高タンパク質食に応答する腸内ホルモンがショウジョウバエの行動と代謝の最適化を制御する

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公開：2024年12月30日
高タンパク質食に応答する腸内ホルモンがショウジョウバエの行動と代謝の最適化を制御する

A high-protein diet-responsive gut hormone regulates behavioral and metabolic optimization in Drosophila melanogaster - Nature Communications

吉成勇人、西村隆、...丹羽竜介 著者を表示
Nature Communications 15巻、論文番号： 10819 (2024) Cite this article

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Abstract
タンパク質はすべての生物にとって必須であるが、過剰なタンパク質摂取は高アンモニア血症などの弊害をもたらす。タンパク質不足に対応するメカニズムについてはよく研究されているが、生物がタンパク質の過剰摂取を適応的に抑制する仕組みについての理解には大きな隔たりがある。本研究では、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）を用いて、高タンパク食（HPD）に応答して腸内分泌細胞から分泌されるペプチドホルモンCCHamide1（CCHa1）が、タンパク質の過剰摂取を抑制するために不可欠であることを発見した。腸由来のCCHa1は、短い神経ペプチドFを産生する腸ニューロンの小さなサブセットに受け取られ、それによってタンパク質特異的満腹感を調節している。重要なことは、CCHa1を介する腸-腸ニューロン軸が障害されると、HPD条件下でアンモニアが蓄積し、寿命が短くなることである。これらの知見を総合すると、食事によるタンパク質の過剰摂取を予防し、それに適応するための生理的反応を組織化する、腸管ホルモンと神経細胞経路のクロストークが明らかになる。

論文:アミノ酸欠乏に対するショウジョウバエの微生物-腸-脳軸の反応
論文: 2021年05月05日
糖質食欲を抑制し、ショウジョウバエの食物選択を制御する腸内ホルモン
論文: 2022年11月07日
栄養ストレス下で食物摂取と代謝恒常性を制御する腸内ホルモン、アラトスタチンC/ソマトスタチン
論文: 2022年02月04日
はじめに
タンパク質は、すべての生物にとって不可欠な大栄養素である。様々な生物種において、食物タンパク質の摂取は成長、代謝、繁殖、寿命を制御し、アミノ酸の感知は栄養環境への適応に極めて重要である。動物が食餌性タンパク質の制限に反応するメカニズムは広く研究されている。例えば、タンパク質が不足すると、必須アミノ酸（EAA）は重要な栄養素となり、一般制御非抑制性2（GCN2）と活性化転写因子4（ATF4）からなる経路や、ラパマイシン複合体1（mTORC1）経路によって感知される1。最近では、非必須アミノ酸（NEAA）であるチロシンとシステインが、ショウジョウバエの低タンパク食に対する局所的・全身的な適応反応を支配していることが示されている2,3。

一方、動物が十分なタンパク質を摂取すると、様々なメカニズムによってタンパク質の過剰摂取を抑制することができる。特に、高タンパク食（HPD）は、脂肪や炭水化物の等カロリー負荷よりも強い摂食抑制を引き起こす。この抑制は、食餌中のタンパク質含量に基づいて摂食行動を適応的に調節する生物の能力に関連しており、高タンパク質食は摂食量を抑制する傾向があり、低タンパク質食は摂食量を増加させる傾向がある4,5。重要なのは、タンパク質の過剰摂取が高アンモニア血症などの悪影響をもたらすことである6。しかし、タンパク質が過剰に摂取された場合の応答機構は、タンパク質が不足した場合の応答機構に比べて、まだほとんどわかっていない。

キイロショウジョウバエは、神経回路や行動が単純であることから、栄養感知や食物選択のメカニズムを研究する代表的なモデル生物として登場した7,8,9,10。ショウジョウバエは代謝的・生理的要求に基づいて食物を選択する。例えば、飢餓後に食物を摂取するハエは、タンパク質よりも糖質を好む8。さらに、産卵の必要性が高まった交尾後の雌は、タンパク質が豊富な餌を選択的に摂取する10。このような適応行動の基礎となるメカニズムには、個体レベルで適切な行動反応を生み出すために、内的・外的手がかりを統合する高度な意思決定システムが関与していると考えられている。

本研究では、D. melanogasterを用いて、HPD下で高アンモニア血症を回避するためにタンパク質の過剰摂取を抑制するメカニズムに光を当てた。具体的には、腸内分泌細胞（EEC）から分泌される神経ペプチドCCHamide1（CCHa1）が、タンパク質の過剰摂取を抑制することを明らかにした。キイロショウジョウバエのEECもまた、糖などの栄養素に応答してホルモンを分泌し、摂食関連事象や代謝を制御している11,12,13,14,15,16,17,18。ここで我々は、CCHa1を産生するEECが過剰なタンパク質にポジティブに反応することを発見した。さらに、腸由来のCCHa1は腸管ニューロンの限られた集団によって受容され、短型ニューロペプチドF（sNPF）を産生する。これらの腸管ニューロンは、フルクトース受容体であるGustatory receptor 43a（Gr43a）陽性近傍ニューロンと交信することにより、栄養特異的な満腹感とHPDに対する代謝を調節する。これらの知見を総合すると、食事性タンパク質の過剰摂取を予防し、それに適応するための生理的反応を制御する腸管ホルモンと神経細胞経路のクロストークが明らかになる。

結果
中腸CCHa1はメスショウジョウバエの摂食行動を制御する
本研究の最初の目的は、どの腸内分泌ホルモンがメスショウジョウバエの
摂食に影響を与えるかを調べることであった。この目的のために、成虫EECにおいて同定された各腸内分泌ホルモンをノックダウンし、キャピラリーフィーダーアッセイ（CAFÉ）アッセイを用いて24時間の摂食量を定量した。成体EEC特異的ノックダウンには、GAL4ドライバー（prosV1-GAL4）とtub-GAL80ts（以下、pros-GAL4）を組み合わせたトランスジェニックRNAiを用いた（図1a）。本研究では、交尾によって卵形成の活性化に伴う摂餌量の増加が誘導されることから、主に処女成熟雌を対象とした10,19。

図1：中腸CCHa1はメスのショウジョウバエの摂食行動を制御している。
図1
a 実験スキームを示す腸・毛細管摂食（CAFÉ）アッセイ。 b CAFÉアッセイにおける摂食量に影響を与える腸内分泌ホルモンのスクリーニング。c 腸管EECs（prosts）、R5領域中腸EECs（AstA）、脳（nSybbrain）におけるCCHa1 RNAiを用いたCAFÉアッセイ。CCHa1（赤）、プロスペロ（白）、DAPI（青）を示す。下の画像では、白い破線が中腸の輪郭を示している。e CAFÉアッセイを用いた二択摂食実験。コントロールまたは腸特異的CCHa1 RNAiハエのスクロース（左）、酵母自己溶解物（中央）、嗜好性（右）の消費量を示す。この図と以下の2択CAFÉアッセイの図において、各ドットは8匹のハエのサンプルを示す。f CAFÉアッセイを用いた二者択一摂食実験。スクロース（左）、トリプトン（中央）、嗜好性（右）の消費量を示す。 g CCHa1 RNAiまたはコントロールのハエのスクロース（左）および酵母自己溶解物（右）の一口摂取数をflyPADシステムを用いて測定。この図と以下のflyPADアッセイの図において、点は、別々に測定された各食物源からの1匹のハエによる一口の数を示す。評価したサンプルの数（n）をグラフに示す。すべての棒グラフについて、すべてのデータポイントの平均値とSEMを示す。点による箱形プロットでは、中央値、25パーセンタイル、75パーセンタイルの線を示す。ひげは、25パーセンタイルと75パーセンタイルから四分位範囲間の1.5倍まで伸びている。統計： 統計：一元配置分散分析（One-way ANOVA）、ダネット検定（Dunnett『s test）（b）、両側スチューデントのt検定（two-tailed Student』s t test）（c、e、f）、両側ウィルコクソン順位和検定（Wilcoxon rank sum test）（g）。

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キイロショウジョウバエEECは、アラトスタチンA（AstA）、アラトスタチンC（AstC）、バーシコンα（Bursα）、CCHa1、CCHamide2（CCHa2）、利尿ホルモン31（Dh31）、ニューロペプチドF（NPF）、オルコキニン、タキキキニン（Tk）など、複数のペプチドホルモンを産生する20。調べた9種類のペプチドホルモンのうち、CCHa1またはAstAをノックダウンすると、摂食量が有意に増加した（図1b）。その後の解析では、RNAi動物の表現型が顕著であったため、CCHa1に注目することにした。貪食亢進の表現型は、CCHa1 mRNAの異なる領域を標的としたもう1つのCCHa1 RNAi系統（CCHa1RNAi KK）でも観察された（図1c）。また、prosts-GAL4でCCHa1をノックダウンすると、腸特異的にCCHa1 mRNAの発現が抑制されることも確認した（図1d、補足図1a、b）。これらの結果は、食物摂取の表現型がEECにおけるCCHa1の機能喪失によるものであることを示唆している。

さらに、概日行動リズム21を制御している中枢神経系（CNS）のCCHa1が摂食行動に影響している可能性を除外した。脳でのみFLPリコンビナーゼを発現するトランスジーンotd-nls::flpとtub > FRT > GAL80 > FRTを組み合わせることで、nSyb-GAL4の活性を脳に限定することができた（nSybBrain-GAL4と呼ぶ）（補足図1c）。nSybBrain-GAL4によって、脳におけるCCHa1の発現をほとんど抑制することができたが、EECsではできなかった（補足図1c）。それにもかかわらず、nSybBrain-GAL4でCCHa1を脳特異的にノックダウンしても摂食行動は促進されなかったことから、脳内のCCHa1は摂食を制御していないことが示された（図1c）。さらに、AstA上流の断片配列で駆動されるGAL4であるR65D05-GAL4でEECの後方領域（R4-5）のCCHa1をノックダウンすると、prosts-GAL4依存性のCCHa1ノックダウンと同様の方法で摂食量が増加することがわかった（図1c）。注目すべきことに、R65D05-GAL4を介したCCHa1 RNAiは、中枢神経系におけるCCHa1タンパク質レベルには影響を与えず（補足図1d）、腸由来のCCHa1が摂食行動を制御しているという我々の考えを支持した。

標準的なCAFÉアッセイに用いた餌はスクロースと酵母自己溶解物の混合物であったので、スクロースまたは酵母自己溶解物のいずれかを含む溶液を用いた二者択一CAFÉアッセイを行った。CCHa1 RNAi動物は対照動物よりも酵母自己溶解物を多く摂取したが、スクロースの摂取量は影響を受けなかった（図1e）。このことから、腸由来のCCHa1が欠損すると、酵母に対する食欲調節に選択的に影響を与えることが示唆された。酵母はD. melanogasterにとって食餌性タンパク質源であるため、タンパク質に対する食欲を直接評価するために、カゼイン消化物であるトリプトンを用いて食餌性タンパク質摂取量も調べた。CCHa1 RNAi動物は対照動物よりもトリプトンを多く摂取したことから、腸由来のCCHa1がタンパク質の満腹応答を制御していることが示された（図1f）。FlyPAD7を用いた60分間の短期摂食実験でも、CCHa1ノックダウン動物でタンパク質摂食が増加する同様の傾向が示され、これらの結果を裏付けた（図1g）。このように、我々の発見は、腸由来のCCHa1がD. melanogasterのタンパク質満腹反応の制御に極めて重要であることを示唆している。

近年、D. melanogasterの代謝および行動特性は、性的二型性を示すことが明らかになった22,23,24。そこで我々は、腸におけるCCHa1の欠損が雄のハエの行動表現型に影響を与えるかどうかを調べた。上述の雌のハエと同様に、腸特異的CCHa1ノックダウン雄は対照と比較して摂食の増加を示した（補足図1e）。しかし、メスでの反応とは異なり、オスの腸特異的CCHa1ノックダウンでは、高タンパク質摂取への優先的なシフトは見られなかった（補足図1f）。したがって、これらの結果は、腸内のCCHa1が雌雄両方のハエにおいて摂食行動を制御していることを示唆しているが、少なくとも嗜好性においては性的二型性があるようである。

CCHa1を産生するEECはHPDとアミノ酸に反応する
D. melanogasterに関する最近の研究では、特定の栄養素がEECを刺激し、腸内分泌ホルモンの分泌につながり、下流の標的臓器に影響を与えることが報告されている11,13。タンパク質と糖がCCHa1+ EECsの活性に及ぼす影響を調べるため、カルシウムレポーターシステムCaLexA25を利用し、Ca2+シグナル伝達活性の累積追跡を容易にした（図2a, b, 補足図2a）。HPDである標準食（SD）と比較して、10％ペプトン添加食は後中腸に位置するCCHa1+ EECsの活性を増加させた（補足図2a, c）。さらに、イースト菌のみ、4％イースト菌添加食、10％トリプトン添加食など、タンパク質が豊富な他の食餌もCCHa1+ EECsの活性を上昇させたが、グルコースのみの食餌はCCHa1+ EECsの活性に影響を与えなかった（補足図2b, c）。このHPD依存的なCCHa1+ EECの活性化は、雄バエにおいてHPD摂食がCCHa1+ EECを活性化し、CCHa1+ EECを介して覚醒性に影響を与えるという最近の研究と一致している16。

図2：高タンパク食とアミノ酸添加食はCCHa1+ EECsを活性化する。
図2
補給なしの標準食（SD）とHPDのほかに、NEAA、EAA、全アミノ酸（All AA）、およびNEAAの選択された組み合わせ（Mix 1、2、3）を添加した標準食を用意した。これらの混合物のアミノ酸組成は補足データ1に記載されている。 a （左）中腸後部を示す腸の図。(右）各培地で維持したEECでCa2+シグナル感受性レポーターを発現させたプロスト＞CaLexA＞GFPハエの中腸の免疫染色像。GFP（緑）、CCHa1（赤）、DAPI（青）を示す。白い破線は中腸の輪郭を示す。b (a)と同様に維持したprosts>CaLexA>GFPハエのCCHa1+ EECsのGFPシグナルの定量化。 c CAFÉアッセイによる二者択一摂食実験。d, e prosts>CaLexA > GFPハエのCCHa1+ EECのGFPシグナルの定量化。 f EECにおけるCCHa1-T2A-ノックイン-GAL4駆動GCaMP8fシグナルの連続画像。タイムスタンプは撮像開始からの経過時間を示す。白矢印は非応答者、黄色矢印は応答者を示す。 g 単一腸管から採取した6個のEECのGCaMP8f強度の代表的ヒートマップ記録。 h 異なる摂食条件下における2分以内のEECのCa2+ピークの定量化。評価したサンプル数（n）をグラフに示す。点による箱ひげ図では、中央値、25パーセンタイル、75パーセンタイルの線を示す。ひげは、25パーセンタイルと75パーセンタイルから四分位範囲間の1.5倍に伸びる。統計： 統計：一元配置分散分析に続いてDunnettの検定（b）、両側スチューデントのt検定（c）、一元配置分散分析に続いてTukeyの多重比較検定（d、e、h）。図2eの正確なp値は、+Ala, Gly vs +Ala, Pro (0.0063), +Ala, Gly vs +Ala, Tyr (0.0082), +Ala, Gly vs +2x Ala (0.000060)。

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HPDはCCHa1+ EECsを活性化することから、EECsの活性化にはアミノ酸が重要であると考えられた。これらのアミノ酸を同定するために、数種類のアミノ酸混合物をSDに添加し、CCHa1+ EECsの活性を確認した。その結果、すべてのアミノ酸とNEAAの混合物はCCHa1+ EECsを活性化したが、EAAの混合物は活性化しなかった（図2a, b）。さらに、腸由来のCCHa1をノックダウンすると、NEAA溶液の摂食が増加し、NEAA溶液への嗜好性シフトが見られた（図2c、補足図2d）。どのNEAAアミノ酸が重要であるかをさらに明らかにするため、数種類のNEAAアミノ酸のみを含む3つのグループ（Mix1、2、3）を設定して実験を行った（Methods参照）。その中で、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、プロリン（Pro）、チロシン（Tyr）を含むNEAA Mix3は、CCHa1+ EECを活性化した（図2a, b）。これらのアミノ酸を一つでも加えると、CCHa1+ EECを活性化できなかった。しかし、NEAA Mix3からAlaを取り除くと、CCHa1+ EECの活性化は消失した（図2d、および補足図2e）。これらのデータは、CCHa1+ EECの活性化にAlaが必要であることを示唆している。さらに、AlaとGlyの混合物を添加したSDはCCHa1+ EECを活性化したが、AlaとPro、またはAlaとTyrの添加は活性化しなかった（図2e）。一方、2倍量のAlaを加えてもCCHa1+ EECは活性化しなかった（図2e）ことから、AlaとGlyの組み合わせが必須であることが示唆された。CaLexAシグナルに加えて、HPDは腸内のCCHa1 mRNAレベルを増加させ、後中腸の抗CCHa1抗体で免疫染色したEECの数を増加させた（補足図2f, g）。腸内のCCHa1タンパク質レベルはHPD、NEAA、All AA、またはNEAA Mix3添加食によって増加したが（補足図2h）、CCHa1+ EECsを活性化しないEAA添加食でもCCHa1タンパク質レベルが増加したため、CCHa1タンパク質レベルは必ずしもCaLexA活性と相関しなかった（図2bおよび補足図2h）。

HPDまたはアミノ酸添加食がCa2+シグナル伝達に及ぼす影響をさらに調べるため、カルシウムセンサーGCaMP8fをCCHa1+ EECsに発現させた。これらの細胞では、HPDやAlaおよびGly添加食によって、明るさは細胞によって異なるものの、GCaMP8fシグナルが変動することがわかった（図2f, gおよび補足動画1）。この変動は、HPDあるいはAlaとGlyを添加した餌を与えたハエでは、SD餌を与えたハエよりも頻繁に起こった（図2h）。注目すべきことに、CaLexAおよびGCaMP実験では、HPDまたはアミノ酸添加食に反応したCCHa1+ EECは約半数に過ぎなかった（図2f, gおよび補足図2c）。これらの結果は、CCHa1+ EECの半数がHPDまたはアミノ酸添加食に反応し、CCHa1+ EECは不均一であることを示唆している。

EEC活性の操作が腸におけるCCHa1 RNAiと同様の効果をもたらすかどうかを調べるため、シナプス伝達と小胞エンドサイトーシスを阻害するダイナマインの温度感受性対立遺伝子シビレッツをCCHa1+ EECsに特異的に過剰発現させることで、CCHa1+ EECsの細胞活性を阻害した。この目的のために、ニューロンにおけるGAL4活性を阻害するR57C10-GAL80を採用した。CCHa1-T2A-knock-in-GAL4とR57C10-GAL80を組み合わせることで、GAL4活性をEECの後方だけに制限することができた（補足図3a）。これらの遺伝学的ツールを用いて、シビレットによるCCHa1+ EECの阻害が、EECにおけるCCHa1タンパク質の蓄積をもたらすことを確認した（補足図3b）。さらに、CCHa1の分泌を阻害すると、CCHa1 RNAiと同様に摂食量が増加し、タンパク質の摂食が促進された（補足図3c、d）。これらの知見は、CCHa1+ EECsが食事タンパク質に応答して満腹感を調節するという我々の考えを支持するものである。

タンパク質に対する食欲は、ショウジョウバエのインスリン様ペプチド（Dilps）やD. melanogasterの雌成虫における雌特異的トランスフォーマー非依存性（Fit）など、いくつかの体液性因子によって制御されている8,26。腸特異的CCHa1 RNAi動物は、コントロールと比較して、頭部におけるdilp2、dilp5、fit mRNA発現の減少を示したが、dilp3 mRNA発現は増加した（補足図3e）。これらのデータは、dilp2またはfit mRNA発現の減少がタンパク質の豊富な食物への嗜好性を喚起するという以前の結果と一致している8,26。さらに、飢餓によってmRNAが減少するdilp5の発現も27,28、CCHa1 RNAi動物で減少した（補足図3e）。なお、CCHa1 RNAiの雄はfit mRNAの発現に影響を示さなかったことから、fitは雌では摂食行動を制御しているが、雄では制御していない可能性が示唆された（補足図3f）。これらのデータを総合すると、中腸EECにおけるCCHa1は、過剰な食餌タンパク質に応答して活性化することで、タンパク質摂食を抑制していることが示唆される。

sNPFニューロンにおけるCCHa1受容体は糖／タンパク質摂食バランスを制御する
次に、タンパク質満腹感の制御におけるCCHa1受容体（CCHa1-R）の役割を調べた。神経系におけるCCHa1-R発現の濃縮を示すFly Cell Atlasのデータ29と一致して、CCHa1-R-T2A-knock-in-GAL4は神経系で主に発現していることがわかった（図3a）。さらに、汎神経系GAL4（nSyb-GAL4）による神経系特異的CCHa1-Rノックダウンは、腸特異的CCHa1 RNAiと同様の摂食量の増加と摂食嗜好性の変化を示した（図3b）ことから、CCHa1は神経系を標的として摂食行動を制御していることが示唆された。

図3：sNPFニューロンにおけるCCHa1-Rは摂食嗜好性を制御する。
図3
a CCHa1-R-発現細胞で核局在GFPを発現するCCHa1-R-T2A-knock-in-GAL4>スティンガーバエの脳の免疫染色像。GFP（緑）とファロイジン（青）を示す。b CAFÉアッセイを用いた二者択一摂食実験。コントロールとニューロンCCHa1-R RNAiハエのスクロース（左）、トリプトン（中央）、嗜好性（右）の消費量を示す。嗜好性グラフにおいて、Sはスクロース、Tはトリプトンを意味する。 c CAFÉアッセイを用いた二者択一摂食実験スクリーニング。コントロール（GAL4なし）およびいくつかの神経伝達物質、細胞特異的CCHa1-R RNAi発現ハエのスクロースとトリプトン間の嗜好性を示す。コントロールとsNPFニューロン特異的CCHa1-R RNAiハエのスクロースとトリプトンの嗜好性を示す。 e sNPFニューロンで核局在GFPを発現するsNPF>stingerハエの脳（上）と腹部神経節（下：Ag）の免疫染色像。GFP（緑）とファロイジン（青）を示す。f CAFÉアッセイによる二者択一摂食実験スクリーニング。コントロール（GAL4>mCherry RNAi）と様々なsNPF-GAL4-driven CCHa1-R RNAiハエのスクロースとトリプトンの嗜好性を示す。対照および腸管sNPFニューロン特異的CCHa1-R RNAiハエのスクロースとトリプトンの嗜好性を示す。すべてのグラフにおいて、評価したサンプルの数（n）を示す。すべての棒グラフについて、すべてのデータポイントの平均値とSEMを示す。点による箱ひげ図では、中央値、25パーセンタイル、75パーセンタイルの線を示す。ひげは、25パーセンタイルと75パーセンタイルから四分位範囲間の1.5倍まで伸びている。統計：両側Studentのt検定（b, d, f, g）、一元配置分散分析（one-way ANOVA）とTukeyの多重比較検定（c）。

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タンパク質摂食を抑制するCCHa1-R+ニューロンの特定のサブセットを同定するために、いくつかのニューロンGAL4ドライバーを用いて2択CAFÉアッセイスクリーンを行った。試験した神経細胞GAL4株のうち、short NPF（sNPF）-GAL4ドライバーは、nSyb > CCHa1-RRNAiで観察されたような有意な嗜好性シフトを示した（図3c）。重要なことは、インスリン産生細胞（dilp2-GAL4）26や心窩部（Akh-GAL4）13のような摂食嗜好性に関与する細胞でCCHa1-Rをノックダウンしても、摂食嗜好性のシフトは生じなかったことである（図3c）。さらに、睡眠を制御するキノコ体のCCHa1-R+ニューロンのサブセット16におけるCCHa1-R RNAiも、摂食嗜好性に影響を与えなかった（図3c）。別のUAS-CCHa1-R RNAi株（UAS-CCHa1-RRNAi VDRC）でも、同様の嗜好性の変化が見られた（図3d、補足図4a）。

sNPF-GAL4は神経系の100以上のニューロンを標識したので（図3e）、sNPFニューロンをさらに制限してみた。この目的のために、sNPFプロモーターGAL4ドライバーを用いて2回目のスクリーニングを行った。スクロースとトリプトンに対する摂食嗜好性はGAL4系統間で異なるが、異なるmRNA配列を標的とする2つのRNAi系統を用いたCCHa1-Rノックダウンにより、スクロースからトリプトンへの摂食嗜好性のシフトが誘導されたのはsNPFTH-GAL4ドライバー30のみであった（図3f, g）。そこで、タンパク質摂食を抑制する腸由来CCHa1の標的として、sNPFTH-GAL4+ニューロンに注目した。

2対または3対の腸sNPFニューロンが摂食バランスを制御している
次に、sNPFTH-GAL4の発現パターンを解析した。興味深いことに、sNPFTH-GAL4ドライバーは、脳、腹部神経節、腸のEECsのいずれのニューロンも標識しなかったが、一方、低脳神経節（HCG）31,32では2対または3対の腸管ニューロンを標識した（図4a, b, 補足図5a）。sNPFTH-GAL4+腸管ニューロンは抗sNPF/NPF抗体と共標識された。さらに、それらのシグナルはsNPFノックダウンおよびsNPFヌル変異体では消失し、それらがsNPF産生ニューロンであることが示された（補足図5b、c）。注目すべきことに、腸管sNPFニューロンはCCHa1-R-T2A-knock-in-GAL4ドライバーで標識されており、CCHa1-Rが腸管ニューロンで発現していることが示唆された（補足図5d）。腸管ニューロンでsNPFをノックダウンするか、sNPF遺伝子欠損変異体を作ると、CCHa1/CCHa1-Rシグナル伝達の消失と同様に、摂食嗜好性の著しい変化が見られた（図4c、補足図5e）。さらに、sNPFのノックダウンは、短期間の一択FlyPAD実験において、酵母の自己溶解物の摂取を増加させた（図4d）。これらのデータは、CCHa1-R+腸管ニューロンにおけるsNPFが、タンパク質摂食を抑制する上で重要であることを示唆している。

図4：腸管sNPFニューロンはsNPFを介して摂食行動を制御している。
図4
a sNPFTH>刺胞ハエの脳（左）と腹部神経節（右：Ag）の免疫染色像。GFP（緑）とファロイジン（青）を示す。b 中腸の図（上）とsNPFTH>針ハエのHCGニューロンの免疫染色像（下）。GFP（白）、sNPF/NPF（赤）、DAPI（青）を示す。c CAFÉアッセイを用いた二者択一摂食実験。コントロールと腸管sNPFニューロン特異的sNPF RNAiハエのスクロース（左）、トリプトン（中央）、嗜好性（右）の消費量を示す。 d flyPADシステムを用いて測定したsNPF RNAiハエとコントロールハエのスクロース（左）と酵母自己溶解物（右）の一口数。e 標準飼料（SD）または10%ペプトン添加高タンパク質飼料（HPD）で飼育したsNPFTH>CaLexA>GFPハエの腸管sNPFニューロンの疑似カラー画像。蛍光シグナル(GFP)は擬似カラーであり、高強度から低強度はカラースケールで暖色(黄色)から寒色(青色)として表示される。f 腸管sNPFニューロンのCaLexA駆動GFP強度の定量化。 g CAFÉアッセイを用いた二者択一摂食実験。コントロールと腸管sNPFニューロン不活性（sNPFTH>シビレバエ）のスクロースとトリプトンの嗜好性を示す。 h GPCR::Tangoシステムの説明図。リガンド結合により活性化されると、β-アレスチン-TEVがGPCRにリクルートされ、TCSを切断し、LexAをGPCRから放出する。 i コントロール（GAL4ドライバーなし）またはCCHa1-R-ノックイン-TangoとLexAop-mCD8::GFPを持つ腸特異的CCHa1 RNAiハエのHCGの免疫染色像。GFP（緑）、sNPF/NPF（赤）、DAPI（青）を示す。j 腸管sNPFニューロンにおけるCCHa1-R-knock-in-Tango駆動GFP強度の定量。 k CAFÉアッセイを用いた二者択一摂食実験。スクロースと酵母自己溶解物の嗜好性を示す。評価したサンプルの数（n）をグラフに示す。すべての棒グラフについて、すべてのデータポイントの平均値とSEMを示す。点による箱ひげ図では、中央値、25パーセンタイル、75パーセンタイルの線を示す。ひげは25パーセンタイルと75パーセンタイルから四分位範囲間の1.5倍まで伸びる。すべての免疫組織化学実験は少なくとも2回繰り返され、同様の結果が得られた。統計：両側Studentのt検定(c)、両側Wilcoxon順位和検定(d, j)、Holmの補正を加えたWilcoxon順位和検定(f)、一元配置分散分析にTukeyの多重比較検定を加えたもの(g, k)。

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HPDがCCHa1+ EECを活性化するという事実と一致して、sNPFTH-GAL4駆動CaLexA > GFPハエを用いて、HPDが腸管sNPFニューロンの活性化につながることを見出した（図4e, f）。さらに、CCHa1-Rをノックダウンすると、HPDを与えた条件でのGFPシグナルの増加がキャンセルされたことから、CCHa1-Rシグナルが腸管sNPFニューロンの活性化に必要であることが示された（図4e, f）。さらに、シビレッツによる腸管sNPFニューロンの活性抑制も、タンパク質への選好性シフトを示した（図4g）。CCHa1/CCHa1-RシグナルとHPDが腸管sNPFニューロンのニューロン活性を制御する一方で、CCHa1をノックダウンしても、sNPFのmRNA発現とタンパク質レベルには影響しなかった（補足図6a, b）。一方、HPDは遺伝子型に関係なくsNPF mRNAレベルを増加させた（補足図6a）。したがって、CCHa1はsNPF mRNAの発現よりもむしろ、神経細胞活性の制御を通して摂食行動を制御している。

次に取り組むべき疑問は、腸から分泌されたCCHa1が腸管sNPFニューロンに直接作用するかどうかであった。そこで、受容体シグナル伝達活性を調べることができるノックインTangoシステムを用いた33（図4h）。CCHa1-R-ノックイン-Tangoと腸特異的CCHa1ノックダウンを併用したところ、腸由来のCCHa1が欠損すると、腸sNPFニューロンにおけるCCHa1-Rシグナル伝達活性が低下することがわかった（図4i、j）。CCHa1-R-sNPF経路をさらに探索するため、EECにおけるCCHa1過剰発現の効果を調べた。EEC特異的CCHa1過剰発現は、対照（sNPFヘテロ接合体変異体）遺伝子背景ではスクロースへの嗜好性をシフトさせたが、sNPFヌル変異体ではその効果は減少した（図4k、補足図7a, b）。これらのデータは、腸由来のCCHa1が腸sNPFニューロンを介してタンパク質摂食を抑制するという我々の考えを支持するものである。

CCHa1ノックダウンにより、タンパク質満腹因子fit、dilp2、およびdilp5のmRNA発現が低下することから、sNPFノックダウン動物における発現を確認した。CCHa1ノックダウンと同様に、sNPFノックダウンはfitとdilp5の発現を減少させたが、dilp2の発現には影響を及ぼさなかった（補足図8a）。これらのデータは、メスではFitがCCHa1とsNPFを介した摂食制御に部分的に関与しているが、Fitの下流にあるDilp機能の制御は、この経路と同じ制御下にない可能性を示唆している。これらの下流因子の複雑さと一致するように、腸内で産生される摂食促進タンパク質34であるCNMamide（CNMa）のmRNA発現は、CCHa1ノックダウンによって上昇し、sNPFノックダウンには影響されなかった（補足図8b）。fitとdilpsの発現データを総合すると、様々なタンパク質満腹因子がCCHa1とsNPFの下流で摂食行動を制御しているようである。

交尾はメスの摂食行動を著しく変化させる。しかし、交尾したCCHa1ノックダウン動物とsNPFノックダウン動物の両方で、タンパク質への摂食嗜好のシフトが観察された（補足図8c、d）。これらの結果は、CCHa1-sNPFによる摂食調節が交配状態に関係なく働くことを示唆している。

神経sNPF/sNPFRシグナル伝達は摂食行動の制御に必要である
次に、腸sNPFニューロンがタンパク質摂食をどのように抑制するかを調べた。形態学的には、腸管sNPFニューロンは中腸の前部に投射し、HCGニューロンはsNPF陰性ニューロンを含む（図5a、補足図9a, b）。シナプス後マーカーであるDenMark35は、腸の神経突起に局在していた（図5a）。さらに、シナプス前マーカーであるSyt::GFPは、腸だけでなくHCG上の神経突起にも観察されたことから、腸のsNPFニューロンは両方の組織を刺激していることが示唆された（図5a）。sNPF受容体（sNPF-R）の発現は、sNPF-RT2A-knock-in-GAL4駆動核GFPシグナルによって確認された。核GFPは、sNPF陽性と陰性の両方のHCGニューロン、脳、および前腸を取り囲む内臓筋で観察された（図5b、補足図9c）。神経系のsNPF-Rをノックダウンすると摂食嗜好性のシフトが見られたが、筋肉中のsNPF-R RNAiは嗜好性のシフトに有意な影響を与えなかった（図5c、補足図9d, e）。さらに、神経細胞のsNPF-Rをノックダウンすると酵母の摂取が促進されたことから、神経系のsNPF-Rがタンパク質摂食の抑制に関与していることが示唆された（図5d）。

図5：神経系sNPF/sNPFRシグナルは摂食行動を制御する。
図5
a sNPFTH>syt::GFP、デンマークハエの前中腸の免疫染色像。GFP（緑）、RFP（赤）、DAPI（青）を示す。b sNPF-RT2A-knock-in>stinger flyのproventriculus（PV：左）とHCG（右）の免疫染色像。GFP（白）、sNPF/NPF（赤）、DAPI（青）を示す。スケールバー、50 µm（左）、20 µm（右）。 c CAFÉアッセイを用いた二者択一摂食実験。コントロールと筋肉（howts > sNPF-RRNAi）または神経細胞（nSybts > sNPF-RRNAi）特異的sNPF-R RNAiハエのスクロースとトリプトンの嗜好性を示す。Sはスクロース、Tはトリプトンを意味する。 d flyPADシステムを用いて測定したsNPF-R RNAiおよびコントロールのハエのスクロース（左）および酵母自己溶解液（右）上での一口数。 e Trans-Tango実験のイラスト（上）および免疫染色画像（下）。sNPFTH>Trans-TangoフライのHCGの免疫染色像をGFP（シナプス前ニューロン：緑）、RFP（シナプス後ニューロン：赤）、AKH（心尖体：白）、DAPI（青）で示す。RFPシグナルはHCGニューロンで観察されたが、心窩部では観察されなかった。スケールバー、20μm。評価したサンプルの数（n）をグラフに示す。点による箱ひげ図では、中央値、25パーセンタイル、75パーセンタイルの線を示す。ひげは25パーセンタイルと75パーセンタイルから四分位範囲間を1.5倍したもの。すべての免疫組織化学実験は少なくとも2回繰り返され、同様の結果が得られた。統計：両側スチューデントのt検定（c）、両側ウィルコクソン順位和検定（d）。

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腸管sNPFニューロンの下流の神経回路を知るために、Trans-Tango法を採用した。腸管sNPFニューロン主導のTrans-Tangoは、蛍光レポーターmtdTomatoによってHCGのニューロンを標識したことから、神経経路はHCGの腸管sNPFニューロンとHCGの別のニューロン群をつないでいることが示唆された（図5e）。一方、AKHで標識された心尖部（corpa cardiaca）は、腸管sNPFニューロンの近傍に位置していたが、Trans-Tangoシグナルは観察されなかった（図5e）。sNPF-RT2A-knock-in-GAL4は脳神経細胞で活性を示したので（補足図9c）、脳内のTrans-Tangoで標識された神経細胞についても調べた。その結果、上外側前膜（SLP）と食道下神経節（SEG）のニューロンがmtdTomato陽性の下流ニューロンとして標識された（補足図9f）。しかし、GAL4無添加のコントロールでも同様のシグナルが観察されたことから（補足図9g）、SLPとSEGにおけるこれらのシグナルは、Trans-Tangoの非特異的な活性化であることが示唆された。そこで、腸管sNPFニューロンの標的としてHCGニューロンに注目した。

腸管sNPFニューロンは、糖を感知するGr43aニューロンへシグナルを送る
。HCGには、ピエゾニューロンとGr43aニューロンという2種類のニューロンがある36,37。ピエゾニューロンは摂食の機械的刺激によって活性化され、Gr43aニューロンは糖の摂食によって活性化される36,37。免疫染色解析の結果、ピエゾニューロンの亜集団は腸管sNPFニューロンであるのに対し、Gr43aニューロンはsNPFニューロンとは異なることが明らかになった（図6a）。HCGニューロンのどのニューロン集団が腸管sNPFニューロンによって刺激されているかを確認するために、これらのHCGニューロンでsNPF-Rをノックダウンした。ピエゾニューロンにおけるsNPF-Rのノックダウンは、摂食アッセイにおけるタンパク質および酵母の摂取量を増加させなかった（図6b、補足図10a, b）。一方、Gr43aニューロンでsNPF-Rをノックダウンすると、腸管ニューロンでsNPFをノックダウンした場合と同様に、タンパク質の嗜好性が亢進し、酵母の自己融解物の摂取量が増加した（図6b, c, 補足図10c）。さらに、GFP Reconstitution Across Synaptic Partners（GRASP）解析により、腸管sNPFニューロンとHCG Gr43aニューロンは、おそらくシナプス結合を介して互いに接触していることが明らかになった（図6d）。重要なことは、Gr43aニューロンのGr43aのノックダウンによる糖に対する感受性の低下により、酵母の摂取量が減少し、ショ糖の摂取量が増加したことである（図6e）。一方、温度依存性陽イオンチャネルTrpA1によるGr43aニューロンの活性化は、酵母摂取量を増加させた（図6f）。これらのデータから、腸管sNPFニューロンは糖を感知するHCG Gr43aニューロンのニューロン活性を制御し、糖と酵母の摂取バランスを制御していることが示唆された。

図6：腸sNPFニューロンは糖を感知するGr43aニューロンにシグナルを送る。
図6
a Piezo>stinger（上）、Gr43a>stinger（下）のハエのHCGの免疫染色像。GFP（白）、sNPF/NPF（赤）、DAPI（青）を示す。b CAFÉアッセイを用いた二者択一摂食実験。コントロールとピエゾニューロン（ピエゾ＞sNPF-RRNAi）またはGr43aニューロン（Gr43a＞sNPF-RRNAi）特異的sNPF-R RNAiハエのスクロースとトリプトンの嗜好性を示す。d コントロール（Gr43a-LexAなし：下）とGRASP（Gr43a-LexAあり：上）のハエのHCGの免疫染色像。再構成GFP（免疫染色なし：緑）、sNPF/NPF（赤）、DAPI（青）を示す。黄色の矢印は神経が近接しているGRASPシグナルを示している。e FlyPADシステムを用いて測定した、Gr43a RNAiおよびコントロールのハエのスクロース（左）および酵母自己溶解液（右）の一口数。評価したサンプルの数（n）をグラフに示す。点による箱ひげ図では、中央値、25パーセンタイル、75パーセンタイルの線を示す。ひげは25パーセンタイルと75パーセンタイルから四分位範囲を1.5倍したもの。すべての免疫組織化学実験は少なくとも2回繰り返され、同様の結果が得られた。統計：両側Studentのt検定（b）、両側Wilcoxon順位和検定（c、e、f）。

CCHa
1またはsNPFの欠損がタンパク質摂食の調節障害をもたらすことから、機能欠損動物はHPDに関連した代謝に大きな影響を及ぼすと予想された。HPDへの適応におけるCCHa1とsNPFの役割を探るため、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析計（LC-MS/MS）を用いてメタボローム解析を行い、SD条件とHPD条件、および対照動物とEEC特異的CCHa1 RNAi動物との代謝プロファイルを比較した。いずれの遺伝子型においても、HPDはいくつかのアミノ酸レベルの上昇を含む、顕著な代謝変化をもたらした（図7a、補足図11a）。HPDはグリシン、メチオニン、アルギニンのレベルを増加させたが、これらは尿素サイクルとクレアチン・クレアチニン代謝経路を介してアミノ酸から窒素を除去するのに重要である（図7b）。パスウェイ解析から、アルギニン生合成、ピリミジン代謝、Ala/Asp/Glu代謝が有意に影響を受けていることも明らかになり、アミノ酸代謝と分解がHPD摂食によって影響を受けることが示唆された（補足図11b）。

図7：腸-HCGニューロンは尿素サイクルとアンモニウム代謝に影響を与える。
図7
a 標準食（SD）または高タンパク食（HPD）で飼育したprosts>mCherryRNAiハエの全身サンプルからのアミノ酸の相対量。b 尿素サイクルとクレアチン代謝経路の図（左）、およびSDまたはHPDで維持したコントロールと腸管特異的CCHa1 RNAiハエの選択した代謝物のヒートマップ。 c, d コントロール、腸管特異的CCHa1 RNAiハエ（c）、および腸管sNPFニューロン特異的sNPF RNAiハエ（d）の全身サンプルからのアンモニウムレベルの測定。これらのハエは実験前に3日間SDまたはHPDで飼育した。 e SDまたはHPDで飼育したコントロールおよび腸管特異的CCHa1 RNAiハエの生存曲線。 f SDまたはHPDで飼育したコントロールおよび腸管sNPFニューロン特異的sNPF RNAiハエの生存曲線。評価したサンプル数（n）をグラフに示す。すべての棒グラフについて、すべてのデータポイントの平均値とSEMを示す。生存曲線は生存曲線値と信頼区間を示す。統計：両側Welchのt検定(b)、一元配置ANOVAに続くTukeyの多重比較検定(c, d)。p値および(b)のデータは補足図12に示す。

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対照動物とCCHa1 RNAi動物を比較したところ、アルギニン生合成経路の一部であり、アンモニウムをオルニチンに取り込み、シトルリンに代謝することで無毒化する尿素サイクルに関連する代謝物のレベルに有意差が認められた38。HPD下では、CCHa1 RNAi動物はシトルリンの増加と、シトルリンの代謝産物であるアルギニノコハク酸の増加傾向を示した（図7b、補足図12a-g）。さらに、尿素サイクルと連動して機能するクレアチン代謝経路39のいくつかの代謝物も増加した（補足図12h-n）。

これらの中間産物の蓄積を考慮すると、腸特異的CCHa1ノックダウン動物の尿素サイクルはアミノ酸代謝に対応できていないのではないかと推測された。そこで、CCHa1 RNAiがアンモニウム解毒に影響を及ぼすかどうかを確認するため、全身サンプルのアンモニウム濃度を測定した。予想通り、HPDは両遺伝子型においてアンモニウム濃度を上昇させたが、CCHa1 RNAi動物はHPD給餌下でより顕著なアンモニウム濃度の上昇を示した（図7c）。さらに、腸管sNPFニューロンのsNPFまたはCCHa1-Rをノックダウンしても、アンモニウム濃度は上昇した（図7d、補足図13a）。これらの所見を総合すると、腸由来のCCHa1と腸sNPFニューロンによる腸-ニューロン軸は、タンパク質摂取と尿素サイクル能力のバランスをとるのに必須であることが示唆される。

腸由来のCCHa1およびHCGニューロンはHPD条件下での寿命に影響する
最後に、高アンモニア血症につながる尿素サイクル障害が哺乳類の生存に重大な影響を及ぼすことから、腸-ニューロン軸がHPD条件下での寿命に影響するかどうかを調べた40。実際、腸特異的CCHa1 RNAi動物は、SD条件下では対照群と比べてわずかに寿命が短縮することがわかった（図7e）。一方、HPD条件下では、寿命はより著しく短縮した（図7e）。さらに、腸sNPFニューロン特異的sNPFノックダウンもHPD条件下で寿命を短縮させた（図7f）。なお、CCHa1ノックダウンもsNPFノックダウンも、糖質制限食での寿命には影響を与えなかった（補足図13b, c）。以上の結果を総合すると、腸由来のCCHa1から腸管sNPFニューロンを介したHCG Gr43ニューロンへの中継が、過剰なタンパク質摂食を抑制し、その結果、過剰なアンモニア産生を抑制し、HPDへの全身適応に寄与していることが明らかになった（図7g）。

考察
栄養状態に応じて適切な食物を選択する能力は、代謝恒常性の維持に不可欠である。しかし、生物が代謝状態を感知・解釈して食物を選択するメカニズムは、まだ完全には解明されていない。本研究は、EECのサブセットがタンパク質含量を感知し、次いである種の腸管ニューロンが活性化され、タンパク質摂取シグナルが中枢神経系に伝達されることを示している（図7g）。より正確には、HPDは腸管ホルモンCCHa1の分泌を刺激する。CCHa1はsNPF腸管ニューロンを刺激することで、糖・タンパク質摂取と代謝バランスに影響を与える。これらの腸管ニューロンは次に、HCGの下流のGr43a糖感知ニューロンに接続する。さらに、腸由来のCCHa1と腸管sNPFは、おそらく少なくとも部分的にはアンモニアの過剰蓄積を抑制することによって、HPD条件下での成体寿命を確保している。以上のことから、我々は、ハエが異常なレベルのタンパク質を含む餌を摂取する場合、腸-腸管ニューロン-脳のコミュニケーションが最適な生存に必須であることを提唱する（図7g）。

腸管EECの活性における栄養制御
EECは栄養を摂取すると腸内分泌ホルモンを分泌する41,42。糖、アミノ酸、金属、その他の低分子を含む数多くの食物成分は、その受容体やトランスポーターを通じてEECを活性化することができる42,43,44。例えば、D. melanogasterを用いた最近の研究では、Solute Ligand Carrier 2 (SLC2)ファミリーの糖トランスポーターや味覚受容体を介して、BursαやΝPFなどのEECホルモンの放出を促進する食餌性糖質の役割が強調されている11,12,13,15。

我々は、過剰なAlaとGlyの組み合わせがCCHa1+ EECsを活性化することを見出した。これらのアミノ酸の感知には、レセプターやトランスポーターが関与している可能性がある。しかし、D. melanogasterではAlaとGlyに対する特異的なレセプターはまだ同定されておらず、腸管におけるアミノ酸トランスポーターの発現と機能については、さらに理解を深める必要がある。興味深いことに、CCHa1+ EECの活性化にはAlaとGlyの両方が必須であるため、EECはアミノ酸に関する量的情報ではなく質的情報を読み取っているようである。今後の研究では、グリシンとアラニンがどのようにEECを活性化するのかを明らかにするために、AlaとGly、およびそれらから作られる代謝物に焦点を当てるべきである。

腸由来のCCHa1はHPDに高い反応性を示し、過剰なアミノ酸の解毒に不可欠で
ある。タンパク質が豊富な食事が、様々な生物の体重減少に大きく影響することは、広範な研究によって立証されている45,46。しかしながら、HPDは腎臓の機能を損なう可能性が示唆されている47,48。我々の発見は、HPDがD. melanogasterにおいてアミノ酸由来のアンモニアを解毒するのに重要な尿素サイクル代謝経路に大きな影響を与えることを示している。さらに、腸内のCCHa1が欠損すると、尿素サイクル経路のさまざまな中間体やアンモニアのレベルが変化するらしい。最近の研究では、睡眠不足がアンモニアを含む窒素代謝を再構築し、食餌性窒素源の毒性を悪化させることが示唆されている49。加えて、我々のデータや、腸由来のCCHa1が睡眠覚醒を制御するという最近の報告16に照らせば、腸内ホルモンであるCCHa1が、摂食行動や睡眠を食事性タンパク質の量と協調的に制御することによって、窒素の摂取と排泄のバランスをとっている可能性がある。さらに、長期間にわたるCCHa1-sNPFシグナルの機能不全はアンモニアの蓄積を誘導し、その毒性はD. melanogasterの寿命を縮めると予想される。このように、D. melanogasterでは、腸由来のCCHa1は窒素代謝に顕著な影響を及ぼし、睡眠やタンパク質摂食に影響を及ぼす可能性がある。注目すべきは、睡眠不足に伴う腸内の過剰な活性酸素種（ROS）の蓄積も寿命を縮めることである50。アンモニアはミトコンドリア機能を障害し、ヒト腸管細胞における活性酸素産生を促進する51ので、腸由来のCCHa1と窒素代謝が睡眠不足依存性の活性酸素産生に関与しているかどうかは興味深い。

アミノ酸代謝に注目すると、尿素サイクルとアンモニア排出に影響するグリシンのレベル（図7d）がHPDによって上昇したことから、グリシンが他のアミノ酸や代謝産物から活発に合成されている可能性が示唆された。また、アミノ酸誘導体であるクレアチニンは、HPDの影響を最も強く受ける代謝物であることもわかった（30倍増加）。哺乳類では、クレアチニンはクレアチンの代謝産物であり、アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（AGAT）とグアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼ（GAMT）という2つの酵素の作用により、グリシンとアルギニンから合成される39。D.メラノガスターでは、これらの酵素のどちらもまだアノテーションされておらず、特徴もわかっていないが、アミノ酸をクレアチニンに変換する同様の経路が、過剰なアミノ酸の蓄積を防いでいる可能性がある。D.メラノガスターでは、AGATやGAMTと同様の機能を持つ未特定の酵素、あるいは腸内細菌叢が、HPDに応答したクレアチニン産生に関与している可能性があると推測される。アミノ酸代謝のバランスの乱れやクレアチニンの蓄積も、HPDに反応して観察される寿命短縮の根本的な原因である可能性がある。

HCGニューロンによる摂食制御
我々のデータは、代謝を最適化するためにタンパク質分解産物の産生と排泄を調節する腸とニューロンとの間に複雑な相互作用がある可能性を示唆している。我々は、HCGの腸管sNPFニューロンが、HPDに応答して腸由来のCCHa1によって活性化され、タンパク質摂食を抑制することを見出した。成体脳におけるsNPFニューロンの機能は、運動52、摂食53,54,55、概日行動56においてよく特徴付けられている。一方、HCGの腸管sNPFニューロンは、D. melanogasterの幼虫31,32ではすでに同定されているが、成体での機能は報告されていない。今回のデータは、腸管sNPFニューロンが摂食に必須な役割を持つことを示す証拠であり、末梢組織のニューロンが摂食行動を制御する方法の一例となる。sNPFは、イナゴ57、エンドウアブラムシ58、カイコ59、ミツバチ60など、さまざまな昆虫で摂食調節に関与している。特に蚊では、sNPFを受け取ることができるGタンパク質共役型受容体であるニューロペプチドY様受容体LR7が、宿主探索行動を制御している61。したがって、HCGやそれに対応する神経節にsNPFニューロンが他の昆虫にも存在するかどうか、またそれらがD. melanogasterと同じように摂食行動を制御しているかどうかを調べることは興味深い。

我々はまた、HCGのGr43aニューロンを、腸管sNPFニューロンの必須下流標的として同定した。Gr43aはフルクトース受容体として知られ、脳や口唇掌で栄養センサーとして機能している37,62が、HCGにおけるGr43aニューロンの機能は明らかにされていない。HCGのGr43aニューロンは前腸に樹状突起を持つことから、Gr43aニューロンは食餌中のフルクトースを直接感知している可能性がある36,37,63。Gr43aニューロンの関与は、タンパク質と糖の相互作用が摂食嗜好性において重要である可能性を示唆しており、今後調査が必要である。このような相互作用的な神経回路は、CCHa1による摂食意欲の操作を強めたり弱めたりする可能性がある。このシステムは、生物が代謝可能なタンパク質レベルにコミットすることを可能にしながら、栄養選択を行うために必要であろうと予想される。

Gr43aニューロンでsNPF-R RNAiを導入したハエはコントロールよりも多くのタンパク質を消費したことから、腸のsNPFニューロンはフルクトースを感知するGr43aニューロンの感受性を調節している可能性がある。注目すべきことに、Gr43aのノックダウンは砂糖と酵母の摂取をそれぞれ増加・減少させ、TrpA1による活性化は酵母の摂取を促進することから、Gr43aニューロンの活性化がタンパク質の摂取を促進するという考えが支持される。sNPFニューロンがタンパク質摂取の促進にネガティブに関与していることを考慮すると、sNFP-sNPF-RシグナルがGr43ニューロンの機能を阻害していることが予想される。sNPF-Rは、抑制性Gi/o55を含む異なるタイプのGタンパク質と結合することが注目され、sNPF/sNPF-Rシグナル伝達がGr43aニューロンの活性を抑制する可能性が高まっている。今後、糖やタンパク質の摂取によってsNPF-sNPFRシグナルとGr43aシグナルがどのように相互作用するかを調べることは興味深い。さらに将来の研究では、HCG Gr43aニューロンの下流標的の同定を試みるべきである。

哺乳類では、栄養に応答するEECが腸内分泌ホルモンを分泌し、そのホルモンは腸に樹状突起を持つ迷走神経によって受容される64,65。迷走神経の細胞体は脳幹髄質の孤束核（NTS）にあり、摂食中枢を含む視床下部とシナプスしている66。CCHa1+ EECs、腸管sNPFニューロン、HCG Gr43aニューロン間の関係は、栄養要求を制御する腸から摂食中枢への栄養情報の伝達という点で、哺乳類のシステムと部分的に類似していると思われる。

近年、哺乳類におけるタンパク質摂取量と総食事摂取量の関係を考える上で興味深い仮説として、「タンパク質レバレッジ仮説」が注目されている67。この仮説は、哺乳類が一定量のタンパク質を摂取すると、それ以上の食物の摂取が抑制されるというものである。哺乳類では、タンパク質レバレッジ仮説を説明する分子メカニズムはまだほとんどわかっていない。一方、今回発見された腸由来のCCHa1、腸管sNPFニューロン、HCG Gr43aニューロンを介したタンパク質摂取抑制機構は、ショウジョウバエの系ではあるが、この仮説に関連している可能性が高い。CCHa1は脊椎動物には保存されていないが、本研究は、哺乳類でタンパク質平均化仮説を検証する際に、腸内ホルモンとそれを受け取る神経系の重要性を示唆している。より単純なD. melanogasterのシステムと、マウスなどの他のモデル生物のシステムの違いを比較することは、栄養に反応する行動や生理的反応が原生生物と重生生物の間でどのように進化してきたかを理解するための一歩となるだろう。

方法
ハエのストックと飼育
ハエは標準的な餌（寒天8 g、グルコース100 g、ドライイースト40 g、トウモロコシ粉40 g、プロピオン酸4 mL、15% p-ヒドロキシ安息香酸ブチル（100%エタノール中）3 mL/リットル）を用い、実験前6日間、25℃で12/12時間の明暗条件下で飼育した。温度感受性 tubulin-GAL80ts を含む遺伝子型は、20 ℃で 3 日間飼育した後、29 ℃で 4 日間インキュベートし、RNAi 効果を誘導してから実験を開始した。

以下のトランスジェニックおよび変異株を用いた：prosv1-GAL4（Irene Miguel-Aliaga、MRC Londonからのギフト）、R65D05-GAL4（BDSC#39351）、nSyb-GAL4（BDSC#51941）、Akh-GAL4（BDSC#25684）、Ddc-GAL4（BDSC#7010）、TRH-GAL468（Olga V. Alekseyenko、Harvard Medical Schoolからのギフト）、Gr28b. b-GAL4（BDSC#57617）、sNPF-GAL4（京都ストックセンター#113901）、PAMMB441-GAL4（BDSC#68251）、R21C05-GAL4（BDSC#48933）、R57E07-GAL4（BDSC#46382）、 R20D06-Gal4（BDSC#48892）、R19H06-Gal4（BDSC#49840）、R20F11-Gal4（BDSC#49852）、R21A12-Gal4（BDSC#48925）、R19H12-Gal4（BDSC#48869）、 R20B12-GAL4（BDSC#48880）、R20E08-GAL4（BDSC#49851）、sNPFTH-GAL4（BDSC#51991）30、dilp2-GAL4（BDSC#37516）、how-GAL4（BDSC#1767）、 Gr43a-GAL4（テキサス A&M 大学、Chika Miyamoto および Hubert Amrein からの寄贈）37, Piezo-GAL4（BDSC#59266）、tub-GAL80ts（BDSC#7019）、R57C10-GAL80（ワシントン大学、James W. Truman、University of Washington）、UAS-CCHa1（本研究）、UAS-stinger（BDSC#84277）、UAS-myr::GFP（BDSC#32198）、UAS-trans-Tango（BDSC#77124）、CaLexA；UAS-mLexA-VP16-NFAT、LexAop-rCD2-GFP（BDSC#66542）、UAS-syt:： GFP、デンマーク（BDSC#33065）、GRASP； UAS-CD4-spGFP1-10、LexAop-CD4-spGFP11（BDSC#58755）、UAS-GCaMP8f（BDSC#92588）、UAS-TurboRFP（京都ストックセンター#118640）、UAS-LacZRNAi（東京大学三浦雅之氏より寄贈）、UAS-mCherryRNAi（BDSC#35785）、UAS-CCHa1RNAi（BDSC#57562）、 UAS-CCHa1RNAi2（VDRC#104974）、UAS-CCHa1-RRNAi（BDSC#51168）、UAS-CCHa1-RRNAi2（VDRC#103055）、tub > FRT > GAL80 > FRT（BDSC#38879）、Otd-FLP（情報通信研究機構 山本大輔氏より寄贈）69、UAS-AstARNAi（BDSC#25866）、 UAS-AstCRNAi（BDSC#25868）、UAS-TackykininRNAi（BDSC#25800）、UAS-NPFRNAi（BDSC#27237）、UAS-BursαRNAi（BDSC#26719）、UAS-CCHa2RNAi（BDSC#57183）、 UAS-Dh31RNAi（BDSC#41957）、UAS-OrcokininRNAi（BDSC#61833）、UAS-sNPFRNAi（VDRC#330564）、UAS-sNPF-RRNAi（VDRC#330347）、 UAS-AkhRNAi（BDSC#34960）、UAS-shibirets（BDSC#66599）、UAS-TrpA1（BDSC#26264）、sNPFsk470、sNPFattp（BDSC#84574）、 CCHa1knock-in-T2A-GAL471, CCHa1-Rknock-in-T2A-GAL471, CCHa1-Rknock-in-TangoVG33,71, tubP-β-Arrestin-TEV33, 13xLexAop2-mCD8: GFP33、sNPF-Rknock-in-T2A-GAL4（BDSC#84691）。

w1118、UAS-LacZRNAi、UAS-mCherryRNAiはコントロールとして用いた。補足図1e, fおよび補足図3fを除き、データはすべて雌から得た。

温度感受性tub-GAL80ts、TrpA1、またはシビレッツを含む遺伝子型は、20℃で飼育し、孵化後3日間成熟させた後、29℃で3～4日間培養してから実験を開始した。

餌の調製
各種の餌を調製するために、消化タンパク質またはアミノ酸の混合物をSDに添加した。HPDの調製には10% w/v ペプトン（Thermo Fisher Scientific #211677 ）とトリプトン（Thermo Fisher Scientific #211705 ）を用いた。本原稿では、10%ペプトン添加飼料をHPDと呼ぶ。アミノ酸添加飼料は、SDにアミノ酸を添加して調製した。必須アミノ酸またはNEAAを溶解したミックスをあらかじめ調製し、SDと同等の材料をミックス溶液に溶解した。NEAAミックスは1つの酸性グループ（NEAAミックス1）と他の2つのグループ（NEAAミックス2-3）に分けられた。具体的な成分については補足データ1を参照のこと。

UAS-CCHa1株の作製
カントン-Sハエ成虫の頭部から抽出した全RNAを用いて、逆転写（ReverTra Ace、東洋紡）によりcDNAを合成した。CCHa1遺伝子のオープンリーディングフレームは、以下のプライマー：フォワードプライマー（5′-CAAAATGTGGTACAGCAAGTGCAG-3′）およびリバースプライマー（5′-CGGAATGTTCACTTCGTTAGCTC-3′）を用いて、cDNA上でPCR（Prime STAR Max DNA Polymerase、タカラバイオ）により増幅した。PCR産物をIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いてpWALIUM10-moeベクター（RRID: DGRC_1470, Drosophila Genomics Resource Center）にクローニングした。UAS-CCHa1コンストラクトはシークエンシングで確認し、インジェクションに用いた（BestGene）。この構築物はphiC31部位特異的統合を用いて第3染色体のZH-86Fb部位に挿入した。

摂食アッセイ
CAFÉアッセイは以前に発表されたプロトコルに従って行った72。4匹の雌成虫ハエを別々のチューブ（21mLチューブ、Sarstedt、58.489）に入れ、毛細管現象により液体培地（5％スクロース＋2.5％自己溶解酵母エキス）を満たした2本の校正済みガラスマイクロピペット（5μL、Drummond Scientific Company、2-000-001-90）をスポンジキャップから挿入し、29℃、相対湿度70％で24時間飼育した。蒸発による培地の損失は、ハエのいない同一のCAFÉチャンバーからの測定値を差し引くことでコントロールした。液体培地置換の測定は手動で行った。各キャピラリーで減少した液体量から蒸発量を差し引いた量を「消費」と定義し、検査したハエの数で割って正規化し、μL/ハエ/h給餌とした。

二択CAFÉアッセイでは、8匹の雌成虫ハエを別々のチューブに入れ、毛細管現象によって5%スクロース、2%自己溶解酵母エキス（Thermo Fisher Scientific #212750 ）、2%トリプトン（Thermo Fisher Scientific #211705 ）、または10%NEAA溶液（補足データ1参照）を含む液体培地で満たされた4本の校正済みガラスマイクロピペット（5μL、Drummond Scientific Company、2-000-001-90）をスポンジキャップから挿入した。バイアルは29℃、相対湿度70%で24時間挿入した。蒸発コントロールは両方の培地に設定した。消費量はCAFÉアッセイと同じ方法で計算した。スクロース対NEAA溶液アッセイでは、CAFEアッセイの前に、ハエを5%スクロース+1%寒天飼料で24時間アミノ酸欠乏させた。

FlyPADアッセイは、以前に記載された方法7に従って行った。1%寒天で16時間飢餓させたハエ1匹を、5%スクロースまたは2.5%酵母自己溶解液のいずれかをパッチ上の1%寒天と混合したアリーナに置いた。