免疫調節酵素インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼは、そのアポ型を標的とすることで効果的に阻害される

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Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Mar 27; 115(13)： 3249-3254. オンライン公開 2018年3月12日. doi: 10.1073/pnas.1719190115
PMCID: PMC5879690PMID: 29531094
免疫調節酵素インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼは、そのアポ型を標的とすることで効果的に阻害される

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5879690/

Micah T. Nelp, a Patrick A. Kates, a John T. Hunt, b John A. Newitt, c Aaron Balog, d Derrick Maley, b Xiao Zhu, c Lynn Abell, e Alban Allentoff, f Robert Borzilleri, d Hal A. Lewis, c Zeyu Lin, e Steven P. Seitz, d Chunhong Yan, c and John T. Grovesa,1
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意義
インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO1）は、トリプトファンのジオキシゲナーゼ活性を触媒するヘム蛋白質である。この活性を発現している細胞は、周囲の環境を大きく変化させ、免疫反応を抑制することができる。がん細胞はこの経路を悪用して、免疫介在性の破壊を回避する。われわれは、さまざまな速度論的、構造的、細胞的アッセイを通して、IDO1の高選択的阻害剤の2つのクラスが、アポIDO1へのヘム結合と競合することによって作用することを示した。このことは、IDO1がヘム補酵素と動的に結合していることを示しており、この酵素の制御における重要なステップである可能性が高い。これらの結果は、免疫制御におけるユビキタスなヘム補酵素のこれまで発見されていなかった役割を明らかにし、生物学における他のヘムタンパク質も同様に制御されている可能性を示唆している。

キーワード IDO1、ヘム、がん、キヌレニン
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ABSTRACT
癌細胞が生存し増殖するためには、正常な免疫破壊から逃れる必要がある。これが達成されるメカニズムの一つは、トリプトファンのN-ホルミルキヌレニンへの酸化を触媒するヘム酵素であるインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO1）のアップレギュレーションによる免疫抑制である。脱ホルミル化されると、キヌレニンとその下流の代謝産物はT細胞の機能を抑制する。この免疫抑制メカニズムの重要性により、IDO1阻害剤の臨床開発に対する関心が高まっている。本論文では、一群の化合物がIDO1のアポフォームを標的とすることにより、IDO1を効果的かつ特異的に阻害するメカニズムについて述べる。われわれは、in vitroにおける阻害の速度論が、特に第二鉄型において、酵素-ヘム間の本質的な解離速度が異常に速いことと一致することを示した。阻害剤-酵素複合体のX線結晶構造から、これらの化合物によってヘムが酵素から脱離し、再結合が阻害されることが示された。この結果は、アポ型IDO1が阻害のユニークな標的であること、そしてヘムの不安定性が翻訳後制御に重要な役割を果たしていることを明らかにした。

多細胞生物は、自己免疫を防ぎながら、外来細胞や異常細胞を排除するという、非常に複雑なプロセスを課せられている。この微妙に調整されたバランスは、多くの場合、中枢代謝に関わる酵素によって媒介されており、免疫制御の太古からの起源と強い選択圧を反映している(1)。インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO1）はそのような酵素の一つで、必須アミノ酸であるトリプトファンを酸化してN-ホルミルキヌレニンを生成し、さらに加水分解されてキヌレニンとなる(2, 3)。この酵素は多くの組織に存在し、炎症、特にIFN-γなどのサイトカインや細菌のリポ多糖の存在に反応して発現が上昇する(4, 5)。IDO1を発現している細胞は、代謝的に高価な基質であるトリプトファンを炎症環境から除去し、免疫標的の増殖を抑制することができる(6, 7)。

IDO1は免疫抑制酵素としても機能する。代表的な論文では、胎盤組織で高発現していることが知られていたIDO1が、母体の免疫反応から胚を守るために必須であることが示された。IDO1阻害剤である1-メチル-トリプトファンは、母体の免疫反応を引き起こす可能性のある胎児の拒絶反応を引き起こしたが、母体に近縁で、したがって免疫反応を引き起こす可能性の低い胎児は生き残った(8)。一つの酵素がこのような複雑な免疫行動を媒介するという驚くべき能力は、その後深く研究され、この酵素が免疫調節に影響を及ぼす多様なメカニズムが明らかになった。

IDO1の発現は、低トリプトファンと高濃度のキヌレニンの複合効果によって、周囲の免疫細胞を不活性化する(1, 9)。T細胞は低トリプトファン濃度に対して特に感受性が高く、細胞周期停止を起こす(10)。さらに、IDO1の産物の下流代謝物は、アリール炭化水素受容体の強力な活性化因子であり、これを介して免疫細胞のアポトーシスが開始される(11)。IDO1はさらに、炎症プロセスによって引き起こされる酸化ストレスから保護することが示されている(12)。

正確な免疫調節におけるIDO1の重要性は、自己免疫疾患、感染症への応答、移植における寛容、HIV感染、血圧調節など、様々な過程や病態におけるその作用によって強調されている(13-15)。この調節／調節不全は、おそらく、免疫破壊を回避するためにIDO1の免疫抑制能を共用しているがん細胞において、最も不吉に現れている(16-18)。がんにおけるIDO1の転写制御は、しばしばBin1リプレッサーの変異によって変化し、IDO1のレベルが大幅に上昇する(19)。IDO1活性が高い腫瘍は予後不良と関連している(20)。従って、IDO1はほとんど全ての癌の治療における主要な標的であり、IDO1を阻害することで、単独で、あるいは他の治療法と併用して、癌細胞を除去する免疫系の能力を回復させることができる(17)。IDO1の免疫抑制作用は、持続的な細菌感染にも関与しており、IDO1阻害が感染の除去を助けることが示されている(21)。

IDO1のメカニズムは逐次的な酸素挿入反応によって進行し、分子状酸素が第一鉄のヘムに結合し、アルキルペルオキソ中間体を介してトリプトファンのC2-C3二重結合を越えて付加し、フェリル化合物II構造のヘム上に残された分子状酸素の第二原子を持つエポキシドを生成する。次に、このIDO1フェリルがエポキシドを攻撃し、酸素-鉄結合を切断し、鉄を還元して第一鉄の静止状態に戻すと提唱されている(22-24)。この驚くべきフェリルによるエポキシドへの攻撃は、反応速度を決定するステップではないため、完全には解明されていないが、他の酵素における化合物IIの反応性と多様性が最近明らかになったことと一致する(25-27)。

他のヘムタンパク質と同様に、IDO1は基質模倣物質やヘム結合能を持つ化合物などの競合的阻害剤に弱い(28-31)。しかし、この戦略は、医薬品として望ましい特異性とナノモル単位の結合親和性を持つ阻害剤が少ないことに悩まされてきた(32)。この長年のパラダイムに対する例外として、ヘム鉄に直接結合せずに酵素に結合するものが最近報告されている(33)。我々は、IDO1に対して良好な特異性と強固な阻害作用（化合物1および2について、それぞれHeLa細胞IC50 = 4.2および0.50 nM）を示す2つのクラスの阻害剤のユニークな阻害様式を調べたので報告する（SI Materials and Methods）(34)。

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IDO1のヘム補酵素は不安定である
化合物1および2（図1A）によるIDO1阻害のメカニズムは、リコンビナントヒトIDO1を用いた活性アッセイを用いて調べた。化合物 1 と 2（後者は現在第Ⅱ相臨床試験中）は構造的に異 なっており、基質であるトリプトファンや、作用機序を説明できるような明らか なヘム結合部位との大きな類似性は見られない（図 S1）。どちらの場合も、これらの化合物は興味深いことに阻害の開始が遅く、単純な競合メカニズムとは矛盾している（図1B）。また、両化合物とも明確な温度依存性を示し、30℃以上でのみ阻害を促した（図1Cおよび図S2）。

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図1.
IDO1阻害の時間・温度依存性。(A) 3種類のIDO1阻害剤の構造。(B）IDO1（2.4μM）を化合物1（20μM）、2（20μM）、またはウマ・アポミオグロビン（20μM）と37℃で様々な時間（x軸）インキュベートした後、この阻害を標準活性アッセイを用いて試験した（y軸）。(C）IDO1（2.4μM）を化合物1、2、またはウマアポミオグロビン（20μM）と様々な温度（x軸）で15分間インキュベートした後、N-ホルミルキヌレニン産生速度（y軸）に従って標準活性アッセイを用いて阻害を試験した。エラーバーはSDを表す。N ≥ 3.

IDO1のヘム喪失が阻害の重要な開始段階であることを調べるために、IDO1をアポミオグロビンとインキュベートした。アポミオグロビンは、遊離ヘムと迅速かつ本質的に不可逆的に結合することができ、結合定数は1014 M-1である(35)。驚くべきことに、アポ型ミオグロビンを添加したIDO1は、1および2の場合とほぼ同じ時間および温度依存性で、アポ型ミオグロビンへのヘムの損失と解釈される活性を失うことがわかった（それぞれt1/2 = 17, 14, 11 min）。この挙動は、阻害剤やアポ型ミオグロビンの非存在下でインキュベートしたIDO1の活性が安定して維持されるのとは対照的であり、IDO1へのヘム結合が動的で可逆的なプロセスであることを示している（図1B）。

ヘム喪失を分光学的に調べるために、IDO1をマッコウクジラのアポミオグロビンを改良したH64YV68Fとインキュベートした。H64YV68Fはヘムと結合すると独特の緑色を呈する(36)。アポミオグロビンへのIDO1のヘム損失は、600 nmでの吸光度の増加によって簡便にモニターできる。このことから、IDO1は容易にヘム補因子を失うことが確認され（図2Aおよび図S3）、この異常なヘム不安定性は、1および2による阻害の温度依存性を反映していることがわかった（図2B）。このようにして、IDO1のヘム喪失は阻害剤非依存的であり、1および2による阻害の速度決定段階を共有している可能性が高いことが示され、これら2つの異なる阻害剤の阻害プロファイルが驚くほど類似していることが説明された。

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図2.
IDO1からアポミオグロビンへのヘムの移動。(A) 37℃で40分間にわたる、IDO1 (5 µM)からアポミオグロビンH64YV68F (95 µM)へのヘム移動の紫外可視スペクトル。(B) 600 nmにおける吸光度の増加によって示される、様々な温度におけるIDO1 (5 µM)からアポ型ミオグロビンH64YV68F (95 µM)へのヘムの解離。

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1と2はさまざまなオフ率でido1に結合する
これらの阻害剤がIDO1のヘムラビリティーを利用するメカニズムについて、コールドチェイス実験で14C-放射性標識阻害剤を用いてさらに調べた。これらの阻害剤がIDO1に結合するかどうか、またどの程度強く結合するかを調べるため、タンパク質を14C標識した1および2とインキュベートした。これらのインキュベーションに天然存在量の阻害剤を添加し、様々な時間に、遠心濃縮器を使って緩衝液と結合していない阻害剤をタンパク質から交換した。このようにして、残存する阻害剤はすべてIDO1に結合しているはずであり、その14C放射線を用いて定量することができる。この結果、IDO1はこれらの化合物に結合するが、結合速度の差が非常に大きく、t1/2は1が2分、2が50分であった（図3）。このことは、阻害速度論がほぼ同じであるにもかかわらず、ヘム損失が阻害の共有ステップであり、速度決定ステップであることを強く支持している。

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図3.
放射性標識阻害剤を用いたコールドチェイス実験。放射性標識した1（A）と2（B）をIDO1とインキュベートした後、天然存在量の1と2を導入し、緩衝液を交換し、残存するIDO1と結合した14C標識した1と2を定量した。エラーバーはSDを表す。N = 2.

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阻害は阻害剤濃度と直線関係を示さない
次に、1および2による阻害の濃度依存性を調べ、ヘム喪失前の結合事象を示す可能性のある違いを明らかにした。活性アッセイに先立つインキュベーションにおいて、アポミオグロビンを含む阻害剤の濃度はIDO1の1倍から16倍まで変化させたが、このような大きな差があるにもかかわらず、阻害率はほぼ同じであり、直線的な関係を示すにはほど遠かった（図4A）。これらの結果は、内在性のヘム損失から形成されたアポ型IDO1がこれらの阻害剤の標的であることを示しており、ヘムが再結合するのをブロックする何らかの作用が必要であることを示している。

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図4.
IDO1阻害の濃度依存性。(A）IDO1（2.4μM）を、0から40μM（x軸）までの様々な濃度の化合物1、2、またはウマ・アポミオグロビンと37℃でインキュベートし、その後15分間、この阻害を標準活性アッセイを用いて試験した（y軸）。(B）実験を繰り返したが、活性アッセイ前のIDO1とのインキュベーションでターンオーバーが可能な条件とした。この場合、IDO1（2.4μM）を、500μM l-トリプトファン、10mMアスコルビン酸、10μMメチレンブルー、10μg/mLカタラーゼの存在下、37℃で15分間、2.4-40μM 1、2、またはウマアポミオグロビンとインキュベートした。その後、N-ホルミルキヌレニン産生速度を標準活性アッセイを用いて試験した（y軸）。エラーバーはSDを表す。N ≥ 3.

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阻害はIDO1のターンオーバーに依存しない
このメカニズムから、阻害は活性とは無関係であることが予測される。この仮説をさらに確認するために、IDO1を様々な濃度の阻害剤と天然基質であるl-トリプトファンとインキュベートした。その後、活性を評価した。本明細書に記載したすべての活性実験と同様に、基質としてd-トリプトファンを用いた。d-トリプトファンはl-トリプトファンと違って基質阻害を起こさないので、活性を決定するのにより便利で反復可能な手段を提供する(37-39)。これらの実験では、N-ホルミルキヌレニンに変換されなかったl-トリプトファンはインキュベーションから持ち越され、10 mM d-トリプトファンに加えて基質として作用した（阻害剤とのインキュベーションから活性測定溶液への33倍希釈で、最大最終濃度15 μM l-トリプトファン）。阻害プロフィールは、1と2とのインキュベーション中のターンオーバー条件にかかわらず、ほぼ同じであった（図4B）。この観察から、阻害のメカニズムはターンオーバーとは無関係であることが確認され、アポIDO1が阻害の標的であり、ヘム解離を介したアポIDO1の形成がこのプロセスの律速段階であることが支持された。

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IDO1-阻害剤複合体の結晶構造からその作用様式が明らかになった
これらの阻害剤とIDO1との相互作用は、1および3（後者は2の類似体）との共結晶から得られたX線結晶構造によって明らかになった（図5）。(化合物1はBMS-978587、化合物2はBMS-986205、化合物3はBMS-116である）。どちらの阻害剤も、ヘム補酵素を置換する形で結合し、空いたヘムポケットに、重なりはするが、それぞれ異なる空間を占めていた（図S4とS5）。驚くべきことに、各阻害剤と結合したIDO1の全体構造は、ヘムを含むIDO1構造と比べてほとんど変化しなかった（1および3との共結晶構造の2D0Tからのrmsdは、それぞれ0.61Åと0.44Å）。1のカルボキシレートは、Ala-264の骨格アミドおよび通常近位側でヘム鉄と配位するHis-346と水素結合を形成している。1が結合すると、残基260-265からなる柔軟なループがシフトした。この現象は、以前フェニルイミダゾールの結合で観察された(40)。ループのシフトにより、基質結合部位がヘムの遠位側にあることが明らかになった。この部位では、1のフェニルウレア基がTyr-126との端から端までのπ相互作用とSer-167との水素結合を介して結合する。3のキノリンは、Phe-270、Phe-214、His-346、Arg-343の側鎖転位によって利用可能になった付加的なポケットを占め、それらはPhe-270との端面対向π相互作用とArg-343との水素結合によって安定化されている。

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図5.
IDO1-阻害剤複合体の構造。(A)IDO1/3(青)とIDO1ホロ酵素(オレンジ)の結晶構造の骨格原子の重ね合わせ。IDO1の全体構造はリガンド結合によってほとんど変化しない。残基260-265に対応するループがシフトし、その結果、Ser-263とAla-264が（Cαで測定して）大きく変位している。さらに、ヘム配位残基His-346はリガンドと相互作用するためにわずかに回転している。(B)ヘムと重ねた1の球の表現から、IDO1とは互いに排他的に結合することがわかる。結合構造は、Maestroソフトウェアを用いて、結晶学的座標から水素を追加し、アミノ酸側鎖のプロトン化状態を決定し、重原子の結晶学的座標からのずれを最大0.3Åまで最小化して作成した。らせんS（残基383-399）は、わかりやすくするためにCとDでは隠してある。図S4とS5は、阻害剤結合構造と比較したホロIDO1のポケットレンダリング（図S4）、アポIDO1に結合した阻害剤1と3の電子密度マップ（図S5）、1と3の2次元リガンド相互作用マップ（図S5）を示している。

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アポIDO1は細胞内に存在する
アポ型IDO1の生理学的関連性と阻害の標的としての可能性は、IDO1が細胞内にアポ型で存在し、外因性ヘムの添加で活性化できることを示した先行研究によって支持されている(41)。アポ型IDO1が1および2の真の標的であることをさらに裏付けるために、IDO1を過剰発現させ、ヘム濃度を変化させた条件下で、追加の細胞アッセイを行った。簡単に言うと、ヒト卵巣がん細胞をIFN-γで処理し、IDO1の発現を誘導した。次に、新たに翻訳されたIDO1からの干渉を防ぐために、リボソーム阻害剤シクロヘキシミドを添加した後、細胞をIDO1活性について試験した。細胞IDO1活性は、ヘム添加の有無にかかわらず、さらにインキュベートした後に評価された。IDO1タンパク質のレベルは同程度であったにもかかわらず（Fig. S6）、ヘムを添加した細胞の活性は、ヘムを添加しなかった細胞の活性の約5倍であったことから、これらの細胞では少なくとも85%のIDO1が、外因的に添加したヘムによって活性化できるアポ型として存在していることが示された（Fig. 6）。したがって、結晶構造から明らかになったこれらの阻害剤の標的は、生理学的に適切であるだけでなく、これらの細胞におけるこの酵素の優勢な形態であることが確認された。

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図6.
ヒトSKOV3卵巣腫瘍細胞によるキヌレニン産生。左はヘミン非添加でIFN-γで24時間刺激した細胞の結果。右は40μMヘミン存在下、IFN-γで刺激した細胞を示す。青いバーは、24時間のIFN-γ刺激後のキヌレニン産生を示す。細胞をシクロヘキシミドを含む新しい培地で1時間洗浄し、タンパク質合成を停止させた。キヌレニン産生は、ヘムを含まない培地（ピンク）または40μMヘミンを含む培地（紺色）を添加した24時間後に測定した。エラーバーはSDを表す。

1および2がヘムとアポ-IDO1に対して競合することを立証した後、阻害アッセイにおけるヘム添加の効果を決定することが興味深かった。細胞をIFN-γで刺激すると同時に40μMのヘムをHeLa細胞に添加し、20時間のインキュベーション後に阻害を測定したところ、IC50値はヘムを添加しなかった同じ実験と比較して2倍弱シフトした（1, IC50 ± heme = 7.1/4.2 nM; 2, IC50 ± heme = 1.1/0.5 nM）。長時間の誘導期間中、化合物の阻害に劇的なヘム依存性の力価シフトがないのは、阻害剤とヘムの間で新たに合成されたアポ型IDO1に対する直接的な競合が起こり、阻害剤の高い親和性や遅いオフ速度が高いヘム濃度を補っているためと考えられる。

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ヘムの不安定性は酸化還元状態に依存する
細胞の結果は、IDO1のヘム損失がその正常な制御における主要な要因であることを示している。われわれは、IDO1のヘムラビリティーが、ヘム補酵素の鉄の酸化還元状態に強く依存していることを見いだした。化合物2を用いて、ヘム損失から形成されるアポ型IDO1を捕捉したところ、活性型酵素の休止状態である第一鉄IDO1は、触媒的に不活性な第二鉄状態の酵素よりも、少なくとも10倍ヘムに強く結合することがわかった（図7および図S7）。これは、対応するSoret極大における吸光度の減少を単一の指数関数に当てはめ、半減期を比較することで測定した。この損失の速度論は、この過程が複雑で、ヘム結合の複数の状態が関与している可能性を示しており、さらなる研究が必要である。しかしながら、ヘム保持の全体的な差は大きい。

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図7.
IDO1からのヘム解離の酸化還元状態依存性。IDO1(1.1μM)を10μMの2存在下、37℃で40分間インキュベートした。IDO1からのヘムの解離は、ソレトピークのIDO1λmaxにおける吸光度の消失によって追跡した： 第二鉄IDO1では404 nm、第一鉄IDO1では425 nmであった。(A) 様々な時間における第二鉄IDO1のスペクトル。挿入図は、第二鉄IDO1と第一鉄IDO1の吸光度の損失を時間の関数として比較したものである。(B) 様々な時間における第一鉄IDO1のスペクトル。IDO1は、窒素で洗浄した密閉キュベット内で、5 mMの亜ジチオン酸ナトリウムを用いて還元した。亜ジチオン酸の減衰は、375 nm以下の吸収が減少することで確認できる。挿入図は、ヘムの代わりに阻害剤がIDO1に結合し、吸光度の減少が観察されたことを示している。

すべてのIDO1構造の電子密度から欠落している20個のアミノ酸のストレッチは、基質結合時に「閉じた」状態を形成し、ヘムの溶媒露出面を効果的にブロックし、ヘムプロピオン酸との分子間水素結合を導入すると予測されている(42)。したがって、細胞内のトリプトファン濃度もIDO1におけるヘムのリクルートと保持に関与していると考えられる。0-10mMのl-トリプトファン（l-トリプトファンと鉄型IDO1のKdは5.8mMと報告されている）存在下で、IDO1からアポミオグロビンH64YV68Fへのヘム損失を試験したところ、基質濃度が高くなるにつれてヘム損失速度が減少することがわかった（図S8）(37)。しかし、第一鉄型IDO1とl-トリプトファンのKdは13 µMと著しく低い(37)ことから、トリプトファンは活性型IDO1の第一鉄型に対して、このヘム保持効果をより強く発揮している可能性がある。

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考察
IDO1の効果的かつ特異的な阻害という目標は、この酵素が癌の免疫反応回避に重要であるという発見以来、集中的に追求されてきた(17)。これまでのほとんどの阻害剤が、基質であるトリプトファンを模倣するか、ヘム補酵素に結合することで競合阻害剤として作用するのに対し(28)、1と2は、酵素のアポ型に結合するヘム補酵素そのものと競合するという、まったく別の戦略を利用してIDO1を阻害することができる（図8）。この阻害のメカニズムを理解するための努力の中で、IDO1におけるヘムラビリティーの重要性と、その調節機構としての可能性が、より完全に明らかになってきた。

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図8.
IDO1によるトリプトファン異化の触媒機構と、ヘム解離を介したその阻害。

IDO1のホモログであるIDO2が、ヘムの移動と隔離を介してIDO1の活性をダウンレギュレートできることが以前に示されており(44)、IDO1とヘムオキシゲナーゼ-1を介したヘム異化との間に重要なクロストークが存在し、ヘム飢餓を介してIDO1活性が失われることが知られている(45)。また、第一鉄IDO1はトリプトファン非存在下で一酸化窒素と結合し、ヘム鉄-近位ヒスチジン結合を切断してアポIDO1を形成することが示されている(46)。この変換は、可溶性グアニリルシクラーゼのヘムレセプターと類似している。ヘムレセプターはシグナル伝達プロセスの一部であり、触媒作用はないが、その制御にヘムラビリティーを利用しており、アポ型に結合できる化合物の標的となっている(47, 48)。

我々はここで、ヘムラビリティーが細胞内でのIDO1活性の翻訳後制御に重要な役割を果たしている可能性が高いこと、そしてこのラビリティーがヘムの酸化還元状態に強く依存していることから、IDO1活性を制御する潜在的な調節機構が得られる可能性があることを示した。Ravenと共同研究者(49)は、in vitroでトリプトファン濃度が低い場合、IDO1はターンオーバー中に触媒的に不活性な第二鉄の状態で蓄積し、in vivoではIDO1は第二鉄の状態まで自己酸化できることを示している(50)。これらのデータを総合すると、IDO1は自己制御的であることが示唆される。トリプトファンが少ない条件下では、触媒的に不活性な第二鉄状態に変換することで活性が即座に低下し、そこからヘムが失われることでアポ型に進むことができる（図8）。このようなプロセスは、これらの阻害剤の標的として機能するアポ型IDO1の大きなプールの一因となるであろう。

さらに、アポミオグロビンH64YV68Fに対するヘム喪失と2存在下でのヘム喪失のアッセイ（図2、および7）7）の両方で明らかなように、速い相の後に遅い相が続くというヘム喪失速度論に見られる複雑さは、ホロ型とアポ型のIDO1だけという単純なモデルではこのヘム喪失現象を完全に包含できない可能性があること、さらに研究が必要なヘム結合の中間状態が存在する可能性があることを示唆している。

結論として、我々はIDO1が動的、可逆的、酸化状態依存的にヘムを容易に失うことを示した。アポIDO1のプールを標的にすることで、一群の阻害剤がIDO1を効果的に阻害できる手段を提供し、がん細胞の正常な免疫浄化を回復させる可能性がある。これらの結果はまた、IDO1のヘム補酵素に対する親和性を調節することによって達成される複雑な代謝制御をより完全に明らかにし、他の多くのこのような酵素が同様に制御され、メカニズム的に豊富である可能性を示唆している。

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材料と方法
化合物1、2、3は、ブリストル・マイヤーズ スクイブ社において、公開特許出願（51、52）に記載された手順で調製した。1および2の14C標識体はBristol-Myers Squibb社から提供された。

タンパク質は標準的な方法で発現させ、精製した。無細胞活性測定は、Agilent 8453ダイオードアレイ分光計と温度制御Fisher Scientific isotemp 1016s再循環冷却器を用いて標準的な方法で行った。14C-放射性標識1および2を用いたコールドチェイス実験は、SI Materials and Methodsに記載されているように行った。阻害剤結合型およびホロIDO1を得るために用いた結晶化条件は、SI Materials and Methodsに記載されている。HeLa細胞およびSKOV3細胞を用いた細胞ベースの活性アッセイは、SI Materials and Methodsに記載されているように行った。

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補足資料
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謝辞
Dianlin XieとMian Gaoには発現ベクターの構築について、Frank Marsilio、Susan E. Kiefer、Nicolas Szapielには初期のIDO発現と精製について、Yuval Blat、Hao Lu、Litai Zhangには有益な議論について、Kathy JohnstonとJoseph NaglichにはHela細胞でのアッセイデザインについて、Alfred LammensとStefan Steinbacher（Proteros Biostructures GmbH）には3との共結晶構造について感謝する。 P.A.K.はBMS社のフェローシップ支援に感謝する。本研究は、NIH Grant 2R37 GM036298（J.T.G.へ）の支援を受けた。

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脚注
利益相反声明： M.T.N.、P.A.K.およびJ.T.G.は利益相反がないことを表明している。X.Z.とL.A.はBristol-Myers Squibb社の元従業員である。J.T.H.、J.A.N.、A.B.、D.M.、A.A.、R.B.、H.L.、Z.L.、S.P.S.、C.Y.はブリストル・マイヤーズ スクイブ社の社員である。

データの蓄積： 原子座標と構造因子はProtein Data Bank, www.wwpdb.org [PDB ID code 6AZU (holoenzyme), 6AZV (1), and 6AZW (3)] に登録されている。

この論文には、www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1719190115/-/DCSupplemental のオンライン情報が含まれている。

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