保存卵白は、酸化ストレスの軽減、炎症性サイトカイン、NF-κB、MAPKおよび腸内細菌叢の調節を通じて、マウスのDSS誘発大腸炎を緩和する。
フードサイエンスとヒューマンウェルネス
第12巻 第1号 2023年1月 312-323ページ
保存卵白は、酸化ストレスの軽減、炎症性サイトカイン、NF-κB、MAPKおよび腸内細菌叢の調節を通じて、マウスのDSS誘発大腸炎を緩和する。
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https://doi.org/10.1016/j.fshw.2022.07.021Get 権利と内容
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中国の伝統的な保存卵製品は、いくつかの抗炎症作用を示すが、その作用機序は依然として不明である。本研究では、マウスのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発大腸炎に対する保存卵白（PEW）処理の抗炎症作用とその基礎メカニズムを調べることを目的とした。その結果、DSS誘発大腸炎マウスにPEWを14日間投与したところ、臨床症状の改善、炎症性サイトカインの分泌と遺伝子発現の抑制、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性と酸化ストレスレベルの低減が効果的に確認されました。さらに、ウェスタンブロッティングの結果、PEWは、大腸炎マウスの大腸組織において、DSSによって誘発された核因子κB（NF-κB）p65およびp38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）のリン酸化レベルを著しく抑制することがわかった。また、PEWは短鎖脂肪酸（SCFA）の産生を促進し、DSS誘発大腸炎マウスの腸内細菌叢組成を調節した。有益菌であるLachnospiraceae、Ruminococcaceae、Muribaculaceaeの相対存在量を増加し、有害菌Proteobacteriaの相対存在量を減少させた。以上のことから、本研究では、保存卵白が酸化ストレスの軽減、炎症性サイトカイン、NF-κB、MAPKおよび腸内細菌叢組成の調節を通じて、マウスのDSS誘発性大腸炎を緩和することが実証されました。
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大腸炎
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腸内細菌叢（ちょうないさいきんそう
はじめに
潰瘍性大腸炎（UC）は、腸粘膜の炎症を主な特徴とする炎症性腸疾患（IBD）の一次型である [1] 。IBDは通常、持続的な腹痛、下痢、直腸出血、重度の体重減少などの特異な臨床症状を伴います[2]。IBDの正確な病因は未だ不明であるが、IBDは微生物因子、腸管粘膜バリア機能不全、酸化ストレス、炎症性メディエーターの増加などの組み合わせの結果であると考えられる [3], [4]. 現在、UCの治療には、5-アミノサリチル酸塩、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗生物質などの薬剤が一般的に使用されていますが、これらの薬剤は有効性に限界があり、高血圧や糖尿病などの副作用を引き起こすことがあります [5], [6]．そのため、より効果的で安全な治療戦略を見つけることが急務となっています。
新たな研究により、腸内細菌叢の変化が大腸炎の重症度や進行に重要な役割を果たすことが明らかになっています [7], [8] 。腸内細菌叢は、粘膜上にバリアを形成し、腸管透過性を低下させ、粘膜上皮の防御機構を強化することができます [9]。また、腸内細菌叢が産生するSCFAは、NF-κB経路を阻害することにより、好中球やマクロファージからインターロイキン（IL）-8、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）などの炎症性サイトカインの放出を防ぎ、炎症を抑制することができます［10］。一方、腸内細菌叢のバランスが崩れると、腸管内の有害菌が増加し、腸の炎症が悪化します[11], [12]．私たちの以前の研究では、食事性PEWがエンドトキシンを生成する病原性細菌であるプロテオバクテリアの相対的な存在量を減少させ、それによって腸の健康状態の改善に寄与することが示されました[13]。また、特定のプロバイオティクス株の投与は、腸の炎症や損傷を軽減し、腸内微生物の生態系を改善し、大腸炎の発症を予防する可能性があります [14], [15].
食品由来のタンパク質がIBDの進行を効果的に緩和することが研究で示されています[16], [17]。DSS誘発大腸炎マウスへの食事介入は、腸管バリアを改善し、酸化ストレスを軽減し、炎症性サイトカインだけでなく腸内細菌叢を制御し、盲腸でのSCFAsの産生を回復させました[18], [19], [20]．近年、鳥類の卵由来のタンパク質、ペプチド、アミノ酸が、抗菌作用、抗酸化作用、抗炎症作用など様々な生理活性を示すことが多くの研究で確認されている[21], [22], [23]。例えば、オボトランスフェリンおよびオボトランスフェリン由来のペプチドは、スーパーオキシドアニオンを消去し、酸化ストレスを緩和する抗酸化活性を有する[24], [25]．また、オボトランスフェリンはDSSで誘発されたマウスの大腸炎を緩和することができました[16]。保存卵白には、良質なタンパク質が豊富に含まれています。そして、保存卵白に含まれるタンパク質は、アルカリ漬けの工程と消化管での消化の間に、ほとんどがペプチドと遊離アミノ酸に分解されます[26]。Zhangら[27],[28]は、保存卵白の胃腸内消化シミュレーション（SGD-PEW）から得られた4種類のペプチドが、DSS誘発大腸炎マウスの炎症の進行を緩和し、同時にTNF-α誘発Caco-2細胞のNF-κBおよびMAPK活性化を抑制して、炎症の進行を緩和できることを報告しました。しかし、PEWによるUC予防効果のメカニズムや、PEWが腸内細菌叢を制御できるのかについては、まだ十分に解明されていません。
そこで、本研究では、DSS誘発大腸炎に対するPEW食の抗炎症効果をマウスで検討することを目的とした。大腸炎の重症度、MPO活性、サイトカインの発現レベル、酸化ストレスレベル、腸内細菌叢の組成、SCFAsの含有量を解析し、その背後にあるメカニズムを明らかにしました。材料と方法
2.1. 動物、飼料、実験デザイン
実験動物福祉国家ガイドラインに従い、動物実験のプロトコルは、華中農業大学実験動物センターの倫理委員会（許可番号HZAUMO-2020-0058）の許可を得た。特定病原体フリー（SPF）雌性BALB/cマウス30匹（6-8週齢、16-18g）を入手し、華中農業大学実験動物センター（中国・武漢）に収容した。マウスは、湿度（50±5）％、温度（21±1）℃、12時間明暗サイクルのSPF実験動物室で、餌と水に無制限にアクセスできるようにして、1週間の調整給餌の間、飼育した。マウスを以下の3つの異なるグループ（n＝10）にランダムに分けた：正常コントロールグループ、DSS誘発大腸炎グループ（DSS）、および保存卵白グループ（PEW）。PEW群のマウスには、生理食塩水に溶解したPEW（860mg/（kg-day））を14日間経口投与し、他の2群のマウスには、同期間、通常の生理食塩水（1日あたりマウスあたり0.2mL）を経口投与した。8日目から、DSS群およびPEW群のマウスには、4 %のDSS（分子量36000-50000、MP Biomedicals, LLC, Irvine, CA）を飲料水として7日間与え、DSS溶液は1日おきに交換した。
保存卵は、湖北神丹健康食品有限公司（Hubei Shendan Healthy Food Co. (中国・湖北省)から入手した。洗浄した保存卵の殻と膜を剥いた後、保存卵白部分を粉砕し、凍結乾燥した。凍結乾燥された保存卵白粉末は、使用するまで-20℃で保存した[13]。
2.2. コリティの重症度評価
実験期間中、各マウスの体重の変化とDAIは、先行文献の方法に従って毎日記録した[29]。14日後、マウスを安楽死させ、各マウスについて、回腸・膀胱接合部と直腸近位部との間で結腸を切除し、その長さを直ちに測定し記録した。これらの測定の後、盲腸サンプルを縦に切断し、新鮮な内容物を採取し、滅菌チューブに入れ、微生物叢分析のために-80℃で保存した。結腸組織は、あらかじめ冷やしたリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で洗浄し、2つに切り分け、遠位結腸部分を4 %パラホルムアルデヒドで固定し、病理組織学的分析を行った。病理学的変化の重症度を定量的に評価するために、組織学的分析は、以前に確立されたグレーディングシステム（表S1）[28], [29], [30]に従って評価された。スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、マロンジアルデヒド（MDA）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）、MPO、一酸化窒素（NO）および炎症性サイトカインの活性を後で評価するために、大腸の近位部を-80℃で保存した。
2.3. 大腸組織におけるNO、MPO、MDA、GSH-Px、SOD活性およびサイトカインレベルの測定
解凍後、大腸組織を秤量し、あらかじめ冷やしたPBS（0.01mol/L、pH7.4）で10 %の組織ホモジネートを調製した。この懸濁液を3000r/minで10分間遠心分離し、その後、上清を採取して検査した。大腸組織のMPO、MDA、SOD、GSH-Px活性、およびNO指数は、対応するキット（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China）を用いて、メーカーの説明書にしたがって評価しました。マウスの結腸組織におけるサイトカイン（TNF-α、IL-6、IL-1βおよびIL-10）のレベルは、酵素結合免疫吸着法（ELISA）キット（Elabscience、Wuhan、China）を使用して決定した。比色反応の光学密度の測定は、フラットマイクロプレートリーダー（Molecular Devices, Silicon Valley, USA）を用いて450nmで実施した。
2.4. 結腸組織における相対的mRNA発現量の解析
TRIZOL® Reagent（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）を用いて大腸組織からTotal RNAを分離した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）Sequence Detection System（Applied Biosystems, CA, USA）を用い、SYBR Green PCR Master Mixを用いて、製造者のプロトコール（Thermo Fisher Scientific）に従って定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を実施した。相対的な遺伝子発現は2-ΔΔCt法を用いて算出し、標的遺伝子の発現はグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子の発現を用いて正規化した［28］。本研究で使用したプライマーの配列は、表S2に記載した。
2.5. ウェスタンブロット解析
タンパク質を抽出するために、結腸組織を氷冷したRIPAバッファー（PMSFおよびホスファターゼ阻害剤を含む）中で溶解・ホモジナイズし、4℃で12000r/minで5分間遠心分離した。その後、BCAタンパク質アッセイキット（Beyotime Biotechnology, Shanghai, China）を用いてタンパク質の定量を行うために上清を回収した。タンパク質サンプルは、10 %ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離し、ポリビニリデン・ジフルオリド（PVDF）膜（Millipore, MA, USA）上に移した。PVDF膜は、5 %脱脂乳を含むTBST（ブロッキング液）シェーカーに室温で2時間浸した後、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。膜をTBSTで洗浄し、HRP結合希釈二次抗体と室温で2時間インキュベートした。最後に、タンパク質バンドをenhanced chemiluminiscence imaging system (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)で可視化し、結果をImageJソフトウェアで定量化した。
2.6. セカルサンプル中のSCFAsの測定
マウスを安楽死させた後、直接セカルサンプルを採取し、分析まで-80℃で保存した。セカルサンプル中のSCFAの定量分析は、ガスクロマトグラフィー（GC）により決定した。簡単に説明すると、100mgの盲腸サンプルを、粉砕ビーズと1mLの蒸留水を入れた2mLの粉砕管に入れ、0.5％のリン酸と50μg/mLの2-エチル酪酸を含む。その後、試料をクライオグラインダーに入れ、3分間2回粉砕した。混合物を13000×gで4℃、10分間遠心分離した。上清を抽出用の酢酸エチル500μLと混合し、再び遠心分離した（13000×g、4℃、10分間）。HP-FFAPキャピラリーカラム（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm, Agilent J&W Scientific, Folsom, CA, USA）を用いてSCFAsの濃度を評価しました。
2.7. セカルサンプルのDNA抽出とハイスループット配列決定
QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Doncaster, Australia)を用いて、糞便サンプルから全DNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを1 %アガロースゲル電気泳動にかけ、定性・定量評価を行った。ユニバーサルプライマー338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）と806R（5'-GACTACHVGGTWTCTAAT-3'）を使用して、細菌16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅した。配列決定は、Illumina Miseqプラットフォーム（Illumina, San Diego, California, USA）を用いて実施した。
2.8. バイオインフォマティクスと統計解析
生シーケンスデータはFASTQフォーマットで保存された。品質フィルタリングには、Trimmomaticソフトウェアを使用した。次に、ペアエンドリードをFlashソフトウェア（バージョン1.2.11、https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml）を用いてマージした。アセンブリーパラメーターは以下の通りである： 最小オーバーラップ10 bp、最大オーバーラップ200 bp、最大ミスマッチ率20 %。Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software (version 1.9.1, http://qiime.org/install/index.html) のデフォルトパラメーターは、品質フィルタリングのためにいくつかの読み物を削除するように設定された。Usearchソフトウェア（バージョン7.0、http://www.drive5.com/usearch/）を用いて、非反復配列（単一配列なし）の操作的分類単位（OTU）クラスタリングを行い、リード中のキメラを検出してクラスタリング過程で除去し、類似度97 %カットオフのOTUを作成した。代表的なリードはすべてアノテーションし、RDP分類器を用いてSILVAデータベースVersion 138（16S rDNA）に対してブラストした（信頼閾値は70 %）[31].
すべての結果は、平均値±標準偏差（SD）で表された。グループ間の差の統計的有意性は、SPSS（Version 21.0, IBM, USA）を用いた一元配置分散分析（ANOVA）およびダンカンの多重範囲検定によって分析した。グラフ処理にはOrigin Pro 9.0を使用した。結果
3.1. 食餌PEWはマウスのDSS誘発大腸炎の臨床徴候を緩和させた
マウスの初期平均体重には、各群間で差はなかった。コントロール群のマウスの体重は、図1Aに示すように、実験期間中、緩やかな増加傾向を示したが、DSSおよびPEW群も最初の7日間にのみ体重の増加を示した。DSS投与開始後、DSS群およびPEW群のマウスの体重は、11日目から減少した。しかし、PEW群のマウスは、DSS群のマウスに比べて体重の減少が有意に（P < 0.05）少なかった。
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図1. 食餌PEWは、DSS誘発大腸炎マウスの臨床症状を緩和し、大腸組織の組織学的損傷を減少させた。(A）マウスの体重変化（％）、（B）DAIスコアの変化、（C）マウスの大腸の長さと代表写真、（D）大腸組織のH＆E染色の代表画像（倍率200×）と組織学的スコア；黒矢印は粘膜上皮が欠損した部分、赤矢印は腸腺構造の消失、黄矢印は粘膜層と粘膜下層における炎症細胞の浸潤を示す。データは平均値±SD（各群n = 6-10）で示し、共通の文字のない値はP < 0.05で有意差あり。
DAIスコアは、体重減少、便の硬さ、直腸出血の平均的な総合スコアである。対照群のマウスは顕著な体重減少がなく、臨床症状も見られなかったため、DAIスコアの値は0となった。DSS投与日数の増加に伴い、DSS群とPEW群のDAIスコアは徐々に上昇したが、PEW群のマウスはDSS群のマウスに比べてDAIスコアの上昇が有意に低かった（P < 0.05）（図1B）。大腸の短縮はDSS誘発大腸炎の主徴候の一つとして確認されているため、大腸の長さは炎症の重症度を反映する指標として用いることができる[32]。対照群と比較すると、DSS群の結腸長は有意に短縮していたが（P < 0.05）、PEWの投与は結腸の短縮を有意に抑制した（P < 0.05）（図1C）。
3.2. 食餌PEWはDSS誘発大腸炎マウスの大腸組織の組織学的損傷を改善した
DSS誘発大腸炎における炎症の重症度と大腸形態に対するPEWの効果を探るため、ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色後の大腸切片について病理学的検査を実施した。図1Dに示すように、対照群マウスの大腸組織切片は、無傷の粘膜上皮、最小限の炎症細胞浸潤、および他の明白な異常のない、正常な大腸組織を示した。しかし、DSS群マウスの大腸組織は、局所的な組織潰瘍、粘膜上皮および腸腺構造の欠損、粘膜下層浮腫、および粘膜および粘膜下層における重度の炎症細胞浸潤を示し、その結果、組織学的スコアが高くなった。一方、DSS群とは対照的に、PEWを投与したマウスは、クリプトの短縮が少なく、粘膜下層の炎症細胞浸潤とともに粘膜損傷が軽減され、組織学的スコアが有意に低くなった（P < 0.05）。これらの結果から、PEW投与により大腸の炎症が緩和されることが示された。
3.3. 食餌PEWは、DSS誘発大腸炎マウスの大腸組織におけるMPO活性および酸化ストレスレベルを低下させた
MPOは炎症性・抗酸化性の酵素であり、大腸組織の損傷を引き起こす可能性がある[33], [34]。コントロール群と比較して、DSS群の大腸組織におけるMPO活性は有意に上昇し（P < 0.05）、PEW処理によりMPOレベルは有意に低下した（P < 0.05）（図2A）。大腸の酸化ストレスに対するPEW処理の効果を評価するために、MDAレベル、SOD活性、GSH-Px活性およびNOレベルを測定した。コントロール群と比較して、DSS群の大腸組織におけるMDA（図2B）およびNO（図2E）レベルは有意に増加した（P < 0.05）。PEWを投与すると、DSS群と比較してMDAおよびNOレベルが有意に減少した（P < 0.05）。また、DSS群の大腸組織におけるSOD（図2C）およびGSH-Px（図2D）活性は有意に低下していたが（P < 0.05）、PEWの投与によりDSS群と比較してSODおよびGSH-Px活性は有意に上昇した（P < 0.05）。これらの結果から、PEW投与はDSS誘発大腸炎マウスのフリーラジカル消去能力を向上させ、酸化ストレスを抑制することが示された。
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図2. 食餌PEWは、DSS誘発大腸炎マウスの大腸組織におけるMPO活性および酸化ストレスレベルを低下させた。(A）MPO活性、（B）MDA、（C）SOD、（D）GSH-Px、および（E）NO。データは平均値±SDで示した（各群n = 5）；共通文字のない値はP < 0.05で有意差あり。
3.4. 食餌PEWは、DSS誘発大腸炎マウスの大腸組織において、炎症性サイトカインの分泌を減少させ、抗炎症性サイトカインの分泌を増加させた
PEWが炎症性サイトカインに及ぼす影響を評価するため、大腸組織中のTNF-α、IL-6、IL-1βおよびIL-10の濃度をELISA法により測定した。DSS群マウスの炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-6、IL-1βを含む）レベルは、対照群マウスのそれよりも有意に高かった（P＜0.05）（図3A〜C）。DSSグループで観察されたレベルと比較して、食餌PEWは3つの炎症性サイトカインすべての分泌を有意に減少させた（P < 0.05）。同時に、PEW群の結腸組織における抗炎症性サイトカインIL-10のレベルは、DSS群と比較して、有意に増加した（P < 0.05）（Fig.3D）。
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図3. 食餌PEWは、DSS誘発大腸炎マウスの大腸組織において、炎症性サイトカイン（A）TNF-α、（B）IL-6、（C）IL-1βの濃度を低減し、抗炎症性サイトカイン（D）IL-10の濃度を増加させた。データは平均値±SDで示した（各群n＝5）；共通文字のない値は、P＜0.05で有意に異なる。
3.5. 食餌性PEWはDSS誘発大腸炎マウスの大腸組織における炎症性サイトカインの遺伝子発現を変調させた。
DSS誘発大腸炎に対するPEWの抗炎症作用は、大腸組織における炎症性サイトカインのmRNA発現を測定することで検討した。コントロール群と比較して、DSS群マウスでは炎症性サイトカインであるTNF-α、IL-6およびIL-1βのmRNA発現が有意に増加した（P < 0.05）（図4A-C）。PEW投与により、DSSにより誘導されたTNF-α、IL-6およびIL-1βのmRNA発現が有意に減少した（P < 0.05）。また、DSS群における抗炎症性サイトカインIL-10のmRNA発現は、コントロール群と比較して有意に減少した（P < 0.05）。食餌性PEWは、コントロール群に匹敵するレベルには至らないものの、DSS群と比較してIL-10のmRNA発現を有意に増加させた（P＜0.05）（図4D）。
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図4. 食餌PEWは、DSS誘発大腸炎マウスの大腸組織における炎症性サイトカインのmRNA発現を調節した。(A）TNF-α、（B）IL-6、（C）IL-1β、および（D）IL-10。データは平均値±SDで示した（各群n = 5）；共通文字のない値はP < 0.05で有意差あり。
3.6. 食餌性PEWはDSS誘発大腸炎マウスの大腸組織においてp38 MAPKおよびNF-κB p65経路を制御する
PEWによる炎症抑制がNF-κBおよびMAPK経路を介するかどうかを調べるために、大腸組織におけるNF-κB p65およびp38 MAPKのリン酸化を調べた。図5AおよびBに示すように、コントロール群と比較して、DSS群の大腸組織におけるNF-κB p65およびp38 MAPKタンパク質のリン酸化レベルは有意に増加した（P < 0.05）。PEW投与により、コントロール群と同程度のレベルまではいかないが、DSS群と比較してリン酸化レベルが有意に低下した（P < 0.05）。
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図5. 食餌PEWは、DSS誘発大腸炎マウスの大腸組織において、p38 MAPKおよびNF-κB p65経路を制御した。(A）ウェスタンブロッティングの代表画像、（B）NF-κB p65（左）およびp38 MAPK（右）のタンパク質発現。GAPDHはコントロールとして使用した。データは平均値±SDで示した（各群n = 3）；共通文字のない値はP < 0.05で有意差あり。
3.7. DSS誘発大腸炎マウスにおいて、食事性PEWが腸内細菌叢の組成を調節した
3.7.1. 腸内細菌叢の多様性解析
PEWが腸内細菌叢を変化させるかどうかを調べるため、16S rRNA遺伝子配列解析を行い、3群間の腸内細菌叢の組成の変化を明らかにした。グループ間のα多様性を評価するために、Shannon、Simpson、Sobs（観察された豊かさ）が用いられた。Shannon指数とSimpson指数は群集の微生物多様性を評価するために一般的に使用され、Sobs指数は主に群集内の微生物の豊かさを評価するために使用されます。DSS処理群のShannon指数およびSobs指数（図6AおよびC）は対照群と比較して有意に低く（P < 0.001）、DSS処理群のSimpson指数（図6B）は対照群と比較して有意に高かった（P < 0.001）。PEW治療では、Shannon指数とSobs指数が有意に増加し（P < 0.05）、Simpson指数は有意に減少した（P < 0.05）ことから、PEW治療が腸内細菌叢のコミュニティ多様性と豊かさを促進することが示された。β多様性解析は、異なる治療グループ間のコミュニティ構造の類似性についての情報を提供する。β多様性は、加重UniFrac距離を用いた主座標分析（PCoA）により評価した。コントロール群とDSS群の点間距離は、DSS群の腸内細菌叢構造がコントロール群から乖離していることを示した。PEW群では、DSS投与により誘導された腸内細菌叢がコントロール群に近い位置にシフトしており（図6D）、食餌PEWが大腸炎マウスの腸内細菌叢のβ多様性を改善することが示された。
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図6. 食事性PEWは大腸炎マウスの腸内細菌叢のαおよびβの多様性を改善した。(A）シャノン指数、（B）シンプソン指数、（C）ソブス指数、（D）加重UniFrac距離を用いた主座標分析（PCoA）。各プロットは1サンプル、n = 6を表す; * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
3.7.2. 腸内細菌叢の組成と相対存在量
図7A-Bは、別途、マウスの糞便微生物叢の分類学的組成を門レベルおよび科レベルで示したものである。門レベルで、Firmicutes、Bacteroidota、Verrucomicrobiota、Proteobacteria、Campilobacterotaおよびその他のフローラを含む9種類の腸内細菌叢組成を検出した（図7A）。対照群では、Firmicutes、Bacteroidota、Verrucomicrobiota、Campilobacterotaの相対量はそれぞれ82.72 %、15.96 %、0.08 %および0.61 %であった。DSSの投与により、門派レベルでの細菌組成が変化した。DSS投与群では、Bacteroidota、Verrucomicrobiota、Proteobacteria、Campilobacterotaの相対量が、それぞれ54.37 %、3.29 %、4.94 %、1.44 %に増加した。逆に、ファーミキューテス類の相対量は34.85 %に減少した。すべての実験グループにおいて、ファーミキューテス（F）およびバクテロイデー タ（B）が最も重要な分類群であった。F/Bの比率は、微生物の変化を評価するための重要な指標である [35], [36]。DSS群のF/B比（F/B, 0.6410）は、対照群（F/B, 5.1830）に比べて有意に低い（P < 0.05）。PEWの投与により、DSS群と比較して、Verrucomicrobiotaの相対量が増加し（P < 0.05）、Proteobacteriaの相対量が減少した（P < 0.05）．3群間のVerrucomicrobiotaとProteobacteriaの相対存在量の変化を別々にプロットした（図7C）。次に、処理グループ間のファミリーレベルでの違いを決定した（図7B）。ファミリーレベルのフローラでは、3群でLachnospiraceae、Oscillospiraceae、Muribaculaceae、Ruminococcaceae、Akkermansiaceaeが優勢であった。Lachnospiraceae、Oscillospiraceae、Muribaculaceae、Ruminococcaceae、Akkermansiaceaeの相対存在量の3群間の変化を別々にプロットした（図7C）。コントロール群に比べ、DSS群ではLachnospiraceae、Oscillospiraceae、Muribaculaceae、Ruminococcaceaeの相対量が著しく減少した（P < 0.05）。PEW群では、対照群に匹敵するレベルではないが、これらの植物群の相対量が有意に増加した（P < 0.05）。興味深いことに、対照群と比較して、DSS処理およびPEW処理では、アッケシソウの相対存在量が有意に増加した（P < 0.05）。
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図7. 食餌PEWはDSS誘発マウスの腸内細菌叢の分類学的組成を変調させた。(A）門レベルの腸内細菌群集の相対存在量、（B）科レベルの腸内細菌群集の相対存在量、（C）門および科レベルのVerrucomicrobiota、Proteobacteria、Muribaculaceae、Akkermansiaceae、Lachnospiraceae、OscillospiraceaeおよびRuminococcaceaeの相対存在量。データは平均値±SDで示した（各群n = 6）。共通文字のない値はP < 0.05で有意差あり。
図8Aは、マウスの糞便微生物叢の分類学的組成を属レベルで示し、拡張エラーバープロットにより、属レベルでのコントロール群とDSS群（図8B）、DSS群とPEW群（図8C）間の細菌分類群の平均割合の有意差が明らかになった。図8Aに示すように、属レベルで相対的に存在量の高い分類群は、主にBacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Staphylococcus、norank_f_Muribaculaceae、unclassified_f_Lachnospiraceae、Blautia、Akkermansiaなどだった。図8Bに示すように、DSS群における腸内細菌叢共生の崩壊は、Bacteroides（P < 0.01）およびStaphylococcus（P < 0.05）の相対存在量が高いという特徴を有していた。 05）、大腸炎を悪化させることが確認されているLachnospiraceae_NK4A136_group（P < 0.01）, norank_f_Muribaculaceae（P < 0.01）, unclassified_f_Lachnospiraceae（P < 0.01）, Blautia（P < 0.05) がコントロール群と比較して相対的に減少しています。さらに、食事性PEWはDSS群と比較して、Akkermansia（図8A）、unclassified_f_Lachnospiraceae（P < 0.05）およびBlautia（P < 0.05）（図8C）の相対存在量が増加した。これらの結果を総合すると、PEWの投与はDSS誘発大腸炎における腸内細菌叢の組成を調整することができることが示されました。
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図8. 食餌PEWはDSS誘発マウスの腸内細菌叢の分類学的組成を変調させた。(A）腸内細菌群集の属レベルでの相対的存在量。属レベルでのコントロール群とDSS群（B）、DSS群とPEW群（C）の間のフィロタイプが有意に異なっていた。実験群間の差はウィルコクソン順位和検定で求め、FDR（Falsely Discovery Rate）手順で偽検出率を制御した。各群において、n = 6, * P < 0.05, ** P < 0.01.
3.8. 食事性PEWは盲腸でのSCFAの産生を促進した
各群のマウスの盲腸のSCFAの含有量をガスクロマトグラフィーで測定した。図9に示すように、DSS群の酢酸（図9A）、ブタン酸（図9C）および総短鎖脂肪酸（図9D）の盲腸レベルは、対照群に比べて有意に低かった（P＜0.05）。PEW群では、酢酸、ブタン酸および総短鎖脂肪酸の糞便レベルは、DSS群と比較して有意に増加したが（P < 0.05）、コントロール群で観察されるレベルよりも低いままであった。興味深いことに、プロピオン酸のセカールレベル（図9B）は、PEWグループでコントロールグループよりも高かった。
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図9. 食餌性PEWは盲腸におけるSCFAの産生を促進した。 A）酢酸、（B）プロピオン酸、（C）ブタン酸、（D）短鎖脂肪酸の総量。データは平均値±SDで示した（各群n = 6）；共通文字のない値はP < 0.05で有意差あり。考察
クローン病（CD）やUCを含むIBDは、多因子性で長期にわたる難病である[3], [4]。DSS誘発大腸炎マウスの病理は、典型的には下痢、腸管出血、体重減少、大腸短縮、さらに粘膜潰瘍と好中球浸潤です[37], [38]．本研究では、PEWを食餌投与することで、DSS投与マウスの体重減少、DAIスコア、および結腸短縮が有意に改善されました。さらに、PEWの投与により、腸粘膜の損傷、粘膜下浮腫、炎症細胞の浸潤、陰窩の消失が効果的に減少しました。その結果、PEW投与群のマウスは、組織学的スコアが有意に減少した。これらの結果は、卵殻膜加水分解物がDSSで誘発されたマウスの炎症を抑制したという以前の報告[39]とやや類似していた。サイトカインとその関連遺伝子は、IBDの発症と持続に重要な役割を果たす。UCの病態生理学的特徴として、炎症カスケードと様々な炎症性・抗炎症性サイトカインの放出が挙げられる [40], [41]。炎症性サイトカインの過剰発現は、腸管粘膜の炎症を引き起こす。TNF-αは大腸炎における腸管上皮バリアー損傷の主要な促進因子であり、IL-6やIL-1βの産生を促進する作用がある。IL-10は主要な抗炎症性サイトカインであり、胃腸の恒常性の維持に重要な役割を果たす[11]。IL-10の薬理学的投与は、炎症性サイトカインの産生を抑制し、腸の炎症を抑制することにより、マウスの大腸炎を緩和した[42]。本研究では、食事性PEWが大腸炎マウスの大腸組織における炎症性サイトカインTNF-α、IL-6、IL-1βの産生と遺伝子発現を有意に減少させ、同時に大腸組織におけるIL-10の分泌と遺伝子発現を増加させることを証明しました。これらの結果は、食事性PEWがDSS誘発大腸炎マウスの臨床症状を緩和し、大腸組織における炎症性サイトカインのレベルをダウンレギュレートすることにより、マウスの大腸炎の重症度を軽減する可能性を示していると考えられます。
様々な研究により、UC患者およびDSS誘発大腸炎マウスの大腸粘膜において、NF-κBおよびMAPKシグナル伝達経路が活性化されていることが示されている[43], [44]. これらのシグナル伝達経路の活性化は、p38 MAPK、NF-κB p65などのリン酸化を通じて、UCの発症と進行に寄与している[45]。そこで、NF-κB p65およびp38 MAPKの活性化に対するPEWの潜在的な影響を探索した。その結果、DSS誘発大腸炎マウスの大腸組織では、NF-κBとMAPKsのシグナル伝達経路が活性化していることがわかった。PEWを投与すると、卵タンパク質オボトランスフェリン由来ペプチドIRWがNF-κB p65の核内転位を阻害して抗炎症作用を示すことが判明したのと同様に、NF-κB p65およびp38 MAPKのリン酸化を抑制することができた[22]。NF-κBとMAPKシグナル経路のリン酸化は、かなりの量の炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-6、IL-1βなど）の分泌と遺伝子発現を誘導し、炎症反応を悪化させる可能性があります[46]。本研究では、DSS投与後、大腸炎に罹患したマウスの大腸組織において、炎症性サイトカインTNF-α、IL-6およびIL-1βのmRNA発現が有意に増加し、抗炎症サイトカインIL-10のmRNA発現が減少した。PEWの投与により、大腸炎罹患マウスの大腸組織において、炎症性サイトカインのmRNA発現が有意に低下し、抗炎症性サイトカインのmRNA発現が上昇した。したがって、PEW投与により、NF-κBおよびMAPKのリン酸化が抑制され、炎症性サイトカインの分泌および発現が減少し、腸の炎症が緩和されることが確認されました。
UC時の大腸粘膜への好中球の浸潤は、炎症性サイトカインを大量に分泌して炎症状態を悪化させます[47]。MPOは、炎症や損傷を受けた組織への好中球の浸潤を示す炎症マーカーである。今回の研究では、コントロール群と比較して、DSS誘発大腸炎マウスの大腸組織におけるMPO活性が有意に上昇した（P < 0.05）のに対し、PEWの投与は、大腸組織におけるMPO活性だけでなく、好中球の浸潤も抑制しました。腸内の炎症細胞の活性化は、活性酸素を多く発生させ、組織の損傷や酸化ストレスにつながる。酸化ストレスはIBDの病態生理における基礎的なメカニズムと考えられており、過剰な酸素ラジカルは潰瘍性炎症組織損傷や大腸炎を形成する重要な要因である[48]。MDA、SOD、GSH-Pxのレベルは、酸化ストレスの程度を示す良い指標となる。DSS投与後、大腸炎マウスの大腸組織では、SODとGSH-Pxの活性が低下し、MDAの活性が上昇することがわかりました。過剰なMDAはNOの産生を誘導し、酸素ラジカルを供給し、最終的に大腸組織への多数の炎症細胞の浸潤を引き起こすという研究報告がある[12]。このことは、図1DのH&E染色で示されるように、DSS群のマウスの大腸組織の粘膜に多数の炎症細胞が浸潤していることと一致するものであることが報告された。PEWの投与は、DSS誘発大腸炎マウスの大腸組織におけるMDAおよびNOレベルの増加を抑制し、一方でSODおよびGSH-Pxの活性を低下させた。我々の結果は、マウスへの食事介入により、NO、MDA、T-SOD、MPOの産生を調節し、粘膜バリアの酸化的損傷を修復して大腸炎を緩和した他の研究と一致している[47], [48]. 今回の結果から、PEWによる治療は、酸素ラジカルを消去する能力を与え、腸の酸化ストレスを軽減し、その結果、炎症の影響を緩和することがわかりました。
これまでの研究で、腸内細菌叢の異常がUCの発生と発症に密接に関係していることが示されています[49]。無菌マウスモデルでは、腸内細菌叢が存在しない場合、重度の大腸炎症が誘発されないことが実証された[50]。様々な報告により、UC患者や黄砂誘発動物モデルでは、微生物の多様性と存在量が減少することが示されている[12], [15], [38]．本研究では、PEW投与により、DSS投与マウスと比較して、腸内細菌叢の多様性と存在量が増加したことが確認された。Akkermansiaは、Verrucomicrobiota門、Akkermansiaceae科のグラム陰性で分解性の粘液細菌で、Akkermansia muciniphilaという1種のみが確認されています。Akkermansia muciniphilaは、健康な粘膜と関連しており、上皮細胞層の完全性を強化し、腸の健康に貢献する可能性がある[11], [40]. 本研究では、PEW群の腸内細菌叢におけるVerrucomicrobiota門とAkkermansiaceae科の相対存在量がDSS群のそれよりも高く、これはPEW群でAkkermansia属の相対存在量が高いことに起因すると考えられる。DSS群では、対照群と比較して、Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Blautia、Ruminococcaceaeの相対存在量が減少し、有害細菌であるProteobacteriaの相対存在量が増加したが、これは先行研究 [14], [37], [51] と一致していた。プロテオバクテリアは、エンドトキシンを産生する病原性細菌とされている[52]。腸内のエンドトキシン含有量が増加すると、腸炎、免疫障害、腸管粘膜機能障害など様々な症状を引き起こす可能性があります[53]。また、Yuら[13]は、ラットがPEWを摂取すると、通常のアヒル卵白を与えたラットのケカと比較して、Proteobacteriaの相対存在量が有意に減少することを明らかにしました。
また、Blautiaは、腸管制御T細胞をアップレギュレートし、SCFAを産生することにより、炎症を予防する重要な役割を果たすことが報告されている[54]。Lachnospiraceaeは、毒素を分解し、プロピオン酸を生産する能力を持つことから、有益な微生物と考えられています[55]。酪酸を産生する細菌であるRuminococcaceaeは、大腸における腸管細胞の損傷と炎症性サイトカインの分泌を減少させることにより、大腸炎を改善する可能性がある [18], [29], [38]. Muribaculaceaeは、健康な個人で確認された主な腸内細菌叢で、発酵により酢酸とプロピオン酸を生産する[56]。腸内フローラによって生産されるSCFA（酢酸、プロピオン酸、ブタン酸を含む）は、NF-κB経路を阻害し、次にIL-12、TNF-α、IL-6などの炎症性サイトカインの放出を抑制することによって炎症を緩和することができる[57]。特にブタン酸は、腸管上皮に直接エネルギーを供給し、腸管免疫反応を促進し、腸の免疫機能を向上させ、その結果、全体的に腸を保護するという、人間の健康にとって重要な役割を担っています[58]。我々の研究では、大腸炎に罹患したマウスのケカの酢酸、ブタン酸、総短鎖脂肪酸の濃度は、コントロールグループのマウスの濃度よりもはるかに低いものであった。逆に、PEW投与により、大腸内の酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、総短鎖脂肪酸の濃度が増加した。同時に、DSS群と比較して、PEW投与はLachnospiraceae、Muribaculaceae、Blautia、Ruminococcaceaeの相対存在量を増加させ、Proteobacteria（有害菌）の相対存在量を減少させることがわかりました。この結果から、PEWは腸内細菌叢の組成とその代謝物を調節することにより、マウスの大腸炎の兆候を緩和することが示された。
鳥類の卵に由来するポリペプチドやアミノ酸の中には、抗酸化作用や抗大腸炎作用を示すものがあることが証明されています [28], [59]. 先行研究[26]、[60]、[61]で明らかになったように、卵黄由来のリン脂質と保存卵白の模擬胃腸消化物でCaco-2細胞を前処理すると、酸化ストレスを抑制して抗炎症効果を得ることができた。保存卵白タンパク質は消化管消化後、大部分がポリペプチドと遊離アミノ酸に分解され、他の高分子活性成分と比較して腸内の膜受容体などの標的生体分子と相互作用しやすい[21], [62]。SGD-PEW由来のペプチドDEDTQAMPFR（DR-10）、SLSFASR（SR-7）、MLGATSL（ML-7）、MSYSAGF（MF-7）は、マウスにおける大腸炎の程度を緩和することが示された［28］。また、アミノ酸がTrp、Tyr、His、Metのペプチドは、in vitroおよびin vivoでより強い抗酸化活性を示した[63]。したがって、卵白由来のポリペプチドやアミノ酸が持つ抗炎症作用や抗酸化作用は、大腸炎の症状改善に寄与すると考えられます。一方、保存卵には、in vitroの模擬消化後に未消化の高分子ポリペプチドが含まれていました[64]。未消化のタンパク質やポリペプチドは、さらに大腸の腸内細菌叢によって利用され、細菌の増殖や代謝に必要な基本物質（アミノ酸や窒素など）を供給し、SCFAs生産のための追加基質となる可能性があり [65]、PEWグループにおける糞便SCFAsレベルの上昇を説明することができた。結論
本研究では、DSS誘発大腸炎の改善に対するPEW治療の可能なメカニズムは、主に腸内細菌叢とその代謝物の制御、炎症性サイトカインの抑制、酸化ストレスの制御、NF-κBとMAPK活性化の抑制であることが示された。PEWは、マウスの大腸組織における炎症性細胞の浸潤を抑制するだけでなく、大腸組織の酸化的損傷を修復するために酸化ストレスを制御した。また、PEWは、NF-κB p65およびp38 MAPKタンパク質のリン酸化を抑制することにより、多数の炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-6、IL-1βなど）の分泌および遺伝子発現を抑制し、炎症を抑制しました。最後に、PEWは、マウスの盲腸において腸内細菌叢の組成を改善し、SCFAsの産生を促進することにより、DSS誘発大腸炎を緩和することも確認されました。今後、PEWの特定の有効成分の抗炎症作用における炎症関連シグナル伝達経路や腸内細菌叢およびその代謝物の役割について、さらなる研究が必要である。
利益相反
著者らは、利益相反がないことを宣言する。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（助成番号31772043）、中央大学基礎研究費（プログラム番号2662018JC021）の資金援助を受けている。
付録A．補足資料
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補足資料
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引用元: (1)
高塩分食によって誘発される高血圧のプロセス： 腸管粘膜微生物叢の相互作用との関連、および慢性低悪性度炎症、末端臓器障害
2023年、フロンティア・イン・マイクロビオロジー
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