微生物が介在するフルクトース枯渇は、バンコマイシン耐性腸球菌によるマウス腸管コロニー形成を抑制する
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公開日：2022年12月13日
微生物が介在するフルクトース枯渇は、バンコマイシン耐性腸球菌によるマウス腸管コロニー形成を抑制する
https://www.nature.com/articles/s41467-022-35380-5#article-info
サンドリーヌ・イサク、アレハンドラ・フロール・デュロ、...カルレス・ウベダ 著者一覧を見る
Nature Communications 13巻 記事番号：7718 (2022) この記事を引用する
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指標詳細
概要
多剤耐性菌（MDRO）は、公衆衛生に対する大きな脅威である。バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）をはじめとするMDRO感染症は、腸管のコロニー形成から始まることが多く、その重要なステップは腸内細菌叢によって損なわれている。しかし、MDROのコロニー形成を抑制する腸内細菌叢の構成員やその保護機構はほとんど分かっていない。ここでは、メタゲノム解析と患者の抗生物質への曝露を模倣したマウスモデルを用いて、VRE colonizationに対する防御に関連する常在菌を同定しました。さらに、抗生物質を投与したマウスにおいて、VREの腸内定着を制限するのに十分な5株のコンソーシアムを見いだしました。トランスクリプトミクス、メタボロミクス、in vivoアッセイを併用した結果、この細菌コンソーシアムは、栄養枯渇によりVREの増殖を抑制することが明らかになりました。最後に、コンソーシアムの各株の in vivo RNA-seq 解析と ex vivo および in vivo 試験の組み合わせにより、単一の細菌（Olsenella sp.）でコンソーシアムの効果を再現できることが実証されました。この結果は、特定の常在菌による栄養不足がVREの腸内コロニー形成を抑制することを示し、この多剤耐性菌による感染症を予防する新しい非抗生物質ベースの戦略であると言える。
はじめに
バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）を含む多剤耐性菌（MDRO）は、公衆衛生における大きな脅威となっており、一般的な感染症の治療能力を損ない、病院での医療処置のリスクを高めている。VREを含む腸球菌分離株は、世界中の入院患者に感染症を引き起こす病原体の中で3番目から4番目に多く、致死的な転帰をたどる可能性があります1,2。VREは複数の抗生物質に広く耐性があり、治療が困難なため3、世界保健機関（WHO）は、新しい治療法を開発すべき最優先の多剤耐性菌の1つに挙げています4。そのため、VRE感染症の治療薬として新しい抗生物質が導入されています3。しかし、これらの新しい抗菌薬に対する耐性株が急速に出現しているため2,3、この臨床的に困難な病原菌による感染症を予防するために、抗生物質以外の治療法の導入が推奨されています。
VREは、皮膚創傷部やカテーテルの汚染により入院患者に定着し、尿路感染症や菌血症につながる可能性があります5。また、VREは腸管に定着することで感染症が始まることが多く6、この感染症は腸内に生息する常在菌（マイクロバイオータ）7によって抑制されますが、抗生物質治療によってマイクロバイオータが破壊されると、VREが腸管に極めて高い水準で定着します7、8、9、10。その後、VREが腸管に高密度に定着することにより、血流への播種6,7や、糞便による環境汚染を通じて他の患者への播種9,11が促進されます。このように、微生物叢はVREが引き起こす可能性のある感染症のほとんどを防ぐ自然な防御機構として働く一方、抗生物質はVREの腸内コロニー形成の第一段階を許すことで感染症を促進する。しかし、VREの感染予防に重要な微生物叢の構成要素やそのメカニズムについては、臨床的な意義があるにもかかわらず、ごく少数の研究によって明らかにされ始めているに過ぎない。特に、特定の常在菌による抑制性分子の産生がVREの腸内定着を抑制することが2つの研究で示されている12,13。嫌気性常在菌であるBlautia productaは、マウスやin vitroでVREの増殖を直接阻害するlantibioticを産生している8,12。さらに、このlantibioticの存在は、ヒトにおけるVREの糞便中濃度の低下と関連している12。同様に、バクテリオシンを発現する共役プラスミドを持つE. faecalisは、マウスにおけるVREの腸内コロニー形成を阻止する13。
抑制性分子の産生に加え、細菌種間の複雑な関係に対する最近の知見から、常在菌が病原菌の増殖に必要な栄養素を奪い合うことで、日和見病原体の腸管コロニー形成に対する抵抗力を付与する可能性が示唆されている14。この機構は、腸内細菌科の菌種に耐性を付与することが示されている15,16。VRE に関しては、ex vivo アッセイを用いてこのような機構を明らかにする試みが行われた17。しかし、この研究では、常在菌による栄養不足とVREの増殖との関係を明らかにすることはできず、VREのコロニー形成には栄養競合ではなく、微生物相が産生する抑制性分子が関与していると結論づけられた。さらに最近、腸球菌が移植片対宿主病に及ぼす影響を調査した研究では、食事から単一の炭水化物（すなわち乳糖）を欠乏させると腸球菌の腸内レベルが低下することが実証された18。腸球菌の腸内コロニー形成に糖の利用可能性が大きく影響するのと同様に、腸内に頻繁に存在する単糖の取り込みに関与する特定のリン酸化酵素系（PTS）の腸球菌による遺伝的獲得は、腸球菌の臨床分離株の進化と出現の主要因であるようだ19。したがって、VREの腸内定着を決定するのは、栄養素、特に糖類であり、おそらく常在菌による糖類の枯渇は、微生物相が防御を行う未知の重要なメカニズムである可能性がある。この可能性はまだ解明されていないが、もし確実であれば、この多剤耐性病原体による感染症を予防する新しい戦略（非抗生物質ベース）を提供できる可能性がある。
本研究では、マウスモデルを用い、メタゲノム解析、メタトランススクリプトミクス、メタボロミクスといった様々な手法を用いて、VREの腸内定着を抑制するために必要な常在菌とその抑制機構を明らかにしました。その結果、5種類の常在菌（Alistipes、Barnesiella、Olsenella、Oscillibacter、Flavonifractor）からなるコンソーシアムを接種することで、抗生物質投与マウスにおけるVREの腸内定着を十分に抑制できることを明らかにした。さらに、VREレベルの減少は、in vitroおよびin vivoでVREの増殖を促進する食事に頻繁に含まれる糖質であるフルクトースの利用可能性を減少させることによってもたらされることを証明しました。最後に、トランスクリプトーム解析とex vivoおよびin vivoの実験から、コンソーシアムの効果が単一の細菌（すなわち、Olsenella属）によって再現されることが示された。この結果は、VREの腸内定着を減少させる新規細菌を同定し、常在細菌叢が栄養競合を通じてVREの腸内定着を抑制する機構を示した。これらの結果は、ほとんどの抗生物質に対して耐性を獲得している病原体による感染症を予防するための、新たな非抗生物質戦略の可能性を示すものである。
研究成果
異なる抗生物質が異なる細菌学的状態およびVRE腸管コロニー形成の感受性を誘発すること
我々はこれまでに、アンピシリンやバンコマイシンなどの特定の抗生物質がマイクロバイオームを変化させ、マウスにおけるVREの腸管内定着を可能にすることを明らかにしてきた7,10,20。抗生物質によるマイクロバイオームの変化がVREの腸内定着をどのように促進するかをより理解するために、スペクトルの異なる抗生物質（すなわち、シプロフロキサシン、ネオマイシン、セフトリアキソン、アンピシリン、クリンダマイシンおよびバンコマイシン、図1a、補足図1、方法）で1週間、マウスを処理した。その後、マウスにVRE（ATCC700221株、マウスにおけるVRE腸管コロニー形成を調査するための先行研究で使用）を経口経口接種した7,10,20）。マウスは、同じケージを共有するマウス間のマイクロバイオーム伝播を避けるため、個別に飼育された。VRE接種の直前に、マイクロバイオーム組成解析のための糞便ペレットを採取した（方法参照）。その後、VRE接種2日後にVREの腸内レベルを分析した（抗生物質投与で回復しないモデル、図1a）。抗生物質を投与されたすべてのマウスは、無処置のマウスと比較して微生物叢の多様性が低かったが（補足図2A）、その影響はバンコマイシンとクリンダマイシンを投与されたマウスで大きく、シプロフロキサシンを投与されたマウスでは有意でなかった。同様に、抗生物質を投与されたマウスは、無投与のマウスと比較して、微生物相の豊富さ（すなわち、同定されたOperational Taxonomical Units - OTUの数）および糞便バイオマス（ng of DNA/g of faeces）の低下が検出された（補足図2B, C）。次に、2つのサンプル間で得られたBray-Curtis距離にNMDS解析を適用して、全体的な微生物叢の変化を分析した。この解析では、投与した抗生物質によってマウスがクラスタリングされ（図1B）、特定の抗生物質が再現性のある微生物叢の変化を引き起こすことが示された。アルファ多様性と同様に、ベータ多様性もバンコマイシンとクリンダマイシンの投与によって大きな影響を受けたが、ネオマイシンなどの他の抗生物質はほとんど影響を与えなかった（図1b）。また、αおよびβ多様性の変化と同様に、バンコマイシンとクリンダマイシンは、より多くの分類群およびOTUに有意な変化を引き起こす抗生物質であった（図1c、補図3、補遺データファイル1、補遺データファイル2）。次に、VREの腸管内コロニー形成能に対する抗生物質処理の影響を評価した。その結果、抗生物質によって顕著な差はあるものの、いずれの抗生物質も無処置のマウスと比較してVREの腸管内定着を促進した（Fig. 1d）。微生物叢の解析と同様に、VREの腸内定着を促進する抗生物質としてvancomycinとclindamycinが挙げられ（>108 CFU / 100 mg of faeces）、neomycinとciprofloxacinではVRE腸内定着を抑制することが示された。同様の結果は、糞便を用いた解析でも得られている（補足図4）。アンピシリンはバンコマイシンやクリンダマイシンに比べて腸内細菌叢の変化が少ないが（図1c、補足図3）、ほとんどのマウスでVREを非常に高いレベルまでコロニー形成させることができ（図1d、補足図4）、より軽度なディスバイオシスでもコロニー形成抵抗性に同様の影響を与えることが示唆された。VRE腸管内コロニー形成が高レベルであるにもかかわらず、VRE接種後のマウスに痛み、苦痛、不快感の兆候は検出されなかった。次に、抗生物質投与停止後の微生物叢の回復能力、およびこの回復がVREに対するコロニー形成抵抗性にどのような影響を与えるかを評価した。この目的のため、微生物叢を2週間回復させた後、その構成を分析し、マウスにVREを接種することを除いて、前回の実験を繰り返した。その結果、抗生物質による腸内細菌の異常は、抗生物質中止の2週間後も持続していた（Fig.1）。しかし、ほとんどの抗生物質において、ある程度の微生物相の回復（バイオマス、豊富さ、多様性、分類群、OTU）が検出された（図1、補足図2、補足図3）。また，VREの腸管内定着能は，抗生物質投与停止2週間後にほとんどの症例で低下した（Fig.1d，補足 Fig.4）．
Fig. 1: 異なる抗生物質が、バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）の腸管内コロニー形成に対して、異なるdysbiotic stateと感受性のグレードを誘発する。
図1
a マウスモデルの模式図。マウスは、異なるスペクトルの抗生物質（すなわち、シプロフロキサシン、ネオマイシン、セフトリアキソン、アンピシリン、クリンダマイシンまたはバンコマイシン）を7日間投与された。その後、あるマウス群には106個のVRE colony forming units（CFU）を経口投与し、別のマウス群にはVRE接種前に2週間回復させた。VRE接種直前に糞便を採取して微生物叢解析を行い，VRE接種2日後に糞便を採取してVRE濃度を測定した．対照として、無処理マウスの糞便サンプルを採取し、微生物叢解析とVRE定量を行った。 b マウスから採取した糞便サンプルに含まれるOTUの相対量を用いて得られたBray-Curtis距離に基づくNMDS（Non-metric Multidimensional Scaling）解析。各ポイントはマウス1匹の微生物叢を表す。c 採取した糞便サンプルで同定された最も豊富な上位100のOTUの存在量を示すヒートマップである。無処置（NT）、Ciprofloxacin（Cip）、Neomycin（Neo）、Ceftriaxone（Cef）、Ampicillin（Amp）、Clindamycin（Clin）、Bangomycin（Van）、Proteo（Proteobacteria）。OTUの分類およびOTUの存在量の統計解析は補足データファイル2に記載した。LOD = 検出限界。LOD以下の点は、VREのCFUを検出できなかったマウスを示す。*p < 0.05, **p < 0.01, ns - 無意, 両側Wilcoxon rank-sum test. 回復期間なしのセフトリアキソンを除き、各処理につきN=5匹のマウスを用い、N=3匹のマウスを用いた。パネル(d)に示す統計結果は、上方：マウスの各処理群と未処理群との比較、下方：特定の抗生物質で処理したマウスの各群（回復期間の前と後）との比較に言及するものである。(d)では、25%から75%までのボックスが広がっている。ボックス内の線は中央値を表す。ひげは最大値と最小値を示す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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5つの常在菌からなるコンソーシアムが、抗生物質による腸内環境の悪化時にバンコマイシン耐性腸球菌の腸内コロニー形成を制限する
これまでの結果から、抗生物質が微生物相に明確な変化を促し、それによってVREが異なるレベルまで腸管にコロニーを形成することが示された。続いて、各マウスにおいて各抗生物質により誘発される特異的な微生物変化を、VREの腸管内コロニー形成能と比較した。この解析は、未投与のマウスで潜在的に耐性を付与し、抗生物質投与によってその枯渇がVREの腸管内定着を促進する特定の微生物集団を検出することを目的としたものである。Spearman相関分析により、VREの定着と存在量が負の相関を示す特定の属が同定された（補足図5；補足データファイル3）。これらの常在菌がVREの腸内定着を阻害する可能性を検証するため、無処置マウスの糞便内容物を広範囲に培養した（方法参照）。その結果、VRE腸管内定着に負の相関を示す細菌株を、複数の豊富な属（未処理マウスの存在量中央値＞0.4%）から単離できた（Spearman、rho <-0.31; q < 0.05; 補遺図5）。具体的には、Alistipes属、Barnesiella属、Olsenella属、Oscillibacter属の菌株が分離された。また、16S rRNA配列から属レベルに分類できない常在菌群（無処理マウスにおける相対量中央値＝6.37％）であるRuminococcaceae_Unclassified（Ruminococcaceae_UC）と定義される菌株が得られたが、VREに対する耐性と高い有意差があった（Spearman rho = -0.64, q=1.7e-6, Supplementary Data File3）。VREの腸管内定着を抑制するこれらの分類群の役割と一致するように、VRE腸管内定着を強く受けるマウスは、抵抗性の高いマウスに比べてこれらの特定の分類群の存在量が少なかった（図2a）。この常在菌コンソーシアム（CBC）がVREの腸内定着を制限する役割を果たすことを確認するため、バンコマイシンを投与したマウスにCBCを接種すると、VRE腸内レベルが低下するかどうかを検証した（Fig. 2b）。この試験にバンコマイシンを選んだ理由は、（i）バンコマイシンは、総バイオマスの回復にもかかわらず、抗生物質投与停止後に最も高いレベルのVREコロニー形成を可能にする抗生物質である（図1d；補足図2c）、（ii）微生物叢の永久的な変化を促進する（Fig. 1b）、（iii）臨床で頻繁に使用され、患者とマウスで同様の微生物叢の変化を誘発し、いずれの場合もVRE腸管コロニー形成を促進する10,21。図2cに示すように、バンコマイシン中止から2週間後、CBCを投与したマウスは、リン酸緩衝生理食塩水-グリセロール20％-システイン0.1％（PBS-GC；菌保存用ビヒクル）を投与したマウスよりもVRE colonizationに対して著しく抵抗性であった。VRE接種7日後の糞便中に検出されたVREのCFU数は、CBCを投与したマウスではPBS-GCを投与したマウスに比べて3桁以上少なくなっていた。このようなVREの腸管内定着抑制効果は、別の細菌を投与した場合には検出されなかった。バクテロイデスという非常に豊富な分類群（平均12.38％、図1の全サンプルを含む）は、VREレベルに対する防御とは関係なく、バンコマイシン処理後に永久的に枯渇した（補足データファイル3、補足図7）。注目すべきは、耐性腸球菌による腸内コロニー形成に対するCBCの同様の効果が、試験した追加の腸球菌株（AUS0004、E1162、補足図8）でも検出されたことである。VREコロニー形成を制限するCBC効果は、投与した細菌単離株のレベルの回復と関連していたが（補足図9）、微生物叢の豊かさや多様性の全体的な増加とは関連がなかった（図2d、e）。予期せぬことに、CBCを投与しなかったマウスでは、OscillibacterおよびRuminococcaceae_UCの分類群の細菌が自発的に回復しており（補足図9）、これらの分類群の回復はVRE腸内定着を制限するには不十分であったことが示された。重要なことは、VREに対するCBCの抑制効果がex vivoでも検出されたことである（Fig. 2f）。バンコマイシンを投与して回復したマウスから採取した腸管内容物では、VREが増殖することが確認された。一方，バンコマイシン投与後にCBCを投与したマウスの腸管内容物では，VREの増殖が有意に抑制された．この結果は、CBCが宿主由来の細胞を介さずに直接VREの増殖を抑制できることを示唆しており、CBC投与により回復した細菌の機能がVRE抑制に関与している可能性を検討することを促します。
図2：抗生物質による腸内環境異常時に、5つの常在菌のコンソーシアムがバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）の腸内定着を抑制している。
図2
a VREの糞便レベルと負の相関があり（補足図5、補足データファイル3）、分離できた5つの細菌分類群の糞便相対存在量（rel. abund）、UC = 未分類のこと。サンプル（図1より）は、VRE腸管コロニー形成単位（CFU）/100mgが高い（> 103 VRE colony forming units）マウスまたは低い（< 103 VRE CFUs / 100mg）マウスから採取したものに分ける（2群の定義については方法を参照のこと）。CBC（Commensal Bacterial Consortium）は、表示された5つの分類群から分離された5つの細菌を含む細菌混合物に与えられた頭字語である。****p = 4e-5,**p < 0.01,*p = 0.011. b 使用したマウスモデルの模式図。マウスはバンコマイシンで治療された。抗生物質投与中止の1日後、マウスにCBCを3日間連続で経口投与した。抗生物質投与停止から2週間後、VRE接種直前に糞便サンプルを採取した。VRE接種後2日目および7日目に糞便中のVRE濃度を測定した（p.i.）。対照として、CBCの代わりに菌投与用ビヒクル（PBS-GC）を投与したマウス群。 c （b）のマウス群から採取した糞便サンプルにおけるVREレベル、**p < 0.006. d）（b）のマウス群から採取した微生物叢の多様性および（e）微生物叢の豊富さ（Operational Taxonomical Units - OTUの数）、nsp>0.21。 f）バンコマイシン投与マウスから採取した糞便内容物における生体外VRE増殖、CBCまたはPBS-GC投与後抗生物質治療を停止した。糞便内容物は、抗生物質治療を停止してから2週間後に採取した。各ポイントは生物学的複製（すなわち、異なるマウスから採取した盲腸）である。数値は24時間後のVREレベルの変化（log2FC）を表す、**p = 0.004。(a と c) は両側 Wilcoxon rank-sum test、(d-f) は両側 t-test, ns - nonsignificant. (a)では1群あたり23匹および40匹、(c-e)では1群あたり12匹、(f)では1群あたり5匹の生物学的に独立した試料を用いた。棒グラフは(a,c)では中央値、(d-f)では平均値を表す。WhiskersはSEMを表す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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常在菌コンソーシアムは、フルクトースの代謝に関連する機能など、バンコマイシン処理後に失われた特定の細菌機能の発現を回復させる
次に、CBCがVREの腸内コロニー形成を抑制するメカニズムを解明するため、未治療マウスとバンコマイシンを投与したマウスのマイクロバイオームにおいて、抗生物質停止後にCBCまたは菌体であるPBS-GCを投与した場合に発現する細菌機能を比較検討しました。さらに、CBC分離菌のゲノムを解読し、これらの菌が特異的にコードし、発現している菌の機能を特定することができるようになった。さらに、ゲノム解読により、これまでUC_Ruminococcaceaeと定義されていた菌株を属レベルで分類（Flavonifractor；補足図10）することができた。まず、腸内コロニー形成（補足図9）以外に、投与した菌が転写活性を有するかどうかを評価した。CBCを投与したバンコマイシン投与マウスでも、無投与マウスと同様にBarnesiella, Alistipes, Olsenellaの各株がコードする特異的遺伝子の発現が検出された（図3a）。しかし、CBCを投与しないバンコマイシン投与マウスでは、これらの遺伝子の大部分は発現が検出されなかった。この結果は、これら3つの分離菌が腸内に定着し、抗生物質処理によって失われた特定の細菌遺伝子の発現を回復させることができたことを示している。一方、OscillibacterとFlavonifractorの分離菌がコードする遺伝子の発現は、3群のマウスのすべてで確認された。これは、これらの分類群から菌が自然回復したことと一致し（補足図9）、これら2つの分類群ではVREの腸内定着を防ぐのに十分ではないことを強く示唆するものであった。次に、CBCの投与がマイクロバイオームの機能的能力をどの程度修飾しうるかを評価した。この目的のために、マウス大腸のトランスクリプトームで同定された非冗長遺伝子にKEGGオルソログ（KO）を割り当てた（方法参照）。発現したKOの多様性と豊かさは、バンコマイシン投与後に著しく減少し、CBC投与により一部回復した（図3b）。そこで、バンコマイシンを投与したマウスにCBCを投与すると発現が増強される特定の細菌機能（KO）を定義し、VRE腸管コロニー形成の抑制に関連する可能性があることを明らかにした。この目的のために、CBC投与により発現が有意に増加し（log2FC > 2; q < 0.05）、未処置マウスで検出された発現と同様のレベルに達するKOを特定するためにDeSeq2統計解析が適用された。合計6つのKOが定義された基準に合致した（Fig.3c）。これらのKOのほとんどは、K01295（ペプチダーゼ）、K00174（酸化還元酵素）、K01425（グルタミナーゼ）など、病原体に対するコロニー形成抵抗性に寄与することが報告されていない酵素に割り当てられていた。また、ファージショックタンパク質をコードするとされるK03969も、CBCを受けたマウス群では過剰発現していた。腸球菌ファージは、臨床腸球菌分離株による腸内コロニー形成を減少させることが示されている22。CBCを接種したマウスのほとんどで、導入した分離株の1つ（Olsenella）がK03969を発現していることがわかった（Fig. 3d）。Olsenellaは放線菌であるため、Enterococcus（Firmicutes）とは系統的に無関係である。ファージのスペクトルが非常に狭いことを考慮すると、このKOをコードするOlsenellaに存在するファージがVREのコロニー形成に対する抵抗性に寄与しているとは考えにくいと推測された。注目すべきは、CBCを投与したマウス群で過剰発現していた2つの追加KO（K16213とK02770）が、特定の糖の取り込みと異化に必要なタンパク質をコードしていたことである。理論的には、これらのKOの発現は、Enterobacteriaceae属細菌ではよく知られているがVREでは知られていないコロニー形成抵抗性メカニズムである糖質枯渇によるVRE抑制に寄与する可能性があると考えられた。K16213はセロビオースエピメラーゼを、K02770はフルクトースの輸送に特異的なPTSのサブユニットであるFruAをコードしている。K16213のKOは、分析したマウスの50％でしかCBC分離株で発現していないことがわかった（Fig. 3d）。しかし、フルクトーストランスポーターをコードするKOの発現は、投与された単離株の1つ（すなわち、オルセンエラ）で、すべての分析されたマウスで検出された（図3d）。分離されたOlsenellaのゲノムには、FruAをコードする4つの遺伝子が含まれている（KO2770）。しかし、OlsenellaによるFruAの発現は、主に1つの単一遺伝子によって駆動されていた。しかし、オルガネラによるFruAの発現は、6匹の分析対象マウスすべてにおいて、主にOLS _9050という単一の遺伝子によって駆動されていた（Fig. 3e）。予想通り、OLS_9050の発現は、CBCを投与していないバンコマイシン投与マウスでは検出されなかったが、すべての無処置マウスで検出された（Fig.3e）。FruAに加えて、CBCを受けた分析したマウスのほとんど（66-100％）において、フルクトーストランスポーターの他のサブユニット（FruB：K02768）、ならびにフルクトースの解糖経路への組み込みに必要な他の遺伝子：FruK（K00882）およびフルクトース-二リン酸-アルドラーゼ（fba、K01624）をコードする投与したオルセネラ分離物によって発現する転写物を検知することが可能だった（Fig. 3f). これらの結果から、CBC、より具体的にはオルガネラは、フルクトースの取り込みと利用に関する生体内細菌機能を発現していることが示唆された。このことは、オルセネラがフルクトースを炭素源として試験管内で増殖できることを示すin vitro実験によって、さらに裏付けられた（補足図11）。
図3：常在菌コンソーシアム（CBC）により、フルクトースの代謝に関連する機能など、バンコマイシン処理後に失われた特定の細菌機能の発現が回復することを示す。
図3
a 無処置マウスおよびバンコマイシンを投与し、PBS-GC（バンコ＋ベヒクル）またはCBC（バンコ＋CBC）を投与したマウスの盲腸内容物で発現が検出されたCBC分離株がコードする遺伝子数、 **p < 0.0054,nsp > 0.169. b (a)で述べた3群のマウスで発現したKEGGオルソログ（KO）の多様性と豊富さ,*p < 0.018,nsp > 0.228. c Vanco+CBCマウス群ではVanco+車両群と比較して発現量が有意に高く（>2log2 fold change (FC); q < 0.05 ）、その豊富さはVanco+CBCと未処置間で差がないKOを示した。CBC投与により発現が増加した（＞1log2FC）KOの拡張リストを補足データファイル8に示す。 d Vanco+CBC群のマウスのそれぞれにおいて、CBCの分離株のいずれかが（c）に示したKOを発現するかどうかを示すカラーパネル。 e K02770に割り当てられたOlsenellaがコードする遺伝子の異なるマウス群での発現。この遺伝子は、フルクトースのPTSトランスポーター（FruA）のサブユニットをコードしている。各マウスの発現量（rel.abund）は、未処理マウスで検出された平均発現量に対する、1匹のマウスで検出された発現量の割合として算出した、**p = 0.0097,***p = 0.0002. f 果糖の内在化および代謝に必要なOlsenellaにコードされる遺伝子の発現量。ヒートマップは、グループ（Vanco+CBC）において、その特定の遺伝子の発現が検出されたマウスの数（赤色）を示している。fruKの場合、あるマウスでは1つの遺伝子コピー、他のマウスでは別の遺伝子コピーで発現が確認されたため、両方の遺伝子を示している。両側t検定（a,b,e）、ns - 無意図。(a,b)の統計は、無処置群との比較を指す。N = 6マウス/群。(a,b,e)の棒グラフは平均値を表す。ひげはSEMを表す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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常在菌コンソーシアムは、フルクトース枯渇により腸管内VREの増殖を抑制する
フルクトースは大腸に存在し23,24、いくつかの腸球菌分離株はこの糖を栄養源として利用できることがこれまでの研究で示されています25,26。したがって、トランスクリプトームデータを考慮すると、CBCはフルクトース枯渇によりVREの腸内コロニー形成を制限している可能性がある。この仮説を検証するため、まず、トランスクリプトームを解析したマウスと、同様の治療を行った追加マウス（すなわち、CBCまたはPBS-GCを投与した未治療マウスとバンコマイシン治療から回復したマウスの追加）の糞便内容物のフルクトースレベルを確認した（図4a）。バンコマイシンを投与したマウスでは、未投与のマウスと比較して、フルクトースレベルが有意に高かった（図4a）。予想通り、CBCの投与により、糞便中のフルクトースレベルは有意に減少した（Fig. 4a）。そこで、VREを経口接種した同腹仔マウスの糞便中フルクトースレベルとVREの糞便中濃度との相関を調べた。なお、同じケージで同居しているマウスは、同様にVREの腸管コロニー形成を受けやすい（Supplement Fig.12）。このような間接的なアプローチを採用したのは、（i）糞便中に排泄される糖のレベルよりも盲腸の糖含量の方が細菌の増殖に利用できる糖の量をよく表していると考えられること、（ii）VREが果糖レベルに影響を与える可能性があるので、同一マウスでVRE接種後の糞便中の果糖レベルとVRE定着レベルを分析すると誤解を招く可能性があること、が理由であった。その結果、盲腸のフルクトースレベルは、VREの糞便レベルと有意に正の相関を示した（Fig.4b）。この結果は、フルクトースが生体内でVREの増殖を促進し、CBCによるその枯渇がVREの腸管内定着を阻害していることを示唆している。この仮説を確かめるため、まず、本研究で用いたVRE株がフルクトースを炭素源として効率的に利用できることを確認した。様々な炭素源を用いたin vitro実験により、フルクトースは嫌気条件下でVREの増殖を促進する炭水化物の一つであることが確認された（すなわち、Supplement Figure 13）。実際、VRE はフルクトースにおいても、細菌代謝の中心的な糖であるグルコースと同程度の増殖が可能であった（Fig. 4c）。次に、VREの腸内共生におけるフルクトースの役割をさらに明らかにするために、フルクトースを利用できないVRE株を得るための変異導入法を追求した。そのため、フルクトース代謝の第一段階に関与するフルクトキナーゼをVREゲノムからすべて削除することを目指した。その結果、実験の大半に使用したVRE株（ATCC70021）において、潜在的なフルクトキナーゼ（1-phosphofructokinaseも含む）をコードする6遺伝子が同定された。また、本研究で使用したもう1つのVRE株（補足図8、AUS0004）では、5つのフルクトキナーゼがコードされていることが判明した。この結果は、VREにおいてフルクトース利用に必要な酵素の機能的重複が高いことを示唆し、VREの増殖においてフルクトースが重要な役割を担っていることを示唆しているものと考えられる。その後、遺伝学的に解析可能な菌株AUS000427を用いて、潜在的なフルクトキナーゼをすべて欠失させたVRE変異体の取得を試みた。しかし、何度試みても（方法参照）、潜在的なフルクトキナーゼをコードする5つの遺伝子のうち2つを破壊することはできず、少なくとも試験した条件では、2つのフルクトキナーゼがVRE増殖の鍵となる可能性があることが示された。それにもかかわらず、作製できた3種の変異体の増殖はフルクトース存在下で低下したが、腸内で頻繁に見られる他の糖（すなわち、グルコース、マンノース、補足図14）存在下では低下しないことがわかり、VREゲノム中の複数の遺伝子が機能的フルクトキナーゼをコードしていることが確認された。この遺伝子の機能的重複は、VREの代謝におけるフルクトースの重要な役割をさらに裏付けるものであるが、すべてのフルクトキナーゼを欠く適切な菌株を用意しなければ、変異誘発法を用いたVRE腸管コロニー形成に対するフルクトースの影響を検討することは不可能である。そこで、我々はフルクトースのVRE腸管内コロニー形成への影響を調べるために、別の方法を用いることにした。そこで、フルクトースを含まない飼料、あるいは同じ飼料にフルクトースを添加した飼料（方法参照）をマウスに与え、フルクトースの存在が腸内環境におけるVREの増殖に有利に働くと予想した。その結果、フルクトースを摂取したマウスでは、摂取していないマウスに比べてVREが有意に高いレベル（すなわち3桁のレベル）に達した（Fig.4d）。この結果は、フルクトースが腸管でのVREの増殖を促進することを示している。
図4：常在菌コンソーシアム（CBC）は、生体内でVREの増殖を後押しする糖であるフルクトースを枯渇させることにより、栄養競合を通じてバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）の腸管コロニー形成を制限している。
図4
a 図3記載のマウス群の糞便中フルクトース濃度 arb.units: arbitrary units,****p = 5.1e-5,*p = 0.047. b VRE接種2日後に同居させたペアのマウスの糞便中のlog10 VRE colony forming units（CFUs）と糞便中フルクトース濃度の両側Pearson相関解析 p = 0.014. 赤線は線形回帰の平均値、点線は95％信頼区間を示す。 c フルクトース、グルコース、または余分な炭素源を含まない最小限の培地におけるVREの増殖。d バンコマイシン治療中止2週間後にマウスにVREを接種した。その1日前に、マウスにフルクトースを含まない飼料を与え（方法参照）、半数のマウスには飲料水にフルクトース（Fru）を投与した。VRE接種2日後に糞便中のVRE濃度を定量した。*p = 0.043. e バンコマイシン処理により回復したマウスのろ過した糞便内容物にPBS、CBCまたはバクテロイデスを接種した。24時間後にVREを接種し、6時間後のVRE量の変化を定量化した。+ f バンコマイシン中止2週間後にマウスにVREを接種した。バンコマイシン中止の1日後、マウスはCBCまたは細菌性ビヒクル（PBS-GC）を代わりに受けた。各群の半数のマウスには、VRE接種の1日前から飲料水にフルクトースを添加した。糞便中のVRE濃度は接種2日後に定量し、nsp = 0.16, *p = 0.021. aとeは両側t検定、dとfは両側Wilcoxon rank-sum検定、nsは有意差なし。(a)では1群あたりN = 8, 10, 12匹のマウス。(b)ではN = 22匹。(d)では、1グループあたり13匹のマウスが使用された。(e)では、1グループあたり3匹の生物学的に独立したサンプル。(f)では、1群あたり8匹。棒グラフは(a,e)では平均値、(d,f)では中央値を表す。(f)の赤線は検出限界を表す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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これまでの研究で、抑制性分子の産生によりVREの腸管内定着を抑制することができる常在菌が同定されている。しかし、我々の結果は、CBCが栄養競合（すなわちフルクトースの枯渇）を通じてVREの増殖を抑制していることを示唆した。この仮説をさらに確かめるために、我々はex vivoアッセイを利用した。簡単に説明すると、バンコマイシン治療で回復したマウスの糞便内容物を濾過し、嫌気性チャンバーで還元した（方法を参照）。次に、ろ過した内容物をCBCまたはBacteroides単離株（非保護性常在菌）の存在下でインキュベートし、栄養枯渇を可能にした。その後、VREを接種し、6時間後にその増殖を観察した。VREの増殖は、細菌を含まない、あるいはBacteroidesと培養した腸管内容物をろ過したものから検出された（Fig. 4e）。一方、CBCとのインキュベーションにより、VREの増殖は完全に抑制された（Fig.） CBCがVREの増殖を抑制しているのが、抑制分子の産生ではなく、主要栄養素（フルクトース）の枯渇であることを示すために、フルクトースが栄養源として制限されないよう、CBCと培養した後、VRE接種直前にろ過した糞便内容物に過剰なフルクトースを添加した。注目すべきは、過剰なフルクトースの添加は、CBC存在下でVREの増殖を回復させるのに十分であったことである（Fig. 4e）。重要なことは、この結果をin vivoマウスモデルを用いて再現できたことである。バンコマイシン処理から回復させ、通常のチャウ食を与えたマウスに飲料水中の過剰なフルクトースを投与すると（方法を参照）、CBC存在下でVREの大腸管へのコロニー形成能力が回復した（Fig. 4f）。これらの結果から、CBCはVREの増殖に重要な栄養源を枯渇させ、特に腸管でのVREの増殖を促進する糖であるフルクトースを枯渇させることによりVREの増殖を抑制することが示唆された。
オルガネラはVREの腸管内コロニー形成を制限することができる
トランスクリプトームデータの結果から、オルガネラはCBCコンソーシアムの中でフルクトース枯渇に関与する細菌であることが示唆された。そこで、この細菌がVREの腸管内コロニー形成を制限する鍵であるかどうかを調べることにした。そこで、まずex vivo実験を繰り返したが、腸管内容物をCBCコンソーシアムの各菌と別々にインキュベートした。VRE接種前に各常在菌が同程度検出されたにもかかわらず、CBCコンソーシアムのうちオルガネラ以外の細菌はVREの増殖を抑制することができなかった（図5a）（補足図15）。また、CBCと同様に、VRE接種直前に過剰なフルクトースを添加することで、オルガネラ存在下でのVREの増殖は回復した（Fig. 5b）。この結果は、オルガネラがVREの腸内定着を抑制する重要な細菌であることを示唆するものであった。このことは、さらにin vivoでも確認された。バンコマイシンを投与したマウスは、抗生物質投与中止後にオルガネラを投与した場合、抗生物質投与中止後にPBS-GCのみを投与したマウスに比べて、VREの腸内コロニー形成を有意に抑制した（図5c、予防モデル）。また、過去にVREが定着したマウスにオルガネラを投与すると（補足図16）、代わりにPBS-GCを投与したマウスと比較して、VRE濃度を2桁以上低下させることができた（図5c、治療モデル）。この結果は、オルガネラがVREの腸管内定着を防ぐだけでなく、VREを腸管から追い出すことができることを示している。しかし、オルガネラの遺伝子操作はまだ実施されていないため、オルガネラにコードされた特定の遺伝子（例えばfruA）がVREのコロニー形成を制限する役割については、本研究では評価することができなかった。
図5：オルセネラは、バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）のコロニー形成に対する細菌コンソーシアム（CBC）の抑制効果を再現している。
図5
a、b バンコマイシン治療から回復したマウスのろ過された糞便内容物に、描かれているようにPBS、CBCまたは個々の単離株のいずれかを接種した。嫌気条件下で37℃でインキュベートした24時間後にVREを接種し、6時間後の増殖を定量化した。数値は6時間後のVREレベルの変化（log2）を表す。+ FruはVRE接種直前に過剰のフルクトースを培養に加えたことを示す。抗生物質中止の2週間後にマウスにVREを経口接種し、2日後に糞便中のVREコロニー形成単位（CFU）を定量した。治療モデル：マウスに4日間バンコマイシンを投与し、VREを接種した。マウスはさらに3日間バンコマイシンで維持された。抗生物質治療を停止した1日後、マウスにオルガネラを連続3日間投与するか、PBS-GCを投与した。抗生物質投与停止2週間後に糞便中のVRE濃度を測定し、*p < 0.05. (a,b)の両側t検定。a）の統計量はPBS群との比較を参照、ns - 無意図。(c)は片側Wilcoxon rank-sum検定。(a)と(b)ではN = 3生物学的に独立したサンプル。(c)の予防モデルでは1群あたりN = 7匹、治療モデルでは1群あたりN = 9匹のマウスを使用。棒グラフは(a,b)では平均値、(c)では中央値を表す。(c)の赤線は検出限界を表す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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考察
VREを含む多剤耐性病原体による腸管コロニー形成は、治療選択肢が非常に限られている、あるいは全くない感染症の発症に向けた最初のステップとなりうる。耐性菌による腸管コロニー形成を抑制するアプローチを見出すことで、全身感染予防に加えて、糞便中の病原体排出を抑制し、他の患者への感染拡大を抑制することができる9,11。我々は、オミックス技術、in vitro、ex vivo、in vivoの実験を組み合わせて、VREの腸内定着を制限できる常在菌（すなわちオルガネラ）を同定しました。さらに、常在菌がVREの腸内定着を阻止する新たなメカニズムを明らかにした。それは、栄養素、特にVREの増殖を促進する糖であるフルクトースの利用率を低下させることである。
腸内細菌科の病原体が腸に定着するために必要な栄養素については、これまでにも多くの研究がなされてきた16,28,29,30。しかし、腸内細菌の腸管コロニー形成に必要な栄養源は、ほとんど知られていない。最近の研究で、この疑問に光が当てられ、マウス腸管でのEnterococcusの増殖を促進する糖としてラクトースが同定された18。我々は、CBCが乳糖枯渇によるVRE抑制にも寄与しているかどうかを調べるために、マウスから得た糞便内容物中の乳糖レベルの定量化を試みた。しかし、本研究で得られたマウスの糞便内容物からはラクトースを検出することができなかった（補足図17）。この結果は、バンコマイシン投与後に回復した常在菌によってラクトースが枯渇したか（CBC投与とは無関係）、あるいはほとんどのラクトースが小腸の上皮細胞で消化吸収されたことを示唆している。このように、本モデルマウスでは、乳糖枯渇はCBCによる大腸でのVRE増殖抑制には関与していないようである。一方、マウスの盲腸には検出可能なレベルのフルクトースが存在し、これはVREの腸内コロニー形成能と相関していた。さらに、フルクトースはin vivoおよびin vitroでVREの増殖を促進することから、VREのコロニー形成過程におけるこの糖の重要な役割が示唆された。フルクトースの栄養源としての重要性に関連して、最近の研究では、Enterococcus属の多様性を網羅する24の分析対象種のすべてがフルクトースを利用して増殖でき、そのコアゲノムにはフルクトース利用に必要な遺伝子がコードされていることが報告されている31。具体的には、本研究で大半の実験に使用した株（ATCC700221）は、フルクトースの代謝に必要な遺伝子を複数コピーコードしており32、そのうち6コピーはフルクトースを一度取り込むのに必要な初期酵素（フルクトキナーゼ）（図3のfruKと類似）をコードしている。さらに、本研究で使用した他の2つの耐性腸球菌株（AUS0004とE1162）には、5つの潜在的なフルクトキナーゼが含まれている。このように遺伝子が重複していることも、この栄養源がVREの増殖に関係していることを裏付けているが、ゲノム変異誘発による機能研究の妨げになっている。実際、我々はVREの遺伝学的追跡可能株AUS000427において、5つのフルクトキナーゼ（1-ホスホフルクトキナーゼも含む）すべてを欠失させることを試みた。しかし、リコンビナーゼの過剰発現により変異誘発を容易にする新しい方法論を導入するなど、数回の試行錯誤の結果、潜在的なフルクトキナーゼのうち2つの変異体を得ることができず、変異誘発法を用いてVREによるフルクトース利用を完全に停止させ、腸管コロニー形成への影響を研究することはできなかった。
腸内細菌が消費する主な糖源は、食事とムチン（腸管粘液の主成分）の2つである34,35。フルクトースはムチンにはあまり取り込まれないが35、食事中には遊離単糖、二糖のスクロース、ポリマー（フルクタン）34として広く存在する。本研究で用いたマウス用食餌の主要成分の1つは小麦で、遊離フルクトースとフルクタンが含まれている36。遊離フルクトースは小腸で吸収されるが37、フルクタンの大部分は吸収されずに38、大腸に到達する。そこで、フルクタンは細胞外の細菌酵素（β-フルクトシダーゼやレバナーゼなどのフルクタナーゼ）によりフルクトースに加水分解され、遊離したフルクトースは特定のトランスポーターを介して体内に入り、栄養源として機能する39。したがって、フルクタナーゼをコードする常在菌がVREのコロニー形成を促進している可能性がある。この仮説に沿うように、トランスクリプトームデータの予備解析では、β-フルクトシダーゼ（フルクタナーゼの一種）の発現レベルと糞便中のVREレベルとの間に、統計的に有意ではないものの正の相関が検出された（Supplementary Fig.18）。興味深いことに、この関連性はバンコマイシン投与マウスの糞便サンプルで検出されたが（補足図18A；r = 0.76, p = 0.079）、CBCを受けたバンコマイシン投与マウスのサンプルでは失われた（補足図18B；r = -0.02, p = 0.95）。β-フルクトシダーゼの発現量は両群間で差がなかったことから（両側Wilcoxon順位和検定、p > 0.99）、CBCを受けたマウスにおけるこの関連の欠如は、細菌コンソーシアムによる利用可能なフルクトースの消費によって説明できる可能性がある。しかしながら、この解析は限られた数のマウス（N = 6）で行われたものであり、この仮説を検証し、フルクトースを含む栄養素の遊離によってVRE腸管コロニー形成を促進する可能性のあるマイクロバイオームの常在菌を特定するために、さらなる研究を行う必要があることを認めます。フルクタンに加え、小腸で吸収されなかった遊離フルクトースは、大腸での細菌増殖のための炭素源となる可能性がある。ヒトの場合、小腸がフルクトースを取り込む能力は限られており、フルクトースを多く含む食品や飲料の摂取により、その能力を超えることが頻繁にある。例えば、高フルクトースコーンシロップを甘味料として含む清涼飲料水は、現代社会の消費習慣に導入されている34。過剰な果糖は大腸に到達し、常在菌による発酵に由来する膨満感や腹痛など、いくつかの症状を引き起こす40。我々の研究は、フルクトースの大量摂取がもたらす潜在的な悪影響を指摘している。それは、この糖を炭素源として増殖するVREのような多剤耐性病原体の腸内レベルを増加させることである。
入院患者の腸内コロニー形成は、その後の感染症発症の鍵となるため6、マイクロバイオームに基づいてVREの腸内コロニー形成を制限する新しいアプローチが提案されている。そのひとつに、健康なドナーの糞便微生物叢を投与して患者の微生物叢を回復させる方法（糞便微生物叢移植：FMT）41がある。しかし、このようなアプローチは、FMTの組成が不完全であるため、潜在的に病原性のある細菌やウイルスが混入する危険性があり、問題となる可能性がある42。これは、通常免疫不全であるVRE感染者において、さらに危険なものとなります。このため、特定の細菌コンソーシアムや単一菌株を導入する代替戦略が提案されている8,12。本研究では、VREの腸管内コロニー形成を抑制するための新規候補として、Olsenella spを同定した。本菌株はマウス由来であるが、同属の数種類がヒトから口腔内および糞便中に分離されている43,44。興味深いことに、これらの種のうちの1つ（Olsenella profusa）は、フルクトースを含む複数の腸内炭水化物を発酵させることが可能である。今後、このヒト由来株がVREの腸管内定着に与える影響を検証する研究が必要である。さらに、代替案として、Olsenellaと同様の栄養嗜好性を持つ他の細菌を先験的に用いて、VREの腸管内定着を制限することも可能であろう。しかし、Olsenellaは抗生物質離脱時に非常に効率的に消化管に定着し、トランスクリプトーム解析で特定されたように、生体内で転写活性があることを示すことが重要である。また、細菌によって、糖に対する嗜好性が異なる可能性があります。ある細菌がin vitroで特定の糖を消費できたとしても、他の糖が利用できればin vivoでも消費するとは限らない45,46。同様の機能を持つ代替プロバイオティクスを試験する前に、これらすべての点を考慮する必要がある。
まず、フルクトース利用経路を完全に欠くVRE株を作製することができなかったため、変異導入法を用いてVREの腸管コロニー形成に与えるフルクトースの影響を評価することができなかったことである。しかし、ターゲットメタボロミクスにより、CBC投与によるフルクトースの枯渇がVREレベルの低下と有意に関連していることが示されました。さらに、カスタマイズド・ダイエット法を用いて、フルクトースがin vivoでVREの増殖を促進することを示しました。さらに、過剰なフルクトースの投与は、ex vivoおよびin vivoの両方でCBCの存在下でVREの増殖能力を回復させた。これらの結果は、CBC依存的なフルクトース減少が腸管におけるVREの増殖を阻害する機構を支持するものである。第二に、単一微生物の投与によりVREの腸管内定着を制限できることを示したが、VREの完全な除菌は達成されなかったことから、VREの定住に対する完全耐性には、オルガネラ以外の他の常在菌が必要である可能性が示唆された。しかしながら、マウスおよびヒトにおいて、腸内細菌が腸管内腔に密に定着すると、血流への播種が起こることが示されていることは重要である6,7,47. したがって、本研究のようにVREの腸管内コロニー形成を抑制する常在菌を同定することは、VRE血流感染症を予防する新規プロバイオティクスの開発に大きな価値をもたらすと思われる。さらに、VRE保菌者による病院環境の糞便汚染は、VREに重度に保菌された患者において特異的に発生する9。多剤耐性菌による院内汚染は、患者間の感染を促進するため11、VRE腸内濃度を低下させる常在菌や特異的メカニズムの特定は、入院患者のVRE伝播を抑制する新規戦略の開発を促進する可能性がある。
我々は、Olsenellaの他に、当初細菌カクテルに含まれていた別の分離株Barnesiellaが、ヒトとマウスの両方でVREの腸内コロニー形成に対する防御と関連していることを以前に示しました20。この最後の結果は、本研究で確認された。しかしながら、BarnesiellaがVREのコロニー形成抵抗性に果たす具体的な役割については、いまだ解明されていない。
本研究では、フルクトースがVREの腸管内コロニー形成に重要であることが示唆されたが、他の糖もVREの腸管内コロニー形成に関連し、それらの枯渇がVREの完全除菌に必要である可能性が考えられる。実際、フルクトースレベルとVREの腸管内定着能には有意な相関が検出されたが、フルクトースレベルが無処置マウスに近いにもかかわらず、高濃度のVREが定着するマウスが少数存在した（Fig. 4b）。また、フルクトースを含まない飼料を与えたマウスの腸管にも、程度は低いもののVREがコロニー形成された（Fig. 4d）。本研究で実施したin vitroアッセイにより、大腸に存在し、in vitroで同様のVRE増殖を促進する他の糖類が特定された。例えば、ムチンや他の粘膜糖タンパク質に含まれるガラクトースやマンノースは、本研究で使用したVRE株や他のVRE株によってin vitroで効率的に利用された48。今後、腸管におけるVREの栄養要求性を完全に解明し、その利用を阻害する微生物叢メンバーを、マウスおよび患者において同定することが必要であろう。最終的には、これらの知見により、VRE感染予防のためのマイクロバイオームベースの個別化治療法の設計が可能になると考えられる。メタボロミクスによって、患者の腸内でVREが利用できる栄養素を特定し、それらの栄養素を効率的に除去する適切な常在菌のカクテルを投与して、腸管からVREを完全に駆除することができるのである。このような知見に到達するためには広範な研究が必要であるが、本研究は、これらの多剤耐性菌による感染を予防するためのマイクロバイオームベースの栄養枯渇戦略を開発するための基盤を提供するものである。
研究方法
動物実験
すべてのマウス実験は、バレンシア大学の "Servei Central de Suport a la Investigació Experimental "の機関プロトコルガイドラインに従って実施された。マウスは、国家ガイドライン（RD 53/2013）に従い、本研究に固有の実験を記述するバレンシア大学動物看護委員会によって承認されたプロトコルの下で維持された。実験は、チャールズリバー社の研究所から直接購入した7週齢のC57BL/6J雌マウス（図1-4a、bおよび補足図2-7、9、12および18）、またはチャールズリバー社の研究所から購入したC57BL/6Jマウスの子孫から得たものを、我々の動物施設で繁殖させて行った（図4d、f、5および補足図8および16）。マウスは、図4dに示す実験において、マウスが示されたように数日間Teklad食TD05075を受けた以外は、オートクレーブ滅菌した餌（2014S Teklad Global食とEnvigo社の2019S Teklad Global Extrused 19％タンパク質 Rodent食の1：1混合）およびオートクレーブ滅菌水を用いて収容された。温度は21℃±2℃に、湿度は60〜70％に、12時間の明暗サイクルで維持した。
動物実験 微生物叢の構成とVRE腸管定着に対する各種抗生物質の影響
マウスの腸内細菌叢に及ぼす各種抗生物質の影響とVRE定着能との関係を調べるため（Fig. 1）、5匹のマウスグループに各種抗生物質を1週間投与した：vancomycin （0.5 g/l, Alfa Aesar）, ampicillin（0. 5 g/l, AppliChem）またはネオマイシン（1 g/l, Calbiochem）を飲料水中に投与し、セフトリアキソン（2.4 mg/ml; 500 µl SC, Sigma）とクリンダマイシン（1.4 mg/ml; 500 µl SC, Fluka）は1日2回皮下投与、シプロフロキサシン（0.6 mg/ml; 150 µl IG, Fluka）は1日2回胃内投与した。対照として、マウス群(N = 5)はいかなる治療も受けなかった。この実験では、実験開始時からマウスを個別飼育した。使用した異なる抗生物質の作用スペクトルの概要を補足図1に示す。これらの抗生物質は、微生物叢の異なる画分（グラム陽性菌、グラム陰性菌、嫌気性菌）を標的とするように選択された。回復のないモデルでは、1週間の抗生物質処置の後、マウスに106CFUのバンコマイシン耐性Enterococcus faecium株ATCC700221を経口投与した。この菌株は、ATCCリポジトリから入手した。この株は、バンコマイシンを含む複数の抗生物質に耐性があり、ヒトの糞便サンプルから分離されたものである。この菌株は、マウスモデルを用いたVRE腸管コロニー形成の他の研究でも使用されたことがある7,10,20,49。VRE接種前に糞便サンプルを採取し、微生物叢の組成を決定するために-80℃で保存した。VRE接種2日後に、採取した糞便および盲腸サンプルの連続希釈液を、vancomycin（Alfa,Aesar）8μg/mlおよびampicillin（AppliChem）10μg/mlを含むGelose BEAプレート（Biokar）にプレートしてVRE数を測定した。本研究では、この培地をBEA-AVプレートと呼ぶことにする。あるいは、回復を伴うモデルでは、抗生物質投与後2週間マウスを微生物叢に回復させた後、VREコロニー形成能を評価した。この場合、マウスは1週間抗生物質投与を受けた後、抗生物質投与を中止し、微生物叢を回復させた。抗生物質中止から2週間後に糞便サンプルを採取し、-80℃で保存して微生物叢の組成を決定した。次に、マウスにVREを経口投与し、VRE接種2日後（p.i.）にそのレベルを既述と同様に評価した。
VRE接種前のマウスの微生物叢に存在する細菌がBEA-AVプレートで増殖せず、接種前にVREの汚染がないことを確認するため、VRE接種前に採取した糞便サンプルをBEA-AV寒天プレートで増殖させた。その結果，VRE接種前に採取した糞便をBEA-AV寒天培地で培養したところ，予想通りコロニーは検出されず，VRE接種前に採取した糞便をBEA-AV寒天培地で培養したところ，コロニーが検出された．
動物実験 VRE腸管内定着に対する常在菌の抑制効果試験
VREに対する特定の細菌の定着抵抗性を回復させる能力を評価するため、マウスを0.5g/lのvancomycinで1週間飲料水処理し、試験する細菌接種物200μlを抗生物質中止の1日後から連続3日間経口投与した（細菌接種物の作製方法は以下の追加セクションを参照）。対照として、一群のマウスは、細菌を再懸濁するために使用される緩衝液（すなわち、PBS-GC）を受けた。投与した細菌の生着を促進するため、抗生物質中止後、2匹のマウスを同じケージに同居させた。抗生物質中止から2週間後に糞便を採取し、-80℃で保存して微生物叢の組成を測定するとともに、マウスにBEA-AVプレートで増殖可能な細菌が含まれていないことを確認した。その後、同じケージのマウス間でVREが混入しないように、VRE接種の直前にマウスを個別に飼育した。次に、マウスに106CFUのVREを経口投与し、2日後にVREのレベルを前述のように評価した。すべての実験で、VRE株ATCC700221を使用した。補足図8に示す実験では、この他にVREのAUS0004株と多剤耐性腸球菌のE1162株を使用した。このマウスモデルは、Fig.5c（治療モデル）を除き、本原稿のすべての細菌投与実験に使用された。この実験では、オルガネラの投与が、VRE接種前に投与した場合にVREの腸内コロニー形成を制限する以外に、VREが最初に定着した後、VREの腸内レベルを低下させることができるかどうかを評価したかったのである。この第二の戦略は、すでにVREが定着している患者において非常に有効であると思われる。そこで，VREの腸内定着を促進するため，バンコマイシン投与中（投与4日後）にVREを接種し，VREの腸内定着を促進させた．その後、抗生物質投与中はVREが腸内優勢菌となるため、VREの定着を促進するために、さらに3日間vancomycinを維持してから抗生物質投与を停止した7。簡単に説明すると、マウスにバンコマイシンを投与した（2匹のマウスを同じケージに収容した）。バンコマイシン投与開始4日後に106個のVRE CFUをマウスに接種し、さらに3日間バンコマイシンを投与した。抗生物質中止の1日後、前述のようにVRE量を分析するために糞便ペレットを採取した。その直後、前記のようにオルガネラ株を連続3日間経口投与した。抗生物質を中止して2週間後、糞便中のVRE濃度を測定した。対照として、別のマウス群にはOlsenella株を投与せず、PBS-GCを投与した。
メタボローム解析およびトランスクリプトーム解析のための糞便サンプルの採取
CBC投与による糞便トランスクリプトームおよびフルクトースレベルへの影響を調べるため、前のセクションに記載したように、マウスをバンコマイシンで1週間処理した。バンコマイシンを投与したマウス群には、抗生物質中止の翌日から連続3日間CBCを投与し、他のマウス群には、代わりにビヒクルのPBS-GCを投与した。抗生物質中止後、2匹のマウスを同じケージで同居させた。抗生物質中止から2週間後、VRE接種の代わりに各ケージ1匹のマウスを犠牲とした。各マウスの糞便を採取し、体重の2倍量のリン酸緩衝液（100 mM Na2HPO4 pH7.4）に懸濁（100 mgを100 µlとみなす）、ホモジナイズ、遠心分離（13200 g、1分間）した。メタボローム解析では、上清を分離し、ドライアイスバスで凍結した。トランスクリプトーム解析では、ペレットを1 mlのRNAlater (Ambion) に懸濁し、4℃で24時間保存した後、-80℃で保存した。同じケージのもう一匹のマウスに VRE を接種し、2 日後に VRE のレベルを分析し、VRE の腸内コロニー形成能と同居マウスの糞便内容物に同定されたフルクトースまたはベータフルクトシダーゼのレベルを相関させた（図 4b、補足図 18）。
同一ケージ内同居マウスのVREコロニー形成レベルの類似性評価
VREのコロニー形成能が、同じケージに収容された他のマウスのコロニー形成能の代表であることを評価するために、マウスを前節に記載したように処理した。簡単に言えば、マウスをバンコマイシンで1週間処理し、抗生物質中止後2週間回復させた。一群のマウスは、抗生物質中止の1日後から連続3日間、経口ガベージによりCBCを受け、他の一群のマウスは、代わりにPBS-GCを受けた。抗生物質中止後、2匹のマウスを同じケージに収容した。抗生物質中止から2週間後、マウスを個々のケージに分離し、106CFUのVREを経口投与し、2日後のVREのレベルを前述のように評価した。
VRE腸管内コロニー形成に対する果糖投与の影響
VRE腸管コロニー形成レベルに対するフルクトースの効果を評価するために（図4f）、まず、マウスを上記のように処理した。簡単に言うと、マウスをバンコマイシンで1週間治療した。その後、抗生物質治療を停止した。一対のマウスのグループは、抗生物質中止の1日後から連続3日間、CBCを受けた。一方、もう1組のマウスには、代わりにPBS-GCを投与した。抗生物質投与中止後、2匹のマウスを同じケージで飼育した。抗生物質投与中止から2週間後、マウスを個別に飼育した。各ケージのマウスのうち1匹には、飲料水中の15％果糖（以前の研究で行われた実験に基づき、果糖の小腸吸収能力を克服し、大腸での果糖レベルを著しく増加させるために用いられた果糖の濃度）50を投与した。対照として、ケージのもう一匹のマウスには、代わりに普通の水を与えた。翌日、マウスに106CFUのVREを接種した。VRE接種の2日後、糞便サンプル中のVRE濃度を既報の通り定量化した。
追加の実験（Fig. 4d）は、VREの腸内コロニー形成に対する食餌からのフルクトースの枯渇の影響を評価するために行った。この場合、マウスをバンコマイシンで1週間治療した。その後、ペアのマウスをバンコマイシン処理から2週間回復させた。その後、各ケージから1匹のマウスに、フルクトースを含まないカスタムTeklad飼料TD05075を投与した。この飼料で利用可能な唯一の炭水化物はデンプン（グルコースモノマーによって形成される多糖類）である。別のグループのマウスには、同じ種類の餌を与えたが、上記のように飲料水に果糖を補充した。その1日後、マウスに106CFUのVREを接種した。VRE接種2日後、糞便中のVRE濃度を既述の方法で定量した。
常在菌の分離
分離したい細菌はすべて嫌気性であるため，10％CO2，10％H2，80％N2混合圧縮ガス（Linde AG®）を供給した嫌気性チャンバー（Whitley DG250 Anaerobic Workstation, Don Whitley Scientific Limited）内で操作した。細菌の増殖に使用する材料（固体または液体培地）は、使用前に嫌気性チャンバー内で一晩脱酸素させた。
マウスから腸内嫌気性常在菌を増殖・分離する目的で、Charles River laboratories社から購入した7週齢のSPF-C57BL/6Jマウスの盲腸内容物を採取した。盲腸内容物を直ちにPBS - システイン0.1%に再懸濁した（盲腸内容物とほぼ同量の緩衝液）。その後、再懸濁された盲腸内容物を含むチューブを嫌気ジャーに入れ、実験室に輸送した。実験室では、嫌気室で作業しながら、7mlのPBS-GCを懸濁液に添加した。懸濁液は、150 µLのアリコートで-80 °Cで凍結させた。1つのアリコートを解凍し、嫌気条件下で培養液コロンビア血液寒天（CBA；VWR）（10-2から10-6への希釈）上にプレーティングした。プレートは嫌気室で37℃で6日間インキュベートした。成長したコロニーは、新しいCBAプレートに再浸透させた。各分離株の分類学的同定は、16S rRNA遺伝子のコロニーPCRとPCR産物のサンガーシークエンスによって行われた。PCRはユニバーサルプライマーF27 (ACGAAGCATCAGTTTGATCMTGGCTCAG)とR1492 (CGGTTACCTTGTTACGACTT)を用いて実施した。各PCR反応は、総容量25 µLで、Thermopol® Reaction Buffer 10× (2.5 µL)、dNTPs 10 mM (0.625 µL)、プライマーフォワード10 µM (0.5 µL)、プライマーリバース10 µM (0. 5 µL）、Taq-polymerase（0.5 µL）、DNA源としてPBSに懸濁した細菌1または5 µL（細菌懸濁液の濃度による）、超純水で合計25 µLに調整した。PCR反応のパラメータは、初期変性（5分、94℃）、変性（30秒、94℃）、ハイブリダイゼーション（30秒、56℃）、伸長（30秒、68℃）の35サイクルとした。35サイクルの後、反応は伸長サイクル（5分、72 °C）で最終化した。PCR産物は精製プレートExcelaPure™ 96-well Ultrafiltration plate (Edge-Bio) を用いて精製し、バレンシア大学Servicio Central de Soporte a la Investigación Experimentalの配列決定設備でキャピラリー電気泳動により配列決定が行われた。ab.1形式で検索された配列の品質は、Staden 2.0パッケージのTrevプログラム（http://staden.sourceforge.net/）で手動でチェックし、配列はFasta形式で保存された。配列の系統分類は、以下に述べるようにMothurを用いて行った51。分離され、分類学的に特徴づけられた細菌は、PBS-グリセロール 20%中で-80℃に保存された。
分離した細菌の培養による生体内VRE増殖抑制効果の検証
嫌気性菌の生存率を維持するため、前節で述べたように嫌気性チャンバー内で操作を行った。細菌単離株はグリセロールストックからCBAプレート上にストリークし、3日間培養した。ただし、Oscillibacterはin vitroでの増殖が遅いため、6日間培養した。増殖した細菌コロニーをPBS-GCに再懸濁した。これらの細菌懸濁液は、実験に応じて個別に使用するか、組み合わせて使用したが、各単離株の吸光度を常に0.5（OD600）に維持した。これは、単離株あたり平均107CFU/mlに相当する。調製後、接種液を分注し、-80℃で凍結した。接種当日は、接種液をドライアイスに載せて動物施設に輸送した。接種当日は，ドライアイス上でマウスに接種し，接種後すぐに解凍した．
マウスに投与された細菌は以下の通りである。Alistipes（CU970株），Barnesiella52，Olsenella（CU969），Oscillibacter（CU971），Flavonifractor（CU972）およびBacteroides（CU22株）であった．また，BarnesiellaはMemorial Sloan Kettering Cancer Centerで以前に入手し，Dr. E.G. Pamer52の好意により提供されたものを除き，すべて本研究で入手した菌である．
CBCによるVRE阻害を調べるためのex vivoアッセイ
CBCの投与が宿主の不在下でVREの増殖を阻害するかどうかを調べる最初の試験として（図2f）、バンコマイシンの投与を停止して2週間後にマウスから盲腸内容物を採取した。盲腸内容物は、(i)vancomycin投与中止の翌日から連続3日間CBCを投与したマウス、(ii)CBCの代わりにPBS-GCを投与したマウスの2群から採取された。回収した盲腸内容物は、直ちに嫌気ジャーに入れ、嫌気槽に導入するまでの間、嫌気環境下においた。その後、嫌気槽内で、PBS pH7 100 μlに懸濁した盲腸内容物50 mgにVRE 1250 CFU（一晩培養）を接種し、37℃の嫌気条件下で24時間培養を行った。その後、混合物の希釈液をBEA-AVプレート上にプレートし、VREの増殖を定量化した。
CBCがVREの増殖を抑制するメカニズムとして栄養欠乏を調べるために（図4e、5a、b）、バンコマイシン治療を中止して2週間後にマウスから盲腸内容物を採取した（前のセクションに記載したのと同様の抗生物質治療）。盲腸試料は、使用時まで-80℃で凍結保存した。盲腸試料を解凍し、PBS pH 7に懸濁した（盲腸内容物100 mgをPBS 1 mlに溶かす）。盲腸内容物を再懸濁した後、11000 gで2分間の遠心分離を行い、上清を新しいチューブに回収した。その後、上清を遠心分離カラムを用いてろ過した。最初は孔径0.45 µmの膜を有するカラム（Thermo Scientific）を用い、その後、膜径0.2 µmのカラム（Thermo Scientific）を用いて2度目の遠心分離をした。ろ過した上清 40 µl を 96 ウエルプレートの各ウエルに添加し、各条件で試験を行った。上清を含むプレートは、酸素を除去するために嫌気性チャンバーで一晩還元した。翌日、細菌単離株（すなわち、アリスティペス、バルネシエラ、オルセネラ、オシリバクターおよびフラボニフラクター）のストックを嫌気性チャンバー内で解凍した。各細菌の106CFUを最終容量の5μlのPBSに再懸濁した（5つの細菌分離体または個々の分離体を含む）。細菌を含む5μlを盲腸濾過上清の40μlに加えた。培養終了後，嫌気槽内で500CFUのVREを含む5μlのPBS（一晩培養）を添加し，24時間37℃で培養を行った．対照として、上記の培養を行ったが常在菌を含まない、あるいはBacteroides属の分離株（VREに対する防御とは無関係）を含む糞便濾過上清に500CFUのVREを添加した。VREの添加の他、結果に明記されている場合は、過剰のフルクトースを添加した。VREを添加する直前に、あらかじめ還元した0.5Mフルクトース5 µlを添加した。この糖はあらかじめ水に懸濁させ、濾過（孔径0.2 µm）しておいた。コントロールとして、果糖の代わりにあらかじめ還元した濾過水を加えた。VRE投与後、37℃の嫌気条件下で6時間インキュベートした。その後、PBS上で希釈したものを選択培地BEA-AV上にプレーティングし、VREの増殖を定量した。VREを接種しない場合、BEA-AVプレート上にコロニーが存在しないことを確認するため、VREを含まないコントロールも含まれた。
糞便DNAの抽出とバイオマスの算出
QIAamp® DNA Fast Stool Miniキット（QIAGEN社、スペイン、ref 50951604）を用いて糞便サンプルからの細菌DNAを抽出した。抽出は、製造元の指示に従い、ビーズビーティングによるメカニックディスラプションステップを導入して行った53。抽出キットの第一バッファに懸濁したサンプルを、Vortex-Genie 2にVortex Adapter (Mobio, ref 13000-V1-24) を装着し、500 µlのガラス製マイクロビーズ (酸洗浄ガラスビーズ 150-212 µm, Sigma®) とともに最高速度で5分間シェイクすることで簡単に行うことができる。その後、QIAamp® DNA Fast Stool Miniキットのプロトコールに従った。精製したDNAは50 µlのmilliQ水で溶出し、Qubit 3.0 Fluorometerを使用して定量した。微生物群集のバイオマスの指標として、以前記載したように54,55、糞便サンプル1gあたりのDNAのナノグラムを算出した。
16S rRNA ハイスループット配列決定と解析
16S rRNA遺伝子のV3-V5領域を増幅し（Kapa HiFi HotStart Ready Mix）、Nextera® XT Index Kitでインデックス付け（96インデックス、384サンプル）、Miseq Reagent Kit V3を使ってMiSeqプラットフォーム（イルミナ）の「16S Metagenomic Sequencing Library Preparation」マニュアルに記載されている通りに配列決定しました。
得られた配列の品質評価は、printseq-lite v.0.20.456を使用して行った。配列のトリミングは、20塩基のウィンドウの最小平均品質スコアが30を下回らないように、sliding-window法を用いて行った。この基準を満たすまで、3'末端から配列をトリミングした。次に、トリミングされた順方向および逆方向のペアエンド配列を、ea-utils suite57のfastq-join v.1.1.2 を用いて、デフォルトパラメータ（最大差8％、最小重なり6bp）を適用してアセンブルした。400bp以上のペアエンド配列は、その後の解析のために保存した。配列は、SILVA reference alignment58 と Needleman-Wunsch アルゴリズムをテンプレートとして、デフォルトのスコアリングオプションで 16S rRNA 遺伝子にアラインメントされた。キメラの可能性のある配列はUchime v.4.2.4059を使用して削除した。微生物多様性の過大評価における配列決定エラーの影響を最小化するために60、高存在配列と1%異なる稀な存在配列は、Mothur51のpre.clusterオプションを使用して高存在配列にマージされた。サンプルあたりの配列数が異なると多様性が異なる可能性があるため、異なる糞便サンプルの多様性を比較する際には、まず、配列数が最も少ないサンプルで得られた配列数（すなわち、図1、2a、補足図2、3、6の解析では29667、図2d、e、補足図9の解析では22904）にすべてのサンプルを希薄化させた。配列は、Vsearch v.2.9.061 を用いて、abundance based agc 法で OTU にグループ化した。距離ベースの類似度が97%以上の配列は、同じOTUに割り当てられた。系統分類は、Wangらによって記述されたBayesian classifierアルゴリズムを用いて、ブートストラップカットオフ60%で各配列に対して行った62。分類は可能な限り属レベルで行い、そうでない場合は属レベルに最も近い分類レベルを示し、その前に「unclassified; UC」を付けた。Mothurを用いてOTUレベルのShannon indexを求めた。豊かさは、特定のサンプルで同定されたOTUの数として定義された。2次元の非計量的多次元尺度法（NMDS）は、関数metaMDSとMothurでOTUレベルで得られたBrayCurtis距離行列を使用して適用された。シングルトン（1つのサンプルに1つだけ含まれる非常に稀なOTU）は、Shannon指数、豊かさ、BrayCurtis距離の算出に含めなかった。
ゲノム配列の決定と解析
対象細菌は、CBAプレート上で嫌気条件下で培養した。細菌をPBSに懸濁し、既報の通りQIAamp® DNA Fast Stool Miniキットを用いてDNAを抽出した。その後、Nextera® XT DNA Sample Preparation Kitを用い、メーカーガイドに従ってゲノムDNAライブラリーを取得した。サンプルはNextera® XT Index Kitでインデックスを付け、Miseq Reagent Kit V3（ペアエンド）を用いてIllumina MiSeq® Systemでゲノムシーケンシングを行った。
1株あたり平均1,114,877のペアエンドリードが得られた。残りのアダプター配列は、Cutadapt v. 1.1063を使用して生データから除去しました。平均して4%のリードにアダプター配列が含まれていたため、適宜トリミングを行いました。次に、UrQt v.1.0.1864を使用して、配列の品質によるフィルタリングを行いました。UrQtは、低品質のリードの極端な部分をトリミングし、データの損失を回避します。ただし、短いリードの誤判定を避けるため、75以上のリードのみを処理しました。合計で、8.5%の塩基がトリミングされ、1.65%のリードが削除されました。
クリーンアップされたゲノムデータは、SPAdes v.3.7.1 を用いて、コンティグ再構成を改善するための「caretic」アルゴリズムでアセンブルされました65。このとき、コンティグ再構築を改善するために、multi-kmer Bruijn graphによる再構築が提案されています。250 bpを超えるリードサイズの推定に最適なkmerの組み合わせであることから、6種類のkmer長（21, 33, 55, 77, 99, 127）を使用しました。SPAdesの結果、平均168コンティグ、N50 82932 bpのドラフトゲノムアセンブリが得られた（すべてのCBC分離株ゲノムのデータは、付録データファイル4で提供されている）。平均的なベースペアカバレッジは33.38Xであった。PROKKA v.1.1366を用いてOpen Reading Frame (ORF)を同定し、アノテーションを行った結果、1ゲノムあたり平均2508.4個のORFを得ることができました。ORF はアミノ酸に翻訳し、KEGG データベース67 と照合した。HMMer v.3.1.268 を用いて、以下のパラメータでアノテーションを行った： e-value が 0.05 より低く、最小カバレッジが 0.50 の Hits のみを有意な結果として保持した。各ORFについて、最良のヒットのみが保持された。
細菌分離株（未分類のRuminococcaceae）のFlavonifractorへの再分類
16S rRNAの完全な配列に基づき、VRE腸管コロニー形成に負の関連があることが判明した細菌分離株の1つ（図2a）は、当初Unclassified Ruminococcaceaeに分類された。この分離株をより適切に分類するために、そのゲノム配列を使用して、現在はOscillospiraceae科に統合されているRuminococcaceae科内での分類を行った。
Ruminococcaceaeの系統は、Ruminococcaceae/Oscillospiraceaeの代表的なゲノムをコアゲノムとした系統樹を構築することで推定した。すべてのゲノムはNCBIのプログラムデータセットを用いてrefseqからダウンロードし（taxID 216572, 21th October 2021）、その後、完全な配列を持つものを使用した。
これらのゲノムと目的のUnclassified_Ruminococcaceaeのコアゲノム再構築は、ソフトウェアOPSCAN v.0.1 (https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/opscan/) 69を使用して行われた。簡単に説明すると、目的のグループからの参照プロテオームと他の各プロテオーム間のエンドギャップフリーグローバルアライメントを使用して、双方向のベストヒットとしてオーソログを同定した。アミノ酸配列の類似度が60%未満、またはタンパク質の長さが20%以上異なるヒットは破棄された。1つの株（Acetivibrio clariflavus DSM 19732）との比較でそれぞれ同定されたオーソログ遺伝子の共通グループをコアゲノムと定義した。コアゲノムは83個のタンパク質コード化遺伝子配列から構成されていると判断した。次に、コアゲノムがコードするタンパク質を、マルチ配列アライメントプログラム MAFFT version 7.453 を用いて、-linsi パラメータ70 で個別にアライメントした。アラインメントの非情報領域は、trimAl v1.4.rev15 を用いて自動化1アルゴリズムでトリミングした71。得られたアラインメントを各ゲノムごとに連結した。IQ-TREE v.2.0.472 を用いて系統樹を推定し、TEST オプションを用いて LG + F + I + G4 という最適なモデルを決定しました。トポロジーの頑健性は1000 rapid bootstrap実験によって検証された。系統樹は iTol v5.5.1 で可視化し、重複する系統は手作業で削除した73。
RNA抽出とメタトランススクリプトーム配列決定
RNAlaterで保存したサンプルを氷上で解凍し、100-250 mgの糞便サンプルに相当する量を錘付きの2.0 mlマイクロチューブに移した。各サブサンプルを重量と同量の氷冷DEPC水で希釈し、11000 g、4℃で5分間遠心分離した。上清を捨て、得られたペレットを秤量した。得られたペレットから、キットPower Microbiome RNA isolation kit（参考文献26000-50、Mobio社）を用いて、製造元のプロトコルに沿って、若干の修正を加えながらRNAを抽出した。まず、プロセスを改善するために、キットのプロトコルで提案され、すでに文書化されているように、フェノール-クロロホルム抽出（pH 5）とビーズビート破壊を組み合わせて最初のステップを実施した74。第二に、DNAの除去を改善するために、DNAse処理工程を室温で15分間ではなく、37℃で45分間に増やした。第三に、最終ステップで、RNAを5分間（1分間ではなく）インキュベートした後、100 µlのPM8で溶出させた。抽出後、bacterial 16S rRNA universal primer F27 (ACGAAGCATCAGTTTGATCMTGGCTCAG) と338 R (TGCTGCCTCCCGTAGGAGT) によるqPCRを行ってRNAの純度を確認した。PCRが陽性であれば、サンプル中にDNAが残っていることを意味する。増幅の場合、サンプルはBaseline-ZERO Dnase (Epicentre)で処理し、残存するDNAを完全に除去した。標準的なエタノール沈殿プロトコルを用いてRNAを沈殿させ、次のステップに干渉する可能性のあるStop溶液を洗浄した。
CBC が発現する機能を特定することに関心があったため、主に mRNA に注目した。しかし、細胞内に存在するRNAのほとんどはrRNAである。rRNAを除去するために、すべてのサンプルをRibo-Zero rRNA Removal Kit (Bacteria) (Illumina)で処理した。シーケンス用のライブラリは、ScriptSeq Complete Kit Bacteriaを使用して、メーカーのプロトコールに従って構築した。ライブラリーは、NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 bp, pair-end) を用いて、メーカープロトコルにしたがってNextseqプラットフォームでシーケンスした。
メタトランススクリプトーム解析
各サンプルについて平均2.6 × 107 ペアエンドリードが得られました（補足データファイル5のサンプルごとの取得リード数参照）。Adaptor配列と低品質リードはCutadapt v.1.10とUrQt v.1.0.18で除去しました。使用したRNA抽出法にはリボソームRNAを除去するステップが含まれているが、このステップではリボソームRNAを100%除去することはできない。このため、メタトランススクリプトームデータは、SILVA76のShort Ribosomal Subunitデータベース（16Sおよび18S rRNA参照データを含む）に対して、bowtie v.2.2.975を用いてマッピングされました。これらのデータベースと一致する配列は破棄されました。残りのリードは、SILVAのLong Ribosomal SubunitデータベースとNCBIリファレンスリポジトリのMouse reference genome v.38に対して再マッピングされました77。両データベースのいずれかにマッピングされたヒットは、さらなる解析から除外されました。
残りのトランスクリプトーム配列（サンプルあたり平均7.1×106リード）は、SPAdes v. 3.7.1と "rna "アルゴリズムを用いて組み立てられ、転写産物の再構成が改善されました。アセンブル結果の向上が示唆されているmulti-kmer de Bruijn graph再構成に従いました。上述したように6種類のkmer長を使用しました。ORFはMetaGeneMark v.1.0.178を使用して同定・注釈付けを行いました。最小サイズが50aaで、少なくとも1つの極限が完全であるORFのみが保持された。
その後、非冗長（NR）ORFのカタログを作成した。ORF は vsearch v2.9.0 の "cluster smallmem" オプションで 90% の同一性でクラスタリングされた61,79 。NR-ORF は、上記のように KEGG と HMMer を用いてアノテーションした。ORFあたりの平均カバレッジとマッピングされたリードの総数を計算するために、bowtie v.2.2.9を使用して、フォーマットされたNRカタログに対してフィルタリングメタトランススクリプトームデータをマッピングした。リードカウントは、まずリードカウント数を各ORFの長さ(RPK)で割って、Transcripts per million (TPM)に変換した。次に、RPK数の合計を1,000,000で割り（つまり、スケーリングファクターとなる）、最後に各RIKを当該スケーリングファクターで割った。この正規化により、各サンプルの合計が1,000,000 TPMとなり、比較可能となります。
CBC分離株で発現している転写産物を特定するため、クリーンアップしたメタトランススクリプトームデータを、同一性の割合が99%以上、最小カバレッジ長が80%で、bowtie v.2.2.9を用いてCBC分離株から得られた細菌ゲノム（ゲノム配列決定と解析の項参照）にマッピングした。同様の正規化を前述と同様に行った（TPMはサンプルあたりの総リード数で算出）。
フルクタナーゼを同定するために、Uniprot [The UniProt Consortium]80 からフルクタナーゼ（フルクタン-β-フルクトシダーゼとレバナーゼ）に対応する配列を収集し、手動でキュレーションした配列のみを使用した。配列はMAFFTで-linsiパラメータ70でアライメントし、手動でキュレーションした。得られたキュレーションされたアライメントは、HMMer v.3.1.2 の hmmbuild を用いて、標準パラメータ（http://hmmer.org/）で隠れマルコフモデル（HMM）を構築するために使用された。次に、このHMMプロファイルをRefSeqゲノムデータベースに対して、-cut_ncフィルターを選択したHMMsearchでアライメントし、フルクタナーゼ活性を持つタンパク質を抽出しました。カバレッジ85%以上、E-value <1e-10のヒットのみを選択した。Prokkaアノテーションにより6-glucose-phosphate kinase (G6PK)と注釈されたヒットが多く検出されたため、それらを分離した。最後に、メタトランススクリプトームデータを、デフォルトパラメータでblastnを使用して、両方の配列セットに対してマッピングしました。85%以上のカバレッジと1e-10未満のe-valueを持つヒットが選択されました。同じ転写産物が両方のモデル（fructanaseとG6PK）にマッピングされた場合、fructanaseのe-valueがG6PKのそれよりも小さいものだけが考慮されました。
糞便内容物中のフルクトース検出
フルクトースの分析は、ガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）により行った。試料の処理は、タンパク質の沈殿とそのトリメチルシリル誘導体への誘導体化であり、以前の研究81に従った。そのために、50 µLのサンプルに3容量の冷えたメタノールを加えた。遠心分離後、きれいな上澄み液を集め、真空乾燥させた。乾燥した試料に，1% TMCS (trimethylchlorosilane) を含む BSTFA (N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) 溶液 20 μL とピリジン 10 μL を加え，70℃で3時間保持して誘導体を化成した。誘導体化された抽出物を真空乾燥し、100 µLのヘキサンに溶解して注入した。フルクトースの標準品も同様に誘導体化し、フルクトースピークの同定に使用した。
GC-MS 分析は、Agilent 7890 A ガスクロマトグラフに Agilent 7200 正確質量高分解能 GC/Q-ToF を接続して行いました。分離は、Agilent DB-5ms + DG キャピラリーカラム (30 m × 0.25 mm i.d., 0.25 μm film thickness +10 m Duraguard) を用いて、キャリアガスとしてヘリウムを使用して実施されました。質量分析はEI条件で行い、m/z 50から600の質量範囲において70eVでフルスキャンモードでデータを記録した。イオン源、四重極、トランスファーラインの温度はそれぞれ250 °C、150 °C、290 °Cであった。EIC (extracted ion chromatogram) m/z 217.1075 のフルクトースピークの積算ピーク面積から、単糖を定性的に判定した。
VREおよびOlsenellaが炭素源として利用する糖の検出のためのBiologアッセイ
VRE株ATCC700221が異なる糖の存在下で増殖する能力を評価するために、Biolog社のAN MicroPlateTMを使用した。このプレートには、Supplementary Fig. 13に示した糖類を含むユニークな炭素源が各ウェルに含まれている。各ウェルプレートには、VREを含む最小限の培地M1を100μl接種した。M1 培地は、1 L の PBS に 10 g のトリプトンと 0.5 g の酵母エキスを加えたもので、Enterococcus の増殖を可能にする糖を定義するために以前から使用されている82。簡単に説明すると、VREをBHIプレートで37℃の嫌気室で一晩培養した。実験に使用したM1培地は、あらかじめ嫌気性チャンバーで一晩還元しておいたものである。VREをスワブで採取し、M1培地に再懸濁し、OD600 0.1に調整した。AN MicroPlateTMに、この混合液を各ウェルに100 µlずつ接種した。吸光度を連続的に測定するために、AN Microplateは嫌気槽の外で24時間培養する必要があった。嫌気状態を維持するために、96ウェルプレートの上部にオートクレーブしたミネラルオイルを30 µl添加した。この方法は、嫌気性細菌Barnesiellaを増殖させることで確認したように、嫌気状態を維持することができた。吸光度の測定は、分光光度計Tecan Infinite F200を用い、波長570 nm、Magellan program v.6.6で行った。プレートは37℃でインキュベートした。吸光度は30分ごとに振とうしながら測定した。結果は、最初の講義のバックグラウンドを差し引いて分析された。結果は、特定の糖で得られた吸光度を、最大の増殖を可能にした糖（すなわちマルトトリオース）で得られた吸光度で割った図4cに表されている。オルガネラについても全く同じ実験を行ったが、この場合、より高い増殖を可能にする糖はマンノースであった。
フルクトキナーゼに欠損を持つVRE変異株の作製。VRE株の選択と潜在的フラクトキナーゼの同定
まず、フルクトース利用に欠損した VRE 株を得るために、原稿の大半の実験で使用した VRE 株（ATCC700221）において、フルクトース利用に必要な最初の酵素であり、フルクトース代謝に特異的なフルクトキナーゼ （1-phosphofructokinases も含む）をコードする可能性がある遺伝子を同定した。我々は、フルクトキナーゼをコードしていると推定される遺伝子を合計6つ同定した。我々は、フルクトキナーゼと推定される6つの遺伝子を同定し、そのうちの1つまたは数個を欠失させても、残りの遺伝子の発現によって補うことができるため、同一株内で6つの推定フルクトキナーゼをすべて欠失させることを試みた。しかし、変異体作製に用いたシャトルベクター（pWS3）では、この菌株の形質転換体を得ることができなかった。そこで、遺伝学的に扱いやすいAUS000427株（本原稿で用いたもう一つのVRE株）を用いて、フルクトキナーゼ欠損株を取得した。まず、AUS0004株にコードされている推定フルクトキナーゼをKEGGデータベース（https://www.genome.jp/entry/efc）の注釈付きゲノムを解析することにより同定した。ここで、我々はまた、高いレベルの機能的冗長性を見出した。具体的には、理論的にフルクトキナーゼをコードする5つの遺伝子（EFAU004_00683; EFAU004_01835; EFAU004_02555; EFAU004_01659; EFAU004_01953）を同定した。これらのうち3つの遺伝子（EFAU004_00683; EFAU004_01835; EFAU004_0255）は非リン酸化酵素輸送系（PTS）を介して取り込まれたフルクトースを代謝するタイプのフルクトキナーゼをコードしており、他の2つ（EFAU004_01659；EFAU004_01953）はPTS系を介して取り入れられたフルクトースを代謝する1-リン酸化フォルフルトキナーゼをコードしている。
フルクトキナーゼを欠損したVRE変異株の作製。最初の方法論
変異体を作製するために、我々は以前に述べた方法論に従って、相同組換えにより目的の遺伝子をゲンタマイシン耐性遺伝子: aac(6')-aph(2") に置き換えた83。その後、ゲンタマイシンマーカーをコードする遺伝子がlox部位に挟まれていることから、Creリコンビナーゼを用いてゲンタマイシンマーカーを除去することができる。簡単に言えば、各潜在的フルクトキナーゼについて、（i）目的の遺伝子の最初の50bp＋上流450bp（1st PCR）及び（ii）目的の遺伝子の最後の50bp＋下流450bp（2nd PCR）を、補足データファイル6に記載のKAPA polymerase及びプライマーを用いて増幅させた。PCRは、12.5 μl 2X KAPA HiFi Hot Start Ready Mix、10 μM フォワードおよびリバースプライマー、10-100 ngのDNAテンプレートを含む25 μlの最終容量で行った。PCR反応のパラメータは、初期変性（3分、95℃）、30サイクルの変性（20秒、98℃）、ハイブリダイゼーション（20秒、60-65℃）、伸長（1分、72℃）であった。30サイクルの後、伸長サイクル（1分、72℃）で反応を最終化した。PCR産物は、Nucleo Mag® NGS Clean-up and size select kitを使用して、メーカーのプロトコルに記載されているとおりに精製した。なお、遺伝子外でハイブリダイズするプライマーには、補足データファイル6に明記されているように、クローニングのための制限酵素が含まれていた。1st PCRからのリバースプライマーと2nd PCRからのフォワードプライマーは、両DNA断片の間にゲンタマイシン耐性カセットをクローニングするために、両PCRを融合させるための相補配列とAvrIIの制限部位を含んでいる。次に、得られた2つのPCR産物（上記のように目的遺伝子に対するフランキング領域を含む）1μlをDNAテンプレートとして、2次融合PCRを行った。このPCRは、上記のKAPA HiFi Hot Start polymeraseと1st PCRのフォワードプライマー、2nd PCRのリバースプライマーを用いて行った。これらの融合PCR産物を、XmaIおよびXhoI制限部位を用いてプラスミドpWS3にクローニングした。続いて、pZXL5プラスミド83から、補足データファイル6に記載のプライマーとKAPA HiFi Hot Startポリメラーゼを用いて、ゲンタマイシン耐性遺伝子acc（6'）-aph（2"）を上述と同様に増幅させた。次に、得られたPCR産物をNucleo Mag® NGS Clean-up and size select kitで精製し、pWS3プラスミドにあらかじめクローニングした融合PCR内に挿入したAvrII制限部位を用いてクローニングした。最終的に得られたプラスミド（補足データファイル6）は、以前に記載されたエレクトロポレーションプロトコルを用いてAUS0004株に形質転換した82。簡単に言えば、エレクトロコンピテント細胞を、200mMのスクロースと1％のグリシンを補充した25mlのBHIで一晩培養したものを1000倍に希釈して調製し、37℃で振盪インキュベーター内で一晩増殖させた。次に、細菌細胞を遠心分離し、200mMのスクロースと1％のグリシンを添加した25mlの新しい予熱されたBHIに再懸濁し、37℃で1時間、振盪培養器内で培養した。培養後、細菌細胞を0.5 Mスクロースと10%氷冷グリセロール（洗浄バッファー）で3回洗浄し、最後に1.2 ml氷冷洗浄バッファーに再懸濁させた。細菌コンピテントセルの50 µlアリコートを10 µlのプラスミドと混合し（プラスミド濃度約50 ng/µl）、氷冷したキュベット（ギャップ1.5 mm）に移し、30分間氷上で静置した。細胞およびプラスミドを含む懸濁液を、以下のパラメータを用いてエレクトロポレーションした：電位2.5 kV、容量25 µF、シャント抵抗200 Ω。細菌細胞を0.5 Mグルコース入りBHIに再懸濁し、28℃で1時間インキュベートした。この形質転換体をゲンタマイシン（300 µg/ml）を添加したBHI寒天培地で28 °C、1-3日間培養した。その後、標的変異体を得るためのダブルクロスオーバー組換えを達成するプロトコルは、以前に記載された83に従った。1つの形質転換体コロニーを、ゲンタマイシンを添加したBHIブロス中で、28℃で一晩培養した。翌日、この細胞培養物を抗生物質を含まない予め温めたBHIブロスで10000倍に希釈し、37℃で一晩培養して熱感受性プラスミドを失い、組換えにより染色体に挿入されたゲンタマイシン耐性を付与する遺伝子を持つ形質転換体を選択した。この培養物をゲンタマイシンを添加したBHI寒天培地にプレーティングし、37℃（プラスミド複製の制限温度）で再びインキュベートした。コロニーをスペクチノマイシン（300μg/ml）添加BHI寒天培地プレートとゲンタマイシン（300μg/ml）添加BHI寒天培地プレート上に再浮遊させた。ゲンタマイシンに耐性でスペクチノマイシンに感受性のコロニー（プラスミドにより付与された）を、補足データファイル6に記載のフランキングプライマーを用いたPCRにより確認し、生じた欠失とゲンタマイシン耐性遺伝子の導入を確認した。この方法を用いると、通常100-200クローンを試験した後に変異株を得ることができる。我々は、EFAU004_0255遺伝子にコードされるフルクトキナーゼの変異体を得ることができた。しかし、10回の試行と各フルクトキナーゼにつき1000個以上のクローンを試験した結果、他の4つのフルクトキナーゼの変異体を得ることはできなかった。そこで、最近発表されたリコンビナーゼRecTの発現に基づく新しい方法論33を適用し、潜在的なフルクトキナーゼをコードする他の遺伝子の変異体を得た（次節参照）。
フルクトキナーゼを欠損したVRE変異株の作製：第二の方法論
フルクトキナーゼの変異株を得るための第二の方法として、Enterococcus phage由来のリコンビナーゼであるRecTを過剰発現させることにより、より効率的に耐性マーカーに遺伝子を置換できる新規な方法を適用した33。すなわち、目的の遺伝子の上流および下流のフランキング領域と、両フランキング領域内に挿入されたゲンタマイシン耐性マーカーを含む断片を、以前に作成したプラスミド構築物（前項、補足データファイル6）と、これらのプラスミド構築物の作成に用いた外部プライマー（補足データファイル6）をDNAテンプレートとして増幅させた。PCR産物はNucleo Mag® NGS Clean-upを用いて精製した。PCR産物をプラスミドpRecT_233を含むVRE株AUS0004に形質転換し、他のプラスミドについて前に述べたようにこの株で導入した。PCR産物を形質転換するために、pRecT_2を含むAUS0004株のエレクトロコンピテント細胞を、以前に記述したように入手した33。簡単に言えば、2%グリシンおよび0.5Mスクロースを添加した10mlのBHI培地中で、37℃で一晩培養した。次に、培養物を遠心分離し、ペレットを、RecT誘導のために2%グリシン、0.5Mスクロースおよび1mM IPTGを含む25mLの新鮮なBHI培地に再懸濁させた。細胞を37℃で1.5時間、振盪インキュベーターでインキュベートした。次に、細胞を5000相対遠心力（RCF）で10分間遠心してペレット化し、1mLの洗浄バッファー-エレクトロポレーション溶液（0.5Mスクロースと10%氷冷グリセロール）に再懸濁し、ファルコンチューブへ移した。細胞を7000RCFで4℃、8分間ペレット化し、1mLの新鮮なエレクトロポレーション溶液に再懸濁した。このステップを繰り返したが、ペレットは最終体積1.2 mlに再懸濁された。エレクトロポレーション溶液中の細胞の50μLアリコートを3μgの精製PCRと混合し、氷冷したキュベット(ギャップ1.5mm)に移し替えた。次に、この懸濁液を次のパラメータを用いてエレクトロポレーションした：2.5 kV、25 mF、200 Ω。次に、細胞を0.5 Mスクロースを添加した1 mL BHIに再懸濁し、マイクロチューブに移した。細胞はシャンクすることなく37℃で2時間インキュベートした。細胞をゲンタマイシン（100 µg/mL）を添加したBHI寒天培地に37 °Cで1-3日間プレーティングした。得られた形質転換体について、補足データファイル6に記載されているフランキングプライマーを用いたPCRにより、導入された変異を確認した。この方法により、EFAU004_0255、EFAU004_00683、EFAU004_01659の遺伝子について変異株を得ることができた。しかし、EFAU004_01835とEFAU004_01953の遺伝子については、3回の試行の結果、変異体を得ることができなかった。PCRにより変異体が確認されると、プラスミドpREC_T2は、ゲンタマイシン（100μg/ml）を含む液体BHI上で37℃、振盪培養器でコロニーを一晩培養することにより硬化させた。その後、この培養物をゲンタマイシンを含む新鮮なBHIで1：50に希釈し、OD600nm＝0.8になるまで37℃、振盪インキュベーターでインキュベートした。この培養物の希釈液をゲンタマイシンを含むBHIプレート上にプレーティングした。コロニーをスペクチノマイシン（250μg/ml）を含むプレートに再浸漬し、プラスミド（スペクチノマイシンに対する耐性を付与する）の消失を確認した。
VREフルクトキナーゼ変異体の増殖の検討
WT VRE株AUS0004またはフルクトキナーゼ遺伝子変異体を、フルクトース、グルコースまたはマンノースのいずれかを5mM含む最小培地M1上で37℃にて増殖させた。光学密度は、24時間の間、上記のようにモニターした。
統計解析
CFU数、多様性、豊かさ、バイオマス、発現遺伝子数、フルクトースレベル、糖質中での成長における2つのサンプルグループ間の有意差を確認する目的で、比較対象の集団が正規分布に従っているかどうかを定義するためにShapiro-Wilk正規性検定が適用された。もしそうであれば、t-検定を適用した。研究対象の集団が正規分布に従わない場合は、ノンパラメトリックのWilcoxon rank-sum検定を適用した。まれに、1つのグループを除くすべてのグループが正規分布に従うことがあった（Fig.3b; 4a; Supplementary Fig.2B and Supplementary Fig.2C）。この場合、両方の検定が適用された。どちらの検定も同様の結果をもたらしたが、t検定の結果のみを残し、図に示した。適用した検定は両側検定であったが、Fig. 5cと補足Fig. 8では片側検定を適用した。これは、オルガネラがVREのコロニー形成に対するCBC阻害効果を再現できるか、CBCがさらなるVRE株の腸内コロニー形成を制限するかという仮説を検証するために行われた実験であったためである。これらの実験では、PBS-GC群と比較して、常在菌投与群ではVRE CFUのレベルが低いことが唯一予想された結果であり、確認されたものである。
サンプルグループ間の異なる分類群の相対的存在量における統計的有意差を判断するために、Rパッケージ "stats "のwilcox.test機能を用いてノンパラメトリックWilcoxon rank-sum検定を適用した。ノンパラメトリック検定は、典型的なパラメトリック検定の主要な仮定（各グループの正規集団）にほとんどの場合違反するメタゲノム・データの性質（相対的存在量）のために使用され、ノンパラメトリック検定は、分布フリーアプローチであるためデータの基礎的分布に対してよりロバストである84。最小の検出シグナルを持つ分類群のみを統計解析に含めた（すなわち、その特徴は、研究中の2つのグループの少なくとも一方からのサンプルの50％に存在し、すべての分類群およびサンプルで検出された最小シグナルの5倍より優れた存在度であった）。多重仮説検定の調整には、fdr.Rパッケージ85に実装されているBenjaminiとHochbergによるFDRアプローチを使用した。
VREに対する防御に関連する常在菌を同定するために、VRE接種前に採取した糞便サンプル中の特定のマウスで同定された属の相対存在量と、その特定のマウスにおける2日後のVREの糞便レベル（CFUs/100mg）の間に両側スペアマン相関検定を適用し、多重仮説の検定のために、上記のようにBenjamini and Hochberg法を使用した。この解析は、通常の条件下（すなわち未処置マウス）でVREに対する防御を与える常在菌を同定し、その後の有意な関連を有する細菌の分離を容易にするために行ったので、未処置マウスにおいてより豊富である属（未処置マウスから採取した試料における存在度の中央値＞0.4％；補足図5）に焦点を合わせる。低存在量の属や属レベルまで分類できなかった分類群を含むすべての相関を補足データファイル3に示す。
VREの糞便量が103CFUs/100mgを超える患者は、院内環境をVREで汚染し、その伝播を促進する可能性があるというエビデンスに基づいて、分離された潜在的防御菌の存在量が、コロニー化感受性が高いマウスと低いマウスで有意に異なるかを定義する目的で、両マウスのグループの定義には、VRE CFUs/100mg の閾値を利用した 9,11. 両群を定義した後、両側Wilcoxon順位和検定を適用して、両群のサンプル間の特定の常在菌の存在量の有意差を検討した。
CBC投与により発現が増加したKOを同定するために（図3c）、まず、CBC存在下で過剰発現したKOを同定した（すなわち、バンコマイシン処理後にCBCを投与したマウス群と、投与しなかったマウス群のlog2FC差が1以上であった）。ほとんどのマウスでVREのコロニー形成に対する抵抗性を説明できる菌の機能を特定したいので、1群のマウスの80％以上のサンプルに存在しないKOに着目し、すべてのサンプルで検出される最小シグナルの3倍以上の存在量のものを切り捨てた。その後、これらの基準をクリアしたKOのリストにDeSeq2アルゴリズムv.1.24.0をlocal fitオプション86で適用し、得られたp値を上述のBenjamini and HochbergによるFDRアプローチで調整した。KEGGデータベースを用いてアノテーションできないORFにマッチするリードカウントは、この解析に含まれなかった。
Pearson相関分析を適用し、同居マウスにおけるfructose caecal levelとlog10 VRE faecal CFUsの相関を調べた。両変数が正規分布（Shapiro-Wilk test > 0.05）に従っていたため、Pearson testが適用された。未処置マウスのサンプルは、この分析に含まれなかった。その理由は、VREは未処理マウスにコロニー形成することができないからである。未処置マウスには無傷の微生物叢が存在するため、フルクトース枯渇以外にコロニー形成抵抗性を付与するメカニズムがすべて備わっているからである。したがって、これらのサンプルを解析に含めても、フルクトースレベルとVREのマウス腸管へのコロニー形成能力との関連性についての情報は得られなかったであろう。同様の解析を、β-フルクトシダーゼのレベルとVREのレベルの間の関連性を解析するために行った。
結果は、p値が0.05より低い場合に有意であるとした。多重仮説検定の場合、q値が0.05より低い場合、結果は有意であるとみなした。
同一実験におけるマウス群の違いによるサンプル数の違いの理由
Fig.1の結果において、ceftriaxone投与群（回収なし）には3匹しか含まれていないが、これは2匹のマウスで抽出したDNA量が少なすぎて16S rRNAの増幅ができなかったためである。
図4aに示す結果において、マウス群（PBS-GC、CBC）には当初12匹のマウスが含まれていた。しかし、CBCを投与しなかったグループのマウス1匹は、マイクロバイオーム解析の結果、このマウスがCBCコンソーシアムの主要細菌であるオルセネラを非常に高いレベル（10%以上）で自然回復していたことが検出されたため、解析から除外した。CBC（特にOlsenella）の回復がVREのコロニー形成に対する抵抗性をもたらすフルクトースのレベルを低下させるという検証すべき仮説を考慮すると、このマウスを解析に含めることは結果に干渉する可能性がある。予想通り、同居マウスは高いコロニー形成抵抗性を示した（8×102CFUs/100mg）。Fig.4aの結果では、糖の誘導体化に関する技術的な問題により、CBCを受けなかったグループの1サンプルが含まれない。Fig.4aおよび補足Fig.9の結果において、無処置群ではバンコマイシンの投与により回復したマウスよりも変動が小さいと予想されるため、少ない数のマウスが含まれる。また、Supplementary Fig.7では、Bacteroides投与群では、実験に使用できるマウス数が限られているため、投与数を少なくしている。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに記載されている。
データの入手方法
抗生物質を投与し、回復したマウスと回復しなかったマウスの16S rRNAシーケンスデータ（図1、2a、補足図2、補足図3、補足図5、補足図6、補足図7に対応）は、アクセッションコードPRJEB40819でEuropean Nucleotide Archive (ENA) リポジトリに寄託されています（補足データファイル7）。CBCを受けたマウスと受けなかったマウスの16S rRNA配列データ（図2d、e、補足図9）は、ENAリポジトリにアクセッションコードPRJEB40849で寄託されている（補足データファイル7）。作成したゲノム配列データは、ENAリポジトリにaccession code PRJEB40866で寄託されている（Supplementary Data File 7）。Transcriptomic配列は、ENAリポジトリにaccession code PRJEB40858で登録されている（Supplementary Data File 7）。また、16S rRNA配列解析により同定したマウスの常在菌の存在量、抗生物質投与マウスのVREコロニー形成量、解析マウスの細菌遺伝子発現量の表は、補足データファイル9に含まれている。
本研究では、以下のデータベースを使用した。RefSeq genome database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/), SILVA database (https://www.arb-silva.de), PROKKA (https://github.com/tseemann/prokka), KEGG database (https://www.genome.jp/kegg/kegg2.html), Mouse reference genome v.38 from the NCBI reference repository (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/52), UNIPROT (https://www.uniprot.org)。ソースデータは本論文に添付しています。
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CUは、Conselleria d'Innovació, Universitats, Ciència i Societat Digital [AICO/2019/266, CIPROM/2021/053] およびスペインMINECO/MICINNの助成金 [SAF2014-60234R, SAF2017-90083-R, PID2020-120292RB-I00/AEI/10.13039/501100011033] によりサポートされていました。SIとAFDは、スペインのMINECO/MICINNからFPIフェローシップの支援を受けた。GCはスペインのMEFPからFPUフェローシップの支援を受けた。AQはFISABIOからフェローシップの支援を受けた。Unidad Analítica (IIS La Fe)にはフルクトースレベルの分析でお世話になった。FISABIOのServicio de Secuenciación y Bioinformáticaにはハイスループットシークエンスでお世話になった。動物実験にご協力いただいたServei Central de Suport a la Investigació Experimentalに感謝いたします。E.G. Pamerには、Barnesiellaの分離株を提供していただき、感謝いたします。プラスミドpZXL5とpWS3を提供してくださったW. van Schaik氏とプラスミドpRecT_2を提供してくださったH.C. Hang氏に感謝します。E.G. PamerとJ.R. Penadésには、原稿に対する有益なコメントをいただいた。
著者情報
著者ノート
Sandrine Isaac
現住所 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, School of Life Sciences, Molecular Microbiology, Laboratory of Molecular Health Institute, Global Health Institute, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Switzerland
これらの著者は等しく貢献した。Sandrine Isaac, Alejandra Flor-Duro.
著者と所属
バレンシア研究助成基金-FISABIO（スペイン・バレンシア
Sandrine Isaac, Alejandra Flor-Duro, Gloria Carruana, Anna Quirant & Carles Ubeda
スペイン・バレンシア、ラ・フェ研究所、創薬ユニット
レオノール・プチャデス-カラスコ、アントニオ・ピネダ-ルセナ
スペイン・バレンシア、ラ・フェ研究所、分析ユニットプラットフォーム
Marina Lopez-Nogueroles
分子治療学プログラム、医療応用研究センター、ナバラ大学、パンプローナ、スペイン
アントニオ・ピネダ・ルセナ
ローザンヌ大学基礎微生物学教室（スイス・ローザンヌ
Marc Garcia-Garcera（マルク・ガルシア・ガルセラ
CIBER en Epidemiología y Salud Pública, Madrid, Spain
カルロス・ウベダ
寄稿
S.I.、A.F.D.、C.U.が研究の企画を行った。S.I.、A.F.D.、C.U.はマウス実験を行った。S.I.、A.F.D.、G.C.、A.Q.はex vivoおよびin vitroの研究を行った。S.I.、A.F.D.、L.P.C.、M.L.N.は糞便を処理し、オミックスデータを取得した。S.I.、M.L.N.、L.P.C.、A.P.L.、M.G.G.、C.U.はオーミックデータを解析した。A.F.D.、G.C.、A.Q.は、変異株を入手した。S.I.は細菌分離株を入手した。原稿はS.I.とC.U.が執筆した。最終原稿は全著者が読み，承認した。
協力者
Sandrine IsaacまたはCarles Ubedaに連絡すること。
倫理的宣言
利益相反
CUは、Vedanta Biosciences社およびThe Zambon Group社のコンサルタントとして参加したことがある。本研究とこれらのコンサルタント業務との間に直接的な重複はない。その他の著者は、競合する利害関係を有していない。
査読
査読情報
Nature Communicationsは、本研究の査読に貢献したDavid BerryとElena Verduに感謝します。査読者のレポートがあります。
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出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。
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Isaac, S., Flor-Duro, A., Carruana, G. et al. Microbiome-mediated fructose depletion restricts murine gut colonization by vancomycin-resistant Enterococcus（微生物が媒介するフルクトースの枯渇は、バンコマイシン耐性腸球菌によるマウス腸管コロニー形成を制限する。Nat Commun 13, 7718 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41467-022-35380-5。
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2020年9月28日
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2022年11月30日
掲載
2022年12月13日発行
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https://doi.org/10.1038/s41467-022-35380-5
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