制御配列に基づく古細菌ウイルスの防御遺伝子の発見

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公開日： 2024年05月02日
制御配列に基づく古細菌ウイルスの防御遺伝子の発見

https://www.nature.com/articles/s41467-024-48074-x

Yuvaraj Bhoobalan-Chitty, Shuanshuan Xu, ...Xu Peng 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ15巻、記事番号：3699（2024）この記事を引用する

2 Altmetric

メトリクス詳細

概要
ウイルス性抗CRISPRタンパク質（Acrs）のインシリコ同定は、既知のAcrsまたは抗CRISPR関連タンパク質（Acas）を餌として用いるguilt-by-association法に大きく依存してきた。しかし、古細菌のAcrsやAcasは数が少なく、その広がりも限られているため、guilt-by-associationを用いたAcrsの同定は困難であった。本研究では、古細菌のAcrsとAcaがウイルス感染直後に転写されることから、これらの遺伝子や他の多くの未同定の防御遺伝子（ADG）は、強力なプロモーターを含む保存された制御配列の制御下にあると仮定し、古細菌ウイルスの防御遺伝子を予測する。このコンセンサス配列に基づく方法を用いて、57の古細菌ウイルスと6つのメタゲノム集合ゲノムから354の潜在的ADGを同定した。実験的検証の結果、CRISPRサブタイプI-A阻害剤と、古細菌の毒素-抗毒素に基づく免疫系に対するウイルスにコードされた最初の阻害剤が同定された。また、guilt-by-associationアプローチと組み合わせたADGの同定をさらに促進できる、Acasに類似した制御タンパク質の可能性も同定した。これらの結果は、古細菌やバクテリアのウイルスにおけるADGを広範囲に同定するための制御配列解析の可能性を示している。

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はじめに
原核生物は、レセプター修飾、感染阻止、制限修飾システム、CRISPR-Casなど、多様な自然および適応的防御機構をコードしており、近年その特徴が明らかにされつつある1。ウイルスと宿主の軍拡競争は、細菌や古細菌の免疫システムの絶え間ない拡大と多様化をもたらし、ウイルスやその他の移動性遺伝要素（MGEs）における抗防御機構の進化を同時に引き起こしている。MGEsは、制限修飾2,3や感染阻止4,5,6システムを阻害する抗防御タンパク質をコードしていることが古くから知られている。最近では、多様な実験戦略とguilt-by-associationバイオインフォマティックアプローチを用いて、細菌ウイルスがコードする多数の抗CRISPR（Acr）タンパク質が同定されている7,8,9,10,11。

古細菌の防御機構の研究はより限定的であり、これまでのところ、表面抵抗性12,13、アルゴノート14,15,16,17、制限修飾18,19,20、および多様なCRISPR-Cas21,22,23のみが特徴づけられている。さらに、古細菌ではCRISPR-Casシステムがほぼ普遍的に存在するにもかかわらず、古細菌ウイルスでは実験的に同定されたAcrはわずか4つであり、バクテリオファージでは100以上のAcrが同定されているのとは対照的である24,25,26。これまでのところ、古細菌ウイルスに対するguilt-by-associationアプローチはほとんど適用されていない。その主な理由は、ベイトが通常、機能未知の複数のモノシストロニックORFに囲まれているからである27。配列決定されているウイルスゲノムの数が比較的少ないこと、多様な遺伝学的ツールがないこと、古細菌ウイルスの基本的な生物学的理解が比較的乏しいことが、Acrsの同定を困難にしている。ひとつの古細菌ウイルスゲノムに、機能的に未解明なAcrsのパラログが複数存在すること28も、さらに複雑さを増している。

常時発現している宿主のCRISPR-Casシステムを不活性化するためには、Acrsの初期発現が重要である。Acrの早期発現にもかかわらず、免疫抑制が確立する前に感染ウイルス粒子のかなりの部分が破壊される。ウイルスの完全駆除の回避は、Acrの早期発現とその阻害活性の有効性に依存し、これらは共にティッピングポイント、すなわち初期ウイルス密度の臨界閾値を決定する29,30,31。最近では、バーストサイズもウイルス感染全体の運命に関与していることが示されている32。Acrsの急峻な初期発現の後には、共発現するAcr associated (Aca)タンパク質31による抑制が続き、免疫抑制された宿主のリソースは、ウイルスのライフサイクルの完了に必要なウイルス遺伝子の発現へと整然と方向転換される。したがって、宿主の防御機構を阻害する遺伝子をコードする以外に、ウイルスは遺伝子発現のタイミングを正確に制御することが不可欠である。

抑制因子を早期に発現させることは、ウイルスがそのライフサイクルの初期段階でウイルスを攻撃する宿主防御システムに対抗するために極めて重要であるようだ。従って、ほとんどの初期ウイルス遺伝子は、抗防御遺伝子（ADG）である可能性が高い。ここでは、acrID128とacrIIIB133を含むIcerudivirus SIRV2（SIRV2）のすべての初期遺伝子が、ほぼ同一のプロモーターコア（TATAボックスとBRE）を取り囲む高度に保存された制御配列を共有していることを示した。古細菌ウイルスゲノムを解析した結果、57の古細菌ウイルスゲノムと6つのメタゲノム配列から、初期プロモーターコアを含むコンセンサス制御配列を持つ354の新規ADGを同定した。これらの新規ADGは116のファミリーに分類された。概念実証として、溶菌性古細菌ウイルスSulfolobus islandicus filamentous virus 2 (SIFV2)の予測ADGをスクリーニングすることにより、サブタイプI-A CRISPR-Casの阻害剤を同定した。さらに、Sulfolobus monocaudavirus SMV1を含むいくつかの古細菌ウイルスにおいて、古細菌毒素-抗毒素免疫系の阻害剤の最初の例が同定された。また、我々の結果は、これまでAcrに関連すると定義されていた転写制御因子、すなわちAcaが、acrsに加えて他の抗防御遺伝子の発現を制御している可能性を示唆している。

結果
初期発現ウイルス遺伝子に先行するコンセンサス制御配列
現在までのところ、古細菌ウイルスにおいて同定されているAcrsは、AcrID1、AcrIIIB1、AcrIIIB2、AcrIII-1、そして推定上のAcaであるAca8の4つのみであり、いずれもまばらに分布している（補足図1）26,28,33,34。acrID1、acrIIIB1、acrIIIB2、およびaca8遺伝子は、機能アノテーションを欠くいくつかの小さな、ほとんどが単一遺伝子に囲まれている（図1A）27。その結果、古細菌ウイルスのAcr同定には、既知のAcrの数が少なく、未同定タンパク質が圧倒的に多いため、guilt-by-associationアプローチはほとんど適用できない（補足図1）。

図1：Acr関連遺伝子の前には、強力なプロモーターを包含する制御配列が存在する。
図1
A AcrIIIB1（青）、AcrID1ホモログ（赤）、Aca8（黄）、ウイルス関連ピラミッド（vap、茶）、仮説タンパク質（灰色）をコードする遺伝子を含む、すべてのイセルディウイルスSIRV2遺伝子の両末端の図。黒線の矢印ブロックは、発現パターンに基づいて決定されたSIRV2初期遺伝子を示す（補足図2A）。破線の矢印は、遺伝子の上流に強い制御配列があることを示している。B 13個のSIRV2初期遺伝子のうち11個の遺伝子に先行する制御配列のMEME解析から得られたコンセンサスモチーフ。C 早期遺伝子／アンチディフェンス遺伝子を同定するためにここで採用した一般的な方法論の図解。D 代表的な古細菌ウイルスゲノムSIFV、Hoswirudivirus ARV2、Mexirudivirus SMRV1およびSMV2における潜在的ADGのMEME-RSAT予測。E 個々の古細菌ウイルスから得られたコンセンサス配列モチーフ。

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Acrsを同定する別のアプローチを開発するために、我々は2つの興味深い観察を行った。第一に、SIRV2のaca8（gp01/gp54）と、既知のAcr遺伝子であるacrID1（gp03）とacrIIIB1（gp48）の両方が、Sulfolobus islandicus LAL14/1の感染直後に発現していることである（補足図2A）35。第二に、acrID1とacrIIIB1を含むSIRV2ゲノム末端の小さな仮説遺伝子のほとんどは、遺伝子自体の塩基配列の保存性が非常に低く、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の類似性が限られているのとは対照的に、非常に類似した制御配列を共有している（図1B）。同定されたコンセンサス制御配列は、TFB認識エレメント（BRE）の下流にTATA-box（TTTAWATA）を持つコアプロモーター領域を包含しており、このプリンリッチ配列は古細菌の転写因子TFB（真核生物の転写因子TFIIBの古細菌ホモログ）と結合する上で最も強い配列として以前に報告されている36,37。このようなプロモーター配列は、予測されるORF（83 aa）の5'末端コード配列内ではあるが、aca8にも見られる。Aca8ホモログの複数配列アラインメントから、実際の翻訳開始部位は、現在注釈のあるgp01/gp54の開始コドンから84塩基下流に位置することが示された（補足図2B）。SIRV2のトランスクリプトームを再解析したところ、55 aaをコードするgp01転写産物の短いバージョンが優勢であり、ウイルス感染後期には長い方の転写産物に対応するリードはごくわずかしか検出されないことがわかった38。したがって、SIRV2の13の初期遺伝子のうち、aca8、acrID1、acrIIIB1、さらに8つの遺伝子の高レベル転写は、コンセンサス制御配列内で高度に保存されたプロモーターから駆動されているようである（図1B）。感染1時間後に見られる初期遺伝子のその後の抑制は、以前報告された細菌のAcas31,40と同様に、予測されるwHTH抗CRISPR関連タンパク質Aca839が制御配列に結合するためと考えられる（補足図2C）（図1A）。さらに、acrs/acaとのクラスタリングから、他の初期転写小遺伝子も抗防御タンパク質をコードしていることが示唆された。これらのことから、我々は保存された制御配列を利用して、新たな防御遺伝子を予測することにした。

保存された制御配列に導かれた推定ADGの同定
古細菌ウイルスのゲノムからADGを同定するためのパイプラインを設計した（図1C）。簡単に言うと、開始コドンの上流にある100bpの配列を、ウイルスの単一遺伝子、すなわちオペロンに属さないと予測される遺伝子から検索した。同じウイルスゲノムからの配列をMEME-suiteを用いてアライメントし、次いでRSATを用いてマトリックススキャンを行い、強力なプロモーターに特徴的なBREとTATA-boxを持つ高度に保存された制御配列を持つ遺伝子を同定した（Methods参照）。(1)予測される強力なプロモーターが存在すること、(2)同じウイルスゲノムの強力なプロモーターを囲む推定調節配列を共有していること。

まず、aca8を持つルディウイルスゲノムに解析を適用し、17のルディウイルスから127のADGを予測した。その後、同じ基準を用いて、ルディウイルス科の他のメンバー、すなわちaca8を欠くメンバー、リポトリックスウイルス科の全メンバー、ビカウダウイルス科、その他の未分類ウイルス41,42,43,44,45,46のゲノムをスクリーニングし、さらに105個のADG候補を同定した。予測された232個のADGのうち、175個は既知の古細菌AcrsやAca8、あるいはその他の既知のタンパク質と検出可能な配列類似性を示さなかった（補足データ1）。この戦略で予想されたように、AcrIIIB1とAcrID1ホモログをコードする遺伝子のほとんどが、Sulfolobus islandicus filamentous virus (SIFV)とAcidianus rod-shaped virus (Hoswirudivirus ARV2)に代表されるように、他のADGとクラスター化したいくつかのウイルスゲノムでADGとして同定された（図1D）。特に、Sulfolobales Mexican rudivirus 1 (Mexirudivirus SMRV1)のように、既知のAcrsのホモログをコードしていないウイルスのADGを予測した（図1D, Eおよび補足図3）。古細菌ウイルスの遺伝子の位置を解析した結果、ルディウイルスは直鎖ゲノムの両端に（推定）ADGをコードしているのに対し、リポトリックスウイルスのADGは主に直鎖ゲノムの一端近くに位置し（図1A, D）、Sulfolobus monocaudavirus SMV2、SMV3、SMV4のようなバイカウドウイルスのADGは円形ゲノム内にランダムに位置していることがわかった（補足図4A）。

同様に、我々は6つのSulfolobalesとThermofilum MAGs (Metagenome-Assembled Genomes)内の19の推定ADG（1つのaca8を含む）の中から初期遺伝子制御配列を同定した（図2、補足データ1）。これらのうち、535 aaのADG（MCI4409744.1）はAcrIIIB1と未知のドメインの融合体で、他のMAG、SMV2、SIRV分離株V3にホモログがある（補足図5）。MCI4409744.1は、複数の宿主防御システムに対する活性を持つ、おそらく最大級のAcrsである可能性がある。

図2：メタゲノムコンティグにおけるADG。
図2
ウイルスまたはプラスミド由来と思われるSulfolobalesとThermoproteiのコンティグが、予測されるADGをコードしている（緑で示す）。4つのThermoproteiコンティグから2つの異なる制御配列が同定され、それぞれ関連するADGの上流に破線の矢印でオレンジ色と水色で描かれている。対応するコンセンサス制御配列は、同じ色の枠内に示されている。

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Aca8ホモログを欠く古細菌ウイルスは、推定ADGに関連する多様な制御配列を持っている（図1D、E、2）。TATA-boxとBREエレメントで構成されるコアプロモーターはコンセンサス配列の中で非常に類似しているが、上流と下流の領域はウイルス間で大きく異なり、これは特にMexirudivirus SMRV1とSMV2モチーフの中で顕著である（図1E、補足図3）。制御配列の多様性とAca8ホモログが存在しないことは、これらのウイルスが異なる制御タンパク質をコードしていることを示唆している。一例として、SMV2とSulfolobales archaeon単離株（MAG: JAKMAB010000038.1）で同定されたコンセンサス制御配列は、それぞれBREエレメントに重なるインバーテッドリピートを含んでおり、転写抑制因子の結合部位である可能性が高い（図1Eおよび図2）。さらに、SMV2とメタゲノム配列の両方が小さなタンパク質（それぞれSMV2 gp37とL7H13_norf1）をコードしており、これはこれら2つのゲノムに共通する唯一のADGであると予測された（補足データ1）。AlphaFold2によって予測されたコイルドコイル構造と、特定の間隔で配置されたロイシン残基の存在から、SMV2 gp37ホモログはロイシンジッパータンパク質であり、ADGの転写を抑制するためにインバーテッドリピートに結合していると考えられる（補足図4B）。

ADGの中には、保存された制御配列と関連しない相同遺伝子を持つものがあり、ADGタンパク質とアミノ酸配列が相同であるにもかかわらず、ADGとして含まれていない。次に、既知および新規に同定されたすべてのADGについて、モチーフ有病率、すなわち調節配列を持つ相同遺伝子の割合を計算した（補足データ1）。モチーフ有病率は、AcrIIIB1、AcrID1、AcrIII-1ホモログをコードする遺伝子ではそれぞれ0.75、0.51、0.13であり、Aca8ホモログをコードする遺伝子では1であった。AcrIIIB1ホモログは、リポトリックスウイルス科とルディウイルス科の2つのウイルス科の多くのメンバーの間で、ほとんどがゲノムあたり1コピーとして分布している（補足図1）のに対し、同定された35個のAcrID1ホモログのうち26個は、ルディウイルス科の4つのメンバー（イセルディウイルスSIRV1（SIRV1）、イセルディウイルスSIRV1バリアントXX、SIRV2、イセルディウイルスSIRV3）のみが近接してコードしている。このことは、AcrIIIB1遺伝子とAcrID1遺伝子の間のモチーフの有病率の違いを説明する、AcrID1の遺伝子重複のレベルがはるかに高く、機能的多様化の可能性があることを示唆している。ADGモチーフとAcrIII-1との関連がほとんどないことは、AcrIII-1（SIRV2 gp37）が自然環境においてAcrとして機能しないこととよく相関している47。

そこで、古細菌ウイルスのゲノム中のADGを予測する新しい方法を開発した。この手法を用いて、既知のAcrを含む251個のタンパク質をADGまたはADG関連遺伝子として同定し、そのうち193個を古細菌ウイルス37個とMAG6個から新規ADGとして同定した。予測されたADGがコードするタンパク質配列をタンパク質配列データベースと比較した結果、そのほとんどにホモログが見つからなかった。それにもかかわらず、ADGがコードするタンパク質のいくつかでは、ヘリックス-ターン-ヘリックス（HTH）またはリボン-ヘリックス-ヘリックス（RHH）ドメインが検出され、その作用様式がDNA結合に関与していることが示唆された（補足データ1）。

フセロウイルスにおける初期遺伝子制御モチーフ
初期遺伝子制御配列が高いレベルで保存されていることから、温帯古細菌ウイルスと宿主ゲノムの間で類似した配列を検索することにした。まず、ウイルスの初期遺伝子プロモーターと、我々が以前に研究したSulfolobalesのCRISPR-CasサブタイプI-A干渉遺伝子クラスターのプロモーターとの間に高い配列同一性があることに気づいた（補足図6）。S. islandicus LAL14/1ゲノム内のRSATマトリックス検索により、クロマチンタンパク質Cren7、S層タンパク質SlaA、シャペロニンGroEL、転写制御因子、その他8つの宿主遺伝子をコードする宿主ハウスキーピング遺伝子に同一のTATA-boxとBRE-elementが同定された。これらの遺伝子はすべて、高発現することが知られているか、あるいはその可能性がある（補足データ2）35,48。ADGモチーフ（初期遺伝子モチーフ）が強力なプロモーターを含んでいるという仮説を補強している。

フーセロウイルス科は温帯古細菌ウイルスの仲間で、SSV1からSSV22までの20のメンバーがいる。SSV遺伝子は一般にオペロンを形成し、T1-T849と呼ばれる6つの優性転写産物と2つの弱い転写産物に転写されることがわかった。以前、T6オペロンのBRE配列をrRNA遺伝子のTATA-boxの上流に配置すると、in vitroでrRNAの転写が約8倍増加し、T6プロモーターで観察された転写レベルとほぼ同じになることが示された36。TFBの好ましい結合部位は、TATA-box開始位置の上流-6位にG、-3位にAのコンセンサス配列を含んでいる36。我々は、20のSSV全てから得られたT6オペロンの制御配列の中に、強力なプロモーターの特徴を持つコンセンサス配列を同定した（図3A）。これらの特徴を総合すると、ADGは強力なプロモーターの制御下にあり、高発現を促していることが示唆される。

図3：フーセロウイルスにおける初期遺伝子モチーフの保存。
図3
A 20のSulfolobus紡錘形ウイルスのT6転写産物の制御配列内のTATA-boxとBREエレメントの保存。B 20種のSSVのT6転写体がコードする遺伝子座における予測されるADGの構成と多様性。ホモログは色分けされ、その機能が予想される。

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20のSSVから165のADGが同定された。先に同定したSSVの4つのacrID1ホモログはすべて、SSV2、SSV3、SSV6のT6オペロンの一部である（図3B）28。既知のacr遺伝子とのクラスター形成と、ウイルス感染時のT6転写産物の高い発現レベルは、新規SSV ADGの抗防御機能を強く支持している。

解析したすべての古細菌ウイルスゲノム（57の個別ウイルスゲノムと6つのメタゲノム集合ゲノム）において、既知のAcrsとAcasとは別に、354の新規ADGを予測した（補足表1）。ADGの大部分（251個）は単一遺伝子によってコードされており、それぞれが独自のプロモーターと制御配列を持っていた。これまでに特徴づけられたADGを含めると、今回解析したすべてのウイルスは3～12個のADGを持っていた（補足図7）。アミノ酸配列の類似性に基づき、ADGは116のタンパク質ファミリー、単一遺伝子としてコードされるADG.01-ADG.89、MAG由来のmADG.01-10、SSVオペロン内のADGSSV.01-ADG.SSV.17に分類された。116のタンパク質ファミリーのうち、42は2つ以上のメンバーを含み、74はシングルトンであった。シングルトンでない42のADGファミリーでは、ほとんどがアラインメントカバレッジ80%以上で、この閾値を下回ったのは8ファミリーだけであった。ほとんどのファミリーにおいて、ファミリー内のアミノ酸同一性（pid）は20〜100％の範囲であったが、11のファミリーには同一性の割合がより低いメンバーが含まれていた。AcrID1ファミリーの最小カバー率は84.4％、最小pidは7.3％であるのに対し、AcrIIIB1ファミリーの最小カバー率は84.2％、最小pidは20.2％である。カバレッジに大きなばらつきのあるADGファミリーには、異なるドメイン構造を持つメンバーが含まれている可能性があり、それらは異なる抗防御機能に関与している可能性がある。

SIFV2ウイルスのCRISPR-CasサブタイプI-A阻害剤
ADG予測のアプローチを検証するために、予測されたADGのプールから、I-A型CRISPR-Casシステム（AcrIA）の阻害剤を実験的に同定することを試みた（補足データ1）。CRISPR-Cas I-Aシステムは古細菌に広く存在するが、CRISPR干渉を阻害するAcrIAは報告されていない。我々はこのようなAcrを同定するために、リポトリックスウイルス科のメンバーであるSulfolobus islandicus filamentous virus 2（SIFV2）（KX467643）を選んだ。SIFV2は溶原性ウイルスであるが、その特性はあまり明らかにされていない。SIFV2は、コンセンサス制御配列（下記参照）内の強力な初期プロモーターに関連する6つの遺伝子のクラスターを包含する。Sulfolobus では CRISPR-Cas I-A がほぼどこにでも存在することから、SIFV2 は AcrIA をコードしていると考えられるが、in silico 解析では acrIIIB1 ホモログしか見つからなかった（図 4A）。

図4: SIFV2におけるCRISPR-CasサブタイプI-Aインヒビター。
図4
A SIFV2における予測ADG（上段）とコンセンサス初期遺伝子モチーフ（下段）。B 空のプラスミド（左パネル）またはSIFV2 gp15をコードするプラスミド（右パネル）を導入したS. islandicus LAL14/1 Δcas6(I-D)の増殖曲線。培養物は感染させないか（未感染）、または親ウイルス（SIRV2M）、ΔacrIA（SIRV2MΔgp45-gp47）、ΔacrIIIB1（SIRV2MΔgp48）、およびΔacrIAΔacrIIIB1（SIRV2MΔgp45-gp48）に感染させた。データは3生物学的複製の平均であり、平均±SDで表される。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。C ウイルス感染後72時間におけるBの感染培養物のウイルス力価。PFU/ml：培養上清1mlあたりのプラーク形成単位。データは3生物学的複製の平均値であり、平均値±SDで表される。P値の算出には、プラーク形成データの両側不対t検定を用いた；*P < 0.05、ns - 有意ではない；P = 0.7898、0.0153、0.4115、0.3373（左から右へ）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。D 空のプラスミドまたはSIFV2 gp15をコードするプラスミドを持つS. islandicus LAL14/1 Δcas6(I-D)上での連続希釈ウイルスサンプルのスポットアッセイ。希釈倍率は上に示した。画像は5つの独立した実験の代表である。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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6つのSIFV2 ORF、gp09、gp10、gp14、gp15、gp16、およびgp17のAcr活性をスクリーニングするために、弱いアラビノースプロモーター、ParaS250の制御下で、Sulfolobus - E. coliシャトルベクターpEXAにそれぞれクローニングした。このプラスミドをS. islandicus LAL 14/1 Δcas6(I-D)株（以下、Δcas6(I-D)と呼ぶ）にそれぞれ形質転換し、I-D cas6遺伝子を欠失させると、III-B亜型cmr-γとI-D亜型が不活性化される一方、I-A亜型とIII-B亜型cmr-αは機能性を維持した33,51。形質転換体は、サブタイプI-AおよびサブタイプIII-B cmr-↪Ll_251 CRISPR-Casシステムに対する感受性が異なる4種類のウイルスに感染させた。4つのウイルスのうち、SIRV2M（親株）はIII-B型およびI-A型CRISPRターゲティングの両方に耐性であり28,33、そのノックアウト株SIRV2MΔgp48（ΔacrIIIB1）はIII-B型ターゲティングに対する耐性を失った33。3つの遺伝子（SIRV2 gp45-gp47、AcrIIIB1をコードする遺伝子gp48に隣接）をコードする断片の欠失により、I-A型CRISPRターゲティングに感受性のウイルスが得られ、SIRV2MΔgp45-47（ΔacrIA）と呼ばれた52。第4の株SIRV2MΔgp45-48（ΔacrIAΔacrIIIB1）は、4つの遺伝子すべてを欠き、サブタイプIII-BおよびサブタイプI-AのCRISPR-Casターゲティングの両方に感受性である。

弱いアラビノースプロモーターを用いた予備スクリーニングでは、試験した6つの遺伝子のうち、gp15のみがΔacrIA変異体感染時に軽度の宿主成長遅延を引き起こし、CRISPR-Cas阻害とそれに伴うウイルス増殖を示唆した（補足図8）。続いて、強力なアラビノースプロモーターからgp15を発現する株、Δcas6(I-D) pgp15araS-SDを用いて、Acr活性をさらに証明した。空のベクターと比較して、pgp15araS-SDは宿主の著しい増殖阻害によって示されるように、ΔacrIAの感染性を回復させた。しかし、pgp15araS-SDは、ΔacrIAと比較してacrIIIB1を欠くΔacrIAΔacrIIIB1の感染性を回復できなかった。したがって、gp15の阻害活性はI-Aサブタイプに限定される（図4B）。培養物からのウイルス力価を定量し、増殖の遅延がウイルスの増殖を示すことを確認した（図4C）。実際、pgp15araS-SDはΔacrIAの増殖を可能にし、親ウイルスと同様のレベルに達した。これらの結果をさらに検証するために、空のベクターまたはpgp15araS-SDのいずれかを持つ宿主の芝生上で4つのウイルスの連続希釈液を用いたスポットアッセイを行った。親ウイルスを除き、空のベクターを持つ株ではウイルスの増殖が阻害された（図4D、左パネル）。pgp15araS-SDを導入した株（図4D、右パネル）では、ΔacrIAの感染性が約4桁特異的に回復した。これらの結果から、SIFV2 gp15はサブタイプI-A CRISPR-Casシステムの阻害剤であることが示された。

ウイルスADGは宿主の毒素-抗毒素系を阻害する
116のADGファミリーのほとんどはウイルス遺伝子のみを含むが、ADG.17（arCOG10132）とADG.51（arCOG03737）は多様な宿主に感染するウイルス間で保存されているだけでなく、いくつかの宿主タンパク質と相同性がある（補足データ1、図5A）。ADG.17のホモログは、ウサルドウイルスSIRV7、SIRV8、SIRV9、SIRV10、ATSV、SMV1、SMV3、SMV4のゲノムにコードされており、Sulfolobales目のいくつかのメンバーにコードされている小さなタンパク質と高い類似性を示している（図5Aおよび補足図9A）44,53,54。PSI-BLASTによって同定され、AlphaFold255構造モデリングによって確認されたADG.17ホモログは、古細菌ゲノムの防御アイランドまたは統合プラスミドにコードされている（図5A）。構造モデルの比較から、これらのタンパク質はPhd（宿主の死を防ぐ）ファミリーの抗毒素であることが示唆された（図5B）。これらの遺伝子は、伸長因子Tu56を不活性化するキナーゼであることが知られているDoc（death on curing）ファミリーの毒素をコードする遺伝子と収束遺伝子ペアを形成している（図5A）。PhdとDocは共同でII型毒素-抗毒素（TA）系を構成しており、この系は細菌やファージではよく研究されているが、古細菌では研究されていない57,58。そのため、ADG.17は古細菌におけるDoc毒素の抗毒素であると考えられるが、実験的な研究はまだこれからである。

図5：ADG.17（arCOG10132ドメインタンパク質）は宿主のPhd-Doc毒素-抗毒素系を阻害する。
図5
A 古細菌ウイルス（単一遺伝子）と宿主（2つの構成遺伝子系Phd-Docの一部）の間で保存されているarCOG10132ドメイン抗毒素（青矢印）。Doc遺伝子は赤矢印で示す。B ウイルス抗毒素ホモログSMV1 gp44のAlphafold2予測構造。C SMV1 gp44（黄色で示す）の構造とPhd-Doc（SIL_0730-SIL_0731、それぞれ濃い水色と緑色で示す）の予測構造を重ねたもの。残基Asp39は抗毒素ホモログ間で保存されており、Lys81とArg82は毒素ホモログ内で保存されている。D Doc毒素(SiL_0731)またはPhd抗毒素(SiL_0730)、Phd抗毒素のウイルスホモログ(SMV1 gp44)、または早発停止コドンを生成するナンセンス変異を持つ変異体を含む毒素と抗毒素の組み合わせをコードするプラスミドのS. islandicusにおける形質転換効率()。データは4生物学的複製の平均値であり、平均値（中央の線）±SDで表される。ゼロの対数はプロットできないため、2つの値は示していない。SiL_0731の形質転換データに対するP値の算出には、形質転換データの両側対応のないt検定を用いた; P < 0.001, ns - 有意ではない; P値は<0.0001 (SMV1gp44), <0. 0001 (SiL_0730), <0.0001 (SMV1gp44/SiL_0731), <0.0001 (SiL_0730/SiL_0731), 0.1335 (SMV1gp44/SiL_0731), 0.0671 (SiL_0730/SiL_0731), <0.0001 (SMV1gp44/SiL_0731), <0.0001 (SiL_0730/SiL_0731). ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。E ヒスチジンタグ付きアンチトキシン、SMV1 gp44（レーン5-6）およびSiL_0730（レーン7-8）をベイトとしたタグなし毒素（SIL_0731、レーン4-8）のプルダウン。レーン1 - タンパク質ラダー。非誘導およびIPTG誘導SiL_0731培養をそれぞれレーン2およびレーン3に示す。2つの独立した実験の代表的な画像。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

フルサイズ画像
ADG同定のための我々のアプローチをさらに検証するために、ウイルスADG.17ファミリータンパク質の1つであるSMV1 gp44の特徴を明らかにした。まず、宿主ゲノムにコードされている毒素SiL_0731の詳細な解析を行い、アデニル化に不可欠な構成要素59である特徴的なFicドメインモチーフHXFX(D/E)(A/G)N(G/K)Rを同定した（補足図9B）。宿主毒素/抗毒素ペアSiL_0730/SiL_0731およびSMV1 gp44/SiL_0731複合体の構造は、タンパク質構造・複合体予測プログラムAlphaFold255を用いてモデル化した。ホモログ間で保存されているアミノ酸を考慮すると、同族抗毒素とウイルスにコードされたホモログ両方による毒素アデニル化の阻害は、残基D39を介して起こると結論できる。この残基は、Ficドメインモチーフの一部である毒素残基K81とR82と相互作用する（図5B, Cおよび補足データ3）。

次に、同一のアラビノース・プロモーターの転写制御下に、S. islandicus LAL14/1 Phd-DocペアSiL_0730/SiL_0731、あるいは2つの遺伝子のいずれかをコードするプラスミドを構築した。SiL_0730（Phd）をSMV1 gp44に置換した同様のプラスミドも構築した。予想通り、毒素SiL_0731を単独でコードするプラスミドは、SiL_0730とSiL_0731の両方をコードするプラスミドに比べて形質転換効率がはるかに低かった（3〜4桁）。しかし、SiL_0731とSMV1 gp44をコードするプラスミドは、毒素-抗毒素ペアをコードするプラスミドと同等の形質転換効率を示し、ウイルス小蛋白質がSiL_0730を阻害していることが示唆された。その後、抗毒素の性質（RNAまたはタンパク質）を同定するために、SMV1 gp44またはSiL_0730の早期翻訳終結を引き起こす点変異を導入した。その結果、形質転換効率は毒素のみをコードするプラスミドと同レベルまで低下し、SiL_0731の毒性を阻害するには、SMV1 gp44またはSiL_0730のタンパク質産物が必要であることが示された（図5D）。

直接的なタンパク質間相互作用の可能性を調べるため、ヒスチジンタグを付けたSMV1 gp44またはSiL_0730をベイトとし、異種発現した毒素SiL_0731を含む大腸菌細胞溶解液を餌としてプルダウンアッセイを行った（図5E、パネル2および3）。毒素はどちらの場合も抗毒素と共役し（図5E、パネル5-8）、Docとその抗毒素パートナー間の直接的な相互作用が確認された。

ADG.51のホモログは、Hoswirudivirus ARV3（ARV3）とAcidianus two-tailed virus 2（ATV2）にコードされており、ADG.17と同様に、宿主にコードされているSulfolobalesの小タンパク質、例えばSiRe_2374と高い類似性を示した（補足図10A）。SiRe_2374はSiRe_2373とともに推定オペロンにコードされており、N末端のAAA ATPaseドメインとC末端のPD-DExKスーパーファミリーヌクレアーゼドメインからなる融合タンパク質である（補足図10A、補足データ4）。ADG.51とそのホモログはwHTH型転写因子であると予測されるが、AlphaFold解析とその後のDALIにより、Multiple antibiotic-resistance Repressor（MarR）ファミリーの転写制御タンパク質との類似性が明らかになった（補足データ4、補足図10B）60。ADG.51に相同な宿主タンパク質は2つのwHTHドメインから構成されているが、ウイルスのホモログはN末端のwHTHドメインのみを持ち、さらにa-helixを持つ。DNA結合タンパク質とヌクレアーゼが2遺伝子カセットの一部として共局在化するのは、II型毒素-抗毒素系の典型である。従って、SiRe_2374/SiRe_2373様宿主遺伝子対は、新しいタイプの抗ウイルス免疫であり、ウイルスはこの免疫に拮抗するためにADG.51タンパク質をコードしているのではないかという仮説が成り立つ。

これらの結果から、SMV1のgp44と他のウイルスのホモログは、宿主の毒素であるDocを阻害する抗毒素Phdとして働くことが示された。感染すると、ウイルスのPhd抗毒素は、宿主であるSulfolobalesがコードする可能性のある感染システムPhd-Docを効率的に阻害することができた。さらに、AAA+ ATPase/エンドヌクレアーゼドメイン含有タンパク質と共発現し、Sulfolobales間で高度に保存されている別の宿主タンパク質のホモログがARV3とATV2に見いだされ、宿主の抗ウイルス免疫のアンタゴニストとして働いている可能性が考えられた。

これらの知見に促されて、我々は宿主タンパク質と有意な類似性を持つSulfolobales属のウイルスがコードする他のタンパク質を、潜在的な抗毒素として小さなタンパク質に焦点を当てて検索した（詳細は方法を参照）。この検索により、ADG.17とADG.51を含む、Sulfolobalesゲノムに少なくとも1つヒットする114のタンパク質ファミリーが見つかった（補足データ5）。さらにゲノムコンテクストを調べたところ、他の低タンパク質の隣に一貫してコードされ、毒素-抗毒素遺伝子ペアを形成する可能性のあるタンパク質ファミリーがさらに2つ同定された（補足図11）。これらのファミリーの1つ（arCOG07934）は、ウサルディウイルスSIRV8（YP_009362697.1）とウサルディウイルスSIRV9（YP_009362574.1）に存在し、多くの既知の毒素-抗毒素系で抗毒素として機能するDNA結合タンパク質のAbrBファミリー（補足図11A）と遠縁の関係にある61,62。さらに、いくつかの宿主ゲノムでは、RelE毒素の隣にこのファミリーのタンパク質がコードされている（補足図11A）。特に、arCOG07934ホモログ（M164_2845）のノックアウトは、Sulfolobus islandicusにおいて致死的であることがわかった63。したがって、arCOG07934タンパク質はRelE毒素の抗毒素として機能することが確実に予測される。つ目の例は、SIRV1とSIRV2にコードされているarCOG08091のタンパク質で、いくつかのSulfolobalesゲノムではarCOG07288のタンパク質の次にコードされている（補足図11B）。両タンパク質ともSulfolobalesに特異的であり、既知のタンパク質と配列や構造の類似性は見られなかった。したがって、arCOG07288-arCOG08091遺伝子は、arCOG07288が毒素でarCOG08091が抗毒素であるTA系を構成していると考えられる。これらのタンパク質間の複合体のAlphafold2モデリングから、予測される抗毒素のN末端領域は、毒素のC末端β鎖に対して反平行なβ鎖を形成し、パッキングしていることが示唆された（補足図11B）。従って、ウイルスにコードされた抗毒素ホモログは、宿主の抗毒素が分解される感染時に、毒素を阻害すると予測される。

考察
ほとんどの細菌と同様に、古細菌も表面抵抗性、制限修飾、アルゴナウテス、多様なCRISPR-Casシステムを含むがこれらに限定されない複数の抗ウイルス防御システムをコードしている。さらに、熱タンパク質(Thermoproteota)の多くのメンバーは、それぞれが多様な機能を持つ異なるタイプに属する複数のCRISPR-Casシステムをコードしている。古細菌の防御機構の高い多様性は、防御タンパク質の多様性に加えて、古細菌ウイルスがコードする防御遺伝子のレパートリーが相互に複雑であることを示唆しており、精巧な制御を受けている可能性が高い。例えば、54個のSIRV2遺伝子のうち、25個はCRISPR-Cas欠損実験室宿主でのウイルス増殖には必須ではないアクセサリー遺伝子に分類された64。これらのアクセサリー遺伝子は、すべてではないにしても、以前に特徴づけられたacrID1とacrIIIB1を含め、ほとんどが宿主の防御機構の阻害因子である可能性が高い。これらのアクセサリー遺伝子は非常に多様であり、ほとんどが互いに無関係であるが、驚くべきことに、これらの遺伝子の多くのプロモーター周辺に高度に保存された制御配列が同定され、古細菌ウイルスの初期防御レジューロンの存在が示唆された。特に、プロモーター配列は、サブタイプI-Aのcas遺伝子だけでなく、高発現のハウスキーピング宿主遺伝子とも共通している（図3A、補足データ4）35。cren7のようなこのプロモーター配列が先行するいくつかのハウスキーピング遺伝子は構成的に高発現するが、CRISPR-cas I-A干渉遺伝子の強力なプロモーターは、スルフォロブスでは通常抑制されているが、ウイルス感染時には抑制因子Csa3b51の放出によって抑制が解除される。

25個のSIRV2アクセサリー遺伝子のうち、主にゲノム末端付近に位置する11個の遺伝子は、強力なプロモーターを持つ典型的な制御配列の制御下にあるが（図1A、補足図1C）、残りの遺伝子およびコア遺伝子（すなわち、ファミリーメンバー全てに保存されている遺伝子）は、明確な非早期プロモーターの制御下にある（データは示さず）。ADGを含む初期遺伝子の発現はエネルギーを消費するため、下流のウイルス遺伝子の時間的発現を妨げないように厳密に制御されなければならない31。このことは、ウイルスがウイルス収量の抑止を回避し、宿主の防御に打ち勝つために必要な閾値増殖性に到達するために不可欠である29,30,32。しかし注目すべきことに、AcrID1ホモログをコードする12個のSIRV2遺伝子のうち5個は、初期プロモーターを欠いている（図1A）。これらのAcrホモログの正確な機能はまだ解明されていない。いずれにせよ、ウイルスのADGはコード領域だけでなく制御配列も多様化し、複数のレベルで機能的な微調整を可能にしているようである。

特に、SIRV1とSIRV2のウイルスリングヌクレアーゼ遺伝子AcrIII-1は、2つの仮説的タンパク質とホリデージャンクションリゾルバーゼ65を含むオペロンの一部であり、SIRV2の感染中期に発現し、今回同定された初期制御領域を欠いている。最近、AcrIII-1が、III型CRISPR免疫47を持つ宿主のウイルス感染時に、SIRV2のこのネイティブプロモーターから発現された場合、Acrとして機能しないことが証明され、CRISPR-Cas阻害には、初期のウイルス遺伝子発現が必要であることがさらに立証された。しかしながら、初期制御配列を欠くAcrsや他のADGのホモログの機能は謎のままである。

今回の研究では、Phd-Docペアとそのウイルスにコードされた阻害剤によって構成される古細菌毒素-抗毒素の抗ウイルス免疫系が初めて示された。II型TAでは、不安定な抗毒素はウイルス感染などのストレス下で分解され、より安定な毒素は細胞の休眠や死を誘導し、感染の場合は残りの集団を守る66。バクテリオファージϕTEとT4は、それぞれRNA抗毒素（III型）とDmdタンパク質（II型）に似た擬似ToxI遺伝的反復をコードしており、分解された宿主コード抗毒素を補完することで細菌の不成功感染システムを克服し、細胞の休眠や自殺の誘導を防いでいる4,5。VapBC、MazEF、HEPN-NT型の抗毒素-毒素系は古細菌に非常に広く存在している67,68が、今回の結果は、単一コピーのPhd-Doc系がウイルスに対する宿主の防御に積極的に関与していることを示唆している。さらに、いくつかの古細菌ウイルスは宿主のPhd抗毒素をADGとして利用し、この宿主の感染阻止システムを阻害している。いくつかのウイルス抗毒素ホモログ（補足図4B、補足データ1）のモチーフ普及スコアが比較的低いのは、宿主の毒素／抗毒素による感染阻止免疫の時期、すなわちウイルス感染初期以降の時期で説明できるかもしれない。我々はまた、ATV2とARV3にコードされ、TAを阻害する可能性が高いもう1つのADG（ADG.51）を同定した。この推定ADGのホモログはSulfolobalesのほとんどのメンバーで検出され、N末端にAAA+ ATPaseドメインとC末端にPD-DExKエンドヌクレアーゼドメインを持つ大きなタンパク質をコードする遺伝子も持つオペロンに属していた。このオペロンは、ADG.51ホモログが抗毒素であるのに対して、毒素もATPアーゼとヌクレアーゼの融合体であるOLDシステムやPARISシステム69,70に似た頓挫感染システムをコードしている可能性が高い。

主にバクテリオファージ由来のAcrsで学習させた機械学習法を用いてAcrsを予測しようとした初期の取り組みでは、古細菌ウイルスでの成功は限られたものであった9,10。最近開発されたディープラーニング法は、基本的なタンパク質の特徴や事前に訓練されたタンパク質言語モデルを利用することで、何千ものAcrsを予測することができる71,72。我々の解析によって同定された116のADGファミリーのうち、AcrNET（62）とDeepAcr（37）によって、AcrIA SIFV2 gp15（ADG.56）を含む79のファミリーがAcrに分類された（補足データ1）。しかし、これらの79のファミリーのすべてが必ずしも善意のAcrを含むわけではなく、むしろ、両方の方法でAcrに分類された推定抗毒素ADG.51に例示されるように、他の防御システムの阻害剤で構成されている可能性があることに注意することが重要である。DeepAcrとAcrNETによってAcrと注釈されなかった37のADGファミリーを含め、予測されるすべてのADGの機能を調べるには、さらなる実験が必要である。ADGファミリーは、ウイルス性抗毒素ADG.17に示されるように、異なるタイプの抗防御遺伝子をコードしている可能性が高い。

まとめると、この研究結果は、強力なプロモーターを含む制御領域の保存を通じて、ウイルスADGを同定するという難題を解決する手立てを提供するものである。振り返ってみると、様々な宿主防御システムを標的とするADGの多様性にもかかわらず、ADGのいくつかは感染初期に高レベルで同時に発現しなければならないため、この制御配列の保存は生物学的に完全に理にかなっている。とはいえ、場合によってはADGの機能性がその初期発現に依存しないこともある。そのようなADGの予測は、ここで採用した方法では不可能である。加えて、この方法は強力なプロモーターに関する情報を必要とするが、それは常に入手できるわけではないので、この方法の適用には限界がある。ADGリストに含まれるウイルスのライフサイクルに直接関与する遺伝子などの偽陽性の存在を厳密に否定することはできないが、予測されたADGはほとんどが仮説的で、機能的に未特定のタンパク質であり、近縁のウイルスファミリー間で保存されていないため、ウイルスの必須機能に関与している可能性は極めて低い。これらの予測の実験的検証は、推定されるADGの配列と予測される構造の包括的な解析によって補完されるが、それ自体が主要な研究プログラムとなるだろう。

研究方法
上流制御配列モチーフと推定防御遺伝子の同定
個々の遺伝子または遺伝子座内の最初の遺伝子の開始コドンの上流100bpsの配列を検索し、MEME suiteプログラム（バージョン5.5.0以降）を用いて解析し、保存されたモチーフを同定した（デフォルトパラメーター、最小モチーフ幅は30、最大モチーフ幅は75～100bpsに設定）73。Aca8をコードするウイルス（イセルディウイルス（Icerudivirus SIRV1、Icerudivirus SIRV1 variant XX、Icerudivirus SIRV2、Icerudivirus SIRV3）、ウサルディウイルス（Usarudivirus SIRV4、Usarudivirus SIRV5、Usarudivirus SIRV8、Usarudivirus SIRV9、Usarudivirus SIRV10、 Usarudivirus SIRV11）、SIRV6、SIRV7、SIRV単離株V3、SIRV単離株V60、SIRV単離株V65、アゾルジウイルス（Azorudivirus SRV）、ジャパルジウイルス（Japarudivirus SBRV1）については、Aca8ホモログを持つウイルス間のモチーフを同定するために、フランキング配列を組み合わせて単一のマトリックスを作成することはしなかった。その代わりに、それぞれのウイルスゲノムは異なる進化経路をたどったと推定されるため、制御配列は同じゲノムのADG間でより保存されていることから、個々のウイルスゲノムごとに特定のモチーフを同定することを試みた。得られたモチーフ-マトリックスは、Regulatory Sequence Analysis Tools (RSAT)のマトリックス-スキャン機能（デフォルトパラメーター）を使って、対応するウイルスゲノム内でモチーフを持つ遺伝子をさらにスキャンするために使われた（図1C）74,75。ウイルス遺伝子は、その上流配列のウイルス特異的コンセンサス初期制御配列に対する類似性、すなわちMEME suiteのp値がe-08より小さいか、RSATのe値がe-08より小さいことに基づいて、推定ADGとみなされた。

異なるウイルスのaca8モチーフが制御している可能性のある遺伝子を、PSI-BLASTを用いてe-value 0.001で相同タンパク質のクラスターにグループ化した。得られたクラスターは、Aca8および/または古細菌Acrsのホモログを持たない古細菌ウイルスのうち、オープンリーディングフレームを持つAnti-defense関連タンパク質(PSI-BLAST、e-value 0.05)のおおよその同定に利用された。これは、モチーフが関連するタンパク質に応じて早期に同定するために必要な参照タンパク質配列データセットを作成し、可能であれば、解析対象のウイルスゲノム上のADGのおおよその位置を同定するために行われた。

モチーフに基づいた戦略により、我々はリポトリックスウイルス科（AFV2、AFV3、AFV6、AFV7、AFV8、AFV9、SIFV、SIFV2）、ルディウイルス科（Itarudivirus ARV1、 Hoswirudivirus ARV2、Hoswirudivirus ARV3、Mexirudivirus SMRV1）、ウングラウイルス科（Captovirus AFV1）、ビカウダウイルス科（SMV2、SMV3、SMV4、STSV1、STSV2）、フセロウイルス科（SseV isolate 1）、未分類のdsDNAウイルス（SYV1）、および6つのMAG（JAKMAA010000023. 1、JAKMAB010000038.1、JAEMPR010000070.1、JAEMPR010000099.1、JAEMPR010000147.1、JAEMPR010000199.1）。さらに、新規ADGの総数に含まれなかったいくつかのORFを低確率ADGとして集めた。これらはTATA-boxとBREを含むORFで、初期プロモーター配列と高い類似性を持つが、保存されたウイルスのコアタンパク質の中に存在するか、転写開始部位が翻訳開始コドンに近い可能性が高いため、別にリストアップした。予測されたADGの下流で共転写しているORFや予測値の低いORFもこのリストに含まれている。これらのORFは感染直後に発現する可能性は低いが、阻害する防御システムの種類によっては役割を果たす可能性があると予測される。ADGファミリーの要約と古細菌ウイルスの全ADGのリストはSupplementary Data 1に記載されている。SSVからのT6プロモーターの解析は、SSV1～SSV22の20ゲノムに限定した。残りのゲノムは転写組織に関する不確実性のため省略した。

ウイルスゲノムにコードされる抗毒素の探索
2022年8月にSulfolobalesウイルスゲノムをGenBankから、SulfolobalesゲノムをRefSeq76データベースからダウンロードした。ウイルスのタンパク質とSulfolobalesゲノムのタンパク質の全対全比較は、E値カットオフ1e-10でPSI-BLASTプログラムを用いて行った。すべてのタンパク質は、前述78 のように arCOGs77 に割り当てられた。同定された小さなタンパク質（< 150 アミノ酸）の近傍領域は手作業で調べた。あるタンパク質がウイルス性の文脈でコードされている場合（それぞれの近傍領域でvizardedにヒットする遺伝子が少なくとも5つある）、それは統合型ウイルスに属するとみなされ、それ以上は考慮されなかった。その他、同じサイズの他の低分子タンパク質の隣にコードされている場合は、HHpred79を用いてリモート配列の類似性を同定し（もしあれば）、DALI server80とそれぞれのAlphafold255モデルを用いて構造的類似性を検索した（もしあれば）。

菌株、培地および増殖条件
Sulfolobus islandicus LAL14/1、S. islandicus LAL14/1 ΔCas6(I-D)、S. islandicus LAL14/1 Δarray、およびそれらの誘導体は、SCV培地中、78℃、150回転/分（rpm）で培養した。大腸菌DH5α株およびRosetta (DE3)株は、LB培地で37℃、200rpmで培養した。大腸菌の培養には、必要に応じてアンピシリン（100μg/ml）、カナマイシン（25μg/ml）、クロラムフェニコール（10μg/ml）を添加した。

プラスミド構築
SIFV2 gp09、gp10、gp14、gp15、gp16、gp17およびSMV1 gp44を増幅するための鋳型として、SIFV2およびSMV1のゲノムDNAを利用した。精製した S. islandicus のゲノム DNA を鋳型として、SiL_0730 と SiL_0731 を増幅した。この遺伝子を、それぞれShine-Dalgarno配列を持たない、または持つアラビノースプロモーターを持つpEXA2またはpEXA3プラスミドにクローニングした。SiL_0730、SiL_0731、およびSMV1 gp44のコード配列にナンセンス変異を導入するために、指定のオリゴヌクレオチド（補足表1）を用いてオーバーラップ伸長PCRを行った。本研究で使用したすべてのオリゴヌクレオチドを補足表1に示す。

ウイルスの滴定とスポットアッセイ
SIRV2Mおよびその変異体に感染させたΔCas6(I-D)/e.v.およびΔCas6(I-D)/pgp15培養の上清を、感染後24時間でサンプリングした。これらのサンプルのウイルス滴定は、先に述べたように行った81。簡単に述べると、100μlの連続希釈した上清を2mlのΔアレイ培養液と混合し、78℃で30分間インキュベートした。その後、この混合液を2 mlの0.4% Gelzan CMと合わせ、あらかじめ加熱しておいた0.7% Gelzan CM/SCVUプレートに流し込んだ。スポットアッセイでは、事前に滴定したウイルスサンプル5μlを0.7% Gelzan CM/SCVプレートにスポットし、78℃で2日間インキュベートした。

タンパク質の精製とプルダウン
SMV1 gp44、SiL_0730およびSiL_0731を原核生物発現ベクターpET30a(+) (Novagen)にクローニングした。オリゴヌクレオチドは、クローニング時にSMV1 gp44とSiL_0730のみがC末端ヒスチジンタグを持ち、SiL_0731はアフィニティタグを持たないように設計した。pET30a(+)/gp44chisおよびpET30a(+)/SiL_0730chisを導入した大腸菌Rosetta(DE3)株（Novagen社製）の400ml培養液を、LB培地で37℃、200rpm、OD600 = 0.6まで培養した。その後、培養液を冷却し、0.5mM IPTGを添加して15℃で一晩タンパク質発現を誘導した。細胞を6300 x gで10分間、室温で遠心分離して回収し、溶解バッファー（20 mM HEPES、300 mM NaCl、20 mM Imidazole、pH = 7.4）に再懸濁し、さらに処理するまで-80℃で保存した。室温で解凍した細胞ペレットを、ホモジナイザー（STANSTED model SPCH-10 from homogenizing systems, UK）を用いて溶解し、12000×g、35分間、4℃で遠心分離し、細胞残屑を除去した。上清を0.45μmのフィルターで濾過した後、ヒストラップカラム（HisTrap™ High Performance column, Cytiva）で精製した。溶解バッファーで数回洗浄した後、結合したタンパク質を250mMのイミダゾールを含むバッファーで溶出し、タンパク質の純度をSDS-PAGEゲルで分析した。追加の精製段階として、タンパク質をバッファー（20 mM Tris, 300 mM NaCl, pH = 8.0）で平衡化したSuperdex 200 Increase 10/300 gl (Cytiva)にロードした。精製したタンパク質をプルダウンアッセイに用いた。

プルダウンアッセイはSiL_0731を餌として行った。プラスミドpET30a(+)/SiL_0731を持つ大腸菌Rosetta(DE3)株を、前述のようにタンパク質発現のために誘導した。タグなしSiL_0731を含む濾過上清を3つに分け、SMV1gp44chis、SiL_0730chis、またはバッファーのみ（コントロールとして）と混合した。SiL_0731を含まないが、SMV1gp44chisまたはSiL_0730のいずれかを含む2つのコントロールも加えた。混合物を65℃で30分間インキュベートした後、室温まで冷却し、アフィニティー精製した。溶出したサンプルをSDS-PAGEゲルで分析した。

統計と再現性
すべての図のデータは平均値±標準偏差（SD）で表され、統計的有意性は両側対応のないt検定で評価した。データ解析にはGraphPad Prism version 10.0.1（またはそれ以降）を使用した。反復数、統計学的有意性、統計学的検定など、実験に関するすべての統計学的詳細は、関連する図の凡例に示した。

報告の要約
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
著者らは、本研究の結果を裏付けるデータが論文およびその補足情報ファイル内で利用可能であることを宣言する。GenBankからダウンロードしたSulfolobalesウイルスゲノムとRefSeqデータベースからダウンロードしたSulfolobusゲノムは、NCBIからオープンアクセス可能である。ADGの同定に使用したウイルスゲノムとタンパク質のアクセッションIDは、Supplementary Data 1に記載されている。ソースデータは本論文に記載されている。追加の情報は、要請に応じて対応する著者から入手することができる。ソースデータは本論文に掲載されている。

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謝辞
ご指摘をいただいたコペンハーゲン大学生物学部微生物免疫研究室のすべてのメンバーに感謝する。本研究は、Y.B.-C.へのノボ ノルディスク財団生物科学・基礎生物医学博士研究助成金（NNF21OC0067491）、X.P.へのデンマーク独立研究評議会/自然科学助成金[DFF-0135-00402]およびノボ ノルディスク財団/Hallas Møller Ascending Investigator助成金[NNF17OC0031154]の支援を受けて行われた。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Yuvaraj Bhoobalan-Chitty、Shuanshuan Xu、Laura Martinez-Alvarez。

著者および所属
デンマーク、コペンハーゲン、コペンハーゲン大学生物学部

Yuvaraj Bhoobalan-Chitty、Shuanshuan Xu、Laura Martinez-Alvarez & Xu Peng

国立生物工学情報センター、国立医学図書館、NIH、ベセスダ、メリーランド州、USA

スヴェトラーナ・カラミチェワ、キラ・S・マカロワ、ユージン・V・クーニン

貢献
Y.B.-C.、L.M.-A.、X.P.が発案。S.X.はすべての実験を行った。Y.B.-C.、L.M.-A.は、ADG同定のためのパイプラインを設計し、解析を実施した。S.K.とK.S.M.は、Sulfolobales宿主ゲノム中のウイルスホモログを検索し、潜在的な抗毒素を同定した。Y.B.-C.、X.P.、K.S.M.、E.V.K.は本研究を監督した。著者全員が初稿執筆に貢献した。最終原稿は著者全員が読み、承認した。

対応する著者
Yuvaraj Bhoobalan-ChittyまたはXu Pengまでご連絡ください。

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Communications誌は、Francisco Rodriguez-Valera氏、Aude Bernheim氏、およびその他の匿名の査読者の方々の本研究の査読への貢献に感謝する。査読ファイルはこちら。

追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

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転載と許可

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この記事の引用
Bhoobalan-Chitty, Y., Xu, S., Martinez-Alvarez, L. et al.古細菌ウイルスの防御遺伝子の制御配列に基づく発見。Nat Commun 15, 3699 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-48074-x

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受領
2023年09月06日

受理
2024年4月19日

出版
2024年05月02日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-024-48074-x

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