クロストリジウム共培養における異種細胞融合を介した2つの異なる生物種間のDNA転移
mBioロゴ
ジャーナルホーム
著者紹介
論文紹介
ジャーナルについて
購読者の方へ
ジャーナル
ログイン
戻る
抗菌薬と化学療法
応用・環境微生物学
臨床・ワクチン免疫学
臨床微生物学レビュー
エコサル・プラス
真核細胞
感染と免疫
細菌学ジャーナル
臨床微生物学ジャーナル
微生物学・生物学教育ジャーナル
ウイルス学ジャーナル
mバイオ
微生物学・分子生物学レビュー
微生物学リソース
微生物学スペクトラム
mSphere
mシステム
オープンアクセス
生理と代謝
研究論文
2024年1月12日
クロストリジウム共培養における異種細胞融合を介した2つの異なる生物種間のDNA転移
https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03133-23
著者 Kamil Charubin, John D. Hill https://orcid.org/0000-0001-6127-3238, Eleftherios Terry Papoutsakis https://orcid.org/0000-0002-1077-1277 epaps@udel.eduAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.03133-23
PDF/EPUB
mBio
オンライン・ファースト
概要
はじめに
結果
考察
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
情報＆貢献者
指標と引用
参考文献
図表とメディア
表
シェア
ABSTRACT
原核生物の進化は、ランダム突然変異と水平遺伝子転移（HGT）によって駆動される。HGTは形質転換、形質導入、あるいは抱合を介して起こる。我々は以前、Clostridium acetobutylicumとClostridium ljungdahliiの共栄養性共培養において、異種細胞融合により2つの生物間でタンパク質とRNAが大規模に交換されることを示した。ここでは、異種細胞融合が2つの生物間でDNAの交換を促進するという証拠を提示する。選択的下培養法を用いて、プラスミドを保有するC. ljungdahlii株からプラスミドDNAの一部を獲得し、ゲノムに組み込んだC. acetobutylicum細胞を単離した。この細胞は、C. acetobutylicumとC. ljungdahliiのハイブリッド細胞であることを、限界希釈プレーティングと、PacBioシングルモレキュール・リアルタイム（SMRT）シーケンスに基づくDNAメチル化データによって証明した。これらの知見により、複数種のマイクロバイオーム、その生存戦略、進化についての理解が深まった。
重要性
天然の多種混合マイクロバイオームや合成微生物共培養の研究は、バイオテクノロジー、生態学、医療分野への応用の可能性から、新たな関心を集めている。これまで我々は、C. acetobutylicumとC. ljungdahliiの共培養が異種細胞間融合を起こし、2つの生物間で細胞質タンパク質とRNAの交換が促進されることを明らかにしてきた。我々は今回、2つのクロストリジウム菌の間で異種細胞間融合が起こり、DNAの交換が促進されることを示した。この共培養系に選択圧をかけることで、erm遺伝子を持つプラスミドを持つC. ljungdahlii株からエリスロマイシン耐性（erm）遺伝子を獲得した野生型C. acetobutylicumのクローンを単離した。1分子リアルタイムシークエンシングの結果、erm遺伝子はモザイク状にゲノムに組み込まれたことが明らかになった。また、我々のデータは、ハイブリッドDNAメチル化パターンを示すC. acetobutylicumとC. ljungdahliiのハイブリッド細胞の存続を支持するものであった。
はじめに
細菌をはじめとする単細胞生物の進化は、遺伝子の突然変異と水平遺伝子転移によって促進される(1-4)。突然変異駆動進化では、細胞はランダムな突然変異誘発を受ける。その後、突然変異は娘細胞に受け継がれる。遺伝子の水平転移（HGT）プロセスでは、細胞は他の細胞、多くの場合は異なる種の細胞から移された外来DNAを獲得する(1)。HGTの最初の証拠は1928年に示され、肺炎球菌（感染マウス）が遺伝子DNAの取り込みを通じて病原性遺伝子を交換した(1, 5)。それ以来、多くの遺伝子導入や遺伝子組み換えの例が実験室で実証され、一方、自然界で起こる遺伝子交換は広く行われていると考えられている（1, 4）。細菌間のHGTのメカニズムとして最も研究されているのは、形質転換、トランスダクション、コンジュゲーションなどである。また、ナノチューブ形成（6）や細胞外小胞を介した移動（7, 8）の可能性など、その他のHGTメカニズムも同定されている。
形質転換では、コンピテント細胞がゲノムDNAやプラスミドDNAを環境から取り込む(1, 4)。天然のコンピテントには20～50のタンパク質が含まれ(1)、80以上の生物種で報告されている(3)。人工的なコンピテンスは、化学的処理によって実験室で開発することができる(4)。コンピテント細胞は環境から外来DNAを取り込むことができるため、形質転換には細胞間の接触は必要ない。形質転換では、バクテリオファージによって細胞間のDNA交換が行われる(4)。形質導入の頻度は、生物とファージのペアによって大きく異なり、プラーク形成単位あたり10-3から10-9のオーダーである(9)。この現象は、潜伏していたプロファージがゲノムから切り離される際に、親生物の染色体DNAの一部が偶然パッケージングされることで起こる。細菌のDNAを含むファージは他の細胞と相互作用し、感染することができるため、パッケージ化されたDNAが伝達される(4)。トランスダクションには細胞間の接触も必要ない。コンジュゲーションは、DNAを交換するために2つの細菌細胞が物理的に相互作用する必要があり(1)、大腸菌のようなグラム陰性菌で最も詳細に特徴付けられている。交配には、ドナー細胞とレシピエント細胞を固体表面上で共培養する必要がある。交接機構は、交接プラスミドまたは統合・交接エレメント（ICE）にコードされており、そのサブセットには交接トランスポゾンが含まれる(1, 2, 10)。グラム陰性菌では、供与細胞と受容細胞の間の細胞間接触とDNA交換は、通常、ピラス（交尾対形成装置）を利用するIV型分泌系（T4SS）によって仲介される(1)。ブドウ球菌や腸球菌のようなグラム陽性菌の中には、グラム陰性菌のT4SSと相同なシステムを用いるものもある(2)。グラム陽性菌では、プラスミドと交配ペアに依存して、結合頻度は10-3から10-6の範囲である(11)。クロストリジウム属でも共役プラスミドが同定されており、その例としてクロストリジウム・ペルフリンゲンス（Clostridium perfringens）の共役pCW3様プラスミドがよく研究されている(12)。Tn916/Tn1545ファミリーの共役型トランスポゾンが大腸菌や腸球菌からいくつかのクロストリジウム属に移入されたことが報告されており、その中にはClostridium tetani、Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckiiが含まれ、同属間の移入も報告されている(13-15)。テトラサイクリン耐性とエリスロマイシン耐性を持つTn1545自己固定型トランスポゾンが、C. beijerinckiiからEubacterium cellulosolvensに転移されたことが報告されている(16)。しかし、独立栄養性の酢酸菌であるClostridium ljungdahliiや従属栄養性の溶媒菌であるC. acetobutylicumには、本来の共役系は見つかっていない(2)。分布的共役伝達（DCT）として知られるもう一つの共役形態があり、これは最近発見され、マイコバクテリアで主に研究されている(17, 18)。報告されている分布的共役転移の頻度（参考文献18の表S3）は、ドナー細胞あたり2×10-4から＜10-8、レシピエント細胞あたり2×10-5から＜10-8である。
我々は、C. acetobutylicumとC. ljungdahliiの共栄養共培養において、C. ljungdahliiがC. acetobutylicumと極性的に融合するという、2つの生物間で予期せぬ異種細胞融合が起こることを報告した(19)。このような融合現象は、まず、異種蛍光タンパク質とRNAの勾配が異種蛍光物質の均一な分布につながることで証明されるように、細胞物質の一過性の交換につながり、細胞タンパク質とRNAの大規模な交換を示す。ここでは、この異種細胞融合が、2つの生物間でプラスミドや、場合によっては染色体DNAの交換にもつながるという証拠を示す。プラスミドDNA（p100ptaHalo）は、HaloTagタンパク質（20）を発現するC. ljungdahlii-ptaHalo株から野生型（WT）C. acetobutylicumへの転移に成功した。なぜなら、C. acetobutylicumとC. ljungdahliiのいずれもが自然にコンピテントになりうるという証拠はなく(2, 3)、両者とも形質転換が難しいからである。重要なことに、C. acetobutylicumの制限修飾（RM）システムは、C. ljungdahliiが増殖させたプラスミドでの形質転換を妨げる。どちらの生物も同定可能なコンジュゲーション・マシナリーを持っていないことから、今回報告したDNA交換は、新たに同定された異種細胞間融合（19）を通して起こった可能性が高い。我々はまた、種間媒介によるC. acetobutylicumの抗生物質（エリスロマイシン）耐性の獲得という新しい形態の証拠を提供する。
結果
C. ljungdahlii-ptaHalo株からWT株へのプラスミドDNAの共培養を介した移行
異種細胞融合時にC. ljungdahliiとC. acetobutylicumの間でDNAが移行するかどうかを調べるため、p100ptaHaloプラスミドを持つC. ljungdahlii-ptaHalo株とWT C. acetobutylicumの共培養の4生物学的複製を設定した。p100ptaHaloはHaloTag遺伝子とエリスロマイシン（Erm）耐性遺伝子ermを持ち、両方の生物で増殖・発現が可能である(20)。親株の共培養は、異種細胞の融合を可能にするため、グルコースとフルクトースを含み抗生物質を含まない非選択的共培養培地でセットアップした（19, 21）。最初の2継代は選択的液体培地で継代培養し、続いて選択的寒天プレートにプレーティングし、プレートからコロニーを液体継代培養した。その後の継代では、C. ljungdahlii-ptaHaloからp100ptaHaloを獲得した可能性のあるC. acetobutylicum細胞を選択する一方、C. ljungdahlii-ptaHalo細胞を経時的に除去するために、選択培地を選択した。液体サブカルチャーは、グルコースを含みフルクトースを含まず、Ermを添加した選択的ターボCGM培地で行い、一方、プレーティングはErmを添加した2×YTGプレートで行った。C. ljungdahliiはフルクトース上では生育できるが、グルコース上では生育できず、実際その生育は高濃度のグルコースによって阻害される(21)。WT株のC. acetobutylicumはErmの存在下では増殖できないため、選抜過程でWT株のC. acetobutylicum細胞を排除するために用いた。選択手順は、プラスミドDNA（p100ptaHalo）またはerm遺伝子を獲得した純粋なC. acetobutylicum細胞のコロニーを単離するように設計された。
図1
図1 C. ljungdahlii-ptaHalo細胞からp100ptaHaloプラスミドDNAを獲得したC. acetobutylicum株を共培養で単離するための選抜手順の概要。選抜は、80g/Lのグルコースと5g/Lのフルクトースを含み、エリスロマイシン（Erm）を含まない増殖培地上での4つの親コカルチャー（選抜株／系統）から開始した。副培養継代1および2（PX.1およびPX.2；Xは共培養1～4の開始生物学的複製を示す）は、唯一の炭素源としてグルコースとErmを含む選択液体培地での濃縮継代であった。濃縮培養PX.2のサンプルを選択プレート（Erm、グルコース）にプレーティングし、PtPX.3株のシングルコロニーを同定・分離した。選択サブカルチャーP3.2はプレート上で生存せず、放棄された。選択サブカルチャーP1.3およびP2.3（およびそれに続くすべてのサブカルチャー）はヒートショックに耐えられず、胞子形成能力の欠如を示した。選択サブカルチャーP4.3（およびそれに続くすべてのサブカルチャー）はヒートショックに耐えることができ、胞子形成能を有するC.アセトブチリカム細胞の存在を示した。液体選択培地での各サブカルチャーはPX.#と表し、"X "は親コカルチャーを表し、"#"はそれに続く各サブカルチャー（継代）を表す。選択プレート上のサブカルチャーはPtPX.#と表記する。
各サブカルチャー（継代[P]）はPX.#として識別され、"X "は異なる開始コカルチャー（系統）を表し、"#"は選択培地での後続の各継代を識別する。単一コロニーを単離するために選択培地にプレーティングした継代（継代PX.3から始まる）は、プレート（Pt）番号PtPX.#で表し、これらのコロニーから増殖した浮遊性培養物はPX.#と表記する。このことから、液体培地での共培養1の最初の継代はP1.1で表され、選択プレートでの共培養4の3番目の継代はPtP4.3で表される。各プレーティング(PtPX.#)の後、まばらなプレートから単離されたコロニーをいくつか選び、選択的液体培地(PX.#)で増殖させた。培養で増殖を示したコロニーはすべて、選択的プレートに再度プレーティングし、選択プロセスを続けた。
選択プロセスを開始するため、24時間の増殖後、各親の共培養から15 mLのサンプルをターボCGM培地（グルコースのみ80 g/L、フルクトースなし）で洗浄し、液体選択培地20 mLに移した。共培養サンプルを洗浄し、親共培養増殖培地から残ったフルクトースを除去した。これが1回目のセレクションPX.1である。これらの浮遊性培養物を25時間培養した後、各PX.1選択サブカルチャーからのサンプルを新鮮な液体選択培地に移し、プラスミドを含むC. acetobutylicum細胞をさらに濃縮した（PX.1液体培養物15 mLをスピンダウンし、洗浄後、新鮮な選択培地20 mLに移した）。72時間後、サブカルチャーP1.2およびP2.2からのサンプルを2×YTG選択プレート（プレートサブカルチャーPtPX.3）にストリークし、単一コロニーを単離し、試験した。これらの培養の増殖プロフィールを図S1に示す。サブカルチャーP3.2およびP4.2からのサンプルは、44時間のインキュベーション後にプレート上にストリークした。選択プレートPtPX.3は2日後にコロニーを形成したが、選択プレートPtP3.3はコロニーを形成しなかった。したがって、第3系統は放棄された。このことは、C. acetobutylicum 細胞がプランクトン培養条件下でErmに抵抗する能力を獲得したことを意味する。グルコースを利用できないC. ljungdahlii細胞は、C. acetobutylicumが産生するCO2とH2に基づいて生存したであろう。成功した各選抜プレート（PtP1.3、PtP2.3、PtP4.3）から8～10個のコロニーを選び、液体選択培地（P1.3、P2.3、P4.3）で継代培養した。選択されたコロニーの半分を、標準的なC. acetobutylicum培養法に従って、80℃で10分間熱ショックを与え、胞子形成したC. acetobutylicum細胞を選択し増殖させた。熱ショックによりC. ljungdahlii細胞は死滅し、胞子形成できなくなる。プレートPtP1.3およびPtP2.3のコロニーはヒートショックに耐えなかったが、ヒートショックしなければ液体選択培地で増殖した。プレートPtP4.3のコロニーはヒートショックに耐えられ、液体選択培地で生育した。液体培地で増殖したすべてのコロニーを2xYTG選択プレートにプレーティングし（PtPX.4）、Ermに耐性のC. acetobutylicum細胞を同定する目的で、もう1度サブカルチャープロセスを繰り返した（継代PtPX.5）。最後に、プレートPtP1.5、PtP2.5、およびPtP4.5から得られた4つのコロニーを液体選択培地（P1.5、P2.5、およびP4.5）で培養し、顕微鏡検査、蛍光HaloTag発現のフローサイトメトリー、代謝物分析、およびプラスミドDNAがC. ljungdahlii-ptaHaloからC. acetobutylicum細胞に移行したかどうかを調べるPCRアッセイを用いて分析した。
細胞の表現型は6つの特性（表1）に基づいて評価した：ヒートショックの生存、グルコースのみでの増殖、ブタノールとアセトンの生産、Erm耐性、HaloTag蛍光、イソプロパノールの生産（共培養表現型のみ）(21)（表1）。PtP4.5プレートのコロニーから増殖した細胞のみが、プラスミド特異的なHaloTag蛍光を除き、C. ljungdahlii-ptaHalo株からErm耐性を獲得したC. acetobutylicum細胞の期待される表現型をすべて示した（表1）。P4.5細胞は、ヒートショックを生き延び、グルコースを基質として増殖し、Ermに抵抗性を示し、ブタノールとアセトンを生産した（図S2）。これらはすべて、Erm抵抗性を除いて、WT C. acetobutylicum細胞に特有の特徴である。これらの細胞はC. acetobutylicum細胞に特徴的な溶媒を生産するので、細胞はpSOL1メガプラスミド上にコードされているこれらの溶媒生成遺伝子を含んでいなければならない。pSOL1が欠損するとアスポロゲン性表現型になる(22)ので、ヒートショックに耐える能力はpSOL1の存在をさらに裏付ける。重要なことは、40mMのアセトンが存在したにもかかわらず、P4.5細胞の培養からイソプロパノールが検出されなかったことである（図S2）。少量のアセトンであっても、C. ljungdahlii細胞は容易にイソプロパノールに変換する(21)。P4.5細胞のErm耐性は、単離された細胞にerm遺伝子が存在することでしか説明できない。しかし、P4.5細胞は、赤色ハロタグリガンドJanelia Fluorで標識した場合、赤色蛍光を示さなかった（図S3）。PtP4.3およびPtP4.4プレートから得られた以前の培養液を分析したところ、P4.3細胞の約30％が赤色蛍光を示したが、P4.4細胞は赤色蛍光を示さなかった（図S3およびS4）。したがって、4回目の選択的継代で、細胞は蛍光検出に十分なレベルのHaloTagを産生する能力を失った可能性が高い。これらのデータは、erm遺伝子を持つp100ptaHaloの少なくとも一部がC. acetobutylicumに移入されたことを示している。また、透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、P4.5細胞を形態学的に調べた。24時間培養後、P4.5細胞はWT C. acetobutylicum細胞(19)のような外観を示した。完全に形成された胞子は少数であり（図2A）、事実上すべての細胞が細胞質に大きな半透明領域を示し（図2B）、これは胞子形成の準備のために顆粒が形成されたことを示している。C. ljungdahliの細胞（図S5）は、均一な電子密度の（暗い）植物細胞としてのみ現れ（19）、TEM分析ではそのような細胞は検出されなかった。
表1
表1 最初の共培養に用いた親株（C. ljungdahlii-ptaHaloおよびWT C. acetobutylicum）の表現型チェックリスト、プラスミドDNAを獲得したC. acetobutylicum細胞の予想される表現型（C. acetobutylicum-ptaHalo株と同じ）、およびプレートPtP4.5から単離したクローンの観察された表現型。
特徴的な表現型 C. ljungdahlii -ptaHalo 野生型 C. acetobutylicum C. acetobutylicum -ptaHalo
(p100ptaHalo) PtP4.5 プレートからのコロニー 特異性
ヒートショック生存率 いいえ はい はい C. acetobutylicum
特異的グルコース上での増殖
ブタノールおよびアセトンの生産 いいえ はい はい
4.エリスロマイシン耐性 はい いいえ はい プラスミド
特異的ハロタグ蛍光性 Yes No Yes No
イソプロパノールの生産 いいえ いいえ いいえ いいえ 共培養
特異的
図2
図2 細胞のTEMイメージング。(A、B）PtP4.5プレートのコロニーから増殖した細胞。(A)完全に形成されたC. acetobutylicumの胞子。(B)胞子形成しているWT C. acetobutylicum細胞で予想される白色で半透明の大きな領域であるグラニュロースの形成を示す細胞。PtP1.5（C）とPtP2.5（D）細胞のTEMイメージング。(C)すべての細胞はあいまいな形態をしており、いくらかの分化と顆粒形成（C. acetobutylicum特異的表現型）を示したが、純粋なC. acetobutylicum細胞に期待されるような明確なものではなかった（図S5と比較）。(D)全ての細胞は曖昧な形態をしており、若干の分化と顆粒様形成を示し、いくつかの細胞は例外的に長かった。
P4.5細胞のPCRおよび単一分子リアルタイム（SMRT）（PacBio）解析により、C. acetobutylicumゲノムに組み込まれたerm遺伝子とHaloTag遺伝子の両方を持つC. acetobutylicum細胞であることが同定された。
個々のPtP4.5コロニーから液体培養で増殖させたP4.5細胞の全DNAを、5つのユニークなC. acetobutylicum遺伝子と3つのユニークなC. ljungdahlii遺伝子について検査した(21)。WT C. acetobutylicumゲノムDNAを用いたコントロールPCRでは、C. acetobutylicum特異的プライマーでのみバンド（〜100 bp）が生じた（図3A）。同様に、C. ljungdahliiゲノムDNAを用いたコントロール反応では、C. ljungdahlii特異的プライマーでのみ強いバンド（〜100 bp）が生じた（図3B）。2つのPtP4.5コロニーから増殖したP4.5細胞のPCRアッセイの結果、C. acetobutylicum遺伝子のみが存在した（図3C）。
図3
図3 P4.5細胞におけるC. acetobutylicumとC. ljungdahliiの特徴的遺伝子の存在を調べるためのPCR。3つのC. ljungdahlii (Clj)遺伝子（sadh、23bdh、rho）と5〜6つのC. acetobutylicum (Cac)遺伝子（adc、ctfA、ctfB、adhE1、ネイティブpSOL1メガプラスミドにコードされる主要溶媒形成遺伝子、および主染色体にコードされるthl；パネルAにはfabZ遺伝子も含まれる）を標的とした。(A) C. acetobutylicum特異的遺伝子は、C. acetobutylicumゲノムDNA鋳型から期待される〜100 bpのバンドを生成したが、C. ljungdahlii特異的プライマーは生成しなかった。(B）C. ljungdahlii特異的遺伝子はC. ljungdahliiゲノムDNA鋳型から期待される〜100 bpのバンドを生成したが、C. acetobutylicumプライマーは2つのゲノムのA+T含量が高いため、非特異的結合による弱いバンドを生成した。C）3つのC. ljungdahlii特異的遺伝子と5つのC. acetobutylicum特異的遺伝子について、P4.5細胞のゲノムDNAを検査するために用いたPCRアッセイ。結果は2つのPtP4.5コロニー由来の細胞（P4.5.1およびP.4.5.2）について示した。
PCRアッセイもP4.5の全DNAで行い、3つのプライマーセットを用いてp100ptaHalo由来のerm遺伝子またはHaloTag遺伝子の存在を検査した（図4A）。左（L）セットのE1プライマーと右（R）セットのE6プライマーは、それぞれerm遺伝子の左端と右端の外側に結合し、プラスミドコンテキストにおけるerm遺伝子の位置をプローブすることに留意されたい。erm遺伝子のコントロールPCRは、p100ptaHaloプラスミドを持つC. acetobutylicum株（C. acetobutylicum-ptaHalo株）の全DNAとp100ptaHalo DNAの両方で同一の結果を示した（図4B）。4つのP4.5コロニー（P4.5.1〜P4.5.4）からのDNAをerm遺伝子の存在について検査した。中央(M)と右(R)のプライマーセットを用いたPCRでは期待されるバンドが得られた(Fig. 4B)。左（L）セットのプライマーを用いた反応では、すべてのコロニーで非常に淡いバンドが生じた（図4B）。P4.5細胞はErmに抵抗性であったので、erm遺伝子の配列は完全でなければならない。数個のP4.5細胞は完全なプラスミドを含んでいるかもしれないが、これらの培養物からp100ptaHaloプラスミドを単離する努力はすべて失敗した。このことは、p100ptaHaloの少なくとも一部が、E1プライマーとの結合を破壊するような形でゲノムに組み込まれ、その結果、かすかなLバンドが生じたことを示唆している。このことは、後述のPacBioシークエンシングデータによって裏付けられる。
図4
図4 P4.5細胞におけるp100ptaHaloプラスミド由来のermまたはHaloTag遺伝子の存在を調べるためのPCRアッセイ。(A) p100ptaHaloプラスミド上のermおよびHaloTag遺伝子の左（L）、中央（M）、または右（R）に結合するように3つのプライマー対を設計した。プライマーE1とH1は各遺伝子の左外側に結合し、プライマーE6とH6は各遺伝子の右外側に結合し、試験した細胞内に元のプラスミドバックボーンがまだ存在するかどうかをテストした。両遺伝子について、ネガティブコントロールはWT C. acetobutylicumのゲノムDNAを用い、ポジティブコントロールはC. acetobutylicum-ptaHalo細胞または単離したp100ptaHaloプラスミドからのDNAを用いた。陰性対照、陽性対照およびp100ptaHaloプラスミドの単離のための細胞は、指数期（8時間）または初期定常期（24時間）のいずれかに収穫した。試験したP4.5細胞は、4つのPtP4.5コロニーから培養し、培養24時間目に収穫した。すべてのermおよびHalo PCRアッセイで同量のDNA鋳型を用いた。細胞が指数関数期（8時間）から定常期（24時間）に進むにつれて、遺伝子の再配列やプラスミドの不安定性の問題がないことを確認するために、コントロールの2つの培養時間点をテストした。 B）erm遺伝子を検出するためのPCRアッセイ。試験した4つの細胞サンプルは全て、シャープで強いLバンドを生成しなかった（白矢印）。(C）HaloTag遺伝子の存在を調べるPCRアッセイ。
同じP4.5 DNAサンプルについて、HaloTag遺伝子の存在も検査した。HaloTag遺伝子のコントロールPCRは、C. acetobutylicum-ptaHalo株の全DNAとp100ptaHalo DNAの両方で同一の結果を示した（図4C）。HaloTagアッセイの3つのPCR（L、M、R）はすべて、陽性コントロールのバンドより強度は弱かったものの、試験した4つのP4.5コロニーすべてで期待されるバンドを生じた（図4C）。もしP4.5細胞がHaloTag遺伝子を持っているならば、なぜHaloTagリガンドで標識したときに蛍光を発しなかったのでしょうか（図S2）。P4.5細胞はC. acetobutylicum-ptaHaloに比べてHaloTag遺伝子のコピー数が少ない可能性がある。
1つのPtP4.5コロニーから培養した培養物から得られたPacBioシーケンスデータを解析したところ、erm遺伝子またはHaloTag遺伝子を含む6つのシーケンスリードが確認された。そのうちの3つはp100ptaHaloプラスミドのフルコピーを2つ含み、C. acetobutylicumゲノムDNAは存在しなかった。p100ptaHaloのフルコピーは染色体2,734,720位に挿入され、C. acetobutylicumゲノムDNAを含むリードの両端に〜3,000 bpと〜6,000 bpが存在することが確認され、プラスミドの2.5コピーは染色体671,974位に挿入され、C. acetobutylicumゲノムDNAを含むリードの両端に〜7,000 bpが存在することが確認された。P4.5の塩基配列を解析した結果、プラスミドは2つの遺伝子座で染色体に組み込まれたことが示唆された。プラスミドのゲノムへの統合は、プラスミドDNAのみを含む少数のリードとともに、PCR解析データ、フローサイトメトリーや顕微鏡のデータを裏付けている。PacBioのデータから、P4.5にはerm遺伝子とHaloTag遺伝子のコピーがほとんど存在しないことが示唆され、これはerm遺伝子とHaloTag遺伝子のPCRデータ（図4）と一致している。加えて、HaloTagタンパク質は非常に低レベルであるため、フローサイトメトリーと顕微鏡の両データにおいて、HaloTagリガンド存在下でシグナルが得られなかったことが説明できる（Fig.） PacBioのデータを用いて、pSOL1メガプラスミドを含む完全なC. acetobutylicumゲノムのde novoアセンブルにも成功し、P4.5細胞の表現型の特徴を裏付けることができた。P4.5のシーケンスデータからは、ゲノムC. ljungdahlii DNAを確実に同定することはできなかった。
これらの結果を支持するため、PtP4.3とPtP4.4の各1コロニーからも細胞を培養し、塩基配列を決定した。P4.3のシーケンスデータには、少なくとも500bpのp100ptaHaloを含み、リードの少なくとも一端がC. acetobutylicumゲノムDNAを含む6つのシーケンスリードが含まれていた（C. acetobutylicumゲノム上の525,552、1,325,197、1,823,332、2,702,390、2,779,170、3,413,786に挿入）。P4.4からの4つのリードは、少なくとも500bpのp100ptaHaloを含み、少なくとも一端はC. acetobutylicum DNAを含んでいた（349,946; 780,069; 980,388; and 2,204,734に挿入）。さらに、P4.5とは対照的に、P4.3ではC. ljungdahliのDNAを含むリードが数百本あったが、P4.4ではかなり少なかった。C. ljungdahlii DNAとp100ptaHalo DNAの両方を含むリードはなかったことから、プラスミドがC. ljungdahliiゲノムに組み込まれなかったことが示唆された。これらのデータを総合すると、p100ptaHaloは各サブカルチャー継代で、Ermの圧力下でC. acetobutylicumゲノムにダイナミックに統合されたことが示唆される。P4.3とP4.4にC. ljungdahliのDNAが存在することから、第4系統の初期段階では、両生物のDNAが共存していたことが示唆される。
以上より、C. ljungdahlii-ptaHalo株由来のp100ptaHaloは、C. acetobutylicumへの転移に成功し、P4.5でC. acetobutylicumのゲノムに組み込まれた。我々は、オンラインのMobile Element FinderおよびICEFinderツール(23, 24)を用いて参照ゲノムを検索することにより、C. ljungdahliiには、C. acetobutylicumへのプラスミド転移の原因となりうるネイティブなコンジュゲーション・マシナリーやモバイル・ジェネティック・エレメント(MGE)が存在しないことを確認した。重要なことは、参照C. ljungdahliiゲノムには統合的共役要素（ICE）が含まれておらず、DNA交換が従来の共役を介するものではなかったことである(17)。
P1.5とP2.5の細胞は、C. acetobutylicumとC. ljungdahliiの両方の染色体DNAを含む細胞の証拠を示している。
PtP1.5とPtP2.5のコロニーは、上述のP4.5細胞の表現型と比較して、より複雑で予想外の表現型を示した。PtP1.5とPtP2.5から単離したコロニーを液体選択培地で培養し、解析した。その表現型は純粋なC. ljungdahli株とも純粋なC. acetobutylicum株とも一致しなかった。3回目のサブカルチャー（図1）から、系統1と系統2のコロニーは、C. ljungdahliの場合と同様に、ヒートショックに耐えることができなかった。これらの同じコロニーから得られた細胞は、グルコースのみでの増殖に加え、ブタノールとアセトンの生産など、C. acetobutylicumに似た表現型を示した（P1.5細胞のデータを図S6に示す）。さらに、両者ともErm耐性で、細胞の一部はHaloTag蛍光を示した（P1.5細胞のデータをFig.） 最も驚いたのは、P1.5細胞が高濃度のイソプロパノール（～80 mM力価）を生産したことである（図S6）。これは、C. acetobutylicumとC. ljungdahliiの共培養においてのみ、あるいはC. acetobutylicumとC. ljungdahliiのハイブリッド細胞が存続する場合にのみ可能なはずである（21）。SEM分析（図2CおよびD）は、異常な細胞形態を示した：C. acetobutylicum細胞ともC. ljungdahlii細胞とも異なる超微細構造（図S5も参照）と、生理的に長くない細胞（図S4の非常に長いP4.3細胞と比較）。共培養において、C. acetobutylicumとC. ljungdahlii細胞は異種細胞間融合を起こし、タンパク質とRNAの交換を促進することがわかった(19)。これらのデータから、これらのコロニーから得られた細胞は、C. acetobutylicumとC. ljungdahliiの両細胞の特徴的な遺伝子を含んでいるはずである。
C.ljungdahliiまたはC.acetobutylicum遺伝子と、ermおよびHaloTag遺伝子の存在を調べるために、上記のように詳細なPCR分析を行った。PtP1.5プレートから得られた3つのコロニーから増殖したすべての試験細胞において、PCRデータは、これらの細胞が、C. ljungdahlii遺伝子3つすべて、およびC. acetobutylicum遺伝子5つすべて、ならびにC. acetobutylicum-ptaHalo株（陽性対照）からのゲノムDNAを用いて産生されたものと同様のPCR産物バンド強度を有する完全なerm遺伝子およびHaloTag遺伝子を保持していることを示している（図5）。これらのデータから、P1.5細胞にはerm遺伝子とHaloTag遺伝子のコピーが複数存在し、無傷のp100ptaHaloプラスミドが存在することが示唆された。P1.5細胞には、フローサイトメトリーで検出できるほど強い赤色シグナルを示すレベルでHaloTagタンパク質を発現している小さな集団（1.3％～8.0％）が存在する（図S6）。したがって、少なくとも一部の細胞は、選択過程の過程でp100ptaHaloプラスミドを維持し、発現することができた。これを確認するため、P1.5とP2.5の両方の細胞から、完全なp100ptaHaloプラスミドを簡単に単離することができた。PtP1.5とPtP2.5のそれぞれ1コロニーから増殖した細胞のPacBioシーケンスデータを用いて、PacBio SMRT Link解析によりリードをC. ljungdahliiおよびC. acetobutylicum参照ゲノムにマッピングした。その結果、P1.5とP2.5細胞には、それぞれの種の完全な染色体（溶媒形成の全遺伝子を持つC. acetobutylicum pSOL1ネイティブメガプラスミドを含む）と、完全なp100ptaHaloプラスミドが存在することが示された。P1.5細胞では、p100ptaHalo DNAとC. acetobutylicum DNAの両方が検出されたリードが6つあった。P2.5細胞では、p100ptaHaloプラスミドDNAとC. acetobutylicum DNAの両方を含むリードが44本、p100ptaHalo DNAとC. ljungdahlii DNAの両方を含むリードが5本検出された。さらに、P1.5からは259リード、P2.5からは7,016リードのp100ptaHaloプラスミドが500bp以上同定され、これらの系統のそれぞれからインタクトなプラスミドが分離されたことと一致した。
図5
図5（A）PtP1.5コロニーから増殖した細胞のゲノムDNAを、3つのC. ljungdahlii（青）遺伝子と5つのC. acetobutylicum（赤）遺伝子について調べるPCRアッセイ。2つのコロニーから得られた結果を示す。いずれもC. ljungdahlii（Clj）およびC. acetobutylicum（Cac）特異的遺伝子に対して陽性であった。(B）erm遺伝子の検出に用いたPCRアッセイ。陽性コントロールからのDNAは期待される反応産物（バンド）を生成し、左（L）、中央（M）、右（R）の反応では強い強度を示した。3つのPtP1.5コロニーからのDNA抽出物は3つすべての反応産物（バンド）を産生した；バンドの強度は陽性コントロールと同様であった。(C) HaloTag遺伝子の検出に用いたPCRアッセイ。陽性コントロールのDNAは、左（L）、中央（M）、右（R）の反応に強い強度を示し、期待される反応産物（バンド）を産生した。3つのPtP1.5コロニーから増殖した細胞からのDNAは、期待されるすべての反応産物（バンド）を生成した。バンドの強度は陽性コントロールで観察されたものと同様であった。各PCRには同量のDNA鋳型を用いた。Cac-Halo DNAの陽性コントロールを示すパネルC（HaloTag遺伝子）の左のサブパネルは、図4CのゲノムDNA, 陽性コントロール, Cac-Halo (24 h)の下に示した左のゲルと同じゲル画像である。
DNAメチル化がハイブリッド細胞の存在を裏付ける
PacBioのデータを用いて、P1.5細胞とP2.5細胞における2つのゲノムのDNAメチル化モチーフを調べることで、1つの細胞における異種DNAの存在を裏付けることができる。我々は数年前、PacBioシーケンスデータを用いてC. acetobutylicumのDNAメチル化データを収集し、代謝物ストレス（25, 26）がDNAメチル化に与える影響を調べたことがある。このデータは公表されなかった。今回、実験的に決定されたメチル化モチーフを表S1に示す。C.ljungdahliiについては、実験的に決定されたDNAメチル化モチーフは発表されていないが、REBASEデータベース(27)には予測値がある。それらはGATAAT/GTTAAT（GWTAATと略記、WはAまたはT）およびCAAAAARである。したがって、C. ljungdahliiとC. acetobutylicumは主要なメチル化モチーフを共有している： CAAAAm6ARである。このモチーフは、本研究のすべてのPacBioデータから、C. acetobutylicumとC. ljungdahliiの両方のDNA上に検出された。
系統1、P1.5細胞
両方のゲノムを上記のようにアセンブルした。C. acetobutylicum DNA上では、PacBioデータは期待される（表S1）C. acetobutylicumモチーフを高頻度で検出するが、C. ljungdahliiモチーフは検出しない。C. ljungdahlii DNA上では、PacBioデータはC. ljungdahlii GWTAATモチーフを検出しなかったが、2つのC. acetobutylicumモチーフのうちいくつかは検出した：GCDGC（必須で、正規のC. acetobutylicum DNAメチル化モチーフGm4CDGCAGC/Gm4CDGC）とCTTCAG/CTGAAG。
リネージ2、P2.5細胞
C. acetobutylicum DNAでは、PacBioのデータから予想される（表S1）C. acetobutylicumモチーフが高頻度で検出された。しかし、GWTAAT C. ljungdahliiメチル化モチーフも4つ検出された。C.ljungdahliiのDNAでは、共通のCAAAAARに加えて、PacBioのデータはC. ljungdahliiのGWTAATモチーフの強いメチル化（理論的に可能な約50％）を検出したが、C. acetobutylicumのメチル化モチーフは検出されなかった。
これらのデータは、系統1と系統2の結果が異なることを示唆している。P1.5細胞のC. ljungdahlii DNAのメチル化パターンは、1つの細胞内に2つの生物のDNAが共存していることを示唆しており、そこでは何らかの理由でC. acetobutylicumのメチル化装置が優勢である。これは明らかにさらなる調査が必要である。
クローン選択とDNA交換頻度の推定
上述したように、コロニーはまばらなプレートから選択されたが、厳密なクローン性を確認するための限界希釈に基づくプレーティングは行われなかった。したがって、コロニーには混合細胞集団が含まれている可能性があった。このことをさらに追求し、DNA転移頻度を推定するための定量的なコロニーデータを収集するため、図1のスキーマに基づき、さらに3セットの共培養を行い、成功を収めた。テキストS1に記載したように、限界希釈を用いた選択プレーティングを行ったところ、3つとも明瞭なコロニーを形成した。つの培養から得られたデータ（培養希釈、サンプリング、プレーティングに関して、定量的に最も注意深く行われた）を用いて、DNA転移頻度の最初の推定を行った（詳細はテキストS1に記載）：
ドナー細胞に基づくDNA移入頻度 = (31,200)/8.60 * 1010 = 3.63 * 10-7 (式1)
レシピエント細胞に基づくDNA移入頻度 = (31,200)/2.1 * 1010 = 1.49 * 10-6 (式2)
考察
本研究の目的は、共培養におけるC. ljungdahlii-ptaHaloとWT C. acetobutylicum細胞間のDNA転移の可能性を調べることであった。そこで、C. ljungdahlii-ptaHaloからプラスミドDNAを獲得したC. acetobutylicumを同定するための選抜プロセスをデザインした。その結果、ユニークな表現型を持つ細胞が得られた。まず、PtP4.5コロニーから得られたP4.5細胞は、C. ljungdahlii-ptaHalo株のp100ptaHaloプラスミドからerm遺伝子とHaloTag遺伝子を導入し、C. acetobutylicum細胞の期待される表現型（熱ショック生存、ブタノールとアセトンの生産、イソプロパノールと2,3-ブタンジオールの生産なし、期待されるTEM形態）を有していた。さらに、p100ptaHaloプラスミドDNAはP4.5ゲノムに組み込まれたようである。図4のPCRデータの解釈は、LセットのE1プライマーが常に良好なPCR産物を生成できないような形で、erm遺伝子が染色体上の位置に組み込まれているということである。もしp100ptaHaloプラスミドがインタクトでエピソーム的に維持されていれば、3つのセット（L、M、R）すべてが強いバンドを生成したであろう。PacBioのデータから、プラスミド全体が染色体上の2カ所に統合され（これによりE1プローブが結合できる）、さらにerm遺伝子がプラスミドの残りの部分とは無関係に統合されたことがわかった。これらの後者の統合は、明らかにE1プライマーが結合してPCR産物を生成できないようなものであった。従って、PtP4.5コロニーの細胞から得られたかすかなバンドは、染色体の異なる場所に異なる形で組み込まれたerm遺伝子の産物を示しており、あるものはE1結合を可能にし、あるものは不可能であった。
Halo遺伝子のPCR産物（図4）については、陽性対照と比較してバンドがあまり強くないことから、プラスミドがP4.5細胞内にエピソーム的に存在しないことが示唆される。このことは、PacBioのデータと、これらの細胞からp100ptaHaloプラスミドを単離できないことによって検証された。PacBioのデータは、HaloTagの数コピーが染色体に組み込まれたことを示している。鋳型DNAの総量は一定で、PCRの条件はすべて同じであり、PCR産物の量は鋳型DNA中のHaloTag遺伝子の含有量に比例していたため、どうやらHaloTag遺伝子の総量は、エピソーム的に維持されたプラスミドを含むコントロール細胞の用量よりも少なかったようである。その結果、検出可能な蛍光を発するほどの高レベルのHaloTagタンパク質は存在しなかった。
議論したように、シーケンシングデータのゲノムカバレッジを考慮すると、P4.5細胞ではp100ptaHalo-DNA統合を示すリードは比較的少なかった。リード数が少ないのは、PacBioシーケンシングのために私たちのゲノム施設で採用されている標準的なプロトコルで、6kb以上のリードのみがシーケンシングのために選択されたためと思われるが、p100ptaHalo DNAを含むより大きなDNAリードが生成され、シーケンシングされなかった理由はまだ明らかではない。とはいえ、これらのデータと図4のPCRデータ、P4.3とP4.5のPacBioデータ、そしてP4.5細胞の強い表現型データを組み合わせると、P4.5細胞と第4系統のそれ以前の細胞がp100ptaHaloプラスミドを獲得し、そのDNAを染色体に組み込んだことに疑問の余地はない。P1.5細胞とP2.5細胞では、プラスミドとゲノムC. acetobutylicumとC. ljungdahliiのDNAが混在したPacBioリード数が多かった。これらのデータを総合すると、単一で異なるコロニーを用いたにもかかわらず、複雑なDNA再配列がモザイクDNAを生じさせ、おそらく動的なDNA再配列を伴う混合細胞集団を形成していることが示唆される。しかしながら、コロニーはまばらなプレートから選択されたが、厳密なクローナリティを確認するための限界希釈に基づくプレーティングではなかったことを強調しておく。DNA移入頻度を推定する実験のための限界希釈プレーティングは、ハイブリッド細胞の強力な証拠となったが、これらの細胞は詳細に特徴づける必要がある。とはいえ、P4.5細胞の表現型、PCR、PacBioシーケンスデータ、DNAメチル化解析は、明らかに種間DNA転移と染色体統合を示している。
興味深い観察結果は、図1の全系統が何らかの形でC. acetobutylicumのErm耐性を示したことである。C. acetobutylicumは、全系統の最初の継代培養から、高濃度のErmの存在下でも生き延びた。一つの可能性は、p100ptaHaloプラスミドがWT C. acetobutylicum細胞に即座に導入されたことであろう。もう一つの可能性は、染色体とp100ptaHaloプラスミドの両方を持つハイブリッド細胞が直ちに形成されることで、一次親培養でもそのような細胞が存在する証拠がある（参考文献19の図8）。しかし、このようなハイブリッド細胞が、本研究のサブカルチャーと選択条件下で持続するとは予想できなかった。さらにもう一つの可能性は、共培養条件下でのこれらの生物間のタンパク質やRNAの大規模な交換の一部として、C. ljungdahlii-ptaHaloからWT C. acetobutylicum細胞へのErmタンパク質やmRNAの一過性の転移である（19）。しかし、このようなErmタンパク質やmRNAの一過性の獲得が、その後の選択的な継代培養でどのように持続したかは不明である。
共培養におけるプラスミドDNAの交換と統合は、新しいHGTメカニズムの最初の証拠である。対照形質転換実験では、C. acetobutylicumとC. ljungdahliiの制限修飾系は相容れないことが示され(28)、形質転換ルートによるDNAの移入は不可能であった。両種とも既知のIV型またはVI型分泌系を持たないため、これらの機構を介したDNAの移入は不可能である。EVを介した染色体DNAやプラスミドDNAの移入は、グラム-細胞ではある程度よく報告されており、病原性グラム＋細胞ではごくわずかである(7, 8)が、クロストリジウム菌では報告されていない。グラム陽性菌であるStreptococcus mutansでは、SEMで細胞表面にEVが容易に観察され、SEMで可視化された大量のeDNAナノワイヤーと関連していることがよく知られている(29)。C.アセトブチリカム（C. acetobutylicum）やC. ljungdahliiの単培養や共培養のSEM画像には、このようなSEMで可視化できる特徴は見られなかった。
また、DNAのプロファージ切除および転移を介したトランスダクションの証拠もない。C. ljungdahliiゲノムは、51kbの大きなプロファージと、PHASTERツールで疑わしい、あるいは不完全と判定された3つのプロファージをコードしている(30, 31)。C. acetobutylicumにも65kbの完全なプロファージと9kbの不完全なプロファージがある(30, 31)。もしプロファージの切除がプラスミドDNAの転移に関与しているとすれば、プラスミドはまずC. ljungdahliiの染色体のプロファージ領域付近に組み込まれ、その後切除されてプロファージ遺伝子とともにC. acetobutylicumに転移すると予想された。P4.5細胞からはC. ljungdahliiのDNAは検出されなかった。さらに、C. acetobutylicumとC. ljungdahliiのいずれにおいても、伝統的（対分配的[17, 18]）共役機構を示す証拠はない。分配的接合（DCT）(17, 18)は、マイコバクテリアで最初に実証された種内（すなわち、同じ種の菌株間）DNA転移機構である。これは現在VII型分泌系（当初はESAT-6/WXG100として知られていた）として知られているものを介するもので、減数分裂のようなゲノムモザイクを引き起こし、これによりドナーDNAの複数のセグメントが共移植され、ランダムにレシピエント染色体に組み込まれる。ある意味で、DCTの結果は、今回報告されたDNAの移動と統合に似ているように思われる。DCTを介した種内DNA転移は、固体培地やバイオフィルム上で細胞同士が長時間（18時間以上）直接接触する必要があり、プランクトン培養では起こらない(17)。対照的に、今回報告されたDNAの移動は異なる種間であり、上述したように、それはプランクトン培養で起こるようである。とはいえ、この2つのメカニズムは、構造的および／またはシグナル伝達的な構成要素を共有している可能性がある。細胞間の接触によってDCTが開始されるメカニズムはわかっていないが、タイプVII分泌系のタンパク質によって生成される孔を通してDNAが移動するというモデルが提唱されている(32)。現在、枯草菌をはじめとするいくつかの生物において、多様なVII型分泌系が同定されている(33)。C.アセトブチリカムのVII型と推定される遺伝子は計算機で同定されており(34)、枯草菌のVII型分泌系をもとにさらに多くの相同遺伝子が同定されている(33)が、C. ljungdahliiでは今のところ見つかっていない。しかし、少なくともマイコバクテリアでは、VII型分泌系はレシピエント細胞でのDCTには必須であるが、ドナー細胞では必須ではない(35)。
従って、共培養で観察されたDNAの交換は、C. acetobutylicumとljungdahliiの共培養で起こる細胞間の融合現象によって促進された可能性が高い(19)。これら2つの生物間の細胞融合は、タンパク質とRNAの大規模な交換を促進することが分かっており（19）、したがって、プラスミド-DNA交換も異種細胞融合中に行われたようである。タンパク質とRNAの交換によって、プラスミドDNAの一部が受容生物の制限修飾から逃れることができるのかもしれない。観察された表現型につながった出来事を明確に理解するためには、2つの親細胞からの染色体DNAとプラスミドDNAの存在を単一細胞で可視化する必要がある。そのためには、DNA PAINT技術のような、原核生物では現在利用できない新しいバイオイメージング技術を開発する必要がある(36-38)。遺伝学的研究によって、異種細胞融合の分子メカニズムも解明されるかもしれず、これによってこれらの共培養におけるタンパク質、RNA、DNAの転移のメカニズムがよりよく理解できるようになるであろう。
プラスミドDNAの転移にとどまらず、異種細胞融合は、ほとんどの原核生物ゲノムに組み込まれ、動的に切除と再挿入が可能な移動性遺伝要素の交換も促進するであろう（39, 40）。C. acetobutylicumゲノムには、トランスポザーゼ（CA_RS07810）をコードするIS1595様挿入配列が存在する。C. acetobutylicum ATCC 824は、さらに7つのトランスポザーゼ遺伝子（遺伝子座タグCA_RS01390、CA_RS03555、CA_RS03565、CA_RS03880、CA_RS08330、CA_RS13010、CA_RS18140）をコードしている。1つを除く全てのトランスポザーゼは、早期の停止コドンを含むか、部分的なタンパク質しかコードしていないが、これらのトランスポザーゼの1つ以上が、C. acetobutylicumゲノムへのp100ptaHaloプラスミドの動的な挿入と除去を担っている可能性がある。プラスミドまたはプラスミドの一部が移動している証拠は、PacBioのデータで確認されている。プラスミドは、系統4の異なる世代でゲノム内の異なる位置に挿入されているからである。このように、異種融合事象は新規な細胞構造や表現型をもたらし、原核生物学における新たな進化の軌跡をもたらす可能性がある。
材料と方法
リソースや試薬に関する情報やリクエストは、対応する著者までお願いします。本研究で作製された全てのユニークな試薬・安定な試薬は、対応する著者から入手可能である。
微生物および培地
C. ljungdahlii株（C. ljungdahlii-ptaHalo）とC. acetobutylicum株（C. acetobutylicum-ptaHalo）の蛍光株（C. ljungdahlii-ptaHalo）（20）のC. acetobutylicum（ATCC 824）の単培養、およびそれらの共培養には、ターボCGM培地を用いた（19, 21）。簡単に説明すると、C. ljungdahlii-ptaHalo の単培養に用いたターボ CGM は、5 g/L フルクトースを添加し（組換え株にはエリスロマイシン [Erm; 100 µg/mL]を添加）、20 psig の H2/CO2 混合ガス（80/20%）を封入した密閉ボトルで培養した。C. acetobutylicum 株の単培養および共培養に用いたターボ CGM は、5 g/L フルクトースと 80 g/L グルコースを添加し、培養は密閉していないガラス瓶で嫌気チャンバー内で培養した(19, 21)。
単培養の準備と増殖
WT C. acetobutylicum の凍結ストックを 2×YTG プレートにストリークし、ターボ CGM で培養して種培養を行った (21)。C. ljungdahlii-ptaHaloおよびC. acetobutylicum-ptaHalo凍結ストックを液体ターボCGMに接種し、必要に応じて継代培養して種培養物を作製し、プラスミドDNAを維持するためにErm（100μg/mL）を添加した。培養pHは、C. acetobutylicumの単培養で必要とされる酸死滅を防ぐため、滅菌脱酸素1 M NaOHで12時間増殖後、5.2に調整した（21）。
共培養のセットアップ
C. acetobutylicumとC. ljungdahlii-ptaHaloの共培養は、報告されているように調製した(19, 21)。簡単に説明すると、5 mLの指数関数的に増殖するC. acetobutylicum種子培養物（OD600は1.0-2.0）を、90 mLの指数関数的に増殖するC. ljungdahlii-ptaHalo種子培養物（OD600は0.4-0.6）と混合した。C.ljungdahlii-ptaHalo細胞を5,000rpmでスピンダウンし、新鮮なターボCGM培地で2回洗浄して残存するErmを除去した後、共培養のセットアップに使用した。DNA導入に使用した共培養は、プラスミドを保有するC. ljungdahlii-ptaHalo細胞を過剰に確保するため、共培養開始時のC. ljungdahlii細胞とC. acetobutylicum細胞の比率をRとし(21)、～10で調製した(21)。共培養は、嫌気チャンバー内の非加圧静置100mLガラス瓶で行い、総液量は30mLとした。各共培養のpHは、酸死滅を防ぐため、増殖後～12時間後に滅菌脱酸素NaOHで5.2に調整した(21)。
選抜手順
最初の（親）共培養を24時間行った後、C. ljungdahlii-ptaHalo株からp100ptaHaloプラスミド（HaloTag遺伝子とErm耐性遺伝子[erm]を持つ；詳細は参考文献20を参照）を獲得したC. acetobutylicum細胞を分離するために、選択用のサンプルを集めた。選択は液体培地と固体プレートで行った。液体選択培地は、グルコース80g/L、フルクトース無添加、Erm100μg/mLを含むターボCGM培地であった。液体選抜培養は、密閉していない100mLボトルで嫌気チャンバー内で行った。プレート選抜は、グルコース5 g/L、フルクトース無添加、Erm 100 µg/mLの2×YTGプレートで行った。液体および固体選択の間、高濃度のグルコース（C. acetobutylicumの基質）のみが存在し、フルクトース（C. ljungdahliiの基質）は存在しないため、選択の過程でC. ljungdahlii-ptaHaloが除去される一方で、C. acetobutylicum細胞で元の共培養サンプルが濃縮されると予想された。選択培地にはErm（100μg/mL）も含まれており、選択プロセス中にWT C. acetobutylicum細胞を除去し、時間をかけて共培養でプラスミドp100ptaHalo DNA（またはその一部）を獲得したC. acetobutylicum細胞のみを単離する。選択プロセスを開始するために、各母体共培養のサンプル15 mLをターボCGM培地（グルコースのみ80 g/L、フルクトースなし）で洗浄し、液体選択培地20 mLに移した。共培養サンプルを洗浄し、共培養増殖培地から残ったフルクトースを除去した。これが最初の選択継代 PX.1である（図1）。24時間の増殖後、各PX.1培養から15mLのサンプルを回収し、洗浄後、新鮮な20mLの選択液体培地（継代PX.2）に移した。72時間培養後、P1.2およびP2.2培養物からのサンプル1mLを2xYTG選択プレート（PtPX.3）にストリークし、単一コロニーの分離と試験を開始した。P3.2およびP4.2培養液を44時間培養した後、1mLのサンプルを選択プレートにストリークした。選択プレートPtP3.3を除き、37℃で2日間培養後、各選択プレートはコロニーを形成した。各選抜プレートから複数のコロニー（8-10個）を取り出し、液体選択培地（80g/Lグルコース、100μg/mL Erm）で培養した。選択したコロニーの半分を80℃で10分間熱ショックし（標準的なC. acetobutylicum培養技術による）、各プレートのコロニーが胞子形成できるかどうかを調べた。液体選択培地で増殖したすべてのコロニーを、2×YTG選択プレート（プレートPtPX.4）に再度ストリークし、このプロセスをもう1回繰り返して（プレートPtPX.5）、各クローンをさらに濃縮した。プレートPtP1.5、PtP2.5、PtP4.5のコロニーを選択液体培地で増殖させ、顕微鏡、フローサイトメトリー、HPLC、PCR分析用の細胞を作製した。
透過型電子顕微鏡
培養から得られたサンプルは、24 時間の増殖後に採取し、0.1 M カコジル 酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）中の 2%グルタルアルデヒドと 2%パラホルムアルデヒドで固定し、さらに 処理するまで 4℃で保存した。TEMサンプルの処理と画像化は、記載されたとおりに行った(19)。
共焦点蛍光顕微鏡
サンプルは増殖24時間後に採取し、HaloTag特異的Janelia Fluor646 redリガンドで標識した(19, 20)。標識した細胞をポリ-L-リジンでコートしたNunc Lab-Tekチャンバースライドに入れた。細胞をポリ-L-リジンコーティングに固定化するため、1時間インキュベートした。1時間後、チャンバーをPBSで3回洗浄し、余分な細胞を除去した（19, 20）。固定化した細胞は、共焦点Carl Zeiss LSM880顕微鏡を用いて画像化した。各サンプルは63×/1.4対物レンズを用いて撮影した(19, 20)。
フローサイトメトリーと細胞の蛍光標識
培養細胞からサンプルを回収し、HaloTag特異的Janelia Fluor 646 redリガンドで標識した(19, 20)。フローサイトメトリー解析は、記載されているように行った（19, 20）。CytoFlex S（Beckman Coulter社製）フローサイトメーターを用いて、2つの生物のOD600と細胞数の関係（テキストS1）を求めた。
HPLC による代謝物分析
細胞を液体選択培地（Turbo CGM、グルコース 80 g/L、フルクトース無添加、Erm 100 µg/mL）で 40 時間培養し、12 時間ごとに pH を調整して pH を約 5.2 以上に保ち、培養細胞の発酵プロフィールを決定した。サンプルは約10～12時間ごとに採取し、HPLC分析を行った(21)。
分離クローンからのプラスミド単離
プラスミドの単離にはNucleoSpin Plasmid Mini Kit（Macherey-Nagel）を用い、製造元のプロトコールに従った。完全なp100ptaHaloプラスミドが存在するかどうかを調べるために、各試験サンプルから得られたプラスミド調製物を、標準形質転換プロトコールに従って、化学的にコンピテントなNEB 5α大腸菌細胞に形質転換した。形質転換後、大腸菌細胞を37℃で1時間インキュベートした後、各形質転換体150μLを100μgのアンピシリンを添加したLBプレートにプレーティングした（p100ptaHaloプラスミドには大腸菌形質転換用のAmpRマーカーが含まれていた）。LBプレートを37℃で24時間培養し、大腸菌のコロニーを発育させた。PtP1.5およびPtP2.5のコロニーから開始した培養から調製したプラスミドは、大腸菌のコロニーを形成し、これらのサンプルに完全なプラスミドDNAが存在することを示した。PtP4.5のコロニーから開始した培養からのプラスミド調製物は、コロニーを生成しなかったことから、完全なプラスミドがこれらの細胞に存在しないことが示された。
ゲノムおよびプラスミドDNAのPCR分析
結果に記載した様々なプレートの明確なコロニーから細胞を接種し、細胞が光学密度1.0-2.0になるまで液体選択培地で培養した。採取した細胞はDNA抽出に使用した。ゲノムDNAとプラスミドDNAは、DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Germany)を用いて、グラム陽性菌(21)の手順に従ってPCR分析用に培養物から抽出した。プラスミドDNAはNucleoSpin Plasmid DNA Kit (Macherey-Nagel, Germany)を用いて抽出した。各PCRには同量のDNA鋳型を用いた。
P1.5およびP4.5細胞から抽出したDNAを、まず、選択された5つのC. acetobutylicum遺伝子（adc、ctfa、ctfb、adhe、およびthl）および3つのC. ljungdahlii遺伝子（sadh、23bdh、およびrho）を標的とするプライマーを用いたPCRによって試験し、選択プロセス中に各系統で純粋なC. acetobutylicumが単離されたかどうかを決定した。選抜されたC. acetobutylicumおよびC. ljungdahlii遺伝子のスクリーニングに用いたプライマーは報告されている(21)。PCRはgreen 2× Taq polymerase master mix (Fisher, MA)を用いて行った。各反応は以下の条件下で行った：95℃での最初の5分間の変性；95℃での30秒間の変性、65℃での30秒間のアニーリング、72℃での30秒間の伸長を25サイクル；72℃での5分間の伸長で終了。すべてのプライマーセットは、同じアニーリング温度65℃になるように設計された。
P1.5およびP4.5細胞からのゲノムおよびプラスミドDNAサンプルも、HaloTagおよびエリスロマイシン耐性（erm）遺伝子の存在について検査した。アッセイ用に選択された個々のコロニーを、光学密度が1.0～2.0になるまで液体選択培地で培養した。各培養から採取した細胞をゲノムDNA抽出に用いた。各遺伝子に対して3つのプライマーセットが設計され、左のペア（L）は遺伝子の5′末端と遺伝子の左側に位置するプラスミドバックボーンDNAにまたがり、中央のペア（M）は各遺伝子の真ん中の領域にまたがり、右のペア（R）は遺伝子の3′末端と右側に位置するプラスミドバックボーンDNAにまたがった。これを図4に視覚的にまとめた。プライマー配列を表S2に示す。PCRは緑色の2×Taqポリメラーゼマスターミックス（Fisher, MA）を用いて行った。erm遺伝子（L、M、R）の各反応は以下の条件で行った：最初の変性は95℃で5分間、続いて95℃で30秒の変性、53℃で30秒のアニーリング、72℃で35秒の伸長を25サイクル行い、最後に72℃で5分間の伸長を行った。HaloTag遺伝子（L、M、R）の各反応は、これらのプライマーペアのアニーリング温度が53℃であることを除き、上記と同じ条件で行った（表S2）。各増幅反応5μLをアガロースゲル上で行った。ゲルはChemiDoc XRS+ Gel Imaging System（Biorad）を用いて画像化した。
全ゲノムSMRT PacBioシーケンスとバイオインフォマティクス
単離したコロニーをErm添加TCGM培地で一晩培養し、高分子量（HMW）DNAをMagAttract HMW DNA Kit（Qiagen）を用いて製造元の指示に従って単離した。1分子リアルタイムシークエンシングはUniversity of Delaware DNA Sequencing and Genotyping Centerで行った。SMRTbell DNAライブラリーは、記載されているように構築した(41)。ライブラリーのサイズは6 kbから選択し、平均ライブラリーサイズは10 kbとした。DNA シークエンシングは、PacBio Sequel II Single-Molecule Sequencer (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA)を用い、P4-C2ケミストリー、マグビーズローディング、3時間のムービータイムで行った。各サンプルのリードは、SMRTポータルからSMRT Analysis version 10.1を用いてコンティグにアセンブルした。PacBio SMRT Tools v10.1のCCS（Circular Consensus Sequence）ツールを用いて、各サンプルのPacBioデータのサブスレッドからコンセンサス配列を算出した。DNAメチル化解析は、記載されているように行った(41)。次にCCSリードをBLASTn（v2.11.0）を用いてerm遺伝子、HaloTag遺伝子、p100ptaHaloプラスミド全体にアライメントした（42）。次に、erm遺伝子、HaloTag遺伝子、プラスミドのいずれかの連続する500塩基対以上にアライメントしたリードをC. acetobutylicum参照ゲノム(GCF_000008765.1)にマッピングし、minimap2(v2.1)(43)を用いて統合可能部位を同定した。これらのリードはまた、BLASTnを用いてC. acetobutylicum参照ゲノムにアラインメントし、アラインメント長と同一性パーセントでフィルタリングした。さらに、リードをC. ljungdahli参照ゲノム(GCF_000143685.1)にマッピングし、どのリードがC. ljungdahliにC. acetobutylicumよりもよくマッピングされ、C. ljungdahliのみにマッピングされるかを同定することにより、各サンプル中のC. ljungdahli DNAの存在を調べた。プラスミドを含むC. ljungdahlii DNAの存在は、プラスミドが500塩基対以上連続するPacBioリードを、BLASTnを用いてC. ljungdahlii参照ゲノム（GCF_000143685.1）にアライメントすることで調べた。オンラインツールのICEFinder、Mobile Element Finder、PHASTERを用いて、C. acetobutylicum ATCC 824およびC. ljungdahlii DSM 13528の参照ゲノムを検索し、それぞれ統合型・結合型エレメント、移動性遺伝エレメント、プロファージについて調べた（23, 24, 30, 31）。
謝辞
本研究は、陸軍研究局からの助成金（W911NF-19-1-0274）、契約AR0001505に基づくARPA-Eプロジェクト、およびE.T.P.が利用可能な無制限の機関資金の支援を受けた。J.D.H.は、助成金P200A210065に基づく米国教育省GAANNフェローシップの一部支援を受けた。顕微鏡装置は共有機器助成金（助成金S10 OD016361）で取得し、NIH-NIGMS（助成金P20 GM103446）、NSF（助成金IIA-1301765）およびデラウェア州からの支援を受けた。UD Center for Bioinformatics and Computational Biology Bioinformatics Core FacilityおよびBIOMIX計算クラスタの使用は、Delaware INBRE（NIH NIGMS P20 GM103446）、デラウェア州、およびDelaware Biotechnology Instituteからの資金援助により実現した。
TEMおよび共焦点顕微鏡を手伝ってくれたUD Bio-Imaging CenterのShannon ModlaとJeffrey L. Caplan、PacBioシーケンシングを手伝ってくれたUD DNA Sequencing & Genotyping CenterのOlga Shevchenko、PacBioシーケンシングデータ解析を手伝ってくれたUD CBCBのMadolyn MacdonaldとShawn Polson、フローサイトメトリーを手伝ってくれたPapoutsakis研究室のYin Zouに感謝する。Qinghua Wang、Keerthi Prasad Venkataramanan、Cathy H. Wuには、表S1のデータをサポートしたC. acetobutylicum PacBioデータ収集とDNAメチル化解析を手伝ってもらった。特にGwendoly Gregoryには、PacBioシーケンシングのためのDNA単離とデータ解析、シーケンシングデータのデポジション、および原稿作成にご協力いただいた。
E.T.P.はこのプロジェクトを発案した。E.T.P.とK.C.は実験をデザインし、K.C.はE.T.P.とともに培養実験を行った。J.D.H.はDNA転移頻度の推定を可能にするため、限界希釈プレーティングによる共培養実験を行った。E.T.P.、K.C.、J.D.H.がデータを解析し、原稿を執筆した。
補足資料
テキストS1 - mbio.03133-23-s0001.docx
クローン性プレーティングを用いたDNA導入頻度の計算。
ダウンロード
42.31 KB
図S1 - mbio.03133-23-s0002.docx
細胞密度。
ダウンロード
105.54 KB
図S2 - mbio.03133-23-s0003.docx
PtP4.5プレートのコロニーから増殖した細胞の代謝物プロファイル。
ダウンロード
200.27 KB
図S3 - mbio.03133-23-s0004.docx
PtP4.3、PtP4.4、PtP4.5プレートから分離したコロニーから増殖した細胞のフローサイトメトリー分析。
ダウンロード
244.17 KB
図S4 - mbio.03133-23-s0005.docx
P4.3細胞の共焦点蛍光イメージング。
ダウンロード
1.43 MB
図S5 - mbio.03133-23-s0006.docx
様々な株と種の形態の比較。
ダウンロード
2.49 MB
図S6 - mbio.03133-23-s0007.docx
2つのPtP1.5コロニーから培養した細胞の代謝物プロファイルと2つの培養のフローサイトメトリー解析。
ダウンロード
1.47 MB
図S7 - mbio.03133-23-s0008.docx
プラスミド導入効率の定量化。
ダウンロード
2.18 MB
表S1 - mbio.03133-23-s0009.docx
公開されているPacBioシーケンスデータを用いたClostridium acetobutylicumのDNA修飾モチーフ。
ダウンロード
44.93 KB
表S2 - mbio.03133-23-s0010.docx
HaloTagおよびエリスロマイシン耐性（erm）遺伝子PCRアッセイに使用したプライマーペア。
ダウンロード
41.31 KB
ASMは、論文にリンクされている、または論文を通じてアクセスできる補足資料の著作権を所有しません。著者はASMに対し、補足資料ファイルを公開するための非独占的かつ世界的なライセンスを付与しています。再利用を希望される場合は、対応する著者に直接ご連絡ください。
参考文献
1.
Thomas CM, Nielsen KM. 2005. 細菌間の水平遺伝子転移のメカニズムと障壁。Nat Rev Microbiol 3:711-721.
Crossref
PubMed
ISI研究所
Google Scholar
2.
Grohmann E, Muth G, Espinosa M. 2003. グラム陽性菌における共役プラスミド転移。Microbiol Mol Biol Rev 67:277-301.
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
3.
Johnston C, Martin B, Fichant G, Polard P, Claverys J-P. 2014. Bacterial transformation: Distribution, shared mechanisms and divergent control. Nat Rev Microbiol 12:181-196.
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
4.
Low KB, Porter DD. 1978. 細菌における遺伝子導入と組換えの様式。Annu Rev Genet 12:249-287.
クロスレフ
ISIについて
Google Scholar
5.
グリフィス F. 1928年。肺炎球菌型の意義。J Hyg 27:113-159.
引用文献へ
相互参照
PubMed
Google Scholar
6.
Dubey GP, Ben-Yehuda S. 2011. 細胞間ナノチューブは細菌のコミュニケーションを媒介する。Cell 144:590-600.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
7.
Ben-Hur S, Biton M, Regev-Rudzki N. 2019. 細胞外小胞：微生物遺伝子導入のための普及ツール？Proteomics 19:e1800170.
クロスレフ
ISI
Google Scholar
8.
Hosseini-Giv N, Basas A, Hicks C, El-Omar E, El-Assaad F, Hosseini-Bheshti E. 2022. 細菌細胞外小胞とその健康およびがんにおける新規治療応用。Front Cell Infect Microbiol 12:962216.
クロスレフ
国際標準化機構
Google Scholar
9.
Popa O, Landan G, Dagan T. 2017. Phylogenomic networks reveal limited phylogenetic range of lateral gene transfer by transduction. ISME J 11:543-554.
Crossref
PubMed
生物間相互作用
Google Scholar
10.
Wozniak RAF, Waldor MK. 2010. 統合エレメントと結合エレメント：動的な横方向の遺伝子フローを可能にするモザイク状の移動性遺伝エレメント。Nat Rev Microbiol 8:552-563.
クロスレフ
PubMed
ISI社
Google Scholar
11.
Grohmann E, Muth G, Espinosa M. 2003. グラム陽性菌における共役プラスミド転移。Microbiol Mol Biol Rev 67:277-301.
引用文献へ
引用
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
12.
Wisniewski JA, Rood JI. 2017. クロストリジウム・パーフリンゲンスのTCP結合系。Plasmid 91:28-36.
引用文献へ
クロス
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
13.
Woolley RC, Pennock A, Ashton RJ, Davies A, Young M. 1989. Tn1545とTn916のClostridium acetobutylicumへの転移。プラスミド 22:169-174.
引用文献へ
クロスレフ
ISI
Google Scholar
14.
Bertram J, Strätz M, Dürre P. 1991. グラム陽性菌とグラム陰性菌間の共役トランスポゾンTn916の自然転移。J Bacteriol 173:443-448.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
15.
Volk WA, Bizzini B, Jones KR, Macrina FL. 1988. Streptococcus faecalisとClostridium tetani間のTn916の属間および属内移行。Plasmid 19:255-259.
引用文献へ
引用文献
国際標準化機構
Google Scholar
16.
Anderson KL, Megehee JA, Varel VH. 1998. セルロース分解菌Eubacterium cellulosolvensへのトランスポゾンTn1545の共役導入。Lett Appl Microbiol 26:35-37.
引用文献へ
引用文献
国際標準化機構
Google Scholar
17.
Gray TA, Derbyshire KM. 2018. Blending genomes: Distributive conjugal transfer in mycobacteria, a sexier form of HGT. Mol Microbiol 108:601-613.
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
18.
Gray TA, Krywy JA, Harold J, Palumbo MJ, Derbyshire KM. 2013. このような遺伝子座のマッピングを行うことで、交配同一性遺伝子座のマッピングが可能になる。PLoS Biol 11:e1001602.
遺伝子発現
パブコメ
ISI社
Google Scholar
19.
Charubin K, Modla S, Caplan JL, Papoutsakis ET. 2020. クロストリジウムの共培養における種間微生物融合と細胞質タンパク質およびRNAの大規模交換。
クロスレフ
PubMed
Google Scholar
20.
Charubin K, Streett H, Papoutsakis ET. 2020. ハロタグおよびSNAPタグタンパク質を用いたClostridium acetobutylicumおよびClostridium ljungdahliiの強力嫌気性蛍光レポーターの開発。Appl Environ Microbiol 86:e01271-20.
クロスレフ
PubMed
ISI社
Google Scholar
21.
Charubin K, Papoutsakis ET. 2019. 合成Clostridium syntrophyにおける細胞間物質の直接交換により、CO2固定、優れた代謝産物収量、および代謝空間の拡大が可能になる。Metab Eng 52:9-19.
クロスレフ
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
22.
Cornillot E, Nair RV, Papoutsakis ET, Soucaille P. 1997. Clostridium acetobutylicum ATCC 824におけるブタノールおよびアセトン生成の遺伝子は大きなプラスミド上に存在し、その欠損により菌株が変性する。J Bacteriol 179:5442-5447.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI社
Google Scholar
23.
Johansson MHK, Bortolaia V, Tansirichaiya S, Aarestrup FM, Roberts AP, Petersen TN. 2021. 新たに開発したウェブツール：mobileelementfinderを用いたサルモネラ菌の抗生物質耐性に関連する移動性遺伝要素の検出。J Antimicrob Chemother 76:101-109.
クロスレフ
PubMed
ISI社
Google Scholar
24.
Liu M, Li X, Xie Y, Bi D, Sun J, Li J, Tai C, Deng Z, Ou H-Y. 2019. Iceberg2.0：細菌の統合・結合エレメントの最新データベース。Nucleic Acids Res 47:D660-D665.
Crossref
PubMed
ISIデータベース
Google Scholar
25.
Venkataramanan KP, Jones SW, McCormick KP, Kunjeti SG, Ralston MT, Meyers BC, Papoutsakis ET. 2013. ストレスに応答するClostridium small RNome: C. acetobutylicumにおける毒性代謝物ストレスのパラダイムと重要性。BMC Genomics 14:849.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
ISI社
Google Scholar
26.
Venkataramanan KP, Min L, Hou S, Jones SW, Ralston MT, Lee KH, Papoutsakis ET. 2015. Clostridium acetobutylicum（クロストリジウム・アセトブチリカム）における代謝物ストレス応答のプロテオミクスとトランスクリプトミクスの統合解析により明らかになった、複雑かつ広範な転写後制御。Biotechnol Biofuels 8:81.
引用文献へ
論文
パブコメ
桑原 淳
Google Scholar
27.
REBASE. 2022. Re3Data.Org： REBASE; editing status 2022-12-16; Re3Data.Org - Registry of research data repositories. https://doi.org/10.17616/R3J930 から入手可能。
引用文献へ
Google Scholar
28.
Charubin K. 2021年。合成クロストリジウムと合成栄養クロストリジウムの共培養は、優れた代謝、細胞融合、物質交換、ハイブリッド菌の形成を可能にする。博士号取得。University of Delaware, Newark, DE.
引用
グーグル・スカラー
29.
Liao S, Klein MI, Heim KP, Fan Y, Bitoun JP, Ahn S-J, Burne RA, Koo H, Brady LJ, Wen ZT. 2014. Streptococcus mutans（ミュータンスレンサ球菌）の細胞外DNAは、バイオフィルムでの増殖中にアップレギュレートされ、膜小胞を介して能動的に放出され、タンパク質分泌装置の構成要素に影響される。J Bacteriol 196:2355-2366.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
30.
Arndt D, Grant JR, Marcu A, Sajed T, Pon A, Liang Y, Wishart DS. 2016. PHASTER: a better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Res 44:W16-21.
Crossref
パブコメ
ISI社
Google Scholar
31.
Zhou Y, Liang Y, Lynch KH, Dennis JJ, Wishart DS. 2011. PHAST：高速ファージ検索ツール。Nucleic Acids Res 39:W347-52.
クロスレフ
パブコメ
ISIについて
Google Scholar
32.
Rivera-Calzada A, Famelis N, Llorca O, Geibel S. 2021. VII型分泌系：構造、機能、輸送モデル。Nat Rev Microbiol 19:567-584.
引用文献へ
引用
パブコメ
ISI研究所
グーグル
33.
Tassinari M, Doan T, Bellinzoni M, Chabalier M, Ben-Assaya M, Martinez M, Gaday Q, Alzari PM, Cascales E, Fronzes R, Gubellini F. 2022. 枯草菌の抗菌性VII型分泌系：シュードキナーゼYukc/Essbの構造と相互作用。
クロスレフ
パブコメ
Google Scholar
34.
デスヴォーM、カーンA、スコット・タッカーA、チャウドゥリRR、パレンMJ、ヘンダーソンIR。2005. Clostridium acetobutylicum ATCC 824におけるタンパク質分泌系のゲノム解析。Biochim Biophys Acta 1745:223-253.
引用文献へ
論文
パブコメ
ISI社
グーグル
35.
Gray TA, Clark RR, Boucher N, Lapierre P, Smith C, Derbyshire KM. 2016. 細胞間コミュニケーションと結合は、マイコバクテリアのESX分泌系によって媒介される。Science 354:347-350.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI社
グーグル
36.
Filius M, Cui TJ, Ananth AN, Docter MW, Hegge JW, van der Oost J, Joo C. 2020. タンパク質支援DNA-PAINTを用いた高速超解像イメージング。Nano Lett 20:2264-2270.
引用文献へ
引用文献
国際標準化機構
Google Scholar
37.
Geertsema HJ, Aimola G, Fabricius V, Fuerste JP, Kaufer BB, Ewers H. 2021. 核内の超解像イメージングを向上させる左手DNA-PAINT。Nat Biotechnol 39:551-554.
引用文献へ
クロスリファレンス
ISI
Google Scholar
38.
Nieves DJ, Gaus K, Baker MAB. 2018. DNAベースの超解像顕微鏡法： DNA-PAINT. Genes 9:621.
引用文献へ
クロスレフ
ISI
グーグル・スカラー
39.
Scott J, Thompson-Mayberry P, Lahmamsi S, King CJ, McShan WM. 2008. A群レンサ球菌におけるファージ関連変異体表現型。J Bacteriol 190:6290-6301.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
40.
Ramisetty BCM. 2019. "細菌の「接地」プロファージ：遺伝的刷新とイノベーションのホットスポット". Front Genet.
引用文献へ
クロスレフ
ISI
グーグル・スカラー
41.
Sandoval NR, Venkataramanan KP, Groth TS, Papoutsakis ET. 2015. 進化したClostridium pasteurianum株の全ゲノム配列から、ブタノール生産量の増加と優れた増殖の原因となるSpo0Aの欠損が明らかになった。Biotechnol Biofuels 8:227.
クロスレフ
ISI社
Google Scholar
42.
Camacho C, Coulouris G, Avagyan V, Ma N, Papadopoulos J, Bealer K, Madden TL. 2009. BLAST+: アーキテクチャとアプリケーション。BMC Bioinformatics 10:421.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISIの概要
グーグル
43.
Li H. 2018. Minimap2: 塩基配列のペアワイズアライメント。Bioinformatics 34:3094-3100.
引用文献へ
Crossref
PubMed
ISIの概要
グーグル
全文表示|PDFダウンロード
推奨
合成栄養クロストリジウム共培養における種間微生物融合と細胞質タンパク質およびRNAの大規模交換
MBio, 2020
合成栄養クロストリジウム共培養における種間微生物融合と細胞質タンパク質およびRNAの大規模交換
MBio, 2020
ハロタグおよびSNAPタグタンパク質を用いたクロストリジウム・アセトブチリカムおよびクロストリジウム・リュングダフリの強力嫌気性蛍光レポーターの開発｜応用環境微生物学分野
応用環境微生物学, 2020
CXXCフィンガータンパク質1（CFP1）は、ゲノムH3K4me3シグネチャーの再構築と肺腺がんの進展を橋渡しする
タオ・ファンら、シグナル伝達と標的治療、2023年
生体内におけるiPSCの腫瘍原性リスク：芽のうちに摘み取る
Chaoliang Zhongら、Precision Clinical Medicine誌、2022年
神経細胞ヒストンメチル化酵素EZH2は、マウスにおける神経細胞の形態形成、シナプス可塑性、認知行動を制御する
Mei Zhangら、Neuroscience Bulletin誌、2023年
掲載元
アメリカ微生物学会ロゴ
ASMジャーナルロゴ
ジャーナル
抗菌薬と化学療法
応用・環境微生物学
臨床およびワクチン免疫学
臨床微生物学レビュー
エコサル・プラス
真核細胞
感染と免疫
細菌学ジャーナル
臨床微生物学ジャーナル
微生物学・生物学教育ジャーナル
ウイルス学ジャーナル
mバイオ
微生物学・分子生物学レビュー
微生物学リソース
微生物学スペクトラム
mSphere
mシステム
リソース
Microbiologyについて
著者センター
アクセス許可
ASMジャーナルコレクション
出版倫理
移行情報
広告
ASMメンバーシップ
プライバシーポリシー
会員規約
所有権に関する通知
非商用TDMライセンス
いつでもつながる
アラート
RSSフィード
お問い合わせ
ASMコミュニティ
ニュース
プレスリリース
ポリシーステートメント
著作権 © 2024 米国微生物学会
PDF
ヘルプ
この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？