ドナーの糞便微生物叢で治療した潰瘍性大腸炎患者のファージオームから、疾患寛解に関連するマーカーが明らかになった

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ドナーの糞便微生物叢で治療した潰瘍性大腸炎患者のファージオームから、疾患寛解に関連するマーカーが明らかになった


Nature Communications 15巻, 記事番号： 8979 (2024)この記事を引用する

概要

バクテリオファージはヒトの腸内細菌叢において大きな影響力を持つが、細菌と比較してその研究はまだ十分ではない。これは、バクテリオファージが結果に影響を及ぼすと考えられる糞便微生物叢移植（FMT）に関する研究の限界である。ここでは、メタゲノミクスを用いて、潰瘍性大腸炎を対象としたFMTの2つの二重盲検ランダム化試験に組み入れられた患者におけるファージ集団（ファジオーム）のプロファイリングを行った。試験デザインを活用し、ファージ集団が細菌集団と同様の挙動を示し、健康な状態では時間的に安定であること、活動性の疾患では異常な生育を示すこと、抗生物質治療やFMTによって変調をきたすことを観察した。我々は、疾患寛解に関連すると推定されるバクテリオファージのドナーを同定したが、そのバクテリオファージはゲノム解析の結果、以前百寿者から分離され、B12以外のビタミンB複合体を産生すると予測されたオシロスピラ科に分類される細菌に組み込まれていることが判明した。本研究は、様々な状態におけるファージ集団の詳細な評価を提供し、バクテリオファージの追跡が疾患活動性と寛解の決定因子を同定する上で有用であることを示唆している。

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はじめに

ヒト腸内ビロームの大部分はバクテリオファージ1 で構成されており、これらは総称してヒト腸内ファージオームと呼ばれている。ファージオームの密度は、細菌密度が最も高い大腸で最も高い2。しかし、ファージオームが豊富に存在し3、微生物叢内の細菌の多様性を制御するという重要な役割を担っているにもかかわらず4、ヒトの腸内ファージオームに関する理解にはまだギャップが残っている。

腸内ファージオームは健康な状態では安定していることが報告されている5,6,7 。腸内ファジオームの構成に影響を及ぼす様々な因子は、年齢、食事、民族性、地理的条件などである（Tiamani et al.） これらの要因の中には疾患も含まれており、ファージオームの異常は、炎症性腸疾患である潰瘍性大腸炎（UC）8、9を含む様々な消化器疾患4で報告されている。

UCの治療は炎症を抑制する免疫療法が主流であるが、UC患者において微生物叢を直接操作することである程度の成功を収めている。具体的には、健康なドナーの微生物叢をレシピエントに移植する糞便微生物叢移植（FMT）が治療戦略として試みられており、有効率は30〜50％である10,11,12,13,14 。UC患者におけるFMTの影響を検討する研究の大半は、微生物叢の細菌成分に焦点を当てており、有効性に関連するさまざまな細菌の特徴を同定している15。FMTを受けたUC患者の小規模コホートについてビロームを調べたある研究では、患者とドナーのファージオームには差がないことが示唆された。対照的に、真核ウイルスは、患者と比較してドナーで低く、非応答者と比較してFMT前の反応者で低かった16。対照的に、別の研究では、FMTに反応したUC患者では、非反応者に比べてファージが少なく、バクテリオファージのレベルは粘膜IFN-γと相関していた17。マウスでは、バクテリオファージの増殖がDNA感知受容体TLR917を介して大腸炎を悪化させることが示された。

ファージオームに関する研究は、再発性Clostridioides difficile感染症（rCDI）に対するFMT研究でより一貫している。同種移植によるFMTでは、患者のビロームの組成がドナーのプロファイルにシフトすることが報告されている18 、19 。おそらくrCDIにおけるFMTの結果におけるファージオームの役割を示す最も確かな証拠は、バクテリオファージの混合物からなる無菌のドナーの糞便濾過液をrCDI患者5人に移植し、少なくとも6ヶ月間正常な便習慣を回復させたという研究である20。FMTの結果におけるファージオームの役割は、rCDIの治癒がFMT後の患者におけるドナーのCaudoviralesの存在の増加と関連しているという発見によって、さらに裏付けられている21 、22 。メタボリックシンドロームに関する研究でも、ファージオームの潜在的役割が支持されており、同種FMTによってレシピエントの腸内ファージオームがドナーのプロファイルに変化している23。また、二重盲検ランダム化プラセボ対照試験では、メタボリックシンドローム患者に無菌糞便濾過液を投与することで、レシピエントのビロームに短期間で効果が現れ、グルコース変動がわずかに改善した24。

ファージオームが細菌の多様性を調節し、rCDIにおけるFMTの転帰に寄与することの重要性が確立されているにもかかわらず、UCにおけるファージオームに関する知見に一貫性がないことから、活動性UC、FMT後、およびFMTによって誘発された疾患寛解におけるバクテリオファージ集団を調べる、さらなる十分な対照研究の必要性が強調されている。そこで我々は、UCにおけるFMTの2つの独立したランダム化臨床試験に組み入れられた患者とドナーのファージオームを、事前にウイルス様粒子（VLP）を精製することなく、糞便DNA抽出物のショットガン・メタゲノミクスを用いて解析した。臨床試験のさまざまな時点における患者とドナーの評価を通じて、臨床的に検証された健常人のバクテリオファージ集団を調査し、活動性の疾患と対比することができた。また、バクテリオファージの多様性と構成に対する抗生物質治療とFMTの影響を明らかにし、疾患寛解の推定決定因子を同定することもできた。

研究結果

2つの独立した臨床試験における患者とドナーのファージオームのプロファイリング

UC患者をFMTで治療した2つの独立した臨床試験から得られたショットガンメタゲノムデータを解析し、糞便中のバクテリオファージ集団（ファージオーム）への影響、および反応との関連を調べた。FOCUS試験の最初のデータセットでは、ベースライン時（Tx0）、FMT開始4週目（Tx4）、FMT開始8週目（Tx8）、FMT治療終了8週間後の最終フォローアップ時（TxF）のUC患者とそのドナー（ドナーバッチとそのバッチに寄与した個々のドナーの両方）がプロファイリングされた。非盲検FMTの前にプラセボ治療を開始した患者も、8週間のプラセボ治療終了時（P8）にプロファイリングされた。LOTUS試験から得られた2つ目のデータセットには、FMTを受けたUC患者のベースライン時、抗生物質投与後、FMT1週目、2週目、3週目、4週目、8週目（導入期）の検体が含まれていた。また、低用量FMTを受けた患者や休薬群の患者の維持期のサンプリングも含まれていた。LOTUS試験の延長された時間軸を補完するために、試験に参加した2人の個人ドナーの縦断的サンプリングが含まれた。FOCUSデータセットの解析により、7,066個のvOTUが同定され、そのうち2737個が分類学的に（不明ではなく）ウイルスに分類された。LOTUSデータでは113,271個のvOTUが同定され、そのうち25,941個がウイルスとして分類された。vOTU検出のばらつきは、LOTUSサンプルがFOCUSサンプルよりもかなり深い深度で配列決定された結果であると考えられ（平均リード深度±SEM：FOCUS：3415827±37684、LOTUS：36799073±1186931）、これがデータセットを別々に調査した主な理由であった。

データセット中のファージオームプロファイルの品質評価

FOCUS臨床試験の研究デザインを活用し、データとファージ検出方法の品質評価をいくつか行った。具体的には、個々のドナーと、そのドナーが提供したドナーバッチを比較した（図1A）。我々の主な評価は、バッチに含まれる個々のドナーが、含まれない個々のドナーよりもバッチに類似しているかどうかであった。ここでは、優性ファージによる寄与バイアスを排除するために、相対的な存在量に依存する指標ではなく、Jaccard類似度（vOTUの有無）を採用した。その結果、バッチに含まれる個体は、含まれない個体よりも有意に類似していることがわかった（p= 0.0034; Fig.） また、特定の個々のドナーは、バッチプロファイルへの寄与において優位性を示すことが多いことも確認された（図1Bの一番上のピンクの点は、実質的に高い類似性を示す）。この結果は、7,066個のvOTU（分類されたものと分類されていないもの）からなる全データセットで一貫していた（補足図1A ）。追加的な品質チェックとして、αおよびβの多様性指標も評価した。その結果、個々のドナーのファージオームと比較して、ドナーのバッチのファージオームは、より豊富で、より均一で、組成が異なることがわかった（図1C,D；補足図1B,C ）。これらの所見は、これらのサンプルのファージプロファイリングが成功したことを示している。

図1： ファージ同定の品質評価。

A使用したファージマイニング戦略の精度を判定するために、4～7人のドナーを組み合わせてドナーバッチを作成するFOCUS試験デザインを採用した。ウイルスとして分類されたFOCUSvOTU（n= 2737）のみが解析に含まれた。B含まれた個々のドナーに対するドナーバッチ（D1, D5, D6, D10, D11, D14, D15, D17, D19, D20, D22, D24, D25, D28, D29, D31, D32）のJaccard類似度（Yes, pink； n= 4, 7, 5, 5, 6, 6, 6, 7, 6, 5, 5, 6, 6, 7, 7, それぞれ）、バッチに含まれない（No, yellow;n= 10, 7, 9, 9, 8, 8, 8, 7, 8, 9, 9, 8, 7, それぞれ）。バッチ x インクルージョンを変数とする二元配置分散分析を用いて差異を検定した。誤差は±SEM。C個々のドナー（n= 14）およびバッチ（n= 17）におけるマルガレフ（種）の豊富さ。シャピロ・ウィルク検定による正規分布の評価後、両側Mann-Whitney検定（p< 0.0001）を用いて差を検定した（ドナー：p= 0.9537、バッチ：p= 0.0293）。誤差は±SEM。D個々のドナー（緑）とドナーのバッチサンプル（紫）間のAitchinson距離に関する主座標分析（PCO）。グループ間の差はPERMANOVAとPERMDISPを用いて検定した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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健常人のファージオームは経時的に安定している

次に、健常人のファージ集団の経時的な挙動を明らかにするために、両方の臨床試験のドナーを調べた。我々の分析のハイライトは、これらの個人が、FMTドナーに設定された高い閾値をクリアするために、広範な臨床試験によって検証された健康な状態を表していることである。FOCUS試験の14人のドナーのうち、0.3～17ヶ月の13人のドナーから追加サンプルを得たが、LOTUS試験では、2人のドナーを44週間と70週間縦断的にサンプリングした（図2A ）。FOCUSのドナーの経時的なファージ集団の組成を分析したところ、ドナー内の類似性が顕著であり（図2B）、サンプリングの時期とは無関係であった（図2C）。このことは、分類されたvOTUと分類されていないvOTUの全データセットに同じ解析を適用することで確認された（補足図2A,B ）。ほとんどのドナーからのリピートサンプルは、経時的にドナー内のファージ組成に70-80%の類似性を示したが、2つのドナーは平均以上の類似性（80%以上）を示したのに対し、別の2つのドナーは平均以下（70%未満）であったことは注目に値する（図2C ）。

図2：健常人のファージ多様性。

両臨床試験のドナーは、臨床的に健康であることが確認された個体である。AFOCUS試験（上）とLOTUS試験（下）のドナーからのサンプリング。FOCUSの14人のドナーが含まれ、ベースライン（0ヶ月）でサンプリングされた。14人中13人は、0.3ヶ月から17ヶ月の範囲で2回目のサンプリングを受けた（青い点）。LOTUSの2人のドナーが含まれ、44週間（ドナー1、n=12、ピンク）と70週間（ドナー2、n=17、青）にわたってサンプリングされた。B個々のドナーのサンプル間のBray-Curtis類似性に関する主座標分析（PCO）。ウイルスと分類されたFOCUSvOTU（n= 2737）のみが解析に含まれた。C時間（月）に対するドナー内のBray-Curtis類似度の線形回帰。中央の線は線形回帰式、折れ線は95％信頼区間を表す。DLOTUSにおける2人のドナーのサンプル間のBray-Curtis類似性に関するPCO。変動の大部分はドナー間で観察される（PCO1軸）。ウイルス（n= 25941）として分類されたLOTUS vOTUのみが解析に含まれた。ELOTUSの各ドナーからのサンプル間のBray-Curtis類似度の経時変化。値は、最初のサンプルを100%として、時間的に前のサンプルとの類似度を表す。FLOTUSの各ドナーからのサンプルにおけるマルガレフ（種）の豊かさの経時変化。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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LOTUSの2つのドナーにおいて、ドナー内変動は、ドナー間変動（変動の78.7％を占める-PCO1）と比較して最小であった（変動の3.4％を占める-PCO2）（図2D ）。このことは、各ドナーとその前のサンプルの類似性の高さ（図2E ）や、経時的なファージ数の安定性（図2F ）からも裏付けられた。このように、臨床的に健康であることが確認された人のファージ集団は経時的に安定しており、疾患を持つ患者と比較するための強固な対照となる。

UC患者は健常対照と比較して、異なるファージ集団を持っている。

次に、FOCUSのドナーと臨床試験に組み入れられた患者を比較し、UC患者でファージ集団が異なるかどうかを調べた。その結果、ベースライン時（FMT前）の患者は対照群と比較して、ファージのリッチネス（p= 0.0003）は低かったが、シャノン多様性指数（p= 0.42）は低かった（図3A ）。ファージ集団の構成も対照群とは異なっていた（p= 0.0001; 図3B）が、この差の一部は両群間の分散の差に起因しており（p= 0.042）、ファージプロファイルはドナー間よりも患者間でより大きなばらつきを示した（図3B; 補足図3A）。vOTUレベルでの差異を解析した結果、33のvOTUが患者とドナーの間で豊富に存在し、その大部分（n= 32）はドナーで濃縮されていた（図3C ）。統計的に有意ではあるが、<2 Log2FC (n= 14)のvOTU、特にvOTU465とvOTU114の解釈には注意が必要である。患者において濃縮された唯一のvOTU（vOTU_3309; Log2Fold Change=3.82）は、複数の大腸菌ゲノムと99.63%の同一性（クエリーカバレッジ99%）を示した。

図3: 活動性潰瘍性大腸炎におけるファージ多様性と健常人の比較。

ウイルスとして分類されたFOCUSvOTU（n= 2737）を解析に含めた。Aドナー（n= 14）と患者（n= 53）の間のアルファ多様性指標（マルガレフの豊かさとシャノンの多様性指数）。豊かさの差は、シャピロ・ウィルク検定（ドナー：p= 0.9537、患者：p= 0.5537）およびF検定（p= 0.0318）による正規分布の評価後、両側ウェルチのt検定（p= 0.0003）を用いて検定した。シャノン多様性の差は、シャピロ・ウィルク検定による正規分布の評価（ドナー：p= 0.6160、患者：p= 0.061）およびF検定による分散（p> 0.05）の後、両側対応のないt検定（p= 0.4256）を用いて検定した。誤差は±SEM。B個々のドナー（緑）と活動性疾患患者（紫）間のAitchinson距離に関する主座標分析（PCO）。グループ間の差はPERMANOVAとPERMDISPを用いて検定した。CZicoSeqを用いてドナーと患者間で有意に発現量が異なる（q< 0.05）と同定されたvOTU。Log2 fold-change（FC）は、ドナー（緑）と患者（紫）で濃縮されたvOTUについて手動で計算した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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抗生物質治療はファージオームを減少させる

LOTUS試験では、FMTによるドナー種の生着率を向上させるため、患者に抗生物質を前投与した。このデザインを利用して、2週間の3レジメン抗生物質療法（アモキシシリン、メトロニダゾール、ドキシサイクリン）が患者のファージ集団に与える影響を明らかにした。その結果、抗生物質投与後にファージの豊富さが減少することが確認された（図4A）。また、抗生物質の投与によってファージ集団の構成が変化することも確認された（図4 B 、補足図3B ）。しかし、予想に反して、これらのvOTUの大部分（n= 356）は、抗生物質投与後に相対量が増加した（図4D ）が、これはおそらく腸内細菌科細菌の相対量が増加したためであろう。注目すべきは、抗生物質投与後に相対的に存在量が増加したいくつかのvOTUが、アデノウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科を含む真核生物DNAウイルス科に分類されたことである（図4D）。

図4：ファージ多様性に対する抗生物質処理の影響。

ウイルスに分類されたLOTUSvOTU（n= 25941）を解析に含めた。ベースライン時の患者（Baseline、n= 31）と抗生物質治療後の患者（Post Abx、n= 32）におけるマルガレフ（種）の豊富さ。シャピロ・ウィルク検定（ベースライン：p= 0.0102、バッチ：p< 0.0001）による正規分布の評価後、両側Mann-Whitney検定（p< 0.0001）を用いて差異を検定した。誤差は±SEM。Bベースラインの患者（ベースライン、緑）と抗生物質治療後の患者（ポストAbx、紫）の間のAitchinson距離の主座標分析（PCO）。グループ間の差はPERMANOVAとPERMDISPを用いて検定した。CZicoSeqを用いたベースライン時（Baseline）と抗生物質治療後（Post Abx）の患者間のvOTUの存在量差分解析のボルケーノプロット。408個のvOTUがグループ間で有意に存在量に差があることが確認された。D有意に発現量の異なるvOTUの分類。凡例は有病率。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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糞便移植はUC患者の腸内ファージオームを改変する

我々は、糞便移植が患者の腸内ファージオームを変化させるかどうかを、抗生物質の前処置の有無にかかわらず、プラセボ治療と直接比較することによって評価した。FOCUS試験（抗生物質なし）では、FMTはプラセボで観察された以上にファージリッチネスを増加させたが、FMTを受けた患者のリッチネスはドナーバッチのレベルには達しなかった（図5A ）。FMTはプラセボと異なり、ファージ組成をドナープロファイルへと有意にシフトさせた（図5B、補足図4A）。次に、この組成シフトに寄与するvOTUをスクリーニングしたところ、ベースライン時と比較してFMT8週間後に286個のvOTUが有意に豊富であることが同定され、このうち224個のvOTUが8週間後の追跡調査でも患者に維持されていた（図5C 、補足図5 ）。224個のvOTUのうち、11個はドナーと患者を区別できる明確なマーカーであった（図5C ）。プラセボと異なるファージは見つからなかった（補足図5A）。同様に、LOTUS試験（抗生物質併用）では、FMTにより、導入群の初期段階（1～3週目、図5D 、補足図4B ）ではプラセボでは観察されなかったファージの豊富さが増加した。しかし、抗生物質で治療され、その後プラセボで治療された患者のファージの豊富さは、8週目までにベースラインまで回復したようであった（図5D 、補足図4B ）。FMTはファージ組成に有意な影響を及ぼし、ドナーの1人から採取した材料はファージの生着に非常に効果的であった（図5E 、補足図4C ）。プラセボでは、一貫してファージ数が異なることはなく（補足図6A）、FMT後のファージ数はFOCUS試験（n= 46、補足図6B,C）よりも控えめであった。この結果から、FMTはプラセボとは異なり、患者のファージオームにかなりの影響を与えることが確認され、治療効果に対するファージの寄与を考慮する必要がある。

図5：ファージ多様性に対する糞便微生物叢移植の効果。

ウイルスとして分類されたFOCUSおよびLOTUS vOTU（それぞれn= 2737およびn= 25941）は、該当する場合は解析に含めた。FOCUSドナーバッチ（ドナー、n=17）、ベースライン時（Tx0、n=53）、プラセボ 8 週間投与後（P8、n=21）、FMT 4 週間投与後（Tx4、n=53）、FMT 8 週間投与後（Tx8、n=53）、および FMT 後 8 週間のフォローアップ時（TxF、n=53）の FOCUS ドナーバッチ（ドナー、n=17）のマルガレフ（種）リッチネスとシャノン多様性指数。両測定基準の差は、Shapiro-Wilk検定による正規分布の評価後、Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定を用いて検定した。文字は統計的有意性を表す。誤差は±SEM。B全群にわたるFOCUSサンプルのAitchinson距離に関する主座標分析（PCO）。群間差はPERMANOVAとPERMDISPを用いて検定した。CFOCUSサンプルの異なる比較（FMT：Tx0 vs Tx8、FMT後のフォローアップ：Tx0 vs TxF、疾患：ドナー vs UC）においてZicoSeqで同定された有意に豊富なvOTUのベン図。DLOTUSにおけるFMT（Abx、n=14；WK1、n=15；WK2、n=13；WK3、n=11；WK4、n=12；WK8、n=10）またはプラセボ（Abx、n=18；WK1、n=18；WK2、n=17；WK3、n=15；WK4、n=12；WK8、n=13）中の経時的なマルガレフ（種）の豊富さ。差は、治療×週を変数とする二元配置ANOVAを用いて検定した（治療：p< 0.0001、週：p< 0.0001、交互作用：p= 0.0376）。Šídákの多重比較検定を適用して群間の差を同定し、統計的有意性を文字で表した。誤差は±SEM。E全群にわたるLOTUSサンプルのAitchinson距離に関する主座標分析（PCO）。PERMANOVAおよびPERMDISPを用いてグループ間の差を検定した。ドナー、n= 2人からの29検体、ベースライン、n= 31人、Abx後、n= 32人、プラセボ、n= 75検体、FMT、n= 61検体。パネルaおよびdのソースデータおよびp-値は、Source Dataファイルとして提供される。

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特定のファージが2つの臨床試験で治療反応と関連している

次に、ファージオームのどの側面がFMTの奏効と関連しているかを調べた。その結果、FOCUSの治療反応者は、非治療反応者よりもFMT後のファージリッチネスが高かったが、この差は統計学的有意差には達しなかった（図6A ）。ファージ組成は、FMT後の反応者と非反応者の間で有意ではない境界線上の差を示した（ペアワイズPERMANOVAp= 0.054、図6B 、補足図7A ）。反応者と非反応者の間の差は、vOTUレベルではより明確で、合計179個のvOTUが、反応者と非反応者の間で57個が共有され、80個が非反応者に特有で、42個が反応者に特有であることがわかった（図6C ）。LOTUSの結果はより曖昧で、非応答者はFMT後、応答者では観察されなかった有意なファージリッチネスの増加を示したが（補足図7B ）、ファージ組成に明確なパターンは見られなかった（補足図7C ）。これは、この試験が単一ドナーのデザインであったことと、非応答者がより均質なグループ（全員がより強力に生着するファージを持つドナー2を受けた（図5E ））であったのに対し、反応者は混合グループ（ドナー1を受けた者とドナー2を受けた者がいる）であったことによると思われる。LOTUSの2つのドナーはFOCUSのドナーバッチでも使用されたので、これは2つの試験で応答に関連するvOTUを同定するユニークな機会となった。FOCUS で反応した 42 個の vOTU の塩基配列を LOTUS の vOTU リストと blastn で比較し、同一性が 97%以上で、ビットスコアがロバストな 106 個の vOTU を同定した。これらの106個のvOTUを選択し、LOTUS試験における反応との関連を評価したところ、7個のvOTUが反応者に有意に濃縮されていた（図6D）。注目すべきは、7つのvOTU全てがFOCUSの1つのvOTU、vOTU_151と配列類似性を共有していたことである（vOTU_151と類似したvOTUの合計は11）。ファージオームのαおよびβ多様性指標の挙動は試験間で一貫していなかったが、我々のデータは、誘導期間中のFMTに対する反応に関連する関連vOTU群を明らかにした。

図6：ファージ多様性と糞便微生物叢移植に対する反応。

ウイルスとして分類されたFOCUSおよびLOTUS vOTU（それぞれn= 2737およびn= 25941）は、該当する場合は解析に含めた。FOCUSドナーバッチ（ドナー、n= 17）、ベースライン時非応答者（Tx0N、n= 35）、ベースライン時反応者（Tx0Y、n= 18）、FMT 後非応答者（Tx8N、n= 35）、FMT 後応答者（Tx8Y、n= 18）。両測定基準の差は、シャピロ・ウィルク検定による正規分布の評価後、ダンの多重比較検定によるクラスカル・ワリス検定を用いて検定した。文字は統計的有意性を表す。誤差は±SEM。B全群にわたるFOCUSサンプルのAitchinson距離の主座標分析（PCO）。群間差はPERMANOVAとPERMDISPを用いて検定した。Tx8NとTx8Yの間の差異を同定するために一対のPERMANOVAとPERMDISPを行った。CFOCUSサンプルの異なる比較（反応者：Tx0Y vs Tx8Y、非反応者：Tx0N vs Tx8N）でZicoSeqにより同定された有意に存在量の異なるvOTUのベン図。DLOTUSデータセットにおけるベースライン時（Baseline）とFMT後（Post-FMT）の患者間の注目vOTUの存在量の差分解析。ZicoSeqによる解析は、FOCUSで反応者で存在量の差があることが同定された42個のvOTUと相同性を示した106個のvOTUに限定した。パネルAのソースデータとp-値はSource Dataファイルとして提供される。

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奏効に関連するファージは維持療法でさらに濃縮される

LOTUS試験には小規模の維持療法群があり、奏効者は低用量FMTに無作為に割り付けられ、奏効を維持するか（n＝4）、治療から離脱して6ヵ月以内に再燃するか（n＝6、ただし糞便サンプルを経時的に採取したのは4例のみ）のどちらかであった。低用量維持FMT（1日2カプセル）は、患者が導入期に受けたカプセル数を基準に定義された25。このことがファージオームに与える影響を評価したところ、導入群と同様に、維持FMTによってファージリッチネスが増加し、FMTの中止によってリッチネスが減少することがわかった（図7A）。患者数は少なかったが、PCO1軸上のファージ組成に一貫したパターンが見られ、寛解を維持した維持FMT患者は、治療から離脱して再燃した患者と逆方向にシフトした（図7B 、補足図8A ）。次に、vOTU_151と配列が類似している11個のvOTUの変化を調べたところ、ほとんどのvOTUが低用量FMT中に増加し、治療中止とともに減少した（図7C 、補足図8B,C ）が、3個（vOTU_2578、vOTU_3315、vOTU_2838）は統計的に有意であった（図7C ）。このことから、FOCUSとLOTUSの寛解導入群では、奏効群で有意に豊富であったファージ群が、維持群では寛解との関連と一致する相対的な存在量の変化を示したことが示唆された。しかし、vOTUの相対量が低く、多重比較補正が行われていないため、これらの結果を解釈する際には注意が必要である。

図7：維持療法中または休薬中のファージ多様性。

ウイルスとして分類されたLOTUSvOTU（n= 25941）が解析に含まれた。ALOTUS試験における低用量維持FMT（n＝4人）または休薬（フレア、n＝4人）がマルガレフ（種）の豊富さに及ぼす影響。差は二元配置反復測定ANOVAで検定し、多重比較検定は未補正FisherのLSDを用いて行った。B全グループにわたるLOTUSサンプルのAitchinson距離の主座標分析（PCO）。群間差はPERMANOVAとPERMDISPを用いて検定した。FMT_i：維持療法群に移行したFMT導入療法終了時の患者、FMT_m：FMT維持療法終了時の患者、Flare_i：離脱療法群に移行したFMT導入療法終了時の患者、Flare_m：疾患フレアの前後に治療から離脱した患者。C維持FMTまたは休薬中に相対存在量が有意に変化したvOTU（各群の前後でサンプリングしたn= 4患者）。FOCUS の vOTU_151 と相同性を持つ LOTUS vOTU のみがテストされた。vOTU_2578 と vOTU_3315 は導入時の反応と関連していた。差は二元配置反復測定ANOVAで検定し、多重比較検定は未補正Fisher's LSDを用いて行った。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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反応に関連するファージはオシロスピラ科菌株に組み込まれる

次に、vOTUとFMTに対する反応との関連性を検討した。まず、塩基配列の類似性に基づいてvOTUがどのように並んでいるかを特定し、互いの関係を調べた（図8A ）。宿主と生活様式を予測したところ、標的ファージはすべてオシロスピラ科に属し、大多数（1つを除く）は温帯に生息すると予測された（図8B）。これらのファージはドナー由来のものであり、LOTUS vOTUはドナー1（100％成功したドナー）に濃縮されていた（図8C ）、そしてvOTU_151（FOCUS由来）はFOCUSのデータで同じ個々のドナーから検出されたため、検証の方法としてこのドナーのロングリードシーケンスを検討した。その結果、ロングリードデータ中に、ショートリードシーケンスで得られたvOTUと同一のコンティグ（特にcontig_6261；補足表1）がいくつか確認され、ドナー1にこのファージが存在することが検証された。さらに、vOTUは温帯性であると予測されたため、治療反応に関連する原因菌を特定するために、細菌ゲノムに組み込まれた可能性を探した。その結果、問題のvOTUとロングリードのコンティグがすべて、以前に日本から分離され塩基配列が決定された細菌、オシロスピラ科細菌CE91-St42に組み込まれたファージと同一であることを示す確かな証拠が得られた（図8D、補足表1）。この細菌の潜在的重要性を理解するために、ギャップフィルドゲノムスケールの代謝モデルを作成し、パスウェイの濃縮解析を行った。その結果、ビタミンB複合体［KEGG map00770 (B5):q= 8.63E-13, map00740 (B2):q= 1.03E-09, map00730 (B1):q= 9.64E-09, map00750 (B6):q= 6.92E-07, map00760 (B3):q= 0.00045, map00790 (B9):q= 0. 047、およびmap00780 (B7):q= 0.097]が、この細菌の予測される代謝産物の中に含まれており、さらに調べてみると、この細菌はB12を除く全てのビタミンB複合体（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9）を産生すると予測された。

図8：FMTへの反応に関連するファージの宿主細菌の同定。

AFOCUSとLOTUSのvOTUのアラインメントと、異なる解析にわたる応答との関連。アライメントはClustal Omegaを用いて行い、簡略化した代表図を示す。B目的のvOTUの宿主とライフスタイルの予測。予測はipHOPとPhaBoxを用いて行った。C2人のドナーのLOTUS vOTUの生カウントの比較。ドナー1（n= 12）は、LOTUS試験においてドナー2（n= 17）よりも高いFMT効果を示した。D日本人百寿者から分離されたOscillospiraceaeCE91-St42のゲノムに対する、注目vOTUと注目ロングリードコンティグ（Contig_6261）のアライメント。アラインメントと可視化はProkseeを用いて行った。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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考察

UCおよびFMT治療に対するバクテリオファージ集団の理解を深めるために、UCにおけるFMTの2つの独立したランダム化臨床試験から得られた個体のファージオームを解析した。その結果、バクテリオファージ集団は健常人では安定であり、活動性UC患者では豊富さと構成が変化し、マイクロバイオームの細菌成分について報告されているように、これらの患者では抗生物質とFMTによって調節できることが明らかになった。我々は、疾患の寛解と推定される特定のバクテリオファージを発見し、さらに解析を進めたところ、それらはOscillospiraceaeに分類される細菌分類群のゲノムから検出されたファージであり、以前に日本人の百寿者から分離されたものであった26。このことは、UCとマイクロバイオーム操作の文脈におけるファージ集団の重要性を浮き彫りにするとともに、FMTに対する反応の決定因子となりうる細菌分類群を推定的に同定するファージプロファイリングの能力を強調した。

バクテリオファージを解析する方法は、細菌を解析する方法よりも確立されていないため、まずFOCUS試験のドナーデザインを用いてMetaPhageから出力されるデータを評価し、vOTU数が生物学的組み合わせとどの程度一致しているかを調べた。具体的には、14人のドナーが17の異なる組み合わせのドナーバッチに含まれ、すべてのドナーの配列が利用可能であった。その結果、ファージオームの出力は頑健であり、バッチに貢献したドナーは、そうでないドナーよりも有意にバッチに類似していた。また、全てのバッチは個々のドナーよりも豊富であった。この解析で予想外だったのは、バッチ構成において特定のドナーが優勢であり、これは必ずしも同じドナーではなかったことである。これは重要な結果であり、将来的にはマルチドナーFMTの文脈で説明する必要がある。

我々は、経時的なドナーのファージオームの特徴を明らかにした。この分析の強みは、これらのドナーが広範な検査レジメン27 を通して健康であることが確認されていることである。我々は、これらのドナーのファージ集団が長期間にわたって非常に安定していることを示したが、これは健常人を対象とした過去の研究結果5 、6 、7 と一致している。本研究では、健康状態における安定性を2つの異なる文脈で示した。第一に、同一人物から1年以上離れて採取された2つのサンプルは、数週間離れて採取されたサンプルと同様である。第二に、長期間（最大70週間）にわたって、ドナー内差（3.4％）と比較して、ドナー間差が圧倒的に変動の最大要因（78.7％）であった。さらに、これらの臨床的に検証された健常人と比較することで、潰瘍性大腸炎におけるファージオーム異常症を観察することができた。潰瘍性大腸炎患者では、ファージの豊富さが低下し、ファージ組成がシフトしていた。大腸菌は腸の炎症によってコロニー形成が有利になるため、UCで濃縮されることが知られている28 。

我々は、患者のファージオームが抗生物質治療によって変化することを観察した。3レジメンの抗生物質投与が患者のファージ多様性に与える影響、特にリッチネスの縮小は、ヘリコバクター・ピロリ除菌療法（2種類以上の抗生物質投与）を受けた患者のビロームを評価した先行研究29と一致している。しかし、Wangらは6ヶ月間29までビロームに影響を与えたと報告しているのに対し、我々の患者では、抗生物質を投与された後プラセボを投与されたが、ファージの濃度と構成は8週間までにベースライン（抗生物質投与前）と有意な差はなかったという点で我々の結果は異なっている。抗生物質の投与によってファージの豊富さが変化したのは、アデノウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科などの真核生物のDNAウイルスに分類されるいくつかのファージであった。この所見の重要性はまだ不明であるが、活動性UC患者におけるベースライン時のこれらのウイルスの存在についてはさらに検討されるべきである。

我々の研究では、以前に報告されたものとは異なり16 、FMTは、抗生物質の前処理を行った場合と行わなかった場合の両方で、ファージの豊富さと構成に顕著な影響を与えた。ベースライン時のUC患者のファージ濃度が低かったのと同様に、FMTはファージ濃度を増加させ、組成をドナー側にシフトさせた。これは、FOCUS試験では、ドナーバッチ（複数のドナーから構成される）内に存在する超生理学的レベルのファージが移植されたためではないかと推測されるが、LOTUS試験では、ファージ集団のリッチネスが事前に抗生物質で枯渇した結果であった。この研究結果は、肥満と合併症の治療を受けているレシピエントのファージオームに対するFMTの影響を調査したZuppiらの最近の研究結果とも一致している30。著者らは、ドナーのファージが移植された結果、レシピエントのファージオーム構成がドナー側にシフトし、FMT後に女性でファージリッチネスが増加したことを報告している30。

主要エンドポイント（内視鏡的寛解または奏効を伴うステロイドフリーの臨床的寛解）を達成した患者と達成しなかった患者を層別化すると、ファージオームのαおよびβの多様性において、試験間で一貫した特徴は観察されなかった。例えば、FOCUSでは、FMT後のファージリッチネスが、有意ではないものの、非応答者よりも高く、異なる組成であった。注目すべきは、LOTUSでは非応答者で有意な増加がみられたにもかかわらず、FMT後のリッチネスに応答者と非応答者の差はみられなかったことである。これは、抗生物質の前処理、送達経路、単一ドナー対多ドナーのFMTを含む試験デザインの違いの結果かもしれない。多様性の指標とは対照的に、個々の分類群レベルでは、両試験を通じて一貫して反応者に濃縮されたvOTUが同定され、これらはOscillospiraceaeに分類される細菌を宿主とすると予測されるファージに対応した。このファージのゲノム解析は、このファージを高レベルで保有する有効なドナーのロングリードシークエンシングを用いたその存在の検証を含め、日本人の百寿者から分離された特定のオシロスピラ科菌株にこのファージが組み込まれている顕著な証拠を示した。この百寿者のマイクロバイオームは、腸内病原体に対して強力な二次胆汁酸のユニークなプロファイルを産生することが報告されていたが、この菌株がこの活性に寄与しているようには見えなかった26。そこで、公開されているゲノムを用いてこの細菌のゲノムスケール代謝モデルを作成したところ、ビタミンB複合体に関連する経路に富んでいることが判明した。具体的には、他の分類群からの協力を必要とせず、B12を除くすべてのビタミンB複合体を生産することが予測された。ビタミンB複合体は微生物叢の他のメンバーによる有益な短鎖脂肪酸の産生に影響を与える可能性があり31 、ビタミンB5の低レベルはIBD患者において一貫した特徴であり32 、33 、34 、35 、メタアナリシスではUC患者において血清葉酸レベルは低下しているがB12は低下していない36 。

この研究にはいくつかの限界がある。この研究結果は、VLPを精製する前のショットガンメタゲノムシーケンスによるものであり、温和なファージとプロファージを区別することはできない。DNA配列決定の結果、ウイルス解析をファージに限定しようとしたが、いくつかの真核生物DNAウイルスも同定された。将来的には、糞便抽出液に外因性ファージをスパイクして定量的なアウトプットを得るなど、VLP精製と塩基配列決定のプロトコルを最適化することも考えられる37。ビタミンB複合体の測定ができなかったため、患者におけるビタミンB複合体レベルの重要性を確認することはできなかった。今後、このファージとビタミンB複合体のレベルの関係を調べる必要がある。さらに、オシロスピラ科細菌の分類群CE91-St42およびそのファージとFMT後の臨床的解決との関連は、仮説にとどまっており、因果関係を立証するには実験的検証が必要である。オシロスピラ科細菌CE91-St42は、微生物叢の細菌成分を評価した過去の研究では、臨床的消失との関連は確認されなかった25,38,39,40;しかし、これはこの分離株とその特異的ゲノムが2022年に利用可能になった結果かもしれない。

結論として、2つの二重盲検無作為化プラセボ対照試験のデータから得られたこれらの知見は、患者とドナーのファージ集団を分析することにより、UCにおけるFMT治療に対する反応性の決定因子を同定するものである。また、ファージ集団を分析することで、健康と疾病に寄与する微生物叢の細菌メンバーなど、見過ごされていた候補を同定できることも示した。UC患者において、オシロスピラ科細菌CE91-St42に対応する細菌種、あるいはこの細菌内に組み込まれた温帯ファージを補充することによる治療効果の可能性を確立することは、この研究のエキサイティングな成果となるであろう。将来的には、最適なFMTドナーの選択におけるこれらのファージバイオマーカーの有用性を検討するとともに、これらのドナーからの無菌便濾過液がUC患者に寛解を誘導する能力を試験することも考えられる。

方法

倫理承認

FOCUS医師主導治験は、ニューサウスウェールズ大学がスポンサーとなり、St Vincent's Hospital Sydney Human Research Ethics Committee（HREC/13/SVH/69）の承認を受け、ClinicalTrials.gov（NCT01896635）およびAustralian Therapeutic Goods Administration Clinical Trial Notification Scheme（2013/0523）に登録された。LOTUS医師主導治験は、St Vincent's Hospital Sydney Human Research Ethics Committee（HREC/18/SVH/219）により承認され、Australian New Zealand Clinical Trial Registry ACTRN12619000611123に登録された。両臨床試験の参加者全員から、本試験に登録する前に書面によるインフォームドコンセントを取得し、これには本試験で報告されたメタゲノム配列決定および解析に対する同意も含まれていた。

研究コホート

FOCUS臨床試験の患者およびドナーの便サンプル（n= 285）は、Ramaciotti Centre forGenomics38,39において、2 × 250 bpケミストリー（DNAインプット1 ng）のIllumina HiSeq 2500を用いたショットガンメタゲノムシーケンスを用いてプロファイリングされた。患者およびドナーの腸内細菌叢の細菌成分は以前に評価されている39。その際、事前にVLP精製を行わず、MOBIO PowerViral RNA/DNA Isolation kit（カタログ番号28000-BUNDLE）を用いて糞便サンプルから全DNAを抽出した。本試験の盲検群と非盲検群を組み合わせる場合、サンプルにはベースライン時の患者（Tx0、n=53）、FMT4週目の同じ患者（Tx4、n=53）、FMT8週目の同じ患者（Tx8、n=53）が含まれる、 FMT治療終了8週間後の同一患者（TxF、n＝53）、試験に採用された個々のドナー（n＝14人のドナーから27検体）、および患者に移植されたマルチドナーバッチ（n＝17バッチから25検体）。また、オープンラベルFMTに移行する前に、盲検化群（P8、n＝21）で最初に8週間のプラセボ投与を受けた患者からもサンプルが採取された。53人の患者（20人が女性）の平均年齢±SDは37.50±11.83歳であった。

LOTUS臨床試験の患者およびドナーの便サンプル（n= 250）は、ショットガン・メタゲノミック・シーケンシング25,40を用いてプロファイリングされた。QIAamp PowerFecal DNA Kit（Qiagen; Chadstone, Vic, AU）を用いて便サンプルから全DNAを抽出した。全DNAの塩基配列決定（事前にVLP精製なし）は、Ramaciotti Centre for Genomics（UNSWシドニー）で行われ、イルミナDNAプレップキット（Illumina; Melbourne, Vic, AU）を用いてDNAを調製し、2x150bpケミストリーを用いてイルミナNovaSeq 6000 S4ランで塩基配列を決定した（DNAインプット500 ng）。ライブラリー調製およびシーケンス後にデータを生成しなかった2つのネガティブコントロールを含めた。本試験では、患者は抗生物質を2週間投与された後、8週間、単一ドナーFMT（n=15）またはプラセボ（n=20）のいずれかに無作為に割り付けられ、その後、FMTを受けた患者のサブセットは、低用量FMTを投与するか、治療から離脱する維持群に無作為に割り付けられた。全サンプルには、ベースライン時の患者（n＝31）、抗生物質投与後の患者（n＝32）、治療1週目の患者（n＝33）、2週目の患者（n＝30）、3週目の患者（n＝26）、4週目の患者（n＝24）または8週目の患者（n＝23）、治療20週目の患者（n＝5）、32週目の患者（n＝9）、44週目の患者（n＝3）、56週目の患者（n＝5）または治療中止の患者、ドナー1サンプル（n＝12）、ドナー2サンプル（n＝17）が含まれた。ドナーの腸内細菌叢の細菌成分は、以前に評価されている40。患者35人（女性17人）の平均年齢±SDは37.37±11.68歳であった。

ファージ同定

ショットガンメタゲノム中のファージ配列は、MetaPhageの標準操作手順（SOP）41に若干の修正を加えて同定した。簡単に説明すると、リードはMEGAHIT v1.2.942を用いてデフォルトのパラメータでアセンブルし、metaQuast v5.0.243を用いてスキャフォールドの質を評価した。5つのファージマイニングツールを用いて、アセンブルされたスキャフォールドから推定ウイルスコンティグを同定した： DeepVirFinder (v1.0)44, VIBRANT (v1.2.0)45, Phigaro (v2.3.0)46, VirSorter2 (v2.2.3)47, VirFinder (v1.1)48. 同定された配列は、CD-HIT-EST（v4.8.1）49を使用して複製解除され、コンセンサスウイルスコンティグ（現在はウイルス運用分類単位（vOTU）と呼ばれる）は、MetaPhage SOPに従ってCheckV（v0.9.0）50で評価された。その後、SOP51にあるUpSet R library (v1.4.0)に基づくRスクリプトを使用して、異なるファージマイニングツールの結果を比較し、2つ以上のツールでどれだけの数がマイニングされたかを決定した。vOTUのカウントテーブルを作成するために、Bowtie2（v2.4.2）52で前処理したリードセット中のvOTUをマッピングして定量し、SAMtools（v1.11）53で出力を処理した後、BamToCovツール（v2.0.4）54のbamcountrefsモジュールを用いてカウントテーブルを作成した。

ファージのアノテーションと分類学的分類

vOTUのアノテーションと分類には、まずMetaPhage SOPで提案されているツールを使用した。具体的には、メタゲノムモードの Prodigal（v2.6.3）55により、vOTUからオープンリーディングフレームを予測し、DIAMOND（v0.9.14）56を用いてこれらのタンパク質配列を参照データベースにアライメントし、vConTACT2（v0.9.19）57を用いて分類した。これに加え、vOTUはInternational Committee on Taxonomy of Viruses virus taxonomy profile (2021)に基づき、PhaGCN1およびPhaGCN258を用いて分類した。

データ解析

生のvOTU数を用いて、Primer-e v6でα多様性指標（Margalefの豊かさ、Pielouの均等性、Shannonの多様性指数）を算出した。 シャピロ・ウィルク検定による正規分布の検定を含め、これらの指標に関するすべての統計解析はGraphPad Prism v10を用いて行った。 β多様性は2つの方法で評価し、特に断りのない限りPrimer-e v6で解析を行った。まず、R v4.3.2（RStudio 2023.12.1 Build 402）の Tjazi パッケージ（clr_lite オプション、1000replicates）59を用いて生の vOTU カウントを中心対数変換し、続いて Primer-e v6 でサンプル間のユークリッド距離を計算した。主座標分析(PCO)を用いて距離を順序付けし、並べ替え多変量分散分析(PERMANOVA)と分散分析(PERMDISP)を用いてグループ間の差を検定した。上記の分析を検証するため、生のvOTUカウントを相対存在量（％）に正規化し、平方根変換した。Bray-Curtis類似度は変換後のデータで計算し、PCOを用いて順序付けした。群間差はPERMANOVAとPERMDISPを用いて検定した。グループ間の特定のvOTUの存在量の差は、以下の基準に従ってZicoSeq60を用いて検定した： (1)希少な分類群を除去するフィルター処理 prev.filter=0.2、max.abund.filter=0.002、(2)外れ値を置換するwinsorization outlier.pt=0.03、(3)不均一な深さを補正する事後サンプリング post.sample. no=25、(4)平方根変換と第4根変換の出力から最も高いp-値を選択、(5)参照ベースの多段階正規化（ref.pct=0.5、stage.no=6、excl.pct=0.2）、(6)ファミリー単位のエラー率制御をtrueに設定。

ファージの宿主とライフスタイルの予測

ファージの宿主はipHOP61を用いて予測し、ファージのライフスタイルはPhaBox62を用いて予測した。

ロングリードシーケンス

高分子DNAは、Blood and Cell Culture DNA mini kit, genomic-tip 20/G (Qiagen)を使用し、LOTUSドナー1の糞便サンプル(40 mg)から、製造元のプロトコールに従い、若干の修正を加えて再抽出した。糞便サンプルに溶解バッファー（RNase Aを含む）を加え、プロテイナーゼKを200μl加えた。その後、溶液をボルテックスし、50℃で2.5時間インキュベートした（15分ごとに5秒間ボルテックス）。インキュベーション後、ミックスをQiagen Genomic-tipにロードし、重力によりフロースルーを決定した。サンプルを3回洗浄し、バッファーQFで溶出した。その後、溶出したDNAに対して0.7容量のイソプロパノールを用いてDNAを沈殿させた。サンプルを4℃で15分間スピンダウンした。DNAペレットを冷70%エタノールで洗浄し、風乾した後、分子グレードの水に一晩懸濁した。ライブラリー調製は、FLO-PRO114Mフローセルでシーケンスするために、ライゲーションシーケンスキット（Oxford Nanopore Technologies社製）SQK-LSK114を用いて行った。メタゲノム配列決定は、ソフトウェアMinKNOW v22.12.5を使用し、PromethIONプラットフォームで実施した。生成されたNanoporeの生データは、Guppy v6.4.6+ae70e8fを用いてベースコールした。

ロングリードシーケンスデータのアセンブルとポリッシング

シーケンシングリードは、Flye 2.9.2-b178663を使用し、メタゲノムアセンブリーモード（metaFlye）でアセンブルした後、medaka v1.8.0（Oxford Nanopore Technologies）で1回ポリッシングしました。ロングリードアセンブリは、ショートリードポリッシャーPolypolish v0.5.064およびPOLCA v4.0.365を用いてさらにポリッシュした。ロングリードデータ中のvOTU配列の存在を検出するため、BWA-mem v0.7.18（r1243）66を用いて、ポリッシュしていないロングリード集合体とポリッシュしたロングリード集合体に対してvOTU配列をアライメントした。

vOTUアライメント

FOCUS と LOTUS のデータセットから目的の vOTU を選び、ClustalOmega67 を用いてアライメントを行った。vOTU ファスタ配列の検索は、National Center for Biotechnology Information の taxid: 2 (bacteria) に限定したヌクレオチドコレクション（nr/nt）に対してblastn68を用いて行った。OscillospiraceaeCE91-St42 のゲノムに対する目的の vOTU のアライメントとその後の可視化はProksee69 を用いて行った。

オシロスピラ科細菌CE91-St42の代謝モデルの構築

この細菌のゲノム(GenBank: AP025561.1)をRASTを用いてデフォルトのパラメータでKBaseにアノテーションした。モデルは、個別ゲノム用の ModelSEEDPipeline70,71 に基づいて KBase に実装された Build Metabolic Model App を使用して構築した。モデルは、アプリを使用してギャップフィルされた： MS2 - 'Improved Gapfill Metabolic Models'を使用した。ModelSEEDの化合物IDをKEGG IDにマッチングし（1029個の予測化合物のうち747個がマッチング）、MBRole 2.072を用いてKEGGパスウェイの濃縮解析を行った。

統計と再現性

FOCUS臨床試験は、多施設共同二重盲検無作為化プラセボ対照試験38 であった。活動性UC患者は、FMTまたはプラセボのいずれかに無作為に割り付けられた（1：1の割合）。プラセボ群にはオープンラベルのFMTが提供された。奏効率は、試験計画時の限られたデータに基づき、FMTで60％、プラセボで15％と予測された38。30％の脱落が予想されたため、修正intention-to-treat解析で両側αを0.05とし、群間差を示す確率が80％以上となるように、1群あたりn＝40が計画された38。85人の患者が登録され、そのうち42人と43人がそれぞれFMTとプラセボに割り付けられた。85人の患者のうち、81人が治療を受け、完全なサンプル採取を行った53人（Tx0、P8（該当する場合）、Tx4、Tx8、TxF）がショットガンメタゲノムシーケンス用に選択された。どの解析からも除外されたデータはなかった。

LOTUS臨床試験は二重盲検無作為化プラセボ対照試験であった25 。奏効率は、過去の文献に基づき、FMTで36％、プラセボで8％と予測された。

15％の脱落が予測されたため、修正intention-to-treat解析で両側αを0.05として、群間差を示す確率が80％以上となるように1群あたりn＝32が計画された25。本試験は、維持期における差を検出する検出力はなかった。アモキシシリン、メトロニダゾール、ドキシサイクリンを2週間投与した後、活動性UC患者を凍結乾燥FMT経口投与群（n=15）とプラセボ投与群（n=20）に無作為に割り付けた（1:1の割合）。8週目に、FMT反応者は、さらに48週間FMTを継続するか、または中止するかに無作為に割り付けられた（1：1の割合）。COVID-19パンデミックのため募集は早期に打ち切られた。患者から入手可能なすべての糞便サンプルが抽出され、塩基配列が決定され、いかなる解析からも除外されたデータはなかった。

報告概要

研究デザインの詳細については、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性

本研究で使用したFOCUS患者およびドナーのショットガンメタゲノムシーケンスデータは、European Nucleotide Archive（ENA）からアクセッション番号PRJEB26357で入手可能である。本研究で使用したLOTUSドナーのショットガンメタゲノムシーケンスデータは、ENAからアクセッション番号PRJEB50699で入手可能である。本研究の一環として作成されたLOTUS患者のショットガンメタゲノムシーケンスデータ（PRJEB58035[https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB58035]）およびロングリードシーケンスデータセット（PRJEB76864[https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB76864]）は、ENAから入手可能である。FOCUSおよびLOTUSサンプルのvOTU数表および分類の形で処理されたデータは、Zenodo（アクセッション番号13627782）[https://doi.org/10.5281/zenodo.13627782]で入手できる。その他のメタデータは対応する著者から入手可能である。ソースデータは本論文とともに提供される。

コードの利用可能性

本研究のために新たに作成したコードはない。すべてのソフトウェアのバージョンと操作手順はMethodsに引用されている。

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謝辞

著者らは、臨床試験に参加した患者およびドナー、ならびに処置に協力した病院スタッフに謝意を表したい。本研究は、米国クローン病・大腸炎財団（Litwin Award; 988415 to NOK and SP）およびオーストラリア国立保健医療研究評議会（Ideas grants APP2011047 to NOK）の支援を受けた。SPはNHMRC Investigator Grantの支援を受けている。NOKはUNSW Scientiaフェローシップの支援を受けている。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の作成には関与していない。

著者情報

著者メモ

  1. これらの著者は同等に貢献した： Marwan E. Majzoub、Sudarshan Paramsothy、Craig Haifer。

著者および所属

  1. オーストラリア、シドニー、UNSW、医学・健康学部、生物医学部

  2. マルワン・E・マズーブ、ロヒト・パータサラシー、ナディーム・O・カークーシュ

  3. シドニー大学コンコードクリニカルスクール（オーストラリア・シドニー

  4. スダルシャン・パラムソティ＆ルパート・W・レオン

  5. オーストラリア、シドニー、コンコードレパトリエーション総合病院、消化器科

  6. スダルシャン・パラムソティ＆ルパート・W・レオン

  7. オーストラリア、シドニー、UNSW、医学・保健学部、臨床医学部

  8. クレイグ・ハイファー

  9. オーストラリア、シドニー、セント・ヴィンセント病院、消化器科

  10. クレイグ・ハイファー

  11. オーストラリア、シドニー、消化器病センター

  12. トーマス・J・ボロディ

  13. オーストラリア、メルボルン、セント・ヴィンセント病院、消化器科

  14. マイケル・A・カム

  15. オーストラリア、メルボルン、メルボルン大学医学部

  16. マイケル・A・カム

貢献

構想： NOK、MEM。データ管理： MEM、SP、CH。形式分析： MEM、RP、NOK。資金獲得： NOK、SP、CH、TJB、RWL、MAK。調査： MEM、SP、CH、RP、TJB、RWL、MAK、NOK。監督： NOK。視覚化： NOK。原案執筆： NOK、MEM。執筆-校閲・編集： SP、CH、RP、TJB、RWL、MAK。著者全員が本原稿を承認した。

責任著者

Nadeem O. Kaakoushに連絡をとる。

倫理申告

競合利益

SPはVedanta Biosciences社のコンサルタントを務め、AbbVie社、Dr Falk Pharma社、Ferring社、Janssen社、武田薬品から講演料/諮問委員会委員料を受領している。CHはBiomeBank、アッヴィ、武田薬品のアドバイザリーボードを務め、ファイザー、Dr Falk Pharma、フェリング、ヤンセン、武田薬品、アッヴィから講演料／教育支援を受けている。TJBはCentre for Digestive Diseasesと利害関係があり、RedHill BioとTopelia Austのメディカルアドバイザーを務め、FMT治療の特許を保有している。RWLは、AbbVieからの個人的報酬、Aspenからの個人的報酬、Ferringからの個人的報酬、Hospira/Pfizerからの助成金および個人的報酬、Janssenからの助成金および個人的報酬、武田薬品からの助成金および個人的報酬、Shireからの助成金、Celgeneからの個人的報酬、Dr Falk Pharmaからの個人的報酬、Novartisからの個人的報酬、MSDからの個人的報酬、Chiesiからの個人的報酬、BMSからの個人的報酬、Glutagenからの個人的報酬を、提出された研究以外で得ている。その他の著者は、申告すべき利益相反はない。

査読

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Nature Communications誌は、本研究の査読に貢献いただいた匿名査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。

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出版社からの注記スプリンガー・ネイチャーは、出版された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

この記事について

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Majzoub, M.E., Paramsothy, S., Haifer, C.et al.ドナー糞便微生物叢で治療した潰瘍性大腸炎患者のファージオームから、疾患寛解に関連するマーカーが明らかになった。Nat Commun 15, 8979 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-53454-4

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  • 2024年6月16日受領

  • 受理2024年10月08日

  • 2024年10月17日発行

  • DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-024-53454-4

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Nature Communications (Nat Commun)ISSN 2041-1723 (オンライン)


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