血清非標的メタボロミクスはアジア人の糖尿病網膜症進行の潜在的バイオマーカーを明らかにする
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オリジナル研究論文
Front. Mol. バイオサイエンス, 09 June 2022
メタボロミクス
第9巻 - 2022年｜https://doi.org/10.3389/fmolb.2022.871291
この論文は次の研究テーマの一部です
眼疾患における代謝と内分泌の役割
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血清非標的メタボロミクスはアジア人の糖尿病網膜症進行の潜在的バイオマーカーを明らかにする
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmolb.2022.871291/full
www.frontiersin.orgZongyi Wang www.frontiersin.orgJiyang Tang www.frontiersin.orgEnzhong Jin www.frontiersin.orgYusheng Zhong www.frontiersin.orgLinqi Zhang www.frontiersin.orgXinyao Han www.frontiersin.orgJia Liu www.frontiersin.orgYong Cheng www.frontiersin.orgJing Hou www.frontiersin.orgXuan Shi www.frontiersin.orgHuijun Qi www.frontiersin.orgTong Qian www.frontiersin.orgLi Yuan www.frontiersin.orgXianru Hou www.frontiersin.orgHong Yin www.frontiersin.orgJianhong Liang www.frontiersin.orgMingwei Zhao www.frontiersin.orgLvzhen Huang* www.frontiersin.orgJinfeng Qu*
北京大学人民病院眼科、眼病検眼研究所、北京大学健康科学センター検眼学院網膜・脈絡膜疾患診断・治療重点研究室、中国北京市。
目的：アジア人の糖尿病網膜症（DR）の分子メカニズムを明らかにし、アンターゲットメタボロミクスによる新たな治療標的の同定を促進する。2型糖尿病網膜症（T2DM）と増殖性DR（PDR）および非増殖性DR（NPDR）患者における糖尿病網膜症の異なるステージ間の血清代謝物および代謝経路の違いを明らかにし、T2DMとDR（NPDRおよびPDR）患者間の差分代謝物を同定する。
方法 この前向き観察登録研究では、臨床的特徴に有意差のないT2DM患者45例と対照例15例との間の差分代謝物について記述した。生体試料と臨床情報を収集し、診断書に記録した。被験者のDR表現型は網膜専門医によって検証された。血清代謝物は、液体クロマトグラフィーを用いた高分解能質量分析を用いて分析した。T2DM患者15例、非増殖糖尿病網膜症患者15例、増殖糖尿病網膜症患者15例、および糖尿病対照15例の血清サンプルについて、非標的メタボロミクスを実施した。部分最小二乗判別分析（PLS-DA）、階層的クラスタリング分析（HCA）、一般化線形回帰モデルにより、判別可能な代謝の特徴を同定した。
結果： 非標的メタボロミクスにより、931の特徴量（陽性モード523、陰性モード408）が検出され、DRの有無に関連性の高い102の共通代謝物が検出された。調整後解析では、67の代謝特徴がT2DM患者とNPDR患者で有意に異なっていた。パスウェイ解析では、アミノ酸と脂肪酸の代謝に変化がみられた。グルタミン酸、ホスファチジルコリン、13-hydroperoxyoctadeca-9,11-dienoic acid（13-PHODE）がこれらの経路の違いに重要な寄与をしていた。合計171の特徴がPDR患者とT2DM患者を区別し、パスウェイ解析によってアミノ酸代謝、脂肪酸代謝、窒素代謝、トリカルボン酸サイクルの変化が明らかになった。アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、オルニチン、N-アセチル-L-グルタミン酸、N-アセチル-L-アスパラギン酸、クエン酸、コハク酸、N-（L-アルギニノ）コハク酸、2-オキソグルタル酸、13-ヒドロペルオキシオクタデカ-9、 11-ジエン酸、メチオニン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、N(π)-メチル-L-ヒスチジン、ホスファチジルコリン、リノール酸が経路の違いに大きく寄与していた。NPDR患者とPDR患者の間には、79の有意な代謝物の差が認められた。濃縮パスウェイ分析では、アミノ酸代謝、脂肪酸代謝、パントテン酸、CoA生合成に変化がみられた。アスパラギン酸、グルタミン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、N-アセチル-L-アスパラギン酸、パントテン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、イコサペンタエン酸がこれらの経路の違いの重要な因子であった。
結論 本研究により、アジア人のDR患者では、アルギニン生合成代謝、リノール酸代謝、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸代謝、d-グルタミン酸代謝、d-グルタミン酸代謝の経路が調節異常であることが示された。グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、N-アセチル-L-グルタミン酸、N-アセチル-L-アスパラギン酸の増加、ジホモ-γ-リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、イコサペンタエン酸の減少は、アジア人のPDRとNPDRを区別する代謝プロファイルと考えられた。本研究では、ホスファチジルコリンと13-PHODEがDRの進行期における2つの主要な新規代謝物マーカーとして同定された。
はじめに
糖尿病は世界的に蔓延している健康問題であり、現在世界中で5億3,700万人の患者が罹患している（Sunら、2022年）。適切な介入がなければ、この数は2030年までに6億4300万人に達すると予測されている。糖尿病は、特に心血管疾患、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症など、重篤で生命を脅かす合併症を引き起こす可能性さえある。これらの合併症は、医療や看護の必要性を高め、患者のQOLを低下させ、医療費を大幅に増加させる可能性がある（Ogurtsova et al.） 糖尿病網膜症（DR）は、糖尿病の眼における最も重篤な細小血管合併症である（Sumarrivaら、2019）（Cabreraら、2020）。また、発展途上国や先進国における20～74歳の成人の視力低下や失明の主な原因となっている（Sabanayagam et al.） 平均寿命の延伸を可能にする一方で、現代医学の進歩により高齢化が進み、糖尿病網膜症などの合併症を有する糖尿病患者が世界的に、特にアジアで増加している（Yang et al. 中国における糖尿病網膜症の有病率は1.14％と推定されている（Zhongら、2018年）（Songら、2018年）。破壊的かつ進行性の疾患であるDRは、その重症度に応じて非増殖糖尿病網膜症（NPDR）と増殖糖尿病網膜症（PDR）の2段階に分けられる（2016）（Mahajanら、2019）。現在、DRに対する治療戦略で、各DR患者の進行を一貫して抑制できるものはない。DRの全身的な危険因子には、血糖値の高値、血中脂質、血圧、糖尿病の疾患経過の長さ（Sumarrivaら、2019）（Cabreraら、2020）が含まれることが研究で示されているが、血糖値の高値と糖尿病の疾患経過の長さは、臨床現場で考慮すべき主な危険因子である（Jenkinsら、2015）（Cheungら、2014）。しかし、これら2つの因子だけでは、個人の糖尿病網膜症発症リスクを完全に予測することはできない。臨床の現場では、糖尿病の罹病期間や血糖コントロールのレベルが同程度の患者でも、糖尿病網膜症の臨床転帰が大きく異なる可能性がある。ごく軽度の網膜症を発症する患者もいれば、重度網膜症に著しくなりやすいと思われる患者もいる（Sunら、2011）（Gaoら、2014）（Touzaniら、2019）。この現象は、DRの背後に他の潜在的な発症因子が存在する可能性があり、DRの発生と進行を検出し制御するための効果的なマーカーがまだ不足していることを示している（Porta and Striglia, 2020）。したがって、DRの発生と発症を予測できる潜在的なバイオマーカーを探索し、DRのより良い予防と制御を可能にすることは非常に重要である（Tingら、2016；Pengら、2018）。DRに関するメタボローム研究は数多くあるが、DR発症の重要な時期（T2DM期およびNPDR期）における差次的代謝物の同定は、特にアジア人集団ではほとんど試みられていない。このギャップを解決し、DRの複雑な代謝状態をよりよく理解するために、我々は、DRを伴うT2DM患者と伴わないアジア人患者の血清において、LCMSによるアンターゲットメタボロミクスを実施した。本研究の目的は、アジア人のDRで変化する代謝物や代謝経路を同定すること、またNPDR患者とPDR患者の代謝の違い、特にT2DMからDRへのステージの違いを明らかにすることである。さらに、DR群（NPDRおよびPDR患者を含む）とT2DM群、DR群と非DR群（T2DMおよびコントロール患者を含む）の代謝の違いも比較した。このような代謝プロファイルの違いを明らかにすることは、DRとPDRの分子メカニズムの解明に役立ち、新たな治療標的の同定を容易にする。
材料と方法
倫理声明
本研究はヘルシンキ宣言を遵守し、北京大学人民病院倫理委員会の承認を得た。すべての参加者から署名入りのインフォームド・コンセントを得た。
研究参加者と研究デザイン
この前向き観察登録研究は、2020年12月から2021年7月にかけて北京大学人民病院眼科センターで実施された。合計618人の2型糖尿病患者をスクリーニングした。60人の患者コホートが北京大学人民病院眼科センターから無作為に募集された。糖尿病コントロール（n = 15）は糖尿病歴のない健常者であった。T2DM症例（n = 15）には、少なくとも10年間T2DMと診断され、網膜専門医による拡張眼底検査でDRの臨床徴候がないと判断された患者が含まれた。DR症例（n＝30）は、網膜専門医による拡張眼底検査でDRと診断されたT2DM患者であった。ETDRS（Early Treatment Diabetic Retinopathy Study）基準に従い、DRはDRなし、非増殖糖尿病網膜症（NPDR）、増殖糖尿病網膜症（PDR）の3つに分類した（Wilkinsonら、2003）（Wu、2013）。全患者は眼科的精密検査、カラー眼底写真、光干渉断層計（OCT）を受けた。カラー眼底写真とフルオレセイン血管造影（FA）は、FF 540 Plus（Carl Zeiss Meditech, Jena, Germany）またはOptos 200Tx（Optos plc, Dunfermline, Scotland, United Kingdom）を用いて撮影した。光干渉断層計（OCT）は、RTVue XR Avanti（Optovue, Fremont, CA, United States）またはCirrus HD-OCT 5000（Carl Zeiss Meditec Inc.） DRなし、NPDR（n=15）、PDR（n=15）の分類は、網膜専門医がカラー眼底写真、FFA、OCTを用いた拡張眼底検査で行った。潜在的な診断バイアスを避けるため、2人以上の眼科医が検査結果に基づいてDR状態を分類した。専門医間で見解の相違があった場合は、公開仲裁によって全関係者による最終診断の合意に達した。NPDRの診断は、拡張眼底検査でブロット出血、微小動脈瘤、綿毛斑、網膜内微小血管異常が認められ、活動性PDRの所見がなく、PDRの治療歴がないことに基づく。PDRの診断は、虹彩または網膜に新生血管が存在するか、または患者が治療を受けたPDRの既往歴が記録されていることに基づく。除外基準は、1）他の眼疾患（網膜変性症、緑内障、活動性眼炎症など）の存在または既往。 眼内手術歴（網膜硝子体手術、硝子体内注射、レーザー治療、外傷歴）； 2）がん、感染症、高尿酸血症、遺伝性代謝性疾患、精神障害、心不全、重症高血圧（収縮期血圧180mmHg以上または拡張期血圧110mmHg以上）、急性心筋梗塞、妊娠、肝疾患、脳卒中、その他の重症慢性全身疾患、3）眼底が鮮明に見えない角膜および水晶体の病態。
ベースライン検査/データ収集と定義
性別、年齢、過去の病歴、喫煙と飲酒の現状、糖尿病の罹病期間、臨床検査値、使用薬剤、病気の状態など、すべての参加者の人口統計学的情報と医療記録を入手した。患者は血圧、身長、体重測定を含む一般的な身体検査を受けた。全患者の体格指数（BMI）が算出され、記録された。空腹時血糖（FPG）、総コレステロール（TC）、トリグリセリド（TG）、高比重リポ蛋白コレステロール（HDL-c）、低比重リポ蛋白コレステロール（LDL-c）、血清クレアチニン（SCr）、ヘモグロビンA1c（HbA1c）、血中尿素窒素（BUN）などの血液検査値は、標準的な自動測定法を用いて測定され、電子症例報告用紙に記録された。投薬記録には、インスリン、メトホルミン、その他の抗糖尿病薬、ACE阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬、その他の降圧薬、スタチン、その他の脂質低下薬が含まれた。
採血と準備
少なくとも8時間の夜間絶食後、各試験参加者から21Gまたは23Gのバタフライ針を用いて完全無菌的予防措置のもとで6mlの静脈血サンプルをチューブで採取し、4℃で保存した。血清は、全血から血清を分離するために、30分以内に3,000rpm、10分間（4℃）の遠心分離によって分離され、その後、血清を直ちに凍結できるように-80℃の超低温で保存するために1.5mlの滅菌チューブに移された。よく訓練された専門技術者がさらに測定を行った。
非標的メタボロミクス分析
タンデム質量分析（UHPLC-MS/MS）分析は、Vanquish UHPLCシステム（Thermo Fisher、ドイツ）とOrbitrap Q Exactive™ HF質量分析計（Thermo Fisher、ドイツ）を用いて、Novogene Co. (Ltd.（中国、北京）で行った。分析前に、凍結血清サンプル（100μL）を解凍し、4℃で溶解し、エッペンドルフ（EP）チューブに入れ、よくボルテックスしてあらかじめ冷やした80％メタノールと0.1％ギ酸で再懸濁した。サンプルを氷上で5分間インキュベートし、4℃で15,000g、20分間遠心した。上清の一部をLC-MSグレードの水で53%メタノールを含む最終濃度に希釈した。その後、サンプルを新しいEPチューブに移し、15,000 g、4℃で20分間遠心した。最後に、上清をLC-MS/MSシステムに注入して分析した[22]。サンプルはHypesil Goldcolumn (100 × 2.1 mm, 1.9 μm)に0.2 ml/minの流速で17分間のリニアグラジエントを用いて注入した。正極性モードの溶離液は溶離液A（水中0.1％FA）と溶離液B（メタノール）、負極性モードの溶離液は溶離液A（5mM酢酸アンモニウム、pH9.0）と溶離液B（メタノール）であった。溶媒勾配は次のように設定した： 2%B、1.5分；2%-100%B、12.0分；100%B、14.0分；100%-2%B、14.1分；および2%B、17分。Q Exactive™ HF質量分析計は、正/負極性モードで、スプレー電圧3.2 kV、キャピラリー温度320℃、シースガス流量40 arb、補助ガス流量10 arbで操作した。品質管理（QC）サンプルは、各サンプルから同量の血清を混合し、試験サンプルと同じ手順で代謝物を抽出して調製した。QCは10検体ごとに1検体ずつ、操作の前後に定期的に挿入した。UHPLC-MS/MSで得られた生データファイルは、Compound Discoverer 3.1 (CD3.1, Thermo Fisher)を用いて処理し、各代謝物のピークアライメント、ピークピッキング、定量を行った。主なパラメータは次のように設定した：保持時間許容誤差0.2分、実質量許容誤差5ppm、シグナル強度許容誤差30％、シグナル/ノイズ比3、最小強度100,000。ピーク強度は全スペクトル強度に対して正規化した。付加イオン、分子イオンピーク、フラグメントイオンに基づいて、正規化されたデータを分子式の予測に使用した。ピークは mzCloud、mzVault、および MassList データベースとマッチングされ、正確な定性および相対定量結果が得られました。
メタボローム研究のためのデータ処理とパスウェイ解析
統計解析は、統計ソフトウェアR（RバージョンR-3.4.3）、Python（Python 2.7.6バージョン）、CentOS（CentOSリリース6.6）を用いて行った。正規分布していないデータの正規変換は、面積正規化法を用いて行った。これらの代謝物は、KEGG、HMDB、および LIPIDMaps データベースを使用してアノテーションされた。分布を決定するために部分最小二乗判別分析（PLS-DA）を含む多変量解析を使用し、metaX（メタボロミクスデータを処理するための柔軟で包括的なソフトウェア）で実行した。統計的有意性（p値）の算出には単変量解析（t検定）を用いた。これらの差の原因となる代謝物を選択するために、投影における変数重要度（VIP）、フォールド変化（FC）、p値を主に使用した。VIP値は潜在的なバイオマーカー候補を検出するための重要なパラメータであり、代謝物と異なる生物学的状態との相関を反映する。本研究では、PLS-DAのVIP値＞1.0を使用した。平均値間の差を分析する際は、p＜0.05を統計的に有意とみなした。一対比較には、統計ソフトRで計算したボンフェローニ補正を用いた調整p値を用いた。したがって、調整p値＜0.05でも有意とみなした。代謝物の相対値はfold change（FC）に変換し、各代謝物の生物学的反復定量値の全群平均値に対する比として定義した。FC＞1.2および＜0.833は、それぞれ有意にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた差分代謝物を示した。代謝物のlog2（FC）と-log10（p値）に基づいて、目的の代謝物をフィルタリングしてボルケーノプロットを計算し、2群間で統計的に有意な差を示したピークを用いて多変量パターン認識を行いました。ヒートマップのクラスタリングには、R言語のPheatmapパッケージを用い、差分代謝物の強度面積のzスコアを用いてデータを正規化し、プロットした。差分代謝物間の相関はR言語のcor() (method = Pearson)で解析した。差分代謝物間の統計的に有意な相関はR言語のcor.mtest（）で計算した。p値＜0.05を統計的に有意とみなし、相関プロットはR言語のcorrplotパッケージでプロットした。これらの代謝物および代謝経路の機能については、KEGGデータベースを用いて検討した。代謝パスウェイのp値が0.05未満を濃縮、0.05未満を統計的に有意な濃縮とみなした。
バイオインフォマティクス解析
人口統計学的変数および臨床変数の記述統計量を研究集団について計算した。分散分析（ANOVA）は、分散が均質な正規分布データの平均値を比較するために使用した。カテゴリーデータ（例、性別、合併症の有無）の解析にはカイ二乗検定を用いた。Wilcoxon順位和検定は、年齢、糖尿病罹病期間、およびFPG、HbA1c、HDL-c、LDL-c、SCr、TC、TG、BUNなどの生化学的パラメータを各群間で比較するために行われた。
結果
ベースラインの特徴
研究対象者の人口統計学的特徴を表1に示す。全参加者（60例）のうち、15例がT2DM患者（平均年齢73.53±7.54歳、男性40.0％）、15例がNPDR患者（平均年齢70.47±8.28歳、男性60.0％）、15例がPDR患者（平均年齢57.53±9.05歳、男性60.0％）、15例が対照（平均年齢64.07±15.15歳、男性46.7％）であった。T2DM患者および対照群と比較して、PDR患者は平均糖尿病罹病期間が長かったが（p＜0.001、p＜0.001）、NPDRとPDRの間、およびT2DMとNPDRの間には差は認められなかった。PDR群は他の群より有意に若かった（p＝0.028、p＜0.001、p＜0.001）。性別と体格指数（BMI）には群間で統計学的有意差は認められなかった。血清の分析では、対照群の空腹時血糖（p＝0.002、p＝0.001、p＝0.001）とHbA1c（p＜0.001、p＜0.001、p＜0.001）はT2DM、NPDR、PDR群に比べて有意に低かった。対照群、T2DM群、NPDR群の血清クレアチニンはPDR群より有意に低かった（p＝0.045、p＝0.012、p＝0.032）。PDR患者の血中尿素窒素は他の群より有意に高かった（p = 0.001, p < 0.001, p = 0.001）。HDL-c値、LDL-c値、総コレステロール値、トリアシルグリセロール値、高血圧率には群間で統計学的有意差は認められなかった（表1）。
表1
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表1. 各群の人口統計学、合併症、血清検査結果。
代謝物同定分析
アジア人集団におけるコントロール（n＝15）、T2DM患者（n＝15）、NPDR患者（n＝15）、PDR患者（n＝15）間で、どの代謝特徴が異なるかを明らかにするために、メタボロームワイド関連研究（MWAS）を実施した。さらに、DR群（NPDR群、PDR群）とT2DM群、DR群（NPDR群、PDR群）と非DR群（T2DM群、コントロール群）のメタボロミクス比較解析も行った。アンターゲットメタボロミクス解析により、931の代謝機能（ポジティブモード523機能、ネガティブモード408機能を含む）が検出された。MSフラグメントパターンを市販の標準化合物と比較することにより、合計102の共通代謝物が同定され、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)、Human Metabolome Database (HMDB)、LIPIDMapsデータベースなどの様々なデータベースが選択された。その結果、群間で有意差のある代謝物として、アミノ酸30種、水酸基化合物7種、カルボン酸4種、カルニチン5種、脂肪酸17種、胆汁酸5種、炭水化物8種、プリンおよびピリミジン化合物5種、フェノール類3種、リゾホスファチジン酸6種が同定された。これらの代謝物に関する詳細情報を図1に示す。階層的クラスタリング解析（HCA）により、代謝物含有量のグループ間クラスタリングの関係が示された。ポジティブモード、ネガティブモードともに、コントロール群、T2DM群、PDR群で同定された代謝物は、サンプルのクラスターがわずかに重複しているにもかかわらず、グループ内で区別可能なクラスターを示した（図2）。
図1
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図1. 代謝物の分類解析。円グラフは、アミノ酸（29.4％）、脂肪酸（16.7％）、ヒドロキシル化合物（6.9％）、炭水化物（7.8％）、リゾホスファチジン酸（5.9％）、カルニチン（4.7％）、胆汁酸（4.7％）、プリンおよびピリミジン化合物（4.7％）カルボン酸（3.7％）、フェノール（3.7％）、その他（11.8％）を含む60代謝物を示す。これらの代謝物の中で最も高い割合（102個中30個）を占めたのはアミノ酸であった。
図2
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図2 （A）ポジティブモード。(B）ネガティブモード。階層的クラスタリング解析（HCA）により、同定された代謝物は高い再現性で対照群、T2DM群、PDR患者群に明確に分類され、得られたデータは信頼性が高く論理的であることが示されました。有意な代謝の特徴は、他のグループと比較して増加（赤）または減少（青）した。
非増殖糖尿病と2型糖尿病の比較
PLS-DAおよび調整線形回帰分析（p < 0.05）に基づき、調整分析においてNPDR患者とT2DM患者の間で有意差のある代謝特徴が93個（陽性モード40個、陰性モード53個）存在した。これらの特徴は、階層的クラスタリング解析を用いて比較された（図3）。ボルケーノマップは、代謝産物のlog2（FC）と-log10（p値）に基づいて、ポジティブモードとネガティブモードにおけるNPDR患者とT2DM患者の違いを可視化した（図4）。mzCloud、mzVault、または MassList データベースでマッチングできなかった代謝物の特徴を除くと、26 および 41 の代謝物が NPDR 対 T2DM の良好な識別力を示し、陽性モードおよび陰性モードで曲線下面積 (95% CI) が 0.7 以上であった。NPDR患者とT2DM患者を区別する67の特徴を用いて、VIP＞1.0、AUC＞0.7のKEGG濃縮パスウェイ解析を行った。その結果、22の代謝パスウェイが濃縮され、そのうち3つ（d-グルタミンとd-グルタミン酸の代謝、リノール酸、窒素）はp値≦0.05の有意なKEGG濃縮パスウェイと考えられた。アルギニン生合成、一次胆汁酸生合成、α-リノレン酸代謝、ヒスチジンを含む他のパスウェイを表2および補足図S1に示す。グルタミン酸（p = 0.036、AUC = 0.733）、ホスファチジルコリン（p = 0.022、AUC = 0.740）、13-ヒドロペルオキシオクタデカ-9,11-ジエノイン酸（13-HPODE）（p = 0.002、AUC = 0.835）など、MSI（Metabolomics Standards Initiative）で確認された経路の違いに重要な寄与をした代謝物は、NPDR被験者で顕著な増加を示した（図5）。
図3
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図3 （A）ポジティブモード。(B）ネガティブモード。PLS-DAにより選択された有意な代謝物特徴の強度に基づく階層的クラスタリング解析により、NPDRおよびT2DM患者において増加（赤）または減少（青）した特徴のクラスタが同定された。ポジティブモードで示された代謝の特徴は40個、ネガティブモードで示された代謝の特徴は53個ある。
図4
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図4 （A）ポジティブモード。(B）ネガティブモード。log2(FC)と-log10(p値)のボルケーノマップは、93の特徴がNPDR患者(n=15)とT2DM患者(n=15)の間で有意に異なることを示している。T2DM患者と比較してNPDR患者で増加（赤い点）または減少（緑の点）した有意な代謝特徴を示し、点の大きさはVIP値を表す。ポジティブモードでは、T2DM患者と比較して、NPDR患者では12の代謝特徴が有意に増加し、14の代謝特徴が有意に減少した。ネガティブモードでは、T2DM患者と比較して、NPDR患者では35の代謝特徴が有意に増加し、6つの代謝特徴が有意に減少した。
表2
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表2. T2DM患者と比較してNPDR患者で変化したKEGG濃縮パスウェイ。
図5
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図5. NPDR患者では、(A)グルタミン酸、(B)ホスファチジルコリン、(C)13-ヒドロペルオキシオクタデカ-9,11-ジエノイン酸の血清レベルが上昇していた。パスウェイ解析で濃縮された代謝物をさらにp≤0.05でLC-MS/MSを用いて解析したところ、グルタミン酸（p = 0.036、AUC = 0.733、VIP = 1.054）、ホスファチジルコリン（p = 0. 022、AUC = 0.740、VIP = 1.581）、および13-ヒドロペルオキシオクタデカ-9,11-ジエン酸（p = 0.002、AUC = 0.835、VIP = 2.622）レベルは、T2DM患者と比較してNPDR患者で有意に増加した。AUC、曲線下面積。
増殖性DRと2型糖尿病の比較
PDRとT2DMの間で異なる代謝的特徴を決定するために、PDR患者（n＝15）とT2DM患者（n＝15）を比較するMWASが行われた。調整後の解析では、VIP＞1.0のPLS-DAと調整後の線形回帰分析に基づいて、PDR群とT2DM群を区別する259の特徴が同定された（p＜0.05）。階層的クラスタリング解析によると、T2DM群とNPDR群間およびT2DM群内には、それぞれ陽性モード118個、陰性モード141個の代謝特徴が存在した（図6）。代謝産物のlog2（FC）と-log10（p値）に基づくボルケーノマップは、ポジティブモードとネガティブモードにおけるPDR患者とT2DM患者の違いを可視化した（図7）。ポジティブモードとネガティブモードでは、それぞれ63代謝物と108代謝物がPDRとT2DM被験者の良好な識別力を示し、曲線下面積（95％CI）＞0.7であった。KEGG濃縮パスウェイ解析では、PDR患者とT2DM患者の171の特徴から39の代謝パスウェイが濃縮され、そのうち9つ（アルギニン生合成、リノール酸、アラニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸の代謝、d-グルタミンおよびd-グルタミン酸、アミノアシルtRNA生合成、ブタン酸、窒素、ヒスチジン、トリカルボン酸サイクル）がp値≦0.05の有意なKEGG濃縮パスウェイと考えられた。 05. その他のパスウェイには、不飽和脂肪酸の生合成、グルタチオン代謝、グリオキシル酸およびジカルボン酸代謝が含まれた（表3および補足図S2）。T2DMと比較して、PDR被験者では経路の違いに大きく寄与する代謝物が顕著に増加しており、アスパラギン酸（p = 0.001、AUC = 0.996）、グルタミン酸（p = 1.70E-05、AUC = 0. 916）、グルタミン（p = 6.43E-05、AUC = 0.876）、オルニチン（p = 9.50E-04、AUC = 0.827）、2-オキソグルタル酸（p = 0.007、AUC = 0.822）、N-アセチル-L-グルタミン酸（p = 0.002、AUC = 0.871）、N-アセチル-L-アスパラギン酸（p = 0.004、AUC = 0. 813）、クエン酸（p = 0.011、AUC = 0.813）、ホスファチジルコリン（p = 0.001、AUC = 0.871）、13-HPODE（p = 0.001、AUC = 0.796）、メチオニン（p = 0.001、AUC = 0.840）、リジン（p = 0.001、AUC = 0.831）、スレオニン（p = 0. 002、AUC = 0.836）、フェニルアラニン（p = 0.010、AUC = 0.751）、N-（L-アルギニノ）コハク酸（p = 0.026、AUC = 0.796）、コハク酸（p = 0.030、AUC = 0.711）、N（π）-メチル-L-ヒスチジン（p = 0.031、AUC = 0.716）であった。逆に、リノール酸レベルはPDR被験者で有意に低かった（p = 5.31E-04、AUC = 0.871）（補足図S3）。
図6
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図6 （A）ポジティブモード。(B）ネガティブモード。PLS-DAにより選択された有意な代謝物特徴の強度に基づく階層的クラスタリング解析により、PDRおよびT2DM患者において増加（赤色）または減少（青色）した特徴のクラスタが同定された。ポジティブモードで示された代謝特徴は141個、ネガティブモードで示された代謝特徴は118個であった。
図7
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図7 （A）ポジティブモード。(B）ネガティブモード。log2(FC)と-log10(p値)のボルケーノマップは、259の特徴がPDR患者(n=15)とT2DM患者(n=15)の間で有意に異なることを示した。T2DM患者と比較してPDR患者で増加（赤い点）または減少（緑の点）した有意な代謝特徴を、VIP値を表す点の大きさで示した。ポジティブモードでは、T2DM患者と比較して、PDR患者では39の代謝特徴が有意に増加し、24の代謝特徴が有意に減少した。陰性モードでは、T2DM患者と比較して82の代謝特徴が認められた。
表3
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表3. PDR患者でT2DM患者と比較して変化したKEGG濃縮パスウェイ。
増殖性DRと非増殖性DRの比較
VIP＞1.0のPLS-DAおよび調整線形回帰分析（p＜0.05）に基づいて、PDR患者（n＝15）とNPDR患者（n＝15）の間で合計122の代謝的に区別可能な特徴が検出された。階層的クラスタリング解析では、陽性モードで61、陰性モードで61の区別可能な代謝特徴があった（図8）。代謝産物のlog2（FC）と-log10（p値）によると、ボルケーノマップはPDR患者とNPDR患者の陽性および陰性パターンにおける差異代謝産物のアップレギュレーションとダウンレギュレーションをより直感的に表示することができた（図9）。曲線下面積（95％CI）が0.7を超える陽性および陰性モードでは、それぞれ31代謝物および48代謝物がPDR患者とNPDR患者の良好な識別力を示した。VIP > 1.0およびAUC > 0.7を有する79の差次代謝物を用いたKEGG濃縮パスウェイ解析により、アルギニン生合成代謝、アラニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸代謝、d-グルタミンおよびd-グルタミン酸代謝、不飽和脂肪酸の生合成、ならびにパントテン酸およびCoAの生合成における濃縮が同定された（表4および補足図S4）。これらの経路の濃縮に寄与した代謝物についてWilcoxon順位和検定を行い、主要代謝物の優先順位を決定した。NPDR患者と比較して、PDR患者では、アスパラギン酸（p = 0.004、AUC = 0.853）、グルタミン（p = 6.73E-04、AUC = 0.840）、N-アセチル-L-グルタミン酸（p = 0.028、AUC = 0.702）、N-アセチル-L-アスパラギン酸（p = 0.021、AUC = 0.707）、およびパントテン酸（p = 0.025、AUC = 0.729）を含む5つの主要因子が有意に増加した。 729）が有意に増加し、ジホモ-γ-リノレン酸（p = 5.65E-04、AUC = 0.849）、ドコサヘキサエン酸（p = 0.005、AUC = 0.809）、イコサペンタエン酸（p = 0.012、AUC = 0.747）レベルを含む3つの主要因子が有意に低下した（補足図S5）。
図8
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図8 （A）ポジティブモード。(B）ネガティブモード。VIP＞1.0でPLS-DAにより選択された有意な代謝物特徴の強度に基づく階層的クラスタリング解析により、PDR患者とNPDR患者で増加（赤）または減少（青）した特徴のクラスタが同定された。ポジティブモードで示された代謝の特徴は61個、ネガティブモードで示された代謝の特徴は61個ある。
図9
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図9 （A）ポジティブモード。(B）ネガティブモード。代謝物のlog2（FC）と-log10（p値）に基づいて、ボルケーノマップは122の特徴がPDR患者（n = 15）とT2DM患者（n = 15）の間で有意に異なることを示した。NPDR患者と比較してPDR患者で有意に高い（赤い点）または低い（緑の点）代謝特徴を示し、点の大きさはVIP値を表す。ポジティブモードでは、NPDR患者と比較して、PDR患者では20の代謝特徴が有意に増加し、11の代謝特徴が有意に減少した。ネガティブモードでは、NPDR患者と比較して、PDR患者では33の代謝特徴が有意に増加し、15の代謝特徴が有意に減少した。
表4
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表4. PDR患者においてNPDR患者と比較して変化したKEGG濃縮パスウェイ。
さらに、DR患者（NPDRおよびPDR患者を含む）（n＝30）とT2DM患者（n＝15）、DR患者（NPDRおよびPDR患者を含む）（n＝30）と非DR患者（T2DM患者および糖尿病対照を含む）（n＝30）間の差分代謝物をグループ分けして解析した。PLS-DAおよび調整線形回帰分析に基づく調整分析（p＜0.05）では、DR対T2DMおよびDR対非DRにおいて、それぞれ209および198の区別可能な代謝特徴が検出された。ボルケーノマップにおける曲線下面積（95％CI）＞0.7で、138代謝物および133代謝物が、DR対T2DM被験者およびDR対非DR被験者に対して、それぞれ良好な識別力を示した（図10）。KEGG濃縮パスウェイ解析では、DR対T2DMおよびDR対非DRの両方で有意な濃縮を示したパスウェイは、アルギニン生合成、アラニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸代謝、リノール酸代謝、d-グルタミンおよびd-グルタミン酸代謝であった（表5および補足図S6）。その他の経路としては、DR対T2DMではアミノアシルtRNA生合成（p = 0.005）および窒素代謝（p = 0.017）、DR対非DRではブタン酸代謝（p = 0.017）が挙げられた。DR患者とT2DM患者との間のこれらの経路の違いに寄与する主要な因子は12個あり、そのうちの11個（グルタミン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、13-HPODE、アスパラギン酸、N-(L-アルギニノ)コハク酸、スレオニン、メチオニン、ホスファチジルコリン、オキソグルタル酸、グルタミン、オルニチン）はDR患者で有意に増加したが、エイコサトリエン酸のレベルだけがDR患者で減少した。非DR患者と比較して、6つの主要因子（グルタミン酸、アスパラギン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、13-HPODE、ホスファチジルコリン、3-ヒドロキシブタン酸）は、DR患者で有意に増加した。
図10
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図10（A）DR（NPDRとPDRを含む）とT2DMの陽性モード。(B）DR（NPDRとPDRを含む）とT2DMの陰性比較。(C）ポジティブモードにおけるDRと非DRの比較。(D）陰性モードにおけるDR対非DR。代謝物のlog2（FC）および-log10（p値）に基づくボルケーノマップでは、代謝物の特徴が有意に増加（赤い点）または減少（緑の点）した。(A)および(B)ボルケーノマップでは、DR患者(n = 30)とT2DM患者(n = 15)の間で、それぞれ96および113の特徴が陽性および陰性モードで有意に異なっていた。(C)と(D)のボルケーノマップでは、DR患者(n=30)と非DR患者(n=30)の間で、それぞれ112特徴と86特徴が陽性と陰性で有意に異なっていた。
表5
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表5. DR対T2DMおよびDR対非DRの両方で変化したKEGG濃縮パスウェイ。
考察
多因子疾患の複雑な内因性代謝表現型を同定するために、メタボロミクスは、異なるソースからの病的要因の影響や疾患の病態生理学的状態を反映できる強力なツールである（Alshehryら、2016）（Mapstoneら、2014）（Zuoら、2021）（Baharum and Azizan、2018）（Chenら、2016）。
我々の研究では、PDR対T2DM、PDR対NPDR、DR対T2DM、DR対非DRにおいて、アルギニン生合成とアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸代謝の代謝経路が主要な特異的代謝経路として同定された。同様の結果は、硝子体液の液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）に基づくメタボロミクス研究（Paris et al.） 糖尿病患者やさまざまな実験動物モデルを対象とした数多くの研究により、糖尿病が誘発する酸化ストレス、炎症、血管機能障害における尿素サイクルとアルギニン代謝の重要性が実証されている（Sumarrivaら、2019）（Caoら、2019）（Caldwellら、2018）。アルギニン代謝は複雑なプロセスである。非タンパク質アミノ酸としてのオルニチンは、アルギニン-プロリン代謝の中間体であり、尿素サイクルの中核部分である（Tongら、2018）。我々の所見と一致して、Zuoらは血清オルニチンの強度がDRのオッズ上昇と正の相関があることを検出した（Zuoら、2021）。我々の知る限り、DRにおけるオルニチンの機序はこれまで検討されていない。オルニチンは、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）経路の基質であり、ODC/ポリアミン系を調節することにより、さまざまなポリアミンを産生する。また、コラーゲン形成に重要な成分であるプロリンを生成するためのオルニチンアミノトランスフェラーゼ（OAT）の基質でもある（Morris, 2016）。高血糖状態では、アルギニンはアルギニンII酵素（Arg-II酵素）によってオルニチンと尿素を産生する。オルニチン濃度の上昇は、2型糖尿病におけるミクログリアやマクロファージが介在する慢性炎症傷害に関与するArg-II酵素の活性上昇を示す（Narayananら、2014）。一方、Arg-II酵素の活性上昇は、主に一酸化窒素を産生する一酸化窒素合成酵素（NOS）経路の活性を低下させた。一酸化窒素の欠乏とポリアミンとプロリン濃度の上昇は、内皮細胞の機能不全、血管拡張機能の低下、細胞増殖と線維化の誘発を引き起こす可能性がある（Stehouwer, 2018）。このことがDRの発生と発症に密接に関係しているのではないかと推測した。一方、糖尿病網膜症における血清グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸の代謝的役割は明らかにされていない。2021年の関連研究では、空腹時血糖低下、糖尿病性細小血管合併症、糖尿病性末梢血管疾患を有する患者の病態は、血清グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸代謝と高い相関があることが報告された（Liら、2021年）。別の研究では、非糖尿病患者と比較した糖尿病患者において、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸を含む血清アミノ酸のパターンが同様に変化していることが報告されている（Zhouら、2013）。
NPDR対T2DM、PDR対T2DM、PDR対NPDRの比較で強調されたもう1つの経路は、d-グルタミンおよびd-グルタミン酸代謝であった。グルコースからリンゴ酸-アスパラギン酸シャトルを介して誘導されるグルタミン酸は、インクレチン誘導性インスリン分泌の基礎となるシグナル（Gheniら、2014年）であるだけでなく、脳、脊髄、網膜における主要な興奮性神経伝達物質（Takahashiら、2019年）（Liewら、2017年）であり、これがさらに酸化組織の損傷とフリーラジカルレベルの上昇をもたらす（Duら、2018年）。さらに、グルタミン酸に対するグルタミンの比率および血清グルタミン濃度は、様々な細胞機能やインスリン抵抗性と密接に関連している（Gheniら、2014）（Jenstad and Chaudhry、2013）（Chengら、2012）。DRにおける血清グルタミンとグルタミン酸の役割はまだ解明されていない。しかし、糖尿病が進行すると、網膜にグルタミン酸が蓄積し、神経毒性作用が生じ、シナプス後神経細胞に制御不能な細胞内カルシウム応答が生じ、DRの発症と細胞死が加速されることを指摘する証拠もある（Coughlinら、2017）（Narayananら、2019）（Liethら、2000）。糖尿病網膜症の血清標的メタボロミクス研究において、Rheeらは、グルタミンとグルタミン酸の血清レベルとその比が、T2DMにおけるDRを予測するための新規バイオマーカーとなる可能性を示した。さらに、グルタミンとグルタミン酸は、DRにおいて最も特異的な代謝物と考えられた（Rhee et al.） これらの結果は、我々の知見と一致していた。
通常、多価不飽和脂肪酸は網膜で高発現し、神経保護、血管内皮増殖因子発現の調節、網膜新生血管形成の抑制、網膜血管炎症によるペリサイト消失の予防、網膜毛細血管の構造と完全性の維持など、多くの生物学的プロセスを制御している（Sasaki et al.） 多価不飽和脂肪酸とDRの関係に関する研究では、多価不飽和脂肪酸の増加はDRと負の相関があり、DRの独立した保護因子であることが示唆された（Liら、2020）（Zuoら、2021）。しかし、血清のメタボロミクス研究では、リノール酸とアラキドン酸の強度に、DR患者と糖尿病コントロールの間に有意差はないと報告されている（Chenら、2016）。糖尿病患者における多価不飽和脂肪酸組成の減少が、脂質過酸化の増加によるものなのか、脂質合成や循環の変化によるものなのかは、まだ明らかでない（Augustine et al.） 本研究では、NPDRとT2DM、PDRとT2DM、DRとT2DM、DRと非DRを比較することで、リノール酸代謝経路を明らかにした。
我々の知る限り、本研究は、アジア人集団において、ホスファチジルコリンと13-PHODEの血清レベルが2型糖尿病の糖尿病網膜症の異なる病期と密接に関連していることを確認した最初の研究であった。我々の研究では、ホスファチジルコリンおよび13-PHODEレベルは、T2DMおよび非DR患者と比較して、DR患者で有意に上昇していた。糖尿病網膜症におけるホスファチジルコリンの病態に関する関連研究は今のところないが、ハーバード大学の大規模前向き研究では、ホスファチジルコリンの摂取量が多いほど2型糖尿病のリスクが上昇することが明らかになった（Liら、2015年）。さらに、2型糖尿病に関連する血清代謝物を同定するために標的メタボロミクスを用いた研究では、アミノ酸やコリン作動性リン脂質などの代謝変化が、初期の2型糖尿病リスクと高度に関連していることが示された（Floegel et al.） しかし、1型糖尿病の糖尿病網膜症に関する非標的血清リピドミクス解析では、5つの主要脂質のうちホスファチジルコリンを含む104脂質がDRの悪性度と負の相関を示した（Curovic et al.） この我々の結果との相違は、参加者の糖尿病のタイプや国籍の違いによるものかもしれない。糖尿病性網膜症の発症における13-PHODEの機序は今のところ明らかにされていないが、13-PHODEは動物モデルにおいて炎症反応を誘導することが分かっており、特に分化した腸上皮細胞において、in vitroでTNF-αおよびMCP-1の炎症性遺伝子発現を有意に誘導する可能性がある（Keewan et al.） 13-PHODEがミトコンドリア機能障害関連疾患に関与している可能性も報告されている（Faizoら、2021）。我々の知見を確認するためには、さらなる研究が必要である。
微量代謝物に関しては、T2DM患者と比較して、NPDR患者ではグルタミン酸、ホスファチジルコリン、13-PHODEが有意に増加していた。これらの代謝物の存在は、糖尿病患者における眼病変の発現がT2DM期からDR期に移行する可能性を示唆していると考えられる。さらに、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、N-アセチル-L-グルタミン酸、N-アセチル-L-アスパラギン酸の血清中濃度の上昇、ジホモ-γ-リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、コサペンタエン酸の血清中濃度の低下は、PDR患者とNPDR患者の鑑別代謝物として用いることができる。これらの所見から、PDRへの移行を避けるためには、これらの代謝物プロファイルに差がある糖尿病患者をより注意深く観察する必要があることが示唆された。今回の知見は、DR患者の管理およびDR患者に対する新規治療法の開発に新たな知見を与える可能性がある。
本研究の長所は、同じ施設から登録されたアジア人のDR患者と対照糖尿病患者からなるコホートと、標準化された検体採取と処理である。本研究に登録された患者はすべて同じ地域の患者であったため、これらの結果の一般化可能性はまだ定かではないが、本研究で見出された主なDR代謝経路は、欧米諸国におけるDRの血清メタボローム解析とほぼ一致していた。近年、糖尿病網膜症の血清非標的メタボローム研究が4件あり、そのうち3件はLC-MSによる解析（Zuoら、2021年；Sumarrivaら、2019年；Zhuら、2019年）、1件はガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）を用いた解析（Rheeら、2018年）であった。本研究で使用した非標的高分解能LC-MSは、食事、ライフスタイル、薬物、性別の影響を受ける高感度な技術であり、生体内の核酸、タンパク質、脂質、その他の低分子などのすべての内因性代謝物の全体的な動的変化を反映することができる。これらの交絡因子の影響を最小化するために、登録患者の人口統計学的情報と併存疾患を詳細に記録した。Zhuらによる中国のDR患者の血清アンターゲットメタボロミクスに関する先行研究では、PDRの潜在的バイオマーカーとしてフマル酸、ウリジン、酢酸、シチジンを含む4つの差分代謝物と、NPDR患者と比較してPDR患者で有意に濃縮された9つのKEGGパスウェイが同定された（Zhuら、2019）。我々の研究ではさらに、NPDR患者とT2DM患者、PDR患者とT2DM患者、DR患者と非DR患者の違いを分析した。しかし、代謝物の同定を決定し、非標的研究からの潜在的な交絡因子を防ぐためには、より大きなサンプルサイズと標的メタボロミクス検証による研究が必要である。我々の知る限り、この非標的メタボロミクス研究は、アジア人集団におけるPDRとNPDRの代謝プロファイルを具体的に比較し、アジア人集団におけるDR患者とT2DM患者、およびDR患者と非DR患者の代謝的差異を解析した最初の研究である。結論として、このメタボローム解析は、アジア人集団のDR発症において、アルギニン代謝、リノール酸代謝アラニン代謝、アスパラギン酸代謝、グルタミン酸代謝、d-グルタミン酸代謝が調節異常であることを示している。これらの経路と代謝異常がDRの発症と進行に果たす役割を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
データ利用声明
本論文の結論を裏付ける生データは、著者らにより不当な予約なしに入手可能である。
倫理声明
ヒトを対象とした研究は、北京大学人民病院により審査され、承認された。患者／参加者は、本研究への参加について書面によるインフォームド・コンセントを提供した。本論文に含まれる個人を特定できる可能性のある画像やデータの公表については、本人から書面によるインフォームド・コンセントを得た。
著者貢献
ZWは本著作の草稿を作成し、重要な知的内容について批判的に修正し、内容の公表を承認した。JTは、重要な知的内容について批判的に修正した。EJ、YZ、LZ、YC、JH、XS、HQ、TQ、LY、XH、HY、JL、MZは、本論文のデータ収集、分析、解釈を行った。LHとJQは、本著作の正確性や完全性に関する疑問が適切に調査され、解決されるよう、本著作の全側面について責任を負うことに同意した。
資金提供
本研究は、北京・天津・河北特別プロジェクト（助成金番号J200014）、中国首都臨床診断治療技術研究実証応用プロジェクト（助成金番号Z191100006619029）、中国医学科学院科学技術革新プロジェクト（2019-RC-HL-019）、中国国家自然科学基金（助成金番号81670870）の支援を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の作成には一切関与していない。
利益相反
著者らは、潜在的な利益相反と解釈されるような商業的または金銭的関係がない中で研究が実施されたことを宣言する。
出版社ノート
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または支持されるものではない。
補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmolb.2022.871291/full#supplementary-material。
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キーワード 2型糖尿病、増殖糖尿病網膜症、非増殖糖尿病網膜症、メタボロミクス、非標的メタボロミクス、代謝プロファイリング、LC-MS
引用 Wang Z, Tang J, Jin E, Zhong Y, Zhang L, Han X, Liu J, Cheng Y, Hou J, Shi X, Qi H, Qian T, Yuan L, Hou X, Yin H, Liang J, Zhao M, Huang L and Qu J (2022) Serum Untargeted Metabolomics Reveal Potential Biomarkers of Progression of Diabetic Retinopathy in Asians. Front. Mol. Biosci. 9:871291.
受理された： 15 February 2022; Accepted: 25 April 2022；
発行：2022年06月09日
編集者
イェ・スン、ボストン小児病院・ハーバード大学医学部、米国
査読者
キャロライン・ヴォルペ、サンタ・カサBH教育研究所、ブラジル
Cheng Guo、浙江大学、中国
Copyright © 2022 Wang, Tang, Jin, Zhong, Zhang, Han, Liu, Cheng, Hou, Shi, Qi, Qian, Yuan, Hou, Yin, Liang, Zhao, Huang and Qu. これはクリエイティブ・コモンズ 表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事である。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。
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