菌糸体ネットワークにおける局所的なカルシウム信号伝達が示すストレス応答の分散化
菌糸体ネットワークにおける局所的なカルシウム信号伝達が示すストレス応答の分散化
https://academic.oup.com/pnasnexus/article/2/3/pgad012/7070627?login=false
伊谷彩香、増尾俊介、山本里穂、芹澤智子、深澤優、高谷直樹、豊田将嗣、別役実、竹下紀夫
著者ノート
PNAS Nexus, Volume 2, Issue 3, March 2023, pgad012, https://doi.org/10.1093/pnasnexus/pgad012
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2023年3月07日
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多くの菌類は、菌糸のネットワークである菌糸体として生きています。菌糸のネットワークは、栄養分や水を広く行き渡らせるのに適している。この物流能力は、真菌の生存域の拡大、生態系における栄養循環、菌根共生、病原性などに不可欠である。また、菌糸体ネットワークにおけるシグナル伝達は、菌糸体の機能と頑健性に不可欠であると予測されている。真菌の菌糸体におけるタンパク質や膜の輸送、シグナル伝達については、多くの細胞生物学的研究により解明されているが、菌糸体におけるシグナル伝達を可視化した報告はない。本論文では、蛍光Ca2+バイオセンサーを用いて、モデル菌であるAspergillus nidulansにおいて、局所的な刺激に応答して菌糸網内でカルシウムシグナルが伝達される様子を初めて可視化した。菌糸内部でのカルシウムシグナルの波状伝播や、菌糸内でのシグナルの点滅は、ストレスの種類や近接度によって変化することがわかった。しかし、シグナルは1,500μm付近までしか伸びず、菌糸が局所的に反応していることが示唆された。また、菌糸はストレスがかかった部分のみ成長の遅れを示した。局所的なストレスは、アクチン細胞骨格や膜輸送の再編成を通じて、菌糸の成長停止と再開を引き起こした。カルシウムシグナル、カルモジュリン、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼの下流を明らかにするため、主要な細胞内Ca2+受容体を免疫沈降させ、質量分析によりその下流標的を同定した。本データは、脳や神経系を持たない菌糸体ネットワークが、局所的なストレスに応答して活性化されたカルシウムシグナルによって分散型応答を示すことを示す証拠となる。
カルシウムシグナル、菌糸体、カルモジュリン、カルモジュリン依存性キナーゼ、真菌類
課題欄です：
マイクロビオロジー
編集者 馬 立俊（マー・リージュン
シグニチャーステイトメント
菌類の菌糸網は、時には土の中に数メートルも伸びています。菌糸網が栄養や水を運ぶ能力は、菌類の成長だけでなく、植物や森林生態系にも影響を与える。また、脳や神経系を持たない菌糸体ネットワークにおける情報伝達は、その物流能力に加えて、菌糸体の機能や頑強さに不可欠であり、菌類の記憶や知能にも関わる可能性がある。本研究では、カルシウムシグナルを可視化し、その下流のターゲットを特定することで、菌糸体ネットワーク内でどのように情報が伝達されるかを明らかにした。また、菌糸体が局所的なストレスに応答して局所的なカルシウムシグナルを発生させることで、集中型ではなく分散型の応答を示すことを示す証拠となった。
はじめに
ほとんどの真菌は、菌糸の伸長と分岐を繰り返しながら菌糸体を形成する(1, 2)。菌糸の外側に多数の分解酵素を分泌し、環境中の生体高分子を分解し、菌糸の発達過程でそれらを吸収して栄養を得る。菌糸体は栄養基質への吸着やその中への侵入に適しており、大型で固い基質の感染・分解において真菌類に大きな利点を与えている（2-4）。菌糸のネットワーク構造は、吸収した栄養分をネットワーク全体に広く行き渡らせることができる。この物流的な役割は、真菌の生存域の拡大、生態系における栄養循環、菌根共生、病原性などに重要である(5-7)。菌根ネットワークは、土壌中で近隣の植物をつなぎ、その栄養分配に寄与している(8)。栄養の物流に加えて、ストレス応答などのシグナル伝達が菌糸体の機能や頑健性に重要であることが予測されているが（9）、菌糸体ネットワークにおけるシグナル伝達についてはほとんど知られていない。
多細胞生物の細胞は、細胞間コミュニケーションによって一つの生命システムに統合されている。細胞内のCa2+濃度の変化として定義されるカルシウムシグナルは、いくつかの生物種の細胞間で生物学的情報を伝達するセカンドメッセンジャーとして機能する(10)。例えば、カルシウムシグナルは、神経ネットワークにおけるニューロン間の化学交換と情報伝達に必要である(11)。別の例では、植物が乾燥や損傷などの環境ストレスにさらされると、カルシウムシグナルが活性化され、下流の反応が引き起こされる（12）。ある葉が損傷を受けると、カルシウムシグナルは、植物全体に水や栄養を運ぶ葉脈を介して、損傷を受けた葉から離れた葉や植物体全体に移動します(13)。カルモジュリン（CaM）とカルシウム/CaM依存性プロテインキナーゼ（CaMK）は、細胞内の主要なCa2+受容体で、これらのシグナルを多数の標的タンパク質に伝達する役割を担っています（14）。Ca2+に結合し活性化したCaMは、標的タンパク質に直接結合し、その活性を変化させる。CaMKは標的タンパク質をリン酸化し、その活性を調節する。
ジカリヤー菌の多くは、菌糸が隔壁で分離された多細胞菌糸を形成するが、隔壁には小さな孔があるため、細胞質は絶えずつながっている(15)。最近の研究では、菌糸の先端で振動するCa2+の流入がアクチンの脱重合とエキソサイトーシスのタイミングに影響を与え、菌糸が振動的に成長することが明らかになっている（16、17）。本研究では、局所的な刺激に応答して、菌糸体ネットワークおよび各菌糸体内でカルシウムシグナルが伝導されることを調べた。CaM/CaMKの緑色蛍光タンパク質（GFP）トラップおよび質量分析により、カルシウムシグナルの下流標的を同定した。
研究成果
切断ストレスによる菌糸体内のカルシウムシグナルの伝導
細胞内 Ca2+ 量は、モデル菌 A. nidulans (16) の赤色蛍光 Ca2+ バイオセンサー R-GECO により可視化した。2日間培養後の直径約10 mmのコロニーを剃刀で切断し、広視野蛍光顕微鏡で菌糸内の赤色蛍光をモニターした（13）（Methods参照）。菌糸の端は、菌糸の成長と平行な方向に沿って切断し、信号が菌糸内で水平に広がり、隣接する他の菌糸にどのように広がるかを調べた（図1A、ビデオS1）。カルシウムシグナルは切断部位から約500μmの位置に同時に現れ、10秒後にピークに達し（図1BおよびS1A、t = 33）、120秒まで徐々に減衰した（図1C、D）。初期蛍光は切断部付近（300μm以上）で強く、300μmから600μmまで距離が離れると減少し、600μm以上では有意差は見られなかった（図1A-D）。シグナルは、裂け目付近（>300μm）の菌糸全体で安定していた。切断部位から300-600μmでは、初期蛍光の退色後、シグナルはしばしば菌糸内に現れ、広がり、消失した（ビデオS1）。切断部位から遠い菌糸体（<600μm）では、初期蛍光は低く、すぐに消失した。最も長いシグナルが検出されたのは、切断部位から約1,000μmの距離であった（図1D）。
図1.
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切断された菌糸体におけるカルシウム信号の伝導。A）菌糸を切断した直後のカルシウムシグナルの画像（ビデオ1より）。切断部位をグレーの線で示す。切断部位からの距離により、近傍、中間、遠方に分類された。B) 切断部位から近い、中間、遠くの菌糸におけるカルシウムシグナルの信号強度の時間経過。平均±SD; n = 5. C, D) カルシウム信号の伝播の時間変化を異なる色で示す(C)。C)の矢印に沿ったラインプロファイルの時間変化を異なる色で示す(D)、平均±SD; n = 3. E) 異なるカラーボックスでのシグナル強度の時間経過。カラーボックスでのシグナル出現の画像。領域は（A）の点線ボックスで示す。F) Video 2から菌糸の成長方向に対して垂直に菌糸の端を切断する前後のカルシウムシグナルの画像。切断部位をグレーの線で示す。G) 矢印に沿ったラインプロファイル。H)1日、2日、7日、14日のコロニーにおけるカルシウム信号伝導のラインプロファイル。切断部位から最も長い距離のシグナルのボックスプロット。n = 14, 3, 4の独立した実験からの13。I) 切断部位から800-1400 mmのボックス領域。J) 頻繁に出現する2つのシグナルの画像シーケンス。I)に点線ボックスで示した領域。K) J）の異なる色の円での信号強度の時間経過を示す。L) 信号が現れた時間と切断部位からの距離の散布図。波の違いにより色が異なる。M) Video 3の7日目および14日目のコロニーで、菌糸の端を切断した後のカルシウム信号の画像。切断部位をグレーの線で示す。矢印に沿ったラインプロファイル。平均値±SD; n = 3. N) カット前後の菌糸の伸長の画像シーケンス。O) 菌糸の先端付近で切断した部分、菌糸の下部で切断した部分、および切断していない部分の菌糸伸長率。平均値±SD；n = 3.
最初の蛍光が弱まった後、菌糸の先端や菌糸の途中の限られた領域（<50 μm）で、短命のシグナルが菌糸の様々な場所で観察された（Video S1）。Ca2+シグナルは、近接した異なる菌糸の間を伝播し、菌糸内で広がっているように見えた（図1EおよびS1B）。シグナル強度は、切断部位からの距離が長くなるにつれて減少した。シグナルの出現時間と切断部位からの距離には相関があるようだ（Fig. S1A）。同じ菌糸が繰り返し瞬きすることはほとんどなかった。
同じような大きさの菌糸を、菌糸の成長方向に対して垂直に縁を切ってみると（図1F、G、ビデオS2）、切断部位の近く（<500 μm）の菌糸全体にカルシウムシグナルが直ちに出現した。500μmから離れるにつれて信号強度は徐々に減少し（図S1C）、これは図1Bと同様であった。切断部位から1,000μm付近では、菌糸の中央部にシグナルピークが現れた（図1G、H）。これは、切断による拡散性のシグナルが1,000μm付近まで広がっていることを示唆している。それ以上離れると、シグナルは急激に減少した（Fig. S1D）。切断部位から800-1,400μmのボックス領域では、2つのシグナルが頻繁に出現し、伝達速度がそれぞれ41μm/sと50μm/sの第1波と第2波によるシグナル伝播を示唆していた（図1I-L）。
1日培養後の直径約5 mmの小さなコロニーを半分に切断した（図S1E, F）。カルシウムシグナルは、切断部位の近くの菌糸全体に直ちに現れ、切断部位から離れると弱くなった。シグナルは、裂開部から700μm未満の菌糸に出現した。図1AおよびFで2日培養菌糸を切断すると、切断方法によらずシグナルは1000μm以上拡散したが、若い菌糸を切断するとシグナルは700μmしか移動しなかった（図1H）。また、7日または14日培養の成熟菌糸を縁を中心に垂直に切断すると、シグナルは切断部から1,500μm付近に拡散した（図1H, M, Video S3）。これらの結果から、シグナルの伝達距離は菌糸網の成熟度に依存し、カルシウムシグナルは菌糸網の中で最大1,500μmしか移動しないことが示唆された。開裂部付近の蛍光強度は、2日、7日、14日のコロニーで同等であり、1日のコロニーよりも高かった（Fig. S1G）。菌糸の伸長に対する切断の影響を解析したところ、菌糸の伸長は、菌糸の先端付近で切断された部分のみ遅れ、それ以外はほとんど影響を受けなかった（図1N、O、ビデオS4）。
EtOHまたはNaClの滴下による菌糸体内のカルシウムシグナルの伝導性
直径約10 mmの菌糸の端に1 μLのエタノールを滴下して脱水ストレスを与えると、滴下した部分に同時にカルシウムシグナルが現れ、その強度は15秒後にピークに達し、160秒までゆっくりと減少した（図2A、B、ビデオS5）。蛍光は落下した領域にはほとんど広がらない（図2C、D、S2A）。カルシウムシグナルは、多くの菌糸の先端で繰り返し点滅した。ある菌糸は35秒ごとに5回、175秒間点滅し（図2E-G、灰色）、他の菌糸は30秒間に4回、素早く弱い信号を点滅させた（オレンジ色のt = 63-99）。複数回瞬きをした蛍光強度の最大値は、時間の経過とともに徐々に減少した（図2F）。エタノール滴下領域以外では、菌糸はほとんど瞬きをせず、瞬きの回数も2～3回にとどまった（Fig. S2B）。
Fig. 2.
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EtOHまたはNaClの滴下による菌糸体内のカルシウム信号の伝導。A) EtOHの滴下直後のカルシウムシグナルの画像（ビデオS4より）。滴下箇所を白丸で示す。滴下部位からの距離により、近傍、中間、遠方に分類された。B) 落下地点から近い、中間、遠くの菌糸におけるカルシウムシグナルの信号強度の時間経過。平均値±SD；n = 5. C, D) カルシウム信号の伝播の時間変化を異なる色で示す(C)。C)の矢印に沿ったラインプロファイルの時間変化を異なる色で示す(D)。平均値±SD; n = 3. E) カラーボックスにおける菌糸内のカルシウムシグナルの点滅。(A)で点線枠で示した領域。F) (E)の異なるカラーボックスにおける信号強度の時間経過。G) (E)のボックスの画像シーケンスと信号強度の時間経過を示す。点滅の回数を示す。H) NaCl滴下直後のカルシウムシグナルの画像。I)滴下部位の近傍、中間、遠方の菌糸におけるカルシウムシグナルの信号強度の時間経過を示す。平均±SD; n = 5. J, K) カルシウム信号の伝播の時間変化を異なる色で示す(J)。J)の矢印に沿ったラインプロファイルの時間変化を異なる色で示す(K)。平均値±SD; n = 3. L) 菌糸におけるカルシウムシグナルの広がりの画像。拡散は色付きの矢印で示されている。拡散距離の時間変化を色付きの折れ線グラフで示す。M) カット、EtOHまたはNaClを滴下した菌糸のカルシウムシグナルの強度の時間経過を示す。平均値±SD; n = 5.
塩ストレスとして1μLの3M NaClを直径約10 mmの菌糸の端に滴下すると、滴下した部分で数個の菌糸先端が蛍光を発し、すぐに消褪した（図2H、I、ビデオS6）。80秒間の無蛍光期間の後、多くの菌糸の蛍光強度が徐々に増加した（Fig. 2H-K）。カルシウムシグナルは、4.9 ± 1.8 μm/sの速度で、菌糸の中央部から先端部と基端部の両方に広がった（Fig. 2L and S2D）。150秒後、NaClを滴下した部分のほとんどの菌糸は、菌糸全体に拡散した安定した蛍光を示した（図2J、K）。シグナル強度は300秒まで徐々に減少した（Fig. S2G）。滴下した領域の外側では、少数の菌糸が1、2回短時間点滅した（Fig. S2F）。同様のシグナルパターンが、7日間培養したコロニーで、エタノールとNaClに反応して観察された（Fig. S2H, Video S7）。
開裂、エタノール、NaClのストレス応答の時間経過を比較すると、開裂はすぐに最大値に達したが（＜5秒）、エタノールストレスは15秒のわずかな遅延の後にピークに達した。開裂はエタノールやNaCl処理よりも高い最大値を示した（図2M）。NaClストレスでは90秒後にシグナルが増加し、エタノール処理と同程度のピークに達した。菌糸の伸長は、EtOHまたはNaClを滴下した領域でのみ遅延し、それ以外はほとんど影響を受けなかった（図S2I、J、動画S3）。
菌糸を介したカルシウム信号の伝導
点状レーザー照射で刺激した各菌糸のカルシウムシグナルを解析した（方法参照）。点状レーザーを菌糸の先端に照射すると、カルシウムシグナルが素早く繰り返し現れ、それぞれのシグナルは後方に広がって消えた（図3A, B, Video S8）。2分以内に、シグナルは4±2回出現した（図3C）。キモグラフ解析により、伝導時間、距離、速度がそれぞれ11±5秒、25±15μm、4±2μm/sとなった（図3D）。カルシウム信号の平均間隔時間は18±12秒であった（n＝48信号）。図2Lで観察されたように、カルシウムシグナルは時々、菌糸の中央部で両方向に拡散した（図3E、ビデオS9）。菌糸の先端と中間部では、伝導時間と伝導速度に大きな変化はなかった（Fig. 3D）。カルシウム信号は隔壁を通過するが、そこでいったん減速した（Fig. 3F, Video S9）。カルシウム信号の明滅は隣接する菌糸に伝わるが、信号の強度と明滅の数は減少した（Fig. 3G）。
Fig. 3.
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点状レーザー照射で刺激された菌糸のカルシウムパルス。A) ビデオS6より、菌糸の先端（矢印）に点状レーザーを10秒間照射した後のカルシウムパルスの画像シーケンス。経過時間は秒単位で示す。スケールバー：20μm。(B) (A)に示した菌糸に沿ったカイモグラフ。総経過時間120秒、スケールバー：20μm。C）5、10、20秒のレーザー照射後の菌糸先端からのカルシウムパルス数とカルシウムパルスの間隔の箱プロット（それぞれn = 10-14, n = 17-33）。D) 菌糸先端部（n=35）および菌糸中央部（n=6）のカルシウムパルスの時間、距離、速度の箱ひげ図。E)ビデオS7から、菌糸の中央部におけるカルシウム信号の画像シーケンス。経過時間は秒単位で示す。スケールバー：20μm。F)隔壁（矢印）に到達し、通過したカルシウムシグナルの画像シーケンス（合計120秒）。経過時間は秒単位で表示。スケールバー：20μm。G) (1,矢印)でのレーザー照射後、周囲の菌糸(2-4)で発生したCa2+パルス。各菌糸先端部（1-4）におけるカルシウム信号の時間的変化を示すラインプロファイル。H) 点レーザー照射後のGFP-TpmAと成長方向の変化の画像シーケンス（矢印）。経過時間は秒（左）、分（右）で示した。I) Cytochalasin A（アクチン重合阻害剤）で処理したハイファにおけるF-アクチンとCa2+の画像。菌糸に沿ったキモグラフを示す。合計120秒。スケールバー： 5 μm。
レーザー照射時間を10秒から5秒と20秒に変更し、カルシウムパルス数とインターバルをモニターしたところ、カルシウムパルス数の平均はそれぞれ3±2、5±2であった（図3C）。平均インターバル時間はそれぞれ21±17秒、15±9秒であった（Fig. 3C）。レーザー照射時間が長くなるにつれて、カルシウムパルスの数が増え、間隔が短くなった。レーザー刺激がない場合、パルスの平均間隔は26±7秒であった（16）。
レーザー照射により、菌糸の成長は短時間で停止した。数分後に先端から新しい極点部位が出現し、先端の成長が始まった。レーザー照射により、菌糸体先端部のF-アクチンと分泌小胞はシグナルを失った（図3HとS3A、ビデオS10）。菌糸の成長が再開すると、F-アクチンと分泌小胞は新しい極点部位に局在するようになった。この結果は、レーザー照射によって誘発されるカルシウムシグナルが、アクチンの迅速な解重合と膜輸送の一時停止に関与していることを示唆している。一般に、細胞内のCa2+レベルは、アクチンの集合と小胞の融合を直接制御する(18, 19)。逆に、アクチン重合や膜輸送を化学処理で阻害すると、菌糸の成長は止まり、周期的なカルシウム流入も観察されなかった（図3IおよびS3B、C）。
CaMとCaMKsの標的タンパク質
カルシウムシグナルは、菌糸体におけるアクチン細胞骨格の再配列と小胞輸送に役割を果たしているが、カルシウムシグナルがこれらのプロセスをどのように制御しているかについてはほとんど知られていない。A.nidulansのゲノムには、唯一のカルモジュリン（caM）と3つのCaMK（cmkA、cmkB、cmkC）をコードする遺伝子が存在する（図S4A）。caM、cmkA、cmkBは分裂の進行に必要なので必須である（20-22）が、cmkCは必須ではない、胞子の発芽と核分裂が遅れ、コロニーは浸透圧ストレスに弱い（22、23）。
CaM-mRFPは成長する菌糸の頂点と紡錘体極体に局在する（図4A）(24, 25)。我々の動画では、微小管が伸長するにつれてCaMが菌糸体頂点に移動する様子が示されている（図S4B、動画S11）。CmkA、CmkB、CmkCはそれぞれGFPタグを持ち、ネイティブプロモーターで発現しており、細胞質内に存在している（図4A.） これらの株は重度の表現型を示さないことから、CaM-mRFPおよびCaMK-GFP融合タンパク質が機能していることがわかる。qRT-PCR解析では、浸透圧ストレスおよびアクチン重合、膜輸送、カルシウムチャネルの阻害剤による処理に対して、CaMKの発現レベルに変化は見られなかった（図S4C）。EtOHまたはNaCl処理に応答して、CaM-mRFPのアピカルな局在は消失した（図S4D）。
図4.
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CaMとCaMKの局在と相互作用タンパク質。A) GFP標識微小管とCaM-RFPの蛍光像。CmkA-GFP、CmkB-GFP、CmkC-GFPの菌糸体における細胞質局在化。スケールバー： 10 μm。B) CaM、CmkA、CmkB、およびCmkCと相互作用するタンパク質。表は、タンパク質名、遺伝子ID、ベイトタンパク質とネガティブコントロールの強度、配列カバー率を示す。機能分類は異なる色で示されている。C)CaM、CmkA、CmkB、CmkCと相互作用するタンパク質のベン図。D) CaMとCaMKを介したカルシウムシグナル伝達経路の概要。
CaMおよびCaMKと相互作用するタンパク質をRFP-trapまたはGFP-trapを用いて免疫沈降させ、LC-MS/MSにより同定した（Methods参照）。SDS-PAGEにより、これらのタンパク質のバンドがCaMおよびCaMKのバンドに対応することが確認された（図S4E）。2つの独立した実験において、ネガティブコントロール（野生型）より10倍高いLC-MS/MS強度、3.E + 06より高い強度、および10%以上の配列カバー率を有するタンパク質に着目した（図4B、テーブルS1）。CmkBの場合、多くのミトコンドリアタンパク質が検出されたため、4.E + 07以上の強度と10%以上の配列カバー率でタンパク質がフォーカスされた。CaM、CmkA、CmkB、CmkCはそれぞれ11、16、44、7個の標的タンパク質の候補がある。標的タンパク質間の重複はほとんどなく（図4C）、異なる標的へのシグナル伝達は機能的に分化していることが示唆された。
CaM-mRFPと相互作用するタンパク質として、3つのCaMKとカルモジュリン依存性リン酸化酵素であるカルシニューリンのサブユニットAおよびBが同定された（図4B）。さらに、エンドサイトーシスとエキソサイトーシスのモータータンパク質（ミオシン-1、ミオシン-5、キネシン-3）（26-28）、液胞ソーティング関連タンパク質Vps13（29）のオルソログも発見された。これらのタンパク質は、細胞溶解液にEDTAを添加してもCaM-mRFPと共沈しないことから、CaMとの相互作用がCa2+依存であることが示された。GOおよび濃縮解析（クラスター頻度／バックグラウンド頻度）により、小胞輸送および核分裂制御に関わるタンパク質がCaMと相互作用するタンパク質に濃縮されていることが示された（表S2）。
CmkA相互作用タンパク質には、MAPキナーゼキナーゼ（MkkA、MkkB）（23）、サイクリン依存性キナーゼ（NimX、Cdk1）（30）、Ras GTPase、Mitotic Exit Network（31）のTem1、膜交通（32）のArlA（ARF；ADP ribosylation factor）、菌糸形態形成（33）などの情報伝達に関わるタンパク質が含まれていた（図4B）。CmkBと相互作用するタンパク質は、アセチル-CoA生合成、チアミン生合成、糖新生、解糖系、分岐鎖アミノ酸代謝系に豊富であり（表S2）、これらは細胞質タンパク質とミトコンドリアタンパク質からなる。おそらくCmkBがミトコンドリア関連タンパク質をリン酸化するため、この実験ではミトコンドリア画分がCmkBと共沈していた。また、Woronin body (HexA) (34), 14-3-3 ortholog ArtA (35), and a nucleoside diphosphate kinase (SwoH) (36) が発見されたが、これらはすべて菌糸の発達に重要な役割を果たす。CmkBはCmkC-GFPと共沈し、CmkCがCaMKキナーゼ（CaMKK）であることと一致する。ArtAとSwoHは、CmkBを介した間接的な相互作用の可能性もあるが、CmkCと相互作用するタンパク質として再度同定された。菌糸の成長に重要なクラスIIIキチン合成酵素（ChsB）はCmkC-GFPと共沈していた（37）。
考察
細胞内Ca2+の動態は、いくつかの糸状菌の菌糸体において示されている（16、38、39）。本研究は、カルシウムシグナルが菌糸体ネットワーク内でどのように伝播するかを初めて明らかにしたものである。菌糸の一部を切断すると、局所的なカルシウムシグナルが現れ、約1500μmにわたって外側に広がっていった。また、菌糸体の一部にエタノールやNaClを滴下すると、滴下した部分の信号が活性化した。菌糸体には脳や神経系がないため、制御は集中的ではなく分散的である(2)。菌糸体のある部位でストレスを感じても、菌糸体全体に警報を出す必要はなく、むしろその部位でストレスに対応した方が効率的なのです。実際、ストレスを受けた部分だけコロニーの成長が鈍り、それ以外の大部分は滞りなく成長を続けていた。菌糸が四方八方に伸びて、それぞれの場所で判断することが、菌糸の成長と適応に適しているのだろう。
Ca2+の振動は、すべての細胞におけるシグナル伝達のユビキタスな手段である。正のフィードバック、あるいは負のフィードバックとの組み合わせにより、Ca2+誘導性Ca2+放出から生じるCa2+振動が引き起こされる(40)。振動の形状は、その振幅と位相によって特徴付けられ、植物と哺乳類の両方の細胞において、異なる細胞応答を効率的に伝達することができる（41）。今回の結果は、ストレスの種類やストレスの近接度によって振動の形状が異なることを示している。尖ったレーザー照射時間が長くなると、Ca2+流入の回数が増え、間隔が短くなった。ストレスの程度やストレスからの距離によって、下流経路の活性化が異なる可能性があるが、そのメッセージを読み解くにはさらなる解析が必要である。
レーザー照射に応答して、アクチン細胞骨格は菌糸先端で解重合し、小胞輸送と菌糸の伸長を停止する。しばらくすると、細胞極性とアクチン細胞骨格が再構築され、小胞輸送と菌糸の伸長が再開される。モータータンパク質（ミオシン-1、ミオシン-5、キネシン-3）は、CaMの標的として同定された。前者はアクチンの組織化に、後者は小胞輸送に関与している。CaMは、アクチン重合とエキソサイトーシスが起こる菌糸先端と、微小管のマイナス端が結合するSPBに局在している。CaMの菌糸先端への移動は微小管の伸長と関連しており、キネシン-3やミオシン-5と連携して膜輸送に機能すると予想される。CmkAもArlA（ARF）との相互作用により膜輸送に関与している。クラス III キチン合成酵素である ChsB は、小胞で菌糸先端部に輸送され、菌糸先端部の成長に必須な役割を果たすが (37, 42)、これは CmkC と共沈している。Candida albicansのキチン合成酵素Chs3はリン酸化されており、リン酸化と脱リン酸化の両方がその正しい局在と機能に必要である(43)。CmkCは、キチン合成酵素をリン酸化することで、カルシウムシグナルと細胞壁合成を結びつけているのかもしれない。カルシニューリンは免疫抑制剤の標的であり、真菌の病原性や薬剤耐性に重要である(44)。カルシニューリン標的の一つである転写因子Crz1は、脱リン酸化と核内転位を通じて、ストレス応答、細胞壁の完全性、薬剤抵抗性の制御に関与している(45)。細胞壁の完全性シグナル伝達経路もストレス応答に関与している可能性があるが、ChsB以外にその経路との重複がないことから(46)、カルシウムシグナル伝達経路とは異なる機能が期待される。注目すべきは、ここでCmkA-associated proteinsとして推定される転写因子が同定されたことである。
我々は、単一菌糸におけるカルシウム振動を可視化し、アクチンやエキソサイトーシスとの関連性を見出した(16)。カルシウムシグナルの下流にあるどのような分子が菌糸の成長を制御しているのかを明らかにするために、CaMとCamKの標的を探した。一方、1本の菌糸だけの反応は明らかになっても、菌糸ネットワーク全体の反応は不明であるため、カルシウムシグナルが菌糸ネットワーク内でどのように伝達されるかを調べた。本論文では、これまでの知見の上流と下流をそれぞれ探ることで、マクロ菌糸体から単一の菌糸体細胞、そして標的タンパク質に至るまで、異なる階層での現象を結びつけました。その結果、菌糸体ネットワークにおける局所的なカルシウムシグナル伝達は、分散的なストレス応答を示すことがわかった。
本研究では、子嚢菌A. nidulansの菌糸体ネットワークについて解析を行った。アーバスキュラー菌根ネットワークと担子菌の菌糸体ネットワークは基本的な構造が異なるため、この知見が両者に当てはまるかどうかを判断する際には注意が必要である。AM菌は、成長過程で栄養分の輸送と分配を調整することにより、菌糸網を最適化し、主要な菌糸には流れが集中し、細胞壁が厚くなる一方、不要な菌糸は空になって隔壁で分離される(47)。外菌根菌や腐生性担子菌は、複数の菌糸の集合体である菌糸帯を形成し、一部は直径約10〜15μmの厚肉繊維菌糸と血管菌糸が分化した根粒を形成し、流れを良くすると考えられる（2, 48）. 量子ドットや蛍光タンパク質が菌糸体ネットワーク内を移動できることを示す証拠が増えつつあるが、菌糸体ネットワークの流動性を可視化することはまだ難しい(49)。そこで、菌糸体ネットワークの発達や特徴をモデル化し、その生態学的重要性を予測する試みが行われている（50）。菌糸体ネットワークにおける物流の最適化は、菌類の記憶と関係があるようだ(51)。また、菌糸体ネットワークにおける電気的シグナルは、真菌の知的コミュニケーションに関与している可能性がある(52)。菌糸体ネットワークにおける物質や情報の伝達の研究の背景には，菌類の基本的な性質を明らかにする，広く未開拓の研究分野が存在する。
材料と方法
真菌の菌株と培地
本研究で使用した糸状菌の菌株は表S3に示す通りである。GFPによるタギングについては、Supplemental MethodsおよびTable S4に記載されている。
菌糸体におけるCa2+イメージング
遺伝子組換え Ca2+ バイオセンサー R-GECO を発現する Aspergillus nidulans を、P2-SHR PLAN APO 1x/0.16 対物レンズ (Nikon) と sCMOS カメラ (ORCA-Flash4.0 V2; Hamamatsu Photonics) を備えた電動蛍光実体顕微鏡 (SMZ-25; Nikon) で撮影した (13, 53). 水銀灯（Intensilight Hg Illuminator; Nikon）、561/14nmの励起フィルター（FF01-561/14-25, Semrock）、575nmのダイクロイックミラー（Di02-R561-25 × 36; Semrock）を使用してR-GECOを励起した。609/54nmのフィルター（FF01-609/54-25; Semrock）を通過した赤色蛍光信号は、NIS-Elementsイメージングソフトウェア（Nikon）を用いてsCMOSカメラで取得した。
ポイントレーザー照射
Aspergillus nidulansの細胞を最小培地寒天培地プレート上で30℃、2日間培養した。その後、コロニーの縁を5mm角に切り、ガラス皿に入れ、倒立顕微鏡IX-83（オリンパス社製）で観察した。IR-LEGO 1000システム（シグマ光機）（54, 55）を用い、カスタムメイドのUPlanSApo 20x/0.75 およびUPlanSApo 40x/0.95 対物レンズ（オリンパス）を取り付け、15 mWで5-20秒操作して個々の菌糸に局所的に熱ショックを与えた。画像解析にはMetaMorph および Image Jソフトウェアが用いられた。
Lc-MS/MsによるGFP-trapとタンパク質の同定
すべての情報はSupplemental informationに示されている。プロテオームデータ（表S1）は、ProteomeXchange ConsortiumにjPOSTrepo経由で寄託されており、データセット識別子はProteomeXchangeがPXD027777、jPOSTrepoがJPST001285。
その他の方法については、補足資料に示す。
補足資料
補足資料は、PNAS Nexus onlineでご覧いただけます。
資金提供
本研究は、文部科学省科研費番号21H02095、革新的領域研究「ポスト・コッホ・エコロジー」助成番号22H04878の助成を受けて実施したものである。大隅フロンティア科学振興財団、野田科学研究所助成金、科学技術振興機構（JST）ERATO助成番号JPMJER1502.
著者の貢献
A.I.、T.S.、S.B.、N.T.はイメージング実験を行った。A.I.とT.S.がイメージングデータを解析した。S.M.、R.Y.、T.S.はGFP-trap/MS実験とデータ解析を行い、N.T.、M.T.、S.B.は解析ツールを提供、A.I., S.M., Y.F., N.T. wrote the paper.
データの入手方法
本研究の結果を裏付けるすべてのデータは、本原稿および補足資料に掲載されています。プロテオーム解析の生データは、ProteomeXchange ConsortiumのjPOSTrepoに寄託され、ProteomeXchangeのデータセット識別子はPXD027777、jPOSTrepoはJPST001285である。
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211926
.
グーグル・スカラー
ワールドキャット
53
上村
T
,
王
J
,
アラタニ
Y
,
ギルロイ
S
,
トヨタ
M
.
2021
.
シロイヌナズナの局所および全身創傷シグナルの広視野・リアルタイムイメージング
.
J Vis Exp.
172
:
e62114
.
グーグル・スカラー
ワールドキャット
54
亀井
Y
.他
2009
.
赤外レーザーを用いた生体内標的単一細胞における遺伝子誘導法
.
ナットメソッドズ
6
79
81
.
グーグル・スカラー
クロスリファレンス
パブコメ
ワールドキャット
55
デグチ
T
.他
2009
.
メダカ、ゼブラフィッシュ、シロイヌナズナにおける赤外線レーザーによる局所的な遺伝子誘導
.
Dev Growth Differ.
51
:
769
775
.
グーグル・スカラー
クロスリファレンス
パブコメ
ワールドキャット
著者ノート
A.I.とS.M.は、この仕事に等しく貢献した。
競合する利益 著者らは競合する利害関係がないことを宣言する。
© The Author(s) 2023. National Academy of Sciencesに代わってOxford University Pressが発行した。
本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の条件の下で配布されたオープンアクセス論文であり、原著が適切に引用されていることを条件に、いかなる媒体においても無制限の再利用、配布、複製を許可する。
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