プロビオXの併用は短鎖脂肪酸産生菌と胆汁酸経路の促進により2型糖尿病治療薬の治療効果を向上させる
2023年1月23日
プロビオXの併用は短鎖脂肪酸産生菌と胆汁酸経路の促進により2型糖尿病治療薬の治療効果を向上させる
著者 Ye Chen, Xin Shen, Teng Ma, Xia Yu, Lai-Yu Kwok, Yalin Li, Zhihong Sun https://orcid.org/0000-0002-7605-2048, Dongmei Li ldm1229@126.com, Heping Zhang hepingdd@vip.sina.comAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/msystems.01300-22
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mSystems
オンラインファースト
概要
序論
結果
考察
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
ABSTRACT
メトホルミンは2型糖尿病の治療薬として一般的であるが、特に長期間の投与により様々な消化器系の副作用を引き起こす。したがって、メトホルミンの副作用を軽減しつつ、その効果を相乗的に発揮する補助療法を特定することが重要である。腸内細菌叢がメトホルミンの標的であることを支持するこれまでのエビデンスから、本研究では、2型糖尿病の管理におけるプロバイオティクスとメトホルミンの併用の有益な効果およびメカニズムについて、3ヶ月間の無作為二重盲検プラセボ対照臨床試験（n = 27および21、それぞれ試験を完了したプロバイオ群およびプラセボ群）を実施することにより調査した。臨床試験の結果、プロバイオティクスとメトホルミンの併用は、メトホルミン単独服用に比べ、糖化ヘモグロビンを有意に減少させました（P < 0.05）。メタゲノム解析およびメタボローム解析の結果、プロバイオティクスを併用することで、腸内の短鎖脂肪酸（SCFA）産生菌と胆汁酸の量が増加することが示されました。介入後、プロバイオティクス群では、プラセボ群に比べ、有意にまたは僅かに多くの胆汁酸および関連代謝産物が検出された。以上のことから、本研究の結果は、プロバイオティクスとメトホルミンの共投与が2型糖尿病患者の血糖降下作用に相乗効果をもたらし、これは腸内細菌群の調節、ひいてはSCFAおよび胆汁酸代謝の調節を介したものと思われることを示した。本結果は、プロバイオティクスとメトホルミンの併用療法が2型糖尿病患者に有益であることを支持するものである。
重要性 メトホルミンは、特に長期投与後に、さまざまな胃腸への悪影響を引き起こす。我々は、2型糖尿病の管理のためにプロビオXとメトホルミンの共治療は、腸内SCFA産生菌と特定の胆汁酸のレベルを促進し、したがって関連する消化管ホルモンの分泌を高め、最終的にグルコースホメオスタシスを改善することができることを発見した。
はじめに
2型糖尿病（T2DM）は、血糖値の上昇を特徴とする慢性代謝性内分泌疾患である。糖尿病の典型的な症状は、「3多くて1少」、すなわち、多尿、多飲、多食、および体重減少である。ここ数十年の現代的なライフスタイルの変化により、患者数は大きく増加しています(1)。現在、世界には5億人以上の糖尿病患者がいるといわれています。米国におけるT2DMの発症率は、過去10年間で、人口10万人あたり9人から12.5人へと、毎年7.1％増加しています（2）。中国における糖尿病の有病率は1980年の0.7%から2017年には12.8%に上昇し、成人の3分の1以上が糖尿病予備軍であることがわかりました（3）。糖尿病は通常、糖尿病性腎症や心血管・脳血管疾患など、人間の健康を著しく損なう一連の合併症を伴います（4、5）。
現在、糖尿病治療には、ビグアナイド系薬剤、α-グルコシダーゼ阻害剤、インクレチン系薬剤が一般的に使用されています（6）。メトホルミンはT2DMの治療に最も頻繁に使用される薬剤ですが、その具体的な血糖降下作用のメカニズムはまだ解明されていません。一般に、メトホルミンは主にミトコンドリア呼吸複合体Iを阻害し、AMPレベルを上昇させ、AMP-activated protein kinaseを活性化して肝グルコース生成を抑制することにより抗高血糖作用を示すと考えられている(7)。しかし、腸内細菌がメトホルミンの血糖降下機構に重要な役割を果たす可能性があることが、より多くの研究により明らかになってきた。例えば、これまでの研究で、T2DM患者では腸内細菌叢のα多様性が健常者よりも一般に低く（8、9）、FirmicutesとActinobacteriaの相対存在量が増加し、Bacteroidetesの相対存在量は減少していることが示されている（10）。メトホルミンはT2DM患者の血糖を低下させ、Bacteroides fragilisの存在量の有意な減少を含む腸内細菌の有意な変化を伴うことから（11）、血糖低下における腸内細菌叢の役割が示唆されている。既存のエビデンスでは、腸内細菌叢が胆汁酸（BA）を調節することによって代謝性疾患を制御していることが裏付けられている。胆汁酸およびその代謝物は、腸管受容体と相互作用して代謝を調節する重要な生物学的活性リガンドである(12)。BA代謝では、肝臓でコレステロールが一次BAに変換され、頂膜のナトリウム依存性BAトランスポーターによって腸管細胞に吸収される(13)。腸に入った後、BAは腸内細菌によって化学修飾され、細菌修飾されたBAはシグナル分子として働き、さらに腸内細菌と相互作用する（14）。最近のin vivoとin vitroの複合研究により、メトホルミンは腸内のBacteroides fragilisを減少させることで高血糖などの代謝異常を改善し、特定のBAが増加し、腸内のファルネソイドX受容体シグナルが抑制され、血中グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）が増加し、これらの作用により血糖恒常性を改善できることが示された(11). これらの報告は、メトホルミンがBAを調節する腸内細菌叢を標的として、T2DMの臨床症状に影響を与えることを一貫して支持している。
臨床場面では、糖尿病患者は、高血糖の重症度や症状管理の目標に応じて、単一あるいは複合的なレジメンを用いて治療される。しかし、糖尿病治療薬は、特に併用療法を行う場合、必然的に何らかの副作用や不快感を引き起こす。例えば、メトホルミンでは吐き気、ガス、腹部膨満感、下痢、ビタミンB12欠乏症、胃もたれなどが、リラグルチドでは吐き気、下痢、嘔吐、食欲低下、消化不良、便秘などが起こる可能性があるのだそうです。メトホルミンは通常、T2DMの管理において最初に処方される薬剤であり、リラグルチドのような他の薬剤との併用により、さらなる治療効果が期待されます。青少年のT2DM患者を対象に実施された過去の無作為化二重盲検試験では、メトホルミンのみを投与しリラグルチドを投与しないプラセボ群に比べ、メトホルミンとリラグルチドの併用により、糖化ヘモグロビンおよび空腹時血糖値（FPG）の平均値がより明らかに低下し、52週間にわたる血糖コントロールに大きな効果があったと報告されています。両群とも治療に伴う副作用を訴えたが、リラグルチド適用による有益な効果の追加は、消化器系の有害事象の頻度が高くなる代償となった(15)。したがって、併用療法を処方する際には、副作用を考慮することが非常に重要であり、メトホルミンの臨床効果を高めるだけでなく、副作用が少なく、安全に服用できる治療法を探索することは非常に意義があると思われます。
プロバイオティクスは、十分な量を与えると宿主に健康上の利益を与える生きた微生物と定義されています（16）。プロバイオティクスの投与は、多くの動物およびヒトのランダム化比較試験（RCT）において、T2DMの臨床指標を改善することが示されている。Keらは、シンバイオティクス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis、Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DSM 46331、オート麦β-グルカン）の介入により、食事誘導肥満マウスの体重、血糖値、脂質、その他の臨床指標が著しく減少することを示している（17）。多穀物プロバイオティクスの補給は、T2DM患者の空腹時血糖値、グリコシル化ヘモグロビン値、インスリン抵抗性指数を低下させることが判明した（18）。また、プロバイオティクスやシンバイオティクスは、糖尿病前症患者におけるグリコシル化ヘモグロビン値を有意に低下させることが明らかになった（19）。9つのRCTのメタアナリシスでは、従来のヨーグルトと比較して、プロバイオティクスヨーグルトは、患者の空腹時血糖値、空腹時インスリン、インスリン抵抗性およびT2DM/肥満の他の指標を有意に改善しなかったことが明らかになったことは言及に値する(20)。多くの研究が、プロバイオティクスとその関連製品がT2DMの緩和に有益な効果をもたらすことを示しているが、研究間や個人間で見られる臨床効果にばらつきがあるため、臨床場面でのこうした治療の使用方法、特に使用すべき菌株、プロバイオティクスの用量、介入時間について一貫したガイドラインが明確に示されていない。このようなばらつきは、プロバイオティクスの菌株特異性効果や個人間の生理的差異など、複数の要因の結果である可能性があります。したがって、血糖降下作用のある候補菌株を探索するためには、大規模かつ高品質の臨床試験が依然として必要である。
プロバイオティクス製品Probio-Xは、Lactobacillus casei Zhang, Lactobacillus plantarum P-8, Lactobacillus rhamnosus Probio-M9, Bifidobacterium animalis subsp.lactis M8 (Probio-M8) およびBifidobacterium animalis subsp.lactis V9という異なるプロバイオティクス菌株5種類から構成されています。これらの菌株は、これまでの臨床試験で様々な有益な効果が確認されています。例えば、Lactobacillus casei Zhangは、脂肪の蓄積と中心性肥満を抑制することができます（21）。Bifidobacterium animalis subsp. lactis V9は腸内ホルモンと相互作用し、腸脳軸を介して下垂体-視床下部における性ホルモンの分泌に影響を与え、多嚢胞性卵巣症候群を緩和することができる(22). Lactobacillus plantarum P-8は、炎症性因子のレベルを下げ、認知力を向上させることができます(23)。Lactobacillus rhamnosus Probio-M9は、腫瘍の予防と治療に対して良好な治癒効果を有する（24）。Probio-M8は、トリメチルアミンオキシドのレベルを下げ、冠状動脈性心臓病の関連症状を改善することができます(25)。Probio-Xにはこれら5つの菌が含まれており、多くの臨床試験で使用されています。これまでの研究で、Probio-Xは腸内細菌叢の恒常性を維持し（16）、脂質代謝を調節することで高脂血症を緩和することが明らかになっています（Huan Wang, Cuicui Ma, Yan Li, Lei Zhang, Alima, Chengcong Yang, Feiyan Zhao, Haifeng Han, Dongyang Shang, Fan Yang, Yuying Zhang, Heping Zhang, Zhihong Sun, Ruifang Guo）。私たちの以前の研究では、Probio-M8が高血糖マウスモデルにおいてT2DM症状を緩和することがわかりました（Ye Chen, Yaxin Zhao, Xin Shen, Feiyan Zhao, Jinxin Qi, Zhi Zhong, Dongmei LI）。そこで、今回の試験には、複合プロバイオティクス製品であるProbio-Xを選択しました。
プロバイオティクスは一般的に医薬品とはみなされていませんが、T2DMの症状緩和効果が既に実証されていることから、T2DM患者を対象に、メトホルミンとプロバイオティクス併用療法の相乗効果を調べるために、今回の3ヶ月RCTを企画しました（最初に募集したT2DM患者総数は58名、プロバイオティクス群およびプラセボ群は各29名（無作為グループ割付））。主要評価項目は、空腹時血糖値、グリコシル化ヘモグロビン、耐糖能、膵島機能など、T2DMの複数の臨床指標であった。さらに、介入前後で患者さんの糞便メタゲノムとメタボロームの変化をモニターしました。本研究の第二の目的は、患者の腸内細菌叢、臨床指標、代謝産物の変化についてバイオインフォマティクス解析を行い、複合レジメンのT2DM改善における潜在的な血糖降下メカニズムを明らかにすることであった。このような血糖降下メカニズムの解明は、T2DMの管理における従来の薬物療法との併用療法としてプロバイオティクスを使用するための臨床ガイドラインを作成する上で重要なステップとなることが予想されます。
結果
人口統計学的データ。
第1期（n = 10）および第2期（n = 48）の患者を含む、合計58名のT2DM患者が登録され、48名の患者のみが臨床試験を完了した（プロバイオティクス群、n = 27；プラセボ群、n = 21）（図1A）。被験者の年齢は48.70±11.11歳（プロバイオティクス群）、46.90±11.25歳（プラセボ群）であった。ベースラインの年齢、体重、およびウエスト周囲径に、2群間で有意差はなかった（それぞれP = 0.60、P = 0.44、P = 0.16）（補足資料の表S1参照）。全患者にメトホルミン（塩酸メトホルミン徐放錠；Bristol-Myers Squibb Company）（0.75〜1.5 g/日、3用量）を投与し（表S1）、適宜プラセボ材料またはプロバイオティクスを2g投与した。第1期では、空腹時血糖値、グリコシル化ヘモグロビン、尿酸、および糞便メタゲノム試料のみを採取した。したがって、第1期の患者の糞便代謝は解析されなかった。第2期では、10人（プロバイオティクス群から2人、プラセボ群から8人）がフォローアップに失敗し、1人のサンプルが不十分であった。したがって、この研究では37人のサンプルだけが糞便代謝について分析された（プロバイオティクス群、n = 20；プラセボ群、n = 17）（Fig.1A）。
図1
図1 試験デザインおよびT2DMの臨床指標。(A)臨床試験のフロー図。GLU、グルコース。(B）3ヶ月の介入前（0M）と介入後（3M）のプロバイオティクス（Pro）およびプラセボ（Pla）群における空腹時血糖値、ヘモグロビンA1c（HbA1c）、血中尿酸値（UA）の変化。プロバイオティクス群とプラセボ群の同時点での横方向の差、および同一群の0カ月と3カ月間の縦方向の差を評価するために、Wilcoxon検定とt検定を使用した。一対比較で生成されたP値を示す。
補足資料
表S1
被験者に関する情報。Table S1、PDFファイル、0.1 MBをダウンロードする。
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プロバイオティクスの併用は、血糖値とグリコシル化ヘモグロビン値の減少を促進したが、尿酸値と血清脂質値の減少は認めなかった。
空腹時血糖値、グリコシル化ヘモグロビン値、尿酸値は、糖尿病の診断に重要な指標である。その結果、プロビオXとメトホルミンを3ヶ月間併用することにより、グリコシル化ヘモグロビン値は有意に低下し（P < 0.05）、プラセボ群では有意な変化は認められなかった（Fig.1B）。プロバイオティクス摂取者の空腹時血糖値が低下傾向を示したことは特筆に値する。通常、糖尿病患者では、尿酸値が高いと腎臓病の発症リスクが高まる。群間・時点間の有意差はなかったが、プロバイオティクス投与群の尿酸値は3ヶ月の介入後に有意ではない減少を示した（図1B）一方、プラセボ投与群は逆の傾向を示した。全患者を対象に、トリグリセリド（TG）、高密度リポタンパク質コレステロール（HDL-C）、低密度リポタンパク質コレステロール（LDL-C）、総コレステロール（CHOL）の4つの血中脂質指標をモニタリングしたが、これらの血中脂質指標に両群間に有意差は認められなかった（表S2）。これらの結果から，プロビオXとメトホルミンの併用は，メトホルミン単独服用に比べ血糖降下作用を有意に増強し，その血糖降下作用は監視対象の血清脂質指標とは無関係であることが示唆された．
補足資料
表S2
プロバイオティクス/プラセボ介入前後の糖尿病患者における血中脂質指標。表S2、PDFファイル、0.1 MBをダウンロードする。
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プロバイオティクスの同時投与は、インスリン分泌を促進し、膵島機能を改善した。
経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）は、膵島の機能と体の血糖調節能力を明らかにするブドウ糖負荷試験です（26）。血糖値およびインスリンの曲線下面積に、群間および時点間の有意差は認められなかった（図2AおよびB）。プロバイオティクス群におけるβ細胞機能指数（ホメオスタシスモデル評価β［HOMA-β］指数で表される）は、3ヶ月の介入後に有意に増加したが（P = 0.03）（図2C）、インスリン抵抗性およびインスリン感受性指数には有意差が認められなかった（図2DおよびE；表S3）。この結果は，Probio-Xがインスリン分泌を増加させ，膵島機能を改善することを示唆するものであった．
図2
図2 耐糖能と膵島機能評価。(AおよびB）血糖値（A）およびインスリン（B）の曲線下面積の違い。(C) ホメオスタシスモデル評価β（HOMA-β）。(D）ホメオスタシスモデル評価-推定インスリン抵抗性（HOMA-IR）。(E）3ヶ月の介入前（0M）と介入後（3M）のプロバイオティクス（Pro）群とプラセボ（Pla）群間の定量的インスリン感受性チェック指数（QUICKI）とGutt指数（インスリン感受性指数［ISI0,120］）。P値はペアワイズ比較（Wilcoxon検定）により作成した。
補足資料
表S3
プロバイオティクス/プラセボ介入前後の糖尿病患者における膵島機能の評価。表S3、PDFファイル、0.1 MBをダウンロードする。
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プロバイオティクスの同時投与は、糞便マイクロバイオーム組成を調節したが、全体のマイクロバイオータ多様性は調節しなかった。
本研究では、0ヶ月と3ヶ月の96の糞便サンプル（n = 48）（表S4）の微生物メタゲノムを分析した。ほとんどの場合、α多様性（シャノン多様性指数およびシンプソン多様性指数によって反映され、3カ月目のプロバイオティクス群とプラセボ群の間のシンプソン多様性指数を除く［P＝0.05］）には有意差は認められなかった（図3A）。ベータ多様性は、主座標分析（PCoA）により分析した（Fig.3B）。4つのサブグループを表す記号は、PCoAスコアプロット上で高い重複を示し、群間および時点間の腸内細菌叢構造および組成に大きな共通性があることを示唆し、類似性分析（ANOSIM）により有意差は検出されなかった（表S5）。
図3
図3 群間の微生物多様性と差異のある豊富な種レベルゲノムビン（SGB）。(A）ゼロヶ月目（0M）および3ヶ月の介入後（3M）におけるプラセボ（Pla）およびプロバイオティクス（Pro）群の腸内細菌叢のシャノンおよびシンプソン多様性指標。(B）4つのサブグループに対する主成分分析（PCA）スコアプロット。各サブグループを表す記号は、異なる色で示されている。(C) 異なる時点におけるプロバイオティクス群とプラセボ群との間の有意に異なるSGB。P値＜0.05を統計的に有意とした。
補足資料
表S4
メタゲノムデータセットの品質管理情報。表S4、PDFファイル、0.2 MBをダウンロードする。
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補足資料
表S5
腸内細菌叢構造の違いを評価するための類似性分析（ANOSIM）。表S5をダウンロード、PDFファイル、0.1 MB。
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次に、より細かい分類学的レベルでの腸内細菌叢組成の介入後の変化を分析した。反応性のある種レベルのゲノムビン（SGB）（0日目には2群間で有意差はなかったが、介入後にのみ時点間または異なる処理間で有意差となったSGB）を同定した。3ヶ月目とベースラインとの間で量的に差のある反応性SGBが各群で1つずつ同定された。プロバイオティクス群ではFaecalibacterium prausnitziiが増加し、プラセボ群ではFusicatenibacter saccharivoransが減少した。3ヶ月目には、両群間で6種類のSGBが差次的に濃縮されて検出された。フシカテニバクター・サッカリボランスとルミノコッカス・ブロミーはプラセボ群に比べ有意に濃縮され、Eubacterium sp. CAG:274 strain、Bifidobacterium longum、未培養Butyricicoccus sp.はプロボ群に比べ有意に濃縮された（図3C；表S6）。注目すべきは、Faecalibacterium prausnitziiやBifidobacterium longumなどの一部の短鎖脂肪酸（SCFA）産生菌が、プロバイオティクス群で有意に濃縮されていたことである（Fig. 3C）。
補足資料
表S6
有意に差のある種レベルのゲノムビン（SGB）。表S6をダウンロード, PDFファイル, 0.1 MB.
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プロバイオティクスの併用は、いくつかの糞便代謝物および血清BAsを調節した。
対象となる糞便代謝物を分析するために、非標的液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）ベースのメタボローム解析を実施した。データは教師なし座標法である主成分分析（PCA）により解析され、品質管理（QC）サンプルを表すシンボルが密にクラスタリングされており（図4A）、分析装置と条件が安定しており、生成されたデータの信頼性が高いことが示されました。ボルケーノプロットで差分代謝物を解析したところ（図4B）、3ヶ月目にプロバイオティクス群とプラセボ群の間で40の差分代謝物が見つかりました（fold change >2.0 and P value <0.05 or fold change <0.5 and P value <0.05) 。代謝物データベースを横断してMSスペクトルを検索し、40種類の差分代謝物すべてに対応する化合物のアノテーションを行った。同定された40の差分代謝産物に基づく代謝経路分析により、プロバイオティクス群とプラセボ群の間のこれらの差分代謝経路は、ほとんどがアミノ酸代謝経路（トリプトファン代謝、ヒスチジン代謝、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン生合成）および少数の脂肪酸代謝経路（スフィンゴ脂質代謝など）に属することが示唆された（Fig. 4C）。
図4
図4 糞便メタボロームの変化。(A）3ヶ月の介入前（0M）と介入後（3M）のプロバイオティクス（Pro）およびプラセボ（Pla）群の主成分分析（PCA）スコアプロット。"QC "は品質管理試料を表す。異なるサブグループからのサンプルは異なる色で示されている。(B) 3ヶ月のプロバイオティクス群とプラセボ群との代謝物の差を示すボルケーノプロット。有意に増加した代謝物（UP［アップレギュレート］）（2以上のフォールドチェンジ［FC］および0.05未満のP値）および有意に減少した代謝物（DOWN［ダウンレギュレート］）（0.5未満のフォールドチェンジおよび0.05未満のP値）が表されている。Non-SIG、有意でない。(C) 差異的に豊富な代謝産物に基づく代謝経路の濃縮解析。(D）糖尿病患者におけるプロバイオティクス介入に反応する関連糞便代謝産物を示す箱ひげ図。合計37名の患者が、メタボローム解析のために連続した2時点の糞便サンプルを提供した（プロバイオティクス群、n = 20；プラセボ群、n = 17）。統計的差異はWilcoxon検定またはt検定で評価し、P値<0.05を統計的に有意とみなした。
3ヶ月目に、いくつかの代謝物の信号強度は、有意に（5-ヒドロキシトリプトファン、コルチゾール、d-トリプトファン、チェノデオキシコール酸、およびヒデオキシコール酸［P < 0.05］）、またはマージンになった。 05 in all cases])または僅かに(スフィンゴシンおよびコール酸[P = 0.05 in both cases])) (Fig. 4D and Table S7) プロバイオティクス群ではプラセボ群より強く、スクラロースでは逆の傾向 (P < 0.05) (Fig. 4D)がみられた。これらの物質のいくつか（特にコール酸、ヒデオキシコール酸、スフィンゴシン）は、一次胆汁酸生合成とスフィンゴ脂質の代謝経路で重要な役割を担っている。被験者のBA代謝をさらに調べるため、血清BA濃度をLC-MSで分析したところ、血清BA組成は介入後に有意でない変化しか示さなかった（Fig. S1）。
補足資料
図S1
3ヶ月の介入前（0M）と介入後（3M）のプロバイオティクス（Pro）およびプラセボ（Pla）群の血清胆汁酸組成。胆汁酸の定量は液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）により行った。図S1、PDFファイル、0.2 MBをダウンロードする。
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補足資料
表S7
液体クロマトグラフィー-質量分析で同定された糞便代謝物の差分。表S7をダウンロード、PDFファイル、0.1 MB。
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考察
腸内細菌の異常は、T2DM、高血圧、高脂血症などの様々な代謝性疾患の発生と関連している(27-29)。メトホルミンは、T2DMの一般的な血糖降下薬である。複数の研究結果は、患者において腸内細菌がメトホルミンの標的の1つである可能性を裏付けている(30)。プロバイオティクスは腸内細菌叢を標的とし、腸内細菌の異常を緩和することが示されており、プロバイオティクスの摂取はT2DMの新しい補助治療法として提案されている。そこで、本研究では、T2DMの管理において、メトホルミンと併用した場合のプロバイオティクス投与の付加的効果について検討した。その結果、メトホルミン単独投与と比較して、併用療法は血糖降下作用を有意に増強（糖化ヘモグロビン値を有意に低下）させることがわかりました。また、プロバイオティクスの併用は、T2DM 患者の血中尿酸値を非有意的に低下させた。この結果から、プロバイオティクスの併用は、メトホルミンの治療効果と相乗して、T2DMに関連するいくつかの臨床パラメータを改善することが示唆された。
インスリン抵抗性は、細胞がインスリンに反応しなくなる病態であり、膵臓は血糖値を下げるためにさらに多くのインスリンを分泌するようにシグナルを出す。最終的には、細胞はさらにインスリン抵抗性となり、インスリン値と血糖値の両方を上昇させる。その結果、プロバイオティクスを併用することで、インスリンβ細胞の機能指数を有意に改善できることが示唆されたが、インスリン抵抗性とインスリン感受性レベル（Gutt indexとQuickI[定量的インスリン感受性チェック指数]）については両群間に有意差は見られなかった。インスリン抵抗性の臨床指標としては、homeostasis model assessment-estimated insulin resistance (HOMA-IR) indexが最も一般的であるが、動的インスリン分泌への対応には限界がある（31）ため、Gutt indexとQUICKIも使用し、一貫した結果が得られている。一方、過去に行われたT2DM患者を対象とした6ヶ月間の介入試験では、エコロジック・バリア社のマルチストレイン・プロバイオティクス（ビフィズス菌と乳酸菌の複数株）またはプラセボの投与により、HOMA-IR指数が有意に低下することが明らかになった（18）。研究によって結果が対照的なのは興味深いことで、被験者の個人的要因、プロバイオティクスの特異性、投与量の問題など、さまざまな要因が考えられる。とはいえ、今回の結果では、プロバイオティクス群とプラセボ群の間でインスリン抵抗性に有意な変化は見られなかったものの、プロバイオXとメトホルミンの同時投与により、いくつかのT2DM関連指標が改善されることが示された。
いくつかの先行研究では、メトホルミンの血糖降下作用は経口摂取では明らかであるが、静脈内注射では明らかでないことが分かっており、メトホルミンの作用機序が直接消化管に関係していることを示唆している（32、33）。本研究では、メトホルミンの血糖降下作用の主要な標的の1つは腸内細菌であるという仮説が立てられた。この仮説は、メトホルミンが腸内細菌叢の構造やその代謝物を調節し、それによって宿主の生理機能に影響を及ぼす可能性を報告した先行研究によって得られた証拠に基づいていた（34）。Elbereらは、被験者のベースラインの腸内細菌叢の構成が、メトホルミン治療の短期的な有効性と薬剤耐性に関する予測ツールとして使用できる可能性があることを提案している（35）。そこで、本研究では、メトホルミンの血糖値低下作用の潜在的なメカニズムと経路を、糞便メタゲノミクスとメタボロミクスの観点からも分析した。
その結果、いくつかの興味深い知見が得られた。まず、我々のデータでは、介入後のシンプソン指数がプラセボ群に比べプロバイオティクス群で有意に高いことが示された。一般に、微生物叢の多様性の低下は、抗生物質や薬物干渉などの外的要因によって頻繁に起こる腸の恒常性の乱れを示すため、不健康な状態と考えられています。腸内細菌叢の乱れは、しばしば宿主の正常な代謝や免疫に影響を与える。臨床場面では、パーキンソン病や過敏性腸症候群などの様々な慢性疾患において、腸内細菌のα多様性の低下が一般的に観察される（36, 37）。一方、PCoAでは、腸内細菌叢構造の劇的な変化は見られなかったことから、プロバイオティクス併用または非併用のメトホルミン投与による治療効果は、腸内細菌叢の構造や組成の劇的な変化によるものではないことが示唆された。
症状の改善に関連する可能性のある、腸内細菌叢の微妙だが意味のある変化を特定するために、反応性の高いSGBの変化を分析した。第二の興味深い観察は、いくつかの有益なSGB、特にSCFA産生に関連するSGBの存在量が、介入後にプロバイオティクス群で有意に増加したことである。以前の研究では、ゲノムワイド遺伝子型決定と腸管メタゲノムおよびメタボロームデータを組み合わせ、二元的メンデルランダム化を用いて952人の正常血糖値ボランティアにおける糞便SCFA（酢酸、プロピオン酸、酪酸など）レベルを解析している。その結果、腸内のSCFAs（特に酪酸塩）産生の増加は、インスリン反応、エネルギーバランス、代謝の恒常性に大きな有益な効果をもたらすが、プロピオン酸代謝の異常は糖尿病発症のリスクを高めることができ、代謝形質およびT2DMリスクに対する腸内細菌群の因果関係が存在することが支持された(38)。非肥満性糖尿病マウスで行われた別の研究では、SCFAが自己免疫性不感症から保護し、糖尿病の発症を遅らせる可能性があることがわかった（39）。いくつかの酢酸および酪酸産生菌の存在量と多様性は、T2DMの臨床効果に大きく関係しており、酢酸産生の増加は、GLP-1とペプチドYYの分泌を促進し、血糖値を改善する可能性がある(40)。したがって、SCFA産生菌の存在量の増加は、糖尿病患者において特に重要である宿主の糖代謝を改善する可能性がある。
第三に、代謝パスウェイ分析により、プロバイオティクス群とプラセボ群との間の差分代謝産物は、主にトリプトファン代謝、一次BA生合成、スフィンゴ脂質代謝のパスウェイに関連していることが判明した。3カ月間の介入後、プロバイオティクス群の糞便中のいくつかのBA、チェノデオキシコール酸およびヒデオキシコール酸は、プラセボ群に比べ有意に高かった。チェノデオキシコール酸とヒオデオキシコール酸は、チェノデオキシコール酸がCYP3A4酵素の作用でヒオコール酸に変換されることから、関連化合物である。BA類は、グルコース、脂質、エネルギーの代謝を調節するシグナル分子として作用することが知られている(41)。さらに、Chaudhariらは、スリーブ状胃切除が肥満患者やマウスの消化管内で特定のBAであるコール酸-7-硫酸を増加させ、Gタンパク質共役型胆汁酸受容体1（TGR5）のアゴニストとして作用してGLP-1レベルを増加させTGR5遺伝子発現をアップレギュレートし、耐糖能を高め血糖レベルを調節することを発見した(42). 豚の胆嚢は漢方薬として糖尿病の治療に用いられており、ヒオウギ酸はその有効成分として血糖値の恒常性を向上させる。実際、ヒオデオキシコール酸はヒョコール酸の成分の一つであり、両化合物の合成前駆体は代替経路で生産されるBAである。ヒョコール酸は、TGR5シグナルを活性化し、ファルネソイドX受容体シグナルを阻害し、プログルカゴンの発現をアップレギュレートすることにより、GLP-1の産生と分泌を促進する作用を持つ(43)。したがって、プロバイオティクス介入後のヒオデオキシコール酸とチェノデオキシコール酸の糞便レベルの上昇という我々の観察結果は、この研究の参加者における臨床症状緩和のメカニズムの一部である可能性もある。
メタゲノム解析とメタボローム解析の結果を総合すると、プロバイオティクスはメトホルミンと相乗的に作用し、おそらく2つの特定の経路を介してT2DM患者の臨床症状を改善したことが裏付けられた（図5）。(i)腸内SCFA産生菌を促進することにより、大腸内SCFAを調節し、腸管上皮のL細胞によるGLP-1分泌を促進する、(ii)特定のBAsレベルを増加させ、L細胞表面のGタンパク結合受容体と核内受容体（例えば、farnesoid X receptor）を活性化し、GLP-1の分泌を促進する、。GLP-1は消化管ホルモンであり、メトホルミンとともに循環器系に作用して血糖値を下げる作用もある。しかし、私たちが提案したモデルは、さらに検証を重ねる必要がある。さらに、試験開始から終了までの被験者の脱落に顕著な差があり、プラセボ群では脱落者が多く、結果にバイアスがかかっている可能性がある。したがって、この研究で得られた結論は慎重に解釈される必要がある。
図5
図5 臨床症状改善のメカニズムを示す模式図。血糖代謝の調節およびプロバイオティクス主導の宿主応答における主要経路の模式図を示す。SCFA、短鎖脂肪酸；TGR5、Gタンパク質共役型胆汁酸受容体1；FXR、ファルネソイドX受容体；ASBT、アピカルナトリウム胆汁酸トランスポーター；PYY、ペプチドYY；GLP-1、グルカゴン様ペプチド-1。
材料と方法
試験デザイン
3ヶ月間の無作為化二重盲検RCTを実施した。臨床試験は2期に分けて行われ、内蒙古人民病院（中国フフホト市）から臨床的にT2DMと診断された患者計58名が募集された（図1A）。被験者は、コンピュータで作成したリストで作成した無作為化配列に基づいて、プロバイオティクス群とプラセボ群に無作為に割り付けられた（1：1、各群n＝29）。無作為化は、被験者と接触することのない統計学者が行った。この研究に参加した被験者、医師、研究者は、研究終了までこの順序を知らされないようにした。グループ分け後、プロバイオティクス群にはプロビオX（3×1010CFU/日、すなわち1日2g、夕食後に摂取）とメトホルミン（0.75g/日〜1.5g/日、3食前に摂取）、プラセボ群にはプラセボ粉末（マルトデキストリン）2g（1日2g、夕食後摂取）およびメトホルミン（0.75g/日〜1.5g/日、3食前に摂取）、がそれぞれ投与されました。プロバイオティクスとプラセボは、同じ外観と味の乾燥粉末とし、個包装の小袋（中国金華銀和生物技術有限公司）に封入した。プロバイオ-Xには、Lactobacillus casei Zhang, Bifidobacterium lactis V9, Lactobacillus plantarum P-8, Lactobacillus rhamnosus Probio-M9 および Bifidobacterium lactis Probio-M8 という5種のプロバイオ株が含まれる。
倫理的承認と参加への同意
本研究は、内モンゴル自治区衛生局倫理委員会の承認を受け、中国臨床試験登録（http://www.chictr.org.cn/）に登録された（登録番号ChiCTR2100050108）。すべてのボランティアは、試験前にインフォームドコンセントに署名した。
被験者の募集。
58名のT2DM患者が募集された。患者は、包含基準と除外基準によってスクリーニングされた。包含基準は、（i）中国のT2DM予防・治療ガイドライン（44）におけるT2DMの診断基準を満たす、（ii）20〜65歳である、（iii）メトホルミンを常用しているか他の抗糖尿病薬を服用したが3ヶ月以上中断している、（iv）糖尿病の期間が3ヶ月以上ある、（v）6.5％≦HbA1c（ヘモグロビンA1c）≦8.5である、（vi）試験前1ヶ月以内に抗生物質を服用しなかったことであった。除外基準は、（i）主要疾患の既往がある、（ii）妊娠中または授乳中の母親である、（iii）2種類以上の降圧剤を定期的に投与しても血圧が160/100mmHg以上である高血圧者、（iv）グルココルチコイドの長期使用歴がある、（v）試験開始1ヶ月前にプロバイオティクス製品を服用した、（vi）血液または便を完全に提供しなかった、であった。除外された患者や試験の途中で脱落した患者をスクリーニングした後，最終的に48人がRCTを完了した（プロバイオティクス群，n＝27，プラセボ群，n＝21）。すべての患者は、試験中、服用している製品について知らされておらず、抗生物質や他のプロバイオティクス製品は、RCT中に服用されていない。
サンプル採取と臨床パラメータ
全対象者に糖尿病食と活動指導を行い、本RCTに関する基本情報と病歴を理解し、体重とウエスト周囲径の情報を提供した。全患者は4週間ごとに来院するよう指示され、各来院時に患者の体重とウエスト周囲径が記録された。試験の開始時（0ヶ月目）と終了時（3ヶ月目）に血液と糞便のサンプルを採取し、関連する臨床パラメータと糞便中のマイクロバイオームおよびメタボロームの変化をモニタリングした。
臨床血糖値指標とインスリンのレベル
患者の血糖値を測定するために、HbA1c試験、経口ブドウ糖負荷試験、およびインスリン放出アッセイを実施した。HbA1c値は、比濁阻害免疫測定法により測定した。経口ブドウ糖負荷試験には、ブドウ糖溶液の代わりに病院で標準化された蒸しパンを使用した。蒸しパンは中国の通常の食事の一部であり、多くの中国の病院でブドウ糖負荷試験に使用されているためである。蒸しパン食の大きな利点は、ブドウ糖溶液を飲むことによる吐き気や嘔吐などの胃腸の不快感を避けることができるため、経口ブドウ糖に耐えられない患者さんに特に適しています。ブドウ糖負荷試験およびインスリン分泌測定は、患者は朝空腹で、血糖降下剤を服用せず、患者から3mLの空腹時静脈血を採取し、3000rpmで10分間遠心分離し、上清を採取して空腹時血糖と空腹時インスリンを時間的に検出した。蒸しパン摂取開始から0.5時間、1時間、2時間、3時間後に静脈血を採取し、毎回3mLの血液を採取し、3,000rpmで10分間遠心分離を行った。上清を採取し、各時点の血糖値およびインスリンを経時的に測定した。血糖値はヘキソキナーゼ法（45）、インスリンは電気化学発光法（Cobas-E601；ロシュ社）により検出した。残りの血清は-80℃の冷蔵庫で保存し，後で使用した．
血糖値とインスリン濃度を用いて、HOMA-β（homeostasis model assessment beta）指数、HOMA-IR（homeostasis model assessment-estimated insulin resistance）指数、QUICKI、Gutt指数（インスリン感受性指数［ISI0，120］）（31、46-48）を式に従い、HOMA-IR指数＝（FGB × FinS）/22. 5、QUICKI = 1 / (lgI0 + lgG0)、HOMA-β指数 = 20 × FinS/FPG - 3.5 、Gutt指数 (ISI0,120) = 75,000 + (G0 - G120) × 0.5となります。 19 × BW/120 × Gmean(0,120) × log Imean(0,120) ここで、空腹時血糖値（FPG）はミリモル/リットルで表し、空腹時血清インスリン（FinS）はマイクルユニット/ミリリットルで表すものとする。G0及びG120は、それぞれ経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）の空腹時及び120分間の血糖値（ミリグラム／デシリットル）；BWは体重；及びGmean（0，120）及びImean（0，120）はそれぞれ平均血糖値（ミリモル／リットル）及び平均インシュリン（ミリリットル当たりマイクロ）レベルである。
血中脂質、尿酸、胆汁酸の値を測定する。
脂質異常症は、糖尿病患者、特に血糖値のコントロールが悪い場合によくみられます。TG、CHOL、LDL-C値の上昇とHDL-C値の低下として現れる。そこで、本研究では、これらの血中脂質指標をモニターした。朝8〜12時間空腹状態の患者から静脈血（2 mL）を採取し、3,000×gで10分間遠心分離した。CHOL、HDL-C、LDL-Cの濃度は直接法で測定した（49）。尿酸はペルオキシダーゼ法で検出した。胆汁酸はグルコース代謝に重要な役割を担っている。そこで、LC-MSを用いて血清BAsの含有量を測定した(50)。
ショットガン・メタゲノムシークエンス用のメタゲノムDNA抽出。
QIAamp Fast DNA stool minikit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) を用いて、糞便サンプルからメタゲノムDNAを抽出した。DNA の濃度と品質は Nanodrop spectrophotometer と Qubit 2.0 fluorometer (Life Technologies, CA, USA) を組み合わせた Qubit double-stranded DNA (dsDNA) assay kit で確認し、DNA の完全性の評価には 1% agarose gel electrophoresis を使用した。ショットガンメタゲノムシーケンスは、Illumina NovaSeq装置を用いてすべてのサンプルで行い、NEBNext Ultra DNA library prep kit (New England BioLabs [NEB]) を用いてライブラリーを構築した。すべての操作は、製造元の説明書に従って行った。合計96個の便サンプルをショットガンシーケンスに供した（プロバイオティクス群、n＝27；プラセボ群、n＝21）（各被験者について2時点のデータ）。低品質配列のフィルタリングにはKneadData (v0.7.5) (http://huttenhower.sph.harvard.edu/kneaddata)を使用した。
リードアセンブリ、コンティグビニング、ゲノムデリプレーション、分類学的アノテーション。
品質管理された配列は、MEGAHIT (51) を用いてコンティグにアセンブルされた。2,000bp以上のコンティグは、VAMBツールを用いてデフォルトのオプションでビニングするために選択された。メタゲノム解析されたゲノムの完全性と汚染度は、CheckM (https://github.com/Ecogenomics/CheckM) を用いて評価した。この結果、完全性80%以上、汚染度5%以下の高品質ゲノムをクラスタリングし、各複製セットから最も代表的なゲノムをdRep (52) で選択し、パラメータ -pa 0.95 および -sa 0.95 で種レベルのゲノムビン (SGBs) を抽出した。その結果、代表的な単一ゲノムから304個のSGBが抽出されました。SGBはNCBI nonredundant nucleotide sequence databaseを用いてアノテーションされ、予測された遺伝子はDIAMONのBLASTp機能を使ってUniProt Knowledgebase (UniProtKB) (release 2020.11) に対してデフォルトオプションで検索された。CheckMを用いて各SGBの相対量を算出し、各コンティグにおけるSGBの平均含有量を算出し、CoverM (https://github.com/wwood/CoverM) によりRPKM (Reads per kilobase per million) として正規化した。次に、RPKMで表されたSGBの存在量に基づいて、2つのRパッケージ（veganおよびoptparse）を用いて、サンプルの多様性を算出した。
LC-MSによる糞便代謝物の測定。
便サンプル（20 mg）を秤量し、清潔な遠心分離チューブに移した。メタノール-水内部標準抽出物（70％；400μL）を加え、3分間混合し、氷水浴で10分間超音波処理し、さらに1分間ボルテックスし、-20℃冷蔵庫で30分間4℃で静置し、12000 rpmで10分間遠心分離をした。上清（300μL）を新しい遠心管に移し、再び12,000 rpmで3分間遠心した。上清の200μLのアリコートを分析用のインジェクションボトルに移した。クロマトグラフィーおよび質量分析の条件は、以前の研究(53)に記載された条件に従って設定された。機器分析の際、機器とクロマトグラフィー条件の安定性と再現性をモニターするため、15サンプルセットを実行するごとに、品質管理（QC）サンプル（各サンプル抽出物を等量混合して調製）をLC-MS分析用に注入した。収集した生データは、ピーク抽出、アライメント、保持時間補正を行った。
統計解析。
グラフィック表示は、Rソフトウェア（v.4.0.2）、Origin2019、Adobe Illustratorを使用して作成されました。各変数の群間差の評価には、Wilcoxon検定とt検定を用い、P値<0.05を統計的に有意とみなした。腸内細菌叢組成の群間差の評価については、P値をBenjamini-Hochberg法（54）を用いて多重検定で補正し、補正後のP値＜0.05を統計的に有意とした。ANOSIM、PCA、PCoA（Bray-Curtis距離）は、Rソフトウェア（v.4.0.2）を用いて行った。糞便メタボロームの定量データをMetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst）に取り込み、多変量統計解析を行い、fold changeが>2かつP値<0.05の代謝物、fold changeが<0.5かつP値<0.05の代謝物を差分と定義しました。差分代謝物の質量電荷比と保持時間に関する情報は、社内スクリプトを使用して同定し、同定された差分代謝物はMetaboAnalystを使用して検索し、それぞれの差分代謝経路を決定しました。
データの入手
本研究で作成したシーケンスデータは、BioProjectアクセッション番号PRJNA811727でNCBI SRAにて公開されています。
謝辞
本研究は、内モンゴル自治区科学技術主要プロジェクト（2021ZD0014）、中国国家自然科学基金（31720103911）、およびCARS36のイヤーマークファンドの支援を受けて行われました。
代謝物検出でご協力いただいたWuhan Metware Biotechnology Co., Ltd.、メタゲノム解析でご協力いただいたNovogene Co.
Zhihong Sun と Heping Zhang、方法論のコンセプト作成と設計。Ye Chen、臨床試験の実施および検体採取。Xin Shen と Teng Ma、正式な解析、データキュレーション、可視化、および原案の執筆。Xia Yu と Yalin Li、形式解析とソフトウェアのテストと検証。Lai-Yu Kwok、原案の執筆、批判的評価、修正、資料提供。Dongmei Li、臨床試験の監督と原稿の修正。Heping Zhangは、この研究の保証人であり、そのため、研究のすべてのデータにアクセスすることができ、データの完全性とデータ解析の正確性に責任を負うものである。
利益相反はないことを宣言する。
補足資料
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