞の染色と計数
脳をホルマリン固定、パラフィン包埋し、4μmの矢状切片を作製した。Iba-1に対するウサギモノクローナル抗体（1：200，Abcam）、ロバ抗ウサギAlexa-594二次抗体（Invitrogen）、および核染色としてHoeschtを用いて免疫染色することにより、Iba1陽性ミクログリアを検出した。画像は，Zeiss LSM880共焦点顕微鏡とZen 2010ソフトウェアで撮影した．解析のために大脳皮質と脳梁を選択したのは、主に、これらの領域でIba-1密度が治療前と治療後のグループ間で異なって見えるという我々の最初の観察に基づくものであった。細胞数は、FIJI/ImageJ [101, 105]で行った。Iba-1チャンネル（A594）のみの画像を用い、「Despeckle」機能で背景のランダムピクセルノイズを低減した。その後、閾値をすべての画像で同じに設定し、画像を2値化した。組織切片をできるだけ多く包含するように、面積を一致させた円形の関心領域（ROI）を3重に配置した。ROIはすべての画像で再使用され、各画像で同じ大きさの領域が撮影されました。その後、「粒子解析」機能を使用して3つの領域内の粒子をカウントし、結果をExcelにエクスポートしました。画像ごとに、セクションごとに、マウスごとに、脳領域ごとに3つの関心領域が分析され、1グループあたりn = 5-7マウスとした。Fig. 2で7点未満のグループがある場合、これは1つ以上のROI内にギャップ/フォールドまたは自家蛍光の残骸があるサンプルを除外したことを反映している。
図2
図2
大脳皮質と脳梁における炎症性（Iba-1+）ミクログリア密度は、腸内細菌叢によって制御されている。A Iba-1+ミクログリアを免疫染色（赤）で同定し、核をHoechst（青）で対比染色し、全群のマウス脳矢状断面の皮質および脳梁（漫画で強調表示）において定量化した。B 大脳皮質におけるIba-1+細胞の定量化、全群4-7匹のマウスのそれぞれから得た3つの関心領域（ROI）の平均数。C 脳梁におけるIba-1+細胞の定量化、全群から1群あたり4-7匹のマウスのそれぞれから得た3つの関心領域の平均値。Welchのt検定による関心領域間の統計解析；エラーバーは95％CIを示す。有意な値は太字で示す。D 若年、老齢、および高齢のマウスの大脳皮質におけるIba-1+細胞の代表的な免疫染色で、PBSのみで処理、抗生物質のみで処理、または若年、老齢、または高齢のドナーからのFMTに続いて抗生物質で処理した（図S1も参照）。
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行動試験
認知および行動に対するFMTの影響を評価するために、Y迷路自発的交替試験および新規物体認識（NOR）を、以前に記載したように実施した[91]。高齢マウスを、若年ドナー糞便微生物叢を用いたFMTの前後で試験し（n＝10）、高齢ドナー微生物叢を受けた高齢対照マウス（n＝10）、および若年ベースラインマウス（n＝11）と比較した。簡単に言うと、マウスをY迷路に入れ、追跡ソフトウェアがゾーン遷移と運動活性を記録する間、5分間自由に探索させた（Smart 3.0 追跡ソフトウェア、Panlab、Kent、UK）。自発交代は以下の式で算出した：自発交代＝（交代回数／腕の総突入回数-2）×100。新規物体認識(NOR)は以下のように行った：1日目、マウスを空迷路に慣らし、10分間自由に移動させるようにした。2日目に1つの物体に対して10分間条件付けを行った。3日目、マウスを2つの同じ物体が存在する同じ実験エリアに15分間置いた後、それぞれのケージに戻し、試行間隔を1時間置いた。1つの見慣れた物体を新規の物体に置き換えた。マウスは最終的に10分間試験場内に戻された。ビデオ解析は5分間行われ、その後、物体探索時間の合計が累積10秒に達しない場合、10秒に達するまで解析を続けた。10秒に達しない動物は解析から除外した。同様に、慣れ親しんだ物体で累積10秒に達しない動物も除外した。識別指数は以下のように算出した。DI = (TN - TF)/(TN + TF), TNは新規物体探索に費やした時間、TFは身近な物体の探索に費やした時間である。
統計解析
微生物の多様性とパスウェイの差分存在量の統計解析は、上記の「α・β多様性解析」、「メタボロームデータ解析」、「差分存在量解析」のセクションで詳しく説明したように実施した。その他の標準的な統計検定（図の説明に記載）は、Jamovi, v1.1.9.0 [117] でP値 < .05を有意性のカットオフとして実施された。通常、PBS単独マウスとFMT投与マウスの年齢群内、およびPBS単独マウスの年齢群間の一対のグループ比較が行われた。
結果
FMTを用いて、C57BL/6マウスの「若齢」（3ヶ月齢）、「高齢」（18ヶ月齢）、「高齢」（24ヶ月齢）群（以下、それぞれ「若齢」「高齢」「高齢」マウスと呼ぶ）の糞便微生物叢を交換した。実験デザインとスケジュールは図1にまとめられている。実験の最後に組織と血液を採取し（Fig. 1、「終了」）、ヘテロクロニックFMTが主要組織・臓器、特に脳、網膜、腸上皮の炎症に対する感受性に与える影響を調べた。
腸内細菌叢はCNSのミクログリア活性化を制御する
免疫組織化学を用いて、FMT後の全群のマウスの脳矢状断面において、「灰白質」領域と「白質」領域（皮質および脳梁）の両方で、炎症性神経病理の特徴である活性化ミクログリア細胞［48］をマーカーIba-1で定量化した（図2および図S1）。Iba-1+ミクログリア細胞密度は、老齢マウスと高齢マウスの大脳皮質と脳梁の両方で、若年マウスと比較して高かった（図2と図S1、Welchのt検定PBS群若年対高齢皮質P = .005、脳梁P < 0.001）。老齢（18ヶ月）と高齢（24ヶ月）の対照群、PBS処理群の間には有意な差は見られなかった。若齢マウスでは、モックトランスファー、同世代（若齢）トランスファー、老齢（18ヶ月）ドナーの微生物叢を受けたマウスの間でIba-1+細胞数に有意差はなかった。しかし、高齢（24ヶ月）ドナー微生物叢を投与された若いマウスは、他のすべての若い処理群および対照群と比較して、大脳皮質と脳梁の両方で、高齢マウスと同程度のレベルのIba-1+細胞が有意に多かった（図2B-Dおよび図S1）。逆に、若いドナー微生物株を投与された老齢マウスでは、大脳皮質と脳梁でIba-1+細胞が対照群と比較して有意に減少した（図2B-D、図S1）。
これらのデータを総合すると、腸内細菌叢はミクログリアの活性化に強く影響し、ヘテロクロニックFMTはIba-1+ミクログリアのレベルを調節し、高齢者ドナー微生物叢を移植した若年成人マウスではレベルを増加させ、若年者ドナー微生物叢を移植した高齢動物のCNSではレベルを低下させることが示された。
脳内の慢性炎症とミクログリアの過剰活性化は、神経変性病態に寄与し、ひいては認知機能の低下につながる可能性がある[48]）。そこで、FMTによる高齢マウスの炎症性ミクログリア過剰発現の逆転が、マウスの認知機能の確立されたテストにおける何らかの改善につながるかどうかを評価した。空間的ワーキングメモリのテストであるY-mazeと、認識記憶のテストである新規物体認識（NOR）テストを用いて、若齢または高齢ドナーのFMTを受けた高齢マウスの前後を比較したところ、高齢マウスでは、空間的ワーキングメモリのテストの成績は低下していたものの、NORテストの成績は向上した。加齢マウスはベースラインでNORテストの成績が低下していたが、若年ドナーの微生物叢移植を受けた加齢マウスでは、いずれのテストでも対照群と比較して有意な改善が見られなかった（補足図S5）。このデータは、FMTによる短期的な微生物調節が、高齢マウスの作業空間記憶および認識記憶の測定に影響を与えることを支持しない。
ヘテロクロニックFMTは加齢に伴う網膜の炎症を逆転させる
脳の白質領域と灰白質領域の両方におけるCNSの炎症に対するヘテロクロニックFMTの調節効果を確認した後、次に、網膜を検討しました。網膜は中枢神経系の延長または「最終器官」と考えられており、加齢による機能低下と炎症による損傷に対して特に脆弱でもあるからです。老化したネズミの網膜では、炎症性補体タンパク質C3の発現が増加し、網膜色素上皮（RPE）とブルッフ膜（BM）の間の細胞外沈着が進行し、網膜変性に寄与している[7, 103]。脳における我々の結果が、若年および高齢のグループにおいて異時性FMTの最も顕著な影響を示したことから、これらの年齢グループにおけるFMTに対する網膜の反応の特徴を調べた。ベースライン時、高齢マウスは、若年マウスと比較して、RPE/BM界面で補体C3の染色が有意に多かった（図3AおよびB）。加齢ドナー微生物叢を投与された若年マウスは、対照群と比較してこの領域で網膜補体C3の増加を示し（図3A、B）、加齢マウスと同等のレベルまで上昇した。一方、若年ドナー微生物叢を投与された高齢マウスは、PBSのみの高齢対照群と比較して、C3染色が有意に減少し、若年マウスと同程度のレベルまで減少した（図3A, B）。
図3
図3
ヘテロクロニック微生物叢の移植は、加齢に伴う網膜の炎症と機能的な視覚タンパク質の発現を逆転させる。A PBS対ヘテロクロニックFMTを受けたマウスの網膜色素上皮（RPE）/ブルッフ膜（BM）界面の断面における補体C3（緑色）の免疫染色。B 若齢、老齢、または高齢のPBS投与マウス対ヘテロクロニックFMTにおけるRPE/BM界面の面積（1280μm2）あたりの平均補体C3染色ピクセル強度（PI）の定量化（n = 5マウス/グループ）。C 未処置マウスとヘテロクロニックFMT投与マウスのRPE/BM界面の断面における重要な視覚サイクルタンパク質RPE65の免疫染色（RPE65、赤；核DAPI、青）および定量化（D）、n=5マウス/群。Welchのt検定による年齢間およびFMT群とPBS群間の統計的比較。E 若年ドナーFMTを受けた老化マウスにおける網膜溶血性サイトカイン発現量の変化率
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網膜の視細胞は、老齢期には特に全身の炎症や代謝の変動に敏感になる。光受容体の網膜視覚色素の再生に重要な網膜色素上皮タンパク質RPE65は、老化マウスでは若齢マウスと比較して枯渇していた（図3C, D）。若いマウスでは、RPE65のベースラインレベルは、老化したドナー微生物叢を移植した後に減少した（図3C, D）。また、若いドナーの微生物叢を高齢のマウスに移植すると、RPE65の発現が若いマウスのレベルまで回復した（図3C, D）。網膜の炎症と変性は、げっ歯類では24ヶ月より早く始まることが報告されている[22, 103, 129]。そこで、若齢（3ヶ月）および高齢（24ヶ月）群とともに、高齢（18ヶ月）群も評価したところ、RPE65染色は年齢とともに徐々に減少するが（図3D）、C3染色は高齢（18ヶ月）群および高齢（24ヶ月）PBS群の間で有意差はないことが判明した。
また、プロテオームプロファイリングアレイを用いて、FMTを受けた高齢マウスの網膜溶解液中のサイトカインレベルを評価した。加齢マウスで上昇していたCCL11（eotaxin）、CXCL11、IL-1βなど複数の炎症性サイトカインが、若い微生物群の移植により減少した。一方、神経保護サイトカインとされるIL-13[98]は、若いドナーから加齢マウスへのFMT後、最も高い増加を示した。
これらのデータを総合すると、腸内細菌-網膜軸が、網膜の炎症と加齢に関連したサイトカインシグナル、および重要な視覚機能タンパク質（RPE65）の発現を制御する上で、因果関係を持つことが支持される。
ヘテロクロニックFMTは、加齢に伴う上皮バリアー完全性の破壊と全身性炎症を逆転させる
中枢神経系における炎症および病的炎症は、腸管上皮バリアの完全性の喪失、いわゆるリーキーガットと関連している。ここでは、微生物に関連した上皮細胞の損傷および破壊の重要な指標［66］であり、腸管上皮透過性の代替バイオマーカー［42、71、125、127］である腸管上皮細胞タンパク質腸管脂肪酸結合タンパク質（I-FABP）の血清レベルにFMTが何らかの影響を与えるかどうかを調査した。血清I-FABP濃度は、PBSを投与した若年マウスと比較して、高齢ドナー微生物叢を投与した若年マウスで約30％増加し、逆にPBSを投与した高齢マウスと比較して、若年ドナー微生物叢を投与した高齢マウスで約30％減少した（Fig. 4A）。細菌のLPSが血中に漏出した際に肝臓から分泌される（炎症化を促進する[56]）リポポリサッカライド（LPS）結合タンパク質（LBP）の血清濃度は、高齢マウスでは若年マウスの約2倍高く（図4B）、高齢ドナー微生物叢を受けた若年マウスでは高齢マウスと同レベルにまで上昇した。逆に、若いドナーの微生物叢を摂取した高齢マウスでは、LBPの循環濃度が減少し、若いマウスと同程度のレベルにまで低下した。炎症に関連する主要なサイトカインであるIL-6と腫瘍壊死因子（TNF）［95］の分析では、高齢者ドナー微生物叢を受けた若いマウスで血清IL-6濃度が上昇し、PBSを受けた若いマウスの約2倍になった（図4C）が、他のどのグループ間でも有意差は見られなかった。TNFのレベルは、若いドナー微生物叢を受けた高齢マウスの小腸溶解物では約40%減少したが、高齢ドナー微生物叢を受けた若いマウスでは移植前と移植後のレベルに有意差はなかった(Fig. 4D)。我々のサイトカイン分析には、IL-12、IL-17、IL-1β、およびIL-27も含まれるが、これらのいずれも、どのグループにおいてもアッセイの検出閾値を超えなかった（データは示さず）。
図4
図4
ヘテロクロニックFMTは、加齢に伴う上皮バリアー完全性の破壊と全身性炎症を逆転させる。A ヘテロクロニックFMT前後の若齢および高齢マウス（n = 6-8/群）の血清腸脂肪酸結合タンパク質（I-FABP）のELISA分析。B 血清リポポリサッカライド結合蛋白のELISA分析（n = 8/グループ）。C 血清のIL-6レベルは、マルチプレックス磁気ビーズアッセイ（Luminex）により分析した（n＝5／グループ）。D 小腸組織溶解物中の TNF レベルを特異的 ELISA で測定した（n = 5-8/グループ）。Welchのt検定による年齢間およびFMT群とPBS群の統計的比較；エラーバーは95％CI；有意な結果は黒太字で示す。
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これらのデータを総合すると、老化した微生物叢は、上皮バリアーの完全性の破壊、細菌産物の移動、および炎症性サイトカインの血清レベルの上昇を促進し、これらはすべて若いドナーの微生物叢を移植することによって回復することが示された。
次に、高齢のレシピエントにおける炎症と若年者FMTの有益な結果を説明しうる微生物シグネチャーと特徴を明らかにすることを目的として、FMT後、微生物叢が年齢とともにどのように変化するかを調査した。
ドナー由来種がFMTレシピエントの腸内細菌叢組成を規定する
加齢および移植後の腸内細菌叢の特異的な変化を明らかにするため、複数の時点ですべてのマウスの全ゲノムショットガン（WGS）メタゲノムシーケンスを実施した。FMTの前に、まず、若齢、老齢、高齢マウスの糞便微生物叢のベースライン分類を確立した。マウス[64, 112, 118]やヒト[19, 25, 26, 49, 86, 87]で以前指摘したように、年齢とともに微生物のベータ多様性プロファイルに変化が見られた（図5A、図S7およびS8）。我々は、年齢層のクラスタリングを推進する種を同定した（図5A）。その中には、Muribaculaceae, Lacnospiraceae, Lactobacillus, Clostridium, Prevotella種が含まれていた。Prevotella sp.、Lactobacillus intestinalis、Faecalibaculum rodentiumは老齢群と若年群で有意に濃縮され、Enterorhabdus caecimuris、Turicimonas muris、Muribaculaecae bacterium DSM 103720は若年群と高齢群で有意に濃縮された（図5Bと図S7）。ペアワイズPERMANOVAにより、腸内細菌叢はすべての年齢群で有意に異なることが示された（Benjamini-Hochberg、BH補正後P < 0.01）。若年（3ヶ月）群および高齢（24ヶ月）群は、序列において別々のクラスタを形成した。しかし、高齢（18ヶ月）群は別々のクラスタを形成せず、若年および高齢マウスの両方と特徴を共有した（図5A、図S8）。重要なのは、実験開始前の数週間に飼育施設を無作為化することでFMT前に、またFMT後にはメタゲノムデータの統計解析にケージ間のばらつきを考慮することで、ケージ間の潜在的なばらつきを考慮したことである。
図5
図5
FMT前後の糞便微生物叢構造。A 抗生物質投与前（Pre-Abx）の若齢（青）、老齢（白）、高齢（オレンジ）マウスの糞便微生物叢サンプルのクラスタリングを示すPCoAに、クラスタリングを促進した種を重ねたもの。B 抗生物質投与前（Pre-Abx）の高齢マウス（オレンジ色の棒、n = 8）対若年マウス（青色の棒、n = 7）で有意に濃縮された種；結果は中心対数比の平均差、CLR、SEで表示。C 抗生物質投与前（黄色）、投与後（緑色）、FMT後（マゼンタ）、実験終了時（「終了」、灰色）のすべての年齢および処置群のすべてのマウスのクラスタリングを描いたPCoA（Bray-Curtis）。D PCoA（Bray-Curtis）により、すべての年齢層および治療群の全マウスのクラスタリングを描いたもので、年齢層ごとに色分けされており、青マーカーが若年、白/黒マーカーが高齢、オレンジマーカーが高齢である（図S2も参照）。
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FMTを用いて、Fig.1に詳述したように、若齢、老齢、高齢群のマウスの糞便微生物叢を交換した。糞便ペレットは、抗生物質処理の前後、およびFMT後1週間と2週間で採取した。糞便中の微生物および代謝産物の組成は、メタゲノム配列決定、代謝経路の存在比分析、およびNMRによって評価した。抗生物質前処理は、予想通り、全年齢の全処理群にわたって観察種の著しい枯渇をもたらし（図S2、Tukey post hoc test P < .01）、抗生物質前処理と比較して全年齢群の細菌群集組成全体が劇的に変化した（図5C、緑対黄マーカー、5D、S7およびS8）。FMTにより、観察された種の数は抗生物質投与前のレベルに回復した（Fig. S2）。FMTは、レシピエントの糞便微生物叢に有意な変化を誘発し（図5C、D、図S7およびS8、dbRDAの並べ替えANOVA F = 55.8, df = 3, P < .01）、実験時間点がデータ分散の50%を占めていた（R2adj = 50%）。より重要なことは、若年群と高齢群との間の異時的FMTは、レシピエントの糞便微生物叢組成の明確なシフトを誘発し、レシピエントの腸内微生物叢がその初期組成からうまく分岐したことを示した（BH補正後の一対のPERMANOVA P < .01、図5C、マゼンタ対黄マーカー、および図S7）。これは「FMT後」の時点で最も顕著であったが、研究の終わりには、元のドナーのプロファイルとの重複が大きくなり（図5C、黄色対灰色のマーカー）、レシピエントの腸内環境が長期の生着成功を強く調節していることが示唆された。
老齢（18ヶ月）動物群は、微生物叢組成に大きな個体間変動があり、順序付けでは個別のクラスターを形成しなかった（図5A、図S8）。そこで、より乖離の大きい若齢マウスと高齢マウスに着目し、そこにメタゲノム解析を行い、「Pre-Abx」と「Post-FMT」の時点を比較して、微生物叢構造の大きな時間シフトを検出した（Fig.6）。老化したドナーの微生物叢を若いマウスに移植すると、レシピエントの糞便微生物叢組成が劇的に変化し（ペアワイズPERMANOVA P = .01、BH補正後）、ベースラインの老化マウスの微生物叢プロファイルに似たものになった（Fig.6A）。有意な組成の変化（ペアワイズPERMANOVA P = 0.01、BH補正後）は、若いドナーの微生物叢を受けた老化マウスでも誘発された。この場合、変化したプロファイルは、若いベースラインマウスのものとは異なっており、観察されたシフトは、若いドナーの微生物叢を移植された若いマウスのものに続いていた（Fig. 6A）。このことから、若齢ドナーの微生物叢の移植は、FMTの手順やレシピエントの腸内環境、あるいはその両方の影響を受けやすく、若齢ドナーの微生物叢の生着が最も進んでいることが示唆された。
図6
図6
ドナー由来種がFMTレシピエントの糞便微生物叢組成を規定する。A Abx前（緑）およびFMT後（オレンジ）の若齢および高齢マウスの糞便微生物叢サンプルのクラスタリングを示すPCoAと、クラスタリングを駆動する種との重ね合わせ。B 若年および高齢のマウスにおける、異種移植後（Post-FMT）と移植前（Pre-Abx）の濃縮種の存在量の差分析（結果は中心対数比の平均差、CLRおよびSEとして表示）。Family abundance、同胞移植を受けた若齢マウス、抗生物質のみ投与群はFig.S3に示す。
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Oscillibacter属とPrevotella属に属する種、Firmicutes門の未知の種、Lactobacillus johnsoniiが、高齢マウスと高齢ドナー微生物叢を移植した若齢マウスのクラスタリングを促進した（Fig.6A）。一方、若いドナーの微生物叢を移植された若いマウスと若いドナーの微生物叢を移植された高齢マウスの分岐は、Bifidobacterium、Akkermansia、Parabacteroides、Clostridium、Enterococcus属に属する種によって駆動された（Fig. 6A）。
マウスとヒトの腸内外の健康に有益な影響を与えるBifidobacteriaceae, Akkermansiaceae, Eubacteriaceaeのメンバー（[8, 38, 43, 73, 78, 81]）は、若いドナー微生物相のレシピエントと高齢者の両方でより豊富だった（図S3A、差分豊富ファミリは表S2参照）。
若いマウスに加齢したドナー微生物叢を移植すると、加齢したマウスの特徴的な種、すなわちPrevotella sp. MGM2, L. intestinalisに加え、Lachnospiraceae bacterium 10-1, Parabacteroides distasonis, L. johnsoniiが濃縮された（図6A、B）。
逆に、高齢のマウスに若いドナーの微生物叢を移植すると、若いマウスのシグネチャー種であるT. murisとMuribaculaceae bacterium DSM103720が、Bifidobacterium animalis, Eubacterium sp14-2, Akkermansia muciniphila、その他6種とともに濃縮した（図6A, B）。Enterorhabdus caecimurisは、若いマウスではわずかに濃縮されていたが、若いドナー微生物叢を受けた高齢マウスでは有意に濃縮されていなかった（図6A, B）。
若いドナー微生物(Bifidobacterium animalis, Eubacterium sp. 14-2, A. muciniphila)を摂取した高齢マウスでは、最も有意に濃縮された種が存在した（図6A, B）。muciniphila, Clostridium cocleatum）は、若いドナー微生物叢を再添加した若いマウスでも濃縮されていたが、他の種（Parabacteroides distasonis, Lachnospiraceae 28-4, Clostridium ASF356）は加齢受容体でのみ濃縮されており（図6Bおよび図S3B）、異なる種の移植成功に受容体内部環境が影響すると思われた。
若いドナーのFMTを受けた高齢マウスで濃縮された種は、抗生物質処理後に排除されなかった、あるいはよりよく繁殖できた種だけを反映していないことを、対照群で抗生物質処理後にのみ濃縮された種と照合することによって確認した（図S3C）。表S1には、異常に豊富な生物種の表が掲載されている。
集合的に、我々の結果は、ヘテロクロニックFMTがレシピエントの微生物叢構造の有意な変化をもたらし、ドナーの年齢層に特徴的な細菌種を濃縮すること、およびドナーとレシピエントの両方が結果として得られる微生物叢組成に影響を及ぼすことを示した。
FMTの介入によってレシピエントの潜在的な微生物機能プロファイルが変化したかどうかを推定し、腸、脳、網膜で見られた影響の潜在的な分子メディエーターを特定するために、次に、WGSデータにおける微生物代謝経路の豊富さを解析して機能能力を推測し、並行して、FMT前後の若齢および高齢マウスのNMRによる糞便代謝物濃度を分析した。
ヘテロクロニックFMTは脂質とビタミンの代謝を変化させる
微生物代謝産物は、微生物叢の機能の重要なメディエーターであり、宿主細胞の生理学および代謝に影響を与える。異時性FMT前後の若齢および高齢マウスの糞便サンプルの標的核磁気共鳴（1H-NMR）分光法によるメタボロミクスは、主にアミノ酸、糖、短鎖脂肪酸（SCFA）、アルコールを評価するために実施した（検出した代謝物、およびその生濃度は表S3に詳述している）。距離ベースの冗長性分析（dbRDA）では、治療グループ化によって説明される分散はわずか24％で、高い個人間変動が示された（分散の4％はケージグループ化によって説明された）。モデル化のためのPermutational ANOVAでは、グループ間の有意差が示唆された（F = 2.27, df = 3, P = 0.003）。しかし、その後のユークリッド距離行列に関する一対のPERMANOVA比較では、どの2群間にも統計的に有意な差は見られなかった（BH補正後、.05 < P < .1）。
部分最小二乗判別分析（PLS-DA）を用いて、群間の分離を定義する上で最も強い影響を持つ代謝物を同定した（図S4AおよびS4B）。全体として、代謝プロファイルはほぼ同様であり、年齢と治療群間で一部の代謝物に限られた程度の変動があった。加齢したドナー微生物群の若いマウスでは、アミノ酸代謝（リンゴ酸スレオニンおよびクレアチン）および糖代謝（フコースおよびスクロース）に関与する代謝物が含まれていた。若いドナー微生物叢を摂取した高齢マウスでは、タウロ共役胆汁酸、酢酸、ポリアミンのプトレシン、ポリアミン調節物質のオルニチンが負荷に最も寄与しており、これらの代謝物は以前から老化に有益であるとされていた [74, 94]。
並行して、メタゲノムデータに含まれる機能的な代謝経路の存在量を解析した。若いドナー微生物叢を受け取った高齢マウスでは、移植前のサンプルと比較して、脂質合成に関わる複数のパスウェイが有意に濃縮されており（図7A）、特に、中鎖および長鎖脂肪酸（MCFA、LCFA）の合成に関わるパスウェイが検出された。重要なことは、これらの脂質代謝経路のいくつかは、パルミチン酸、マイコレート、不飽和脂肪酸の生合成など、加齢ドナー微生物叢を受け取った若いマウスで枯渇していたことである。また、若いドナー微生物が移植された高齢マウスでは、ビタミンB7とB9（ビオチンと葉酸）の生合成に関与する経路が充実していた（Fig. 7B）。また、腸内古細菌への影響を示唆するメタン生成の減少、一部の乳酸菌が利用するヘテロ乳酸発酵の増加、ビフィドバクテリウム・シャント経路の増加（図7B）が見られ、後者はこのグループにおけるビフィドバクテリウム属の比率の増加（図6B）と一致する。FMT前後で濃縮された代謝経路の完全なリストは、表S4に示すとおりである。
図7
図7
ヘテロクロニックトランスファーが脂質とビタミン代謝を変化させる。A ヘテロクロニックFMT後の若齢および高齢マウスで有意に濃縮または枯渇した脂質代謝パスウェイを選択した。B その他の選択された経路で、若齢FMTを受けた高齢マウスで有意に濃縮または枯渇した経路。結果は中心化対数比（CLR）の平均差として表示され、エラーバーは標準誤差を表す。箱ひげ図は、各パスウェイの相対量をlog2変換したものである。
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つまり、ヘテロクロニックFMTは脂質代謝およびビタミン代謝経路に有意なシフトをもたらし、若いドナーの微生物叢を移植された高齢マウスではそれらの比率が増加し、高齢ドナーの微生物叢を受けた若いマウスではそれらの存在量が減少した。また、若年ドナーのFMTを受けた高齢マウスでは、ヘテロ乳酸発酵とBifidobacterium shuntが濃縮されていることが確認された。
考察
高齢期における腸内細菌叢組成の変化は、慢性的な低悪性度炎症と関連し、加齢に伴う慢性疾患への感受性を高めると考えられている。しかし、加齢に伴う腸内細菌叢の多様性、組成、機能の変化が疾患発症に関与しているかどうかは、まだほとんど分かっていない。本研究では、若齢マウスと高齢マウスの間でFMTを行い、レシピエントの微生物叢の構造と代謝能力を双方向に変化させることを試みた。その結果、高齢のドナーの微生物叢を若いマウスに移植すると、腸管上皮バリアの炎症と完全性の喪失、全身および組織における炎症マーカーの上昇、網膜と脳における炎症の上昇を引き起こすことが明らかになった。移植された高齢者微生物叢とその結果として生じるレシピエント微生物叢の構成は、Prevotella、Lacnospiraceae、Facecalibaculum種に富むこと、長鎖脂肪酸合成が枯渇していることで区別された。逆に、Bifidobacteria, Eubacteria, Akkermansiaに富み、ビタミンB群の生合成と脂質合成経路に富んでいる若いドナー微生物叢を高齢マウスに移植すると、高齢者の腸、脳、網膜における炎症性変化が回復した。このデータは、高齢者における腸内細菌叢の変化が腸および全身の炎症に寄与し、その結果、高齢者臓器の炎症性病態を促進する可能性があるという示唆を裏付けるものである。したがって、微生物組成を改変して免疫および代謝経路を調節することにより、加齢における腸脳軸を標的とすることは、加齢に伴う炎症および機能低下に対する治療アプローチとして可能性があると考えられる。
FMT前後における加齢性消化管のシグネチャー微生物
我々は、ヘテロクロニックFMTによる移植後、レシピエントの生着微生物叢の中で顕著となる加齢に関連した特徴的な細菌を同定した。重要なことは、この解析では、ケージ間のばらつきを統計解析に組み込むことで、ケージ間の潜在的なばらつきを考慮したことである。すべての動物において、ヘテロクロニックFMTによって誘導された微生物構造の変化は、FMT後7日目に最も顕著であった。FMT後18日までに、移植された微生物叢は、ベースラインの抗生物質投与前の微生物叢プロファイルにより近いものとなった（対称的なプロクラステス回転における相関＝25％、P＝0.05）。このことは、レシピエントの消化管における年齢および環境因子が、特定の細菌分類群を好む特定の生態学的ニッチを提供することを示唆している。
しかし、このような経時的な適応は、移植された微生物叢が組織に与える影響を制限するものではなく、組織採取時点であるFMT後18日目には、主要機能細胞型や健康状態のバイオマーカーに明らかな変化が見られた。このことは、移植された微生物叢の安定性と、有益な健康効果を維持するために長期間の持続が必要であるかという問題を提起しており、大規模な長期試験で対処できる可能性がある。
加齢マウスと加齢ドナーの若いレシピエントでは、Prevotella sp_MGM2が有意に濃縮されていた。腸管バリアの完全性に有害な影響を与えるプレボテラ種は、IBS患者および腸管炎症モデルにおいて濃縮されており［52、113］、炎症性関節炎を促進し得る［3、104、126］。しかし、他の報告では、グルコース代謝に対するPrevotella種の有益な影響を同定し[60]、パーキンソン病の進行との相反する関連性が存在する[97]。
Bifidobacterium animalis及びAkkermansia muciniphilaは、若年マウス及び若年ドナー微生物叢を受けた高齢マウスにおいて最も濃縮された分類群の一つであり、腸及び腸外の健康及び健康的な老化の促進に関連している。さらに、A. muciniphilaは炎症や代謝障害のモデルで枯渇しており、粘液産生や上皮バリアの完全性を調節し、血清LPSを減少させることにより、プロバイオティクスの可能性を示している[38]。このLPSに対する後者の影響は、若いマウスや若いドナーの微生物叢を受けた高齢マウスで見られた血清LBPレベルの低下と一致する。加齢加速モデルマウスでは、A. muciniphilaの補給は、加齢に伴う大腸の厚さの減少や免疫活性化を抑制し [73]、寿命や健康寿命に有益な効果を発揮する [8] ことが分かっている。
その他に、若いドナーの微生物叢を受けた高齢者では、マウスの長寿と正の相関があり[78]、炎症やヒトの肥満と負の相関があるプロバイオティクス種B. animalis、Eubacterium sp. 14-2が豊富に含まれていることが分かった。Eubacteriaceaeの中の多くの種の正確な分類は、現在検討中である。しかしながら、いくつかの種は、現在、コレステロールおよび胆汁酸代謝を調節すると考えられており、潜在的な治療薬と考えられている[43]。
全体として、我々のデータは、若齢マウスの微生物叢を用いたFMTにより、高齢マウスにおいて有益な分類群が濃縮されることを示す。単一種または特定のコンソーシアムを用いた精緻なコロニー形成研究は、我々が述べた全身的効果に対する特定の分類群の寄与を明確にし、その作用の具体的なメカニズムを特定するのに役立つであろう。また、特定の微生物種が、独自の細菌産物によって、あるいは新しいニッチの拡大や潜在的なコロニー形成によって、その効果を媒介するのかどうかも不明なままである。我々の手順は、腸内細菌叢の細菌分画を評価するために最適化されており、そのため、我々が説明する効果において他の微生物構成要素からの寄与の可能性を除外することはできない。FMT後のメタン生成経路の存在量にわずかな差が認められたことは、古細菌の代謝または存在量が治療群間で変化した可能性を示唆している。しかし、宿主の健康に大きな影響を及ぼす可能性のあるこの成分およびその他の成分を評価するためには、真菌（53）、ウイルス（30、34）、古細菌（77）抽出および同定に最適化した追加プロトコルを使用する必要があると思われる。
加齢腸内細菌叢はバリア透過性と炎症を促進する
炎症と加齢に伴う腸の病理学に関する中心的な疑問は、上皮バリアの完全性と機能の破綻が腸内細菌叢の変化を引き起こすのか、それとも細菌叢の組成の変化が上皮の損傷と透過性を引き起こすのか、あるいは両者が同時に起こるのかである[2, 128]。我々のデータは、高齢のドナーの微生物叢を若いレシピエントに移植すると、腸内TNF濃度が上昇し、上皮バリア透過性変化の代替バイオマーカー（I-FABP、LBP）が上昇することを示しており、バリア完全性の破壊と全身性炎症反応の促進における加齢関連微生物叢の役割を裏付けている。この仮説は、若いドナーの微生物叢を受けた高齢のマウスでは、これらの影響が逆転することから、若いマウスの微生物叢がバリア保全にプラスの影響を与えること、あるいは加齢に関連する微生物叢を除去することでバリアの回復が可能になることを示唆するものであった。また、加齢に伴う腸内細菌叢の除去によりバリア機能が回復することも示唆された。加齢に伴う腸内細菌叢が無菌マウスの細胞外透過性と炎症を悪化させるという観察は、我々の発見と解釈と一致している [40, 118]。
腸内細菌叢はCNSミクログリアの活性化を制御する
哺乳類モデルでは、加齢に伴いミクログリアの形態および機能の変化、ならびにミクログリア活性化マーカーの発現上昇が認められる[82]。しかし、脳の異なる領域における活性化ミクログリアの年齢と絶対数が正の相関を示すかどうかは不明である。我々は、健常マウスにおいて、加齢に伴い脳梁と大脳皮質の両方でIba-1+ミクログリアの数が増加することを観察した。さらに、両領域のIba1+細胞密度が、加齢に伴う腸内細菌叢によって制御されていることを明らかにした。若いドナーの腸内細菌叢を移植すると、加齢したレシピエントの中枢神経系におけるIba-1+ミクログリア数の上昇が抑制され、一方、高齢のドナーの腸内細菌叢は若いレシピエントの中枢神経系におけるIba-1+細胞を増加させることが示された。このようなミクログリア活性化の顕著な変化は、ミクログリア細胞総数の拡大・縮小、あるいは常在集団におけるIba-1+発現の調節、あるいはその両方を反映している可能性がある。CNSミクログリア集団は絶えず急速にリモデリングしており[6]、FMTの設定において細胞数の変化とIba-1発現の変化を区別することは困難である。長期的なイメージング、系統追跡マウスモデル、パルスチェイス研究は、これらの区別に取り組む上で有用であろう。
腸管バリアの完全性の喪失と循環炎症性サイトカイン濃度の上昇は、炎症性表現型へのCNSミクログリアの偏光と関連し[11, 73, 109]、神経変性疾患を促進する[10, 13, 48]。これらのデータに従って、我々は、高齢のドナーの微生物叢を若いレシピエントに移植した後に、バリア整合性の破壊と細菌の転座の増加を見た。
代謝の調節は、FMTがミクログリアの活性化に影響を与える可能性があるもう一つの方法である。我々は、脂質代謝経路がヘテロクロニックFMTによって、特に若いドナー微生物叢を受け取った高齢マウスで著しく変化することを見いだした。不飽和、モノ、およびポリ不飽和脂肪酸がミクログリア機能に影響を与えるという証拠は、in vitroとin vivoの両方の研究から得られている[70]。例えば、パルミチン酸は、若いドナーの微生物叢を受けた高齢マウスで濃縮され、ミクログリア細胞において抗炎症作用を有する[58, 80, 119]。ターゲットメタボロミクスアプローチと地域サンプリングは、GI管に沿って我々の分析によって同定された特定の代謝物のレベルを決定することによって、さらなる調査に役立つであろう。CNS炎症に対するFMTの影響の他の可能なメディエーターには、微生物叢のメンバーによって誘導される炎症性サイトカインシグナリングおよび免疫調節因子、ならびに血液脳関門を通過できるマイクロベシクルを含む微生物産物の腸脳内輸送がある[45、47、124]。注目すべきは、Iba-1の数も抗生物質投与マウスで減少していることである。これは、有害な種の枯渇または除去が、有益な種の導入よりもミクログリアの炎症を制御する上でより重要である可能性を示唆するものである。本研究で使用した抗生物質は、程度の差こそあれ、血液脳関門や脳脊髄液に浸透することが可能である。したがって、抗生物質による治療が、中枢神経系に関連するあらゆる局所微生物を枯渇させることによって、脳のミクログリア反応性に影響を与える可能性も理論的にはあり得るが、脳関連マイクロバイオームの存在については依然として大きな議論の余地がある。
高齢のドナーの微生物叢を移植された若いマウスは、空間学習と記憶に障害を示すことから[33]、逆の状況において、高齢マウスへの若いドナーのFMTが認知指標に有益な影響を与える可能性があることが示唆される。しかしながら、本研究および同じく高齢マウスに若年ドナーFMTを用いた最近の研究［15］の両方において、短期空間学習および記憶の行動テストを用いた若年ドナー糞便微生物叢の移植の有益な効果は示されなかった。高齢マウスのMorris水迷路試験による長期評価では、4週間にわたって若年ドナーFMTを繰り返した後、若年ドナーFMTと高齢ドナーFMTの高齢レシピエントでいくらかの改善が見られた[15]。このことは、行動への影響にはより微妙な分析が必要かもしれないし、行動表現型を大幅に変えるには持続した微生物介入が必要かもしれないことを示唆している。我々の知見をヒトの老化の併発症に関連付けるには、高齢者における同等のFMT研究が必要である。認知障害の既往がある人がプロバイオティクスを使用すると認知力が向上するというエビデンスがいくつかありますが [31] 、加齢に伴う神経炎症性疾患および網膜疾患の調節における単一または小規模な有益微生物のコンソーシアムの有用性および有効性は、まだ解明されていません。
腸内細菌叢は網膜の炎症を制御する
腸内細菌と加齢性脈絡膜新生血管（CNV）および加齢性黄斑変性症（AMD）の発症および進行との関連性が研究されている［4、131、133］。ここでは、加齢した腸内細菌叢が網膜の炎症を促進し、RPE/BM界面で視覚機能タンパク質RPE65の発現を制御しているという最初の直接的証拠を提供します。ヒトの補体調節因子H（CFH）の多型はAMDの素因となり［35, 46, 59］、マウスのCFH欠損は補体C3の蓄積を含む網膜異常を引き起こし、著しい視覚機能不全をもたらす［28］。我々は、高齢のマウスで高レベルのC3発現が、若いドナーの微生物叢を受けた後に回復することを見出した。逆に、高齢のドナー微生物叢を若いマウスに移植すると、網膜のC3発現は高齢マウスと同レベルに上昇しました。RPE65はトランスレチノール変換により光受容体の機能を正常に保つために不可欠であり、変異や機能喪失は網膜色素変性症やAMDに関与していると言われている[21]。加齢に伴う網膜のRPE65発現の低下が、加齢したドナーの微生物叢によって誘導され、逆に若いドナーの微生物叢の移植によって救済されるという我々の発見は、加齢に伴う腸内細菌叢の機能または生成物が視覚機能を制御することを示唆している。
網膜変性症は、ミュラー細胞、ミクログリア、RPEによって発現が調整されるサイトカインおよびケモカイン産生のアップレギュレーションを誘導する[102]。若いドナーの微生物叢を移植すると、老化したマウスの網膜で上昇するCCL11（eotaxin）、CXCL11、IL-1βなどの炎症性免疫細胞の動員や炎症性シグナル伝達に関与するサイトカインが減少する［23, 62, 84］ ことから [108] 。加齢マウスやヒトに見られる血漿や脳脊髄液中のCCL11の上昇は、神経新生の低下、神経変性疾患、認知機能の低下と関連しており、CCR3との相互作用を介してAMDにおける新生血管の駆動に寄与していると考えられる[1, 93, 123]。CXCL11 のアップレギュレーションは、AMD のドルーゼン沈着に隣接する RPE 細胞で見られ [62]、その分泌は TNF および IL-1β を含む炎症性サイトカインによって誘発される可能性があります。さらに、IL-1βは、AMDを含む網膜病変の進行と関連している[130]。これらの結果を総合すると、若い微生物叢を加齢マウスに移植すると、網膜の炎症と疾患の駆動に関連する主要なサイトカインの発現が低下することが示された。
微生物叢が網膜の補体発現に影響を与えるもっともらしいシナリオの1つは、これらの変化が、老化マウスおよび老化ドナーFMTで処理した若いマウスの両方において、腸から全身循環への微生物産物の漏出および／または全身性炎症性サイトカインシグナルのアップレギュレーションの結果であるということである。このことは、網膜のように代謝や循環の入力や要求が高い組織に特に影響を与える。また、ヘテロクロニックFMTが血中LBP濃度を変化させるという我々の発見が裏付けるように、血液中の細菌毒素に対する急性期反応の一部として肝臓で補体発現が亢進し、網膜膜での補体タンパク質の蓄積につながる可能性もある。
メタゲノム解析の結果、若いドナーの微生物相が、加齢による目の健康維持に重要なビタミンにプラスの影響を与えることが確認された。光受容体の維持と網膜血管の健康状態の制御に重要なビタミンB合成経路は、若いドナー微生物叢の高齢レシピエントでは豊富に存在したが、高齢ドナー微生物叢の若年レシピエントでは枯渇していた。ビタミンB群の欠乏は、網膜色素変性症や緑内障に関与しており、食事による補給で改善することができる[24, 114]。腸内細菌叢によるビタミンB産生のうち、宿主が利用できる量がどの程度なのかは現在のところ不明である。しかし、我々の結果は、網膜RPE65発現を調節するためにビタミンBレベルの食事または薬物補充と組み合わせた微生物の調節が、網膜疾患の治療および高齢者の目の健康維持全般において治療価値を持つ可能性があることを示唆している。
結論
我々の結果は、マウス腸内細菌叢の加齢に伴う変化が、腸管バリアの崩壊、網膜や脳に影響を及ぼす全身および組織炎症に寄与しているが、これらの変化は若いドナー微生物叢との交換により逆転させることができることを実証している。眼と脳における若いドナーの微生物叢の移植の有益な効果の長期的持続性を評価するためのさらなる研究は、FMTが高齢者の長期的な健康利益を促進し、加齢に伴う神経変性や網膜機能低下を改善できるかどうかを確立することになる。
データおよび資料の入手
詳細な情報およびリソースや試薬のリクエストは、主席研究員のSimon R. Carding (simon.carding@quadram.ac.uk)までお願いします。
略語
Abx:
抗生物質
AMD：加齢黄斑変性症
加齢黄斑変性症
BM：ブルッフ膜
ブルッフ膜
C3:
補体成分3
CNS：中枢神経系
中枢神経系
FMT:
糞便微生物培養法（Fecal microbiota transplant
GI：消化管
消化器
イバ-1
イオン化カルシウム結合アダプタータンパク質1
I-FABP:
腸管脂肪酸結合蛋白質
LBP
リポポリサッカライド結合蛋白質（Lipopolysaccharide-binding protein
LPS
リポポリサッカライド
NGS
次世代シーケンサー
NMR:
核磁気共鳴
PBS:
リン酸緩衝生理食塩水
RPE:
網膜色素上皮（Retinal pigment epithelium
RPE65:
網膜色素上皮特異的65kDa蛋白質
(S/M/L) CFA:
短鎖、中鎖、長鎖脂肪酸
SPF:
特定病原体非含有
TNF
腫瘍壊死因子（Tumor necrosis factor
WGS:
ホールゲノムショットガン
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Thevaranjan N, Puchta A, Schulz C, Avee Naidoo JC, Szamosi CP, Verschoor DL, et al. Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction.加齢に伴う微生物の異常は腸管透過性、全身性炎症、マクロファージ機能障害を促進する。Cell Host Microbe. 2017;21(4):455–466.e4. https://doi.org/10.1016/j.chom.2017.03.002.
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論文
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謝辞
動物飼育と動物福祉の確保について、イースト・アングリア大学のDisease Modelling Unitのスタッフに感謝する。また、NMRにご協力いただいたSergey Nepogodiev博士、原稿にコメントをいただいたAlan Walker教授とJudith Pell博士に感謝する。
データおよびコードの入手方法
本研究で作成したメタゲノム解析用リードは、SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) のアクセッション番号PRJNA706366で自由に利用できます。コード 本研究でメタボローム・メタゲノムデータを解析するために作成したRコードは、https://github.com/StfnRomano/Parker_et_al_Inflammaging で公開されています。
資金提供
本研究は、BBSRC Core Capability Grant BB/CCG1860/1, project grant BB/N000250/1, BBSRC Institute Strategic Programme Grant Gut Microbes and Health (BB/R012490/1) とその構成プロジェクト BBS/E/F/000PR10353, BBS/E/F/000PR10355, BBS/E/F/000PR10356 により実施されたもので、Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) からの支援に感謝したい。
著者情報
著者名および所属
腸内細菌と健康研究プログラム、クアドラム研究所、ノリッチ、NR4 7UQ、イギリス
Aimée Parker, Stefano Romano, Rebecca Ansorge, George M. Savva, Andrea Telatin, David Baker, Emily Jones, Steven Rudder, L. Ashley Blackshaw & Simon R. Carding.
ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン眼科研究所（ロンドン、EC1V 9EL、英国
アスマー・アボエルヌール＆グレン・ジェフェリー
イースト・アングリア大学ノリッチ医学部、ノリッチ、NR4 7TJ、英国
グエナエル・ル・ガル、マシュー・G・ポンティフェックス、デビッド・ヴォズール、サイモン・R・カーディング
寄稿
AP：概念化、方法論、調査、形式的分析、データの可視化、原稿の原案：レビューと編集。SR：データキュレーション、形式分析、調査、方法論とコード開発、データビジュアリゼーション、原稿の原案：レビューと編集。RA: データキュレーションと方法論。AA: 調査とデータの可視化 GLG：調査、形式分析。GMS: 正式な分析、方法論、原稿の確認と編集。MP：調査および解析 AT：データキュレーション EJ：サンプル取得、原稿審査 DV：方法論とデータの解釈 DBとSR：調査 LAB：監督、原稿の確認と編集。GJ：コンセプト立案、監督、資源、資金、原稿の確認と編集。SRC：コンセプト立案、監督、リソース、資金、プロジェクト管理、および原稿のレビューと編集。最終原稿は著者が読み、承認した。
連絡先
Aimée Parker または Simon R. Carding に連絡すること。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
動物を用いたすべての実験は、EUおよび英国内務省の法律、1986年改正動物法（Animals (Scientific Procedures) Act 1986 UK）に準拠し、地元の動物福祉および倫理審査機関の承認に従って実施された。
論文発表の同意
該当なし
利害関係者
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場をとっています。
補足情報
追加ファイル 1: 表S1.
存在量の差の表（種）。Fig. 6B と Figure S3B に関連する。別の Excel ファイルとして提供される。
追加ファイル2: 表S2.
存在量の差の表（ファミリー）。図 S3A に関連。別のExcelファイルとして提供。
追加ファイル3: 表S3.
NMR解析による糞便中の生代謝物濃度。図 S4 に関連。別のExcel表として提供。
追加ファイル4: 表S4.
FMT前とFMT後で異なる代謝経路の完全なリスト。図 7 に関連。別のExcelファイルとして提供。
追加ファイル5: Figure S1.
Fig.2.に関連。脳梁のIba-1+細胞密度は腸内細菌叢によって制御されている。(A) Iba-1+ミクログリアを免疫染色（赤）、核をHoechst（青）で対比染色し、脳矢状断面の脳梁（漫画で強調）で同定した。(B）若齢、老齢、および高齢のマウスを、PBSのみで処理、抗生物質（Abx）のみで処理、または若齢、老齢、または高齢のドナーからのFMTに続いて抗生物質を投与した場合の代表的な免疫染色である。Fig.2で定量化。図S2. Fig.5.に関連。抗生物質および微生物叢の移植が観察された菌種に与える影響。抗生物質処理前後、FMT後、実験終了時の観察された細菌種の数。一対比較、クラスカル・ワリス、* = P < .0001。図S3. 図6に関連。FMT後のβ多様性のクラスタリングは、ドナー年齢、および移植前と移植後に同定された細菌ファミリーの存在量の差によって駆動される。(A）若いドナーの微生物叢を受け取った高齢マウスと、若い、高齢、または老化したドナーの微生物叢を受け取った若いマウスにおける細菌ファミリーの存在量の違い。(B）若いドナーの微生物叢を受けた若いマウスに濃縮された菌種。(C）抗生物質投与後の微生物叢の生存／濃縮のみ。図S4. (1 H)-NMRで推定した糞便ペレット中の代謝物プロファイル。(A)NMRで推定した異種移植前後の若齢群および高齢群の糞便代謝物プロファイル（代謝物の全リストは補足表S3参照）を比較したPLS-DA。(B)PLS-DA解析における成分1、2、3の負荷に寄与する特定の代謝物。図S5. 高齢マウスの行動学的検査では、若年ドナーFMTと高齢ドナーFMTを受けた高齢マウスの間に差はない。(A）新規物体認識（NOR）試験および（B）Y迷路試験の結果：若年マウス（n = 11）、高齢マウス（n = 20）、高齢マウス＋若年ドナーFMT（Y-FMT）（n = 10）、高齢マウス＋高齢ドナーFMT（A-FMT）（n = 10）。エラーバーは95％CIを示す。図S6. メタゲノムシーケンスデータにおけるサンプルごとのリード数。(A）ビーズウォームプロット、（B）ヒストグラム、（C）散布図、トリミングおよび除染したメタゲノムシーケンスデータのサンプルごとのリード数を示す。全グループの全マウスから採取したサンプル。図S7. FMT前後の若齢および高齢グループ内のマウス間のメタゲノムサンプル間の変動を描写したバブルプロット。図S8. FMT前後の高齢者グループ内のマウス間のメタゲノムサンプル間のばらつきを描いたバブルプロット。
追加ファイル6.
主要リソース表。
権利と許可
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この記事の引用
Parker, A., Romano, S., Ansorge, R. et al. Fecal microbiota transfer between young and aged mice reverses hallmarks of the aging gut, eye, and brain.（若齢マウスと高齢マウスの糞便マイクロバイオータ移転は、腸、眼、脳の老化の特徴を逆転させる。Microbiome 10, 68 (2022). https://doi.org/10.1186/s40168-022-01243-w
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受付終了
2021年12月03日
受理済
2022年2月04日
掲載
2022年4月29日発行
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