微生物のトリプトファン代謝異常はSARS-CoV-2の急性炎症反応と長いCOVIDに関連する

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腸内細菌 第16巻 2024年 -第1号


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研究論文

微生物のトリプトファン代謝異常はSARS-CoV-2の急性炎症反応と長いCOVIDに関連する

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2024.2429754#d1e429

ルー・ヤオ

,

ハンナ・デヴォッタ

,

李俊慧

,

ノンフラ・ルンジャニ

,

コリンナ・サドリエ

,

アオングス・ラヴェル

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論文 2429754｜2024年7月18日受理、2024年11月08日受理、オンライン公開：2024年11月17日

要旨

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）感染に対する防御と長期のCOVIDリスクは、腸内マイクロバイオーム内の特定の分類群の枯渇または過剰発現と関連している。しかし、これらの影響を媒介する微生物のメカニズムはまだわかっていない。われわれは、トリプトファンおよびその下流の誘導体の微生物産生が変化することで、ウイルス感染に対する不適切な免疫応答に関与している可能性があると仮定した。COVID-19で入院した患者（n=172）において、トリプトファンとインドール-3-プロピオン酸（IPA）の血清レベルは、多くの炎症性メディエーター（C反応性蛋白や血清アミロイドAを含む）の血清レベルと負の相関を示した、 一方、C-グリコシルトリプトファン（C-Trp）、インドール-3-乳酸（ILA）およびインドール-3-酢酸（IAA）レベルは、急性期タンパク質、炎症性サイトカイン、アラミンおよびケモカインのレベルと正の相関を示した。同様のパターンが長期COVID患者（n=20）でも観察され、トリプトファンとIPAは多くの血清サイトカインと負の相関を示したが、C-TrpとIAAは循環サイトカインレベルと正の相関を示した。糞便微生物叢のメタゲノム解析から、トリプトファン産生に必要な微生物酵素（アントラニル酸合成酵素など）をコードする遺伝子と微生物によるトリプトファン代謝の相対的な存在量は、COVID-19入院患者（n＝380）では健常対照群（n＝270）と比較して有意に低いことが示された。微生物トリプトファン代謝産物は、in vitroにおける細胞質DNAセンサーStimulator of interferon genes（STING）、toll-like receptor（TLR）-3およびTLR-4刺激に対する自然細胞の炎症反応を低下させ、IL-10分泌は亢進した。微生物トリプトファン代謝産物は、生体外でもヒトリンパ球の反応を変化させ、TH1およびTH17関連サイトカインの産生を制限する一方、IL-22の分泌を促進した。これらのデータは、腸内微生物によるトリプトファン産生およびトリプトファン代謝のレベルが低いと、感染に対する自然および適応応答が損なわれるため、SARS-CoV-2感染による重篤かつ慢性的な転帰のリスクが高まる可能性があることを示唆している。トリプトファン代謝のマイクロバイオーム能力が低い患者をスクリーニングすることで、リスクのある患者を同定できる可能性がある。

キーワード

はじめに

共生微生物群集を持つ哺乳類の進化は、宿主の生理学的および病理学的プロセスに影響を与える代謝経路の絡み合いをもたらした。ヒトの血中代謝産物の60％以上が宿主の遺伝または腸内細菌叢のいずれかと有意に関連しており、これらの関連性のうち69％は微生物叢のみによってもたらされると推定されている1。 引用2,引用3例えば、タウリン、ヒスタミン、スペルミンなどの微生物叢由来代謝産物は、NLR Family Pyrin Domain Containing 6（NLRP6）インフラムソームシグナル伝達、上皮IL-18分泌、粘膜IL-4応答、好酸球活性化を調節することが示された。 引用4-6ヒト樹状細胞を細菌由来の脂質12,13-ジヒドロキシ-9Z-オクタデセン酸（12,13-diHOME-リノール酸代謝のオキシリピン末端生成物）で処理すると、抗炎症性サイトカインの分泌とTreg細胞の数が減少したことから、この代謝物が免疫寛容を阻害していることが示唆された。 引用7対照的に、短鎖脂肪酸（SCFA）は樹状細胞によるIL-10分泌を促進し、制御性T細胞（Treg）の数と有効性を増加させ、骨髄造血に影響を与え、エフェクターT細胞の活性を低下させ、上皮バリアーを改善し、肥満細胞と2型自然リンパ球（ILC2）の活性化を抑制する。 引用8-12SCFAは、GPR41、GPR43、GPR109AなどのGタンパク質共役受容体（GPCR）に結合し、エピジェネティックな修飾を介してその効果を発揮する。食事、宿主、微生物由来のトリプトファン誘導体は、この代謝的クロストークの象徴である。 引用16-18トリプトファンは、セロトニン（5-HT）経路とキヌレニン経路という2つの主要な宿主経路を通じて代謝されるが、微生物はトリプトファン代謝に続いて、さまざまなインドール誘導体を生成することができる。 引用20-22ヒトマイクロバイオームの複雑さとその膨大なコード化の可能性から、これらの例は、宿主免疫系に対する微生物叢の作用を媒介する、さらなる細菌産生分子を系統的に同定する根拠となる。実際、ある系統的解析では、ヒトマイクロバイオーム内に3,000を超える低分子生合成遺伝子クラスターが同定された。引用23驚くべきことに、これらの遺伝子クラスターの大半はそれ以上研究されておらず、上述の代謝産物でさえ、ヒトにおけるその影響に関するメカニズムや因果関係の情報は限られている。

SARS-CoV-2 のようなウイルスに感染すると、無症状の反応から急性の呼吸困難や死に至るまで、多種多様な転帰をたどる可能性がある。Citation24,Citation25しかし、重症COVID-19の危険因子がいくつか同定されている（年齢、肥満など）が、重症化に寄与する病態生理学的メカニズムは完全には解明されていない。第二に、SARS-CoV-2による炎症反応を制御できないために、過剰なレベルの炎症分子が血管系を損傷し、臓器機能を制限し、恒常性維持機構と修復機構を制限する。さらに現在では、ウイルス感染の長期的な影響（長期COVID）が、最初のウイルス感染から何年にもわたって複数の臓器系に影響を及ぼす可能性があることが分かっている。

Citation31-36。これらの研究は、SARS-CoV-2のような感染因子に対する反応の成功には腸内細菌叢が関与しており、微生物由来の代謝産物が自然免疫反応および適応免疫反応に及ぼす影響によって媒介される可能性があるという概念を支持している。本研究では、トリプトファンとその下流代謝産物の微生物産生が、多臓器不全や長期のCOVIDを引き起こす炎症性サイトカインや可溶性メディエーターの壊滅的な過剰産生を抑制する可能性があると仮定した。われわれは、以前発表したCOVID-19入院患者、長期COVID患者、健常ボランティアのサイトカインとメタボロームデータを再分析し、特に微生物のトリプトファン代謝物に注目した。 COVID-19入院患者では、トリプトファンの生合成と代謝に必要な微生物遺伝子の存在量が低いことが明らかになった。最後に、これらの微生物のトリプトファン代謝産物がウイルス感染に関連する炎症反応を調節することをin vitroモデルを用いて示す。

結果

COVID-19および長期COVID患者における微生物トリプトファン代謝物の血清レベルの変化

SARS-CoV-2感染による循環代謝産物やサイトカインの大きな違いはすでによく報告されているが、我々は免疫活性化と微生物トリプトファン代謝産物との関連に注目した。IPAとIAAの血清レベルは、SARS-CoV-2感染の入院患者（n=172）では健常対照者（n=29）と比べて低く、重症患者において最も低かったが、ILAレベルはCOVID-19患者では低かったが、感染によって致命的な転帰をたどった患者では低かった（図S1）。血清トリプトファン濃度は、主に食事からの摂取と宿主代謝による利用の複合結果を反映しており、トリプトファン濃度はCOVID-19の重症度と負の相関を示した。C-Trpはトリプトファンの宿主炭素指向性グリコシル化に由来し、C-Trpレベルは重症度と正の相関があった（図S2）。微生物由来のインドールは肝臓で5-ヒドロキシインドール硫酸（H5S）と3-インドキシインドール硫酸（I3S）に代謝され、COVID-19患者では両者とも低レベルで存在したが、そのレベルは重症度とは相関しなかった（図S3）。微生物のトリプトファン代謝産物レベルの差は、長期のCOVID患者（2つの時点でn= 20）でも依然として明らかで、トリプトファンとIPAのレベルは対照群（n= 20）よりも一貫して低かったが、C-TrpとIAAのレベルは対照群よりも有意に高かった（図S4）。この研究に含まれる長期COVID患者は、WHOの基準-SARS-CoV-2初感染から3ヵ月後に新たな症状が継続または発症し、これらの症状が少なくとも2ヵ月間持続し、他の説明がつかない-に従って選択された。

微生物トリプトファン代謝物と血清サイトカインとの相関性

微生物のトリプトファン代謝がSARS-CoV-2感染時の免疫活性化の特異的パターンと関連するかどうかを調べるために、代謝物と血清サイトカインの相関解析を行った（n= 172 COVID-19患者とn= 29対照）。多くの循環サイトカインがCOVID-19の重症度とともに増加することを以前に示した（図S5）。トリプトファンとIPAの循環レベルは、多くの炎症性メディエーター（CRPやSAAを含む）、胸腺間質リンパポエチン（TSLP）アラミンレベル、細胞遊走因子（可溶性細胞間接着分子（ICAM）-1や単球走化性タンパク質（MCP）-1など）と負の相関を示した（）。対照的に、C-Trp、ILA、IAAの循環レベルは、急性期タンパク質、炎症性サイトカイン、アルマーミン、ケモカインと正の相関があった()。H5SとI3Sは、急性期タンパク質レベルと負の相関を示し、TH17反応に関連する免疫メディエーターと正の相関を示した。同様のパターンが長期のCOVID患者（n=20患者、n=20対照）でも観察され、トリプトファンとIPAは多くの血清サイトカインと負の相関を示したが、C-TrpとIAAは循環サイトカインレベルと正の相関を示した（）。ILA、H5S、I3Sは特定のサイトカインと負の相関を示した（）。

図1. トリプトファン代謝物はサイトカインレベルと相関する。

急性COVID-19患者（a）および長期COVID患者（b）において、血清トリプトファン代謝物と血清サイトカインレベルは、ピアソン相関計算および多重比較補正による両側p値を用いて相関する。赤は負の相関、青は正の相関を示す。Trp-トリプトファン；IPA-インドール-3-プロピオン酸；C-Trp-C-グリコシルトリプトファン；ILA-インドール-3-乳酸；IAA-インドール-3-酢酸；H5S-5-ヒドロキシインドール硫酸；I3S-3-インドキシル硫酸。*p< 0.05;**p< 0.01;***p< 0.001

腸内細菌叢におけるトリプトファン代謝関連遺伝子の同定

トリプトファン関連酵素を特異的にコードする遺伝子の相対的存在量とCOVID-19との関連を調べるために、COVID-19重症度との腸内細菌叢関連に関するメタ解析に含まれる8件のショットガンメタゲノム研究を調べた（補足表S1）。年齢、体格指数（BMI）、性別は対照群とCOVID-19患者でほぼ同じであったが、重症のCOVID-19患者は有意に年齢が高く、男性が多かった。COVID-19患者では対照群と比較して抗生物質の使用頻度が高かった。各患者の入院後の最初のサンプリング・タイムポイントのみを対象とした。バイオインフォマティクス解析の一貫性を確保するため、すべてのメタゲノムシーケンスデータを再処理し、HUMAnN3を用いて遺伝子ファミリーとパスウェイについて機能プロファイリングを行った。トリプトファン代謝に関与する遺伝子はMetaCycCitation37を用いて同定し、解析のために同定した遺伝子を補足表S2に示した。

表1. メタゲノム研究解析のための参加者メタデータ。

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微生物は、コリスメートなどの植物や微生物の代謝中間体からトリプトファンを生成することができ、またトリプトファンを代謝して幅広いインドール化合物に変換することもできる。合計で、トリプトファンの生合成（5遺伝子）と代謝（14遺伝子）に関連する19の遺伝子が、マイクロバイオームが解析された個体（n= 650）の10％以上で検出された。検出可能なトリプトファン生合成または代謝遺伝子を持つ個体の割合は遺伝子ごとに異なり、100％から14％の範囲であった（補足表S3）。興味深いことに、トリプトファン生合成に必要な5遺伝子の相対存在量は、トリプトファン代謝に関与する遺伝子よりも高かった（）。加えて、5つのトリプトファン生合成遺伝子全ての相対存在量は互いに高い相関があった。このことは、5つの遺伝子全てが通常単一のオペロンに位置しているか、あるいはおそらく近縁の微生物に限定されていることを示唆しているのかもしれない（）。IAAldからIAAへの代謝に関与する5つの遺伝子の第2グループの相対存在量レベルもまた、互いに密接に相関していた（）。19遺伝子の相対存在量は、年齢、BMI、抗生物質の使用とは関連していなかった（補足表S4）。1遺伝子（1.1.1.21 - アルドース還元酵素）の相対存在量は、雄と比較して雌で有意に高かったが、残りの18遺伝子の相対存在量は性別の影響を受けなかった（補足表S4）。

図2. 微生物のトリプトファン代謝遺伝子。

健常ボランティアとCOVID-19患者（n= 650）におけるトリプトファン代謝に関連する19遺伝子の相対存在量を示す（a）。(b)相対的存在量が互いに相関する遺伝子の2つのクラスターを示すピアソン相関行列。数字はピアソン相関係数。IAA - インドール-3-酢酸；IAAld - インドール-3-アルデヒド。

COVID-19患者では微生物トリプトファン生合成遺伝子の相対量が減少している。

トリプトファン生合成に焦点を当てたパスウェイ解析を行ったところ、COVID-19患者（n= 380）では健常対照（n= 270）と比較して、また重症のCOVID-19患者では軽症/中等症（）と比較して、パスウェイ遺伝子の占有率とパスウェイの完全性が有意に減少していることが示された。トリプトファン生合成の低下は、各研究で個別に解析した場合にも観察されたため、この差は研究特有の要因によるものではなかった（図S6）。パスウェイ解析に加え、各経路ステップの遺伝子数を評価した。コリスメートからのトリプトファン合成に必要な5つの遺伝子のうち、trpD（アントラニル酸合成酵素をコードする）の相対的存在量は、健常対照群（n= 270）と比較してCOVID-19患者（n= 380）で有意に低かった（）。入院中の軽症/中等症患者（n= 217）および重症/致死的COVID-19患者（n= 49）ではレベルが低かった。アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼとインドール-3-グリセロール-リン酸合成酵素をコードするトリプトファン生合成経路のさらに下流で作用する遺伝子の発現量は、対照群と比較して重症のCOVID-19患者では有意に低かった（）。

図3. トリプトファン生合成のための微生物遺伝子。

(a)トリプトファン生合成クラスターの全遺伝子の相対存在量は、COVID-19患者では対照群と比較して、また重症患者では軽症/中等症患者と比較して有意に減少していた。(b) 微生物のトリプトファン生合成経路が図示され、各遺伝子にはE.C.番号が付されている。COVID-19患者または重症患者において有意差のある遺伝子の相対的存在量が強調表示され、有意差のある遺伝子についてはドットプロットが含まれる。結果は平均値と標準偏差で表した。群間の差はKruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定を用いて計算した。*p< .05;***p< .001;****p< .0001

微生物トリプトファン代謝遺伝子の相対量はCOVID-19患者で変化している。

トリプトファンからインドールへの微生物代謝に関与する14の遺伝子が解析された。これらの遺伝子のうち、1遺伝子の相対存在量はCOVID-19患者では対照と比較して有意に高く、4遺伝子は患者と対照で同レベルであったが、9遺伝子の相対存在量はCOVID-19患者の腸内細菌叢で有意に減少していた（）。トリプトファンのインドール-3-ピルビン酸（IPYA）への代謝に必要な酵素の一つであるグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼをコードするaspC遺伝子の相対存在量は、COVID-19患者で有意に高かった。一方、COVID-19患者では、IAAldからインドール-3-エタノール（IEt）、IAAldからIAA、インドール-3-アセトアミド（IAM）からIAA、トリプタミンからIAAldへの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の相対量が有意に低かった（）。重要なことは、アルドース還元酵素とアルデヒド酸化酵素をコードする遺伝子の相対量が、重症のCOVID-19患者で有意に低かったことである。

図4. トリプトファン代謝の微生物遺伝子。

KEGG微生物トリプトファン代謝パスウェイが図示され、解析に含まれる各遺伝子についてE.C.番号が記載されている。COVID-19患者、または重症患者において有意差のある遺伝子の相対量は黒枠で強調し、関連するドットプロットは有意差のある遺伝子について矢印で結んである。結果は平均値と標準偏差で表した。グループ間の差は、クラスカル・ワリス検定とダンの多重比較検定を用いて計算した。*p< .05;**p< .01;***p< .001;****p< .0001

微生物トリプトファン代謝産物は自然抗ウイルス免疫応答に直接影響する

微生物のトリプトファン代謝産物のレベルの変化が、感染に関連する宿主の免疫応答に直接影響するかどうかを調べるために、これらのトリプトファン代謝産物で刺激した免疫細胞のin vitro培養を行った。

インターフェロン制御因子3（IRF3）は、ウイルス感染に対する自然免疫応答の調整に重要な役割を果たすインターフェロン制御転写因子である。環状ジヌクレオチド[G(2',5')pA(3',5')p](2'3'-cGAMP)を用いて、細胞質DNAセンサーであるStimulator of interferon genes STINGを活性化し、TANK-binding kinase 1 (TBK1)/IRF3経路を介してI型インターフェロンを誘導した。I3S、IPA、IAA、ILAをTHP-1細胞と共培養したが、1000μMまでは細胞生存率に有意な影響を与えなかった（データは示さず）。I3S、IPAおよびIAAは、ILAではなく、THP-1細胞における2'3'-cGAMP誘発IRF3活性化を有意に減少させた（）。さらに、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（Poly I:C-二本鎖RNAに構造的に類似）を用いて、THP-1細胞でレチノイン酸誘導性タンパク質1（RIG-I）/メラノーマ分化関連遺伝子5（MDA5）刺激を介してIRF3を活性化した。2'3'-cGAMPの活性化と同様のパターンが観察され、I3Sが最も抑制的で、IPA、IAA、ILAがそれに続いた（）。対照的に、細胞表面TLR-4のリポ多糖（LPS）刺激後のTHP-1細胞における核内因子κB（NF-kB）活性化は、I3S、IPA、IAA、ILAの影響を受けなかった（図S7）。

図5. 微生物トリプトファン代謝産物は免疫細胞応答に影響を与える。

代謝物は10、100、1000μMで細胞と共培養した。(a) THP-1細胞におけるIRF3の活性化（n= 4）。(b) ポリI:C刺激によるPBMCのサイトカイン分泌（n= 4）。(c）LPS刺激によるPBMCのサイトカイン分泌（n= 4）。(d）抗CD3および抗CD28はPBMCによるサイトカイン分泌を刺激した（n= 6）。(e) CD4+T細胞（n= 6）による抗CD3および抗CD28刺激サイトカイン分泌。結果は、刺激された陽性コントロールからの変化率として示し、平均値および標準偏差で表した。IPA - インドール-3-プロピオン酸；ILA - インドール-3-乳酸；IAA - インドール-3-酢酸；I3S 3-インドキシル硫酸。*p< .05

ヒト末梢血単核球（PBMC）をPoly I:CまたはLPSで刺激し、サイトカイン分泌を測定した（2'3'-cGAMPはPBMCからの有意なサイトカイン分泌を誘導しなかった）。I3Sは、Poly I:Cで誘導されたインターフェロン(IFN)-α、IFN-β、インターフェロンガンマ誘導タンパク質(IP)-10のPBMCからの分泌を減少させる最も強力な代謝物であった()。IAAとIPAもポリI:C刺激によるサイトカイン分泌を減少させたが、I3Sに比べ高用量が必要であった。ILAは1000μMでのみIFN-βとIP-10の分泌を減少させ、IFN-αの分泌には影響を及ぼさなかった。I3SとIAAは、100μMでLPS刺激による炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子（TNF）-αのPBMC分泌を有意に減少させたが、試験した4つの代謝産物すべてが1000μMでTNF-α分泌を減少させた（）。対照的に、I3S、IPA、IAAおよびILAは、試験した最低用量である10μMでも、制御性サイトカインであるIL-10のPBMC分泌を促進した（）。

微生物トリプトファン代謝物はリンパ球ポリクローナル免疫応答に直接影響する

最後に、PBMC（）または精製CD4+リンパ球（）を抗ヒトCD3およびCD28抗体で活性化し、リンパ球サイトカイン分泌を刺激した。IAAとIPAはIFN-γの分泌を有意に減少させたが、I3S、IAA、IPAは、刺激PBMCに用いた最高用量でIL-17Aの分泌を減少させた()。対照的に、I3S、IPAおよびILAは、上皮バリア機能に重要なサイトカインであるIL-22の分泌を促進した。同様の反応が精製CD4+リンパ球でも観察され、IAAとIPAはIFN-γの分泌を減少させ、4つの代謝産物すべてがIL-17Aの分泌を用量依存的に減少させた()。I3SはCD4+T細胞からのIL-22の分泌を促進し、IAAはIL-22の分泌を減少させた（）。

は、この研究で得られた知見を図式化したものである。

図6. 微生物のトリプトファン代謝産物の循環レベルは、炎症マーカーおよびCOVID-19重症度と相関していた。同様に、入院中のCOVID-19患者では、トリプトファン合成および代謝酵素をコードする細菌遺伝子の相対的存在量が過小であった。細菌由来のインドールは、IL-10とIL-22の分泌を促進し、IRF3を介する転写を減少させ、IP-10、インターフェロン、IL-17の分泌を減少させることによって、活性化免疫細胞応答を変化させた。

考察

本研究では、トリプトファンおよび微生物が生成したトリプトファン代謝産物が、入院中のSARS-CoV-2に対する免疫応答の調節障害と関連し、これらの関連は、COVIDの長い患者において、感染後6ヵ月以上経過しても明らかであった。COVID-19患者では、トリプトファンを生成・代謝する遺伝子のレベルが低下しており、トリプトファン代謝異常とインドールレベルの変化に寄与している可能性がある。また、これらの代謝産物の多くが、ウイルス感染によって刺激される自然反応や適応反応に影響を及ぼし、in vivoでのレベルの変化が、調節不全の炎症反応や関連する組織損傷に寄与している可能性があることも示した。

トリプトファンのレベルと代謝は、炎症、代謝、免疫反応、神経機能など、複数の生理学的プロセスの最適な制御と関連している。引用14,引用19トリプトファンの血清レベルは、食事摂取量と3つの代謝経路（キヌレニン経路、5-ヒドロキシトリプタミン経路、インドール経路）の活性に影響されることが知られている。実際、COVID-19患者におけるインターフェロン誘導性インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）経路の活性亢進はよく報告されており、この経路がCOVID-19患者におけるトリプトファンの著しい枯渇の原因となっている可能性が高い。 引用38最近、ウイルス感染モデルマウスにおける小腸を介した食事性トリプトファンの吸収低下が、血清トリプトファン濃度の低下に寄与していることが示された。腸内で微生物が生成したトリプトファンは、宿主の血清トリプトファン濃度に大きく寄与することはないだろうが、微生物が生成したトリプトファンは微生物の代謝に利用可能であり、潜在的には粘膜内の宿主免疫細胞の代謝にも利用可能かもしれない。注目すべきことに、抗生物質による腸内細菌叢の減少、およびそれに伴うトリプトファン代謝への影響は、おそらく自然免疫細胞における炎症シグナル伝達を促進することによって、インフルエンザワクチン接種による抗体応答の誘導を阻害することが示されたCitation40。

トリプトファンに加えて、COVID-19患者と長期COVID患者では、IPA濃度が多くの循環サイトカインと逆相関していたことから、特にIPAがウイルス感染に対する炎症反応の調節に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。IPAはもっぱら腸内細菌叢によって産生されるため、食事パターンと同様に腸内細菌組成の変化がIPA産生に影響を及ぼす可能性がある。引用41,引用42IPAはすでに、ヒトにおける多くの代謝および免疫介在性疾患に関与していることが示唆されている。 引用44多くのトリプトファン代謝物がAhRを活性化する一方で、IPAはプレグナンX受容体（PXR）を介してシグナルを伝達することもできる。引用45 試験管内アッセイでは、IPAがIFN-αとIFN-βの分泌を減少させるなど、自然ウイルスセンサーとポリクローナルT細胞応答の活性を有意に調節することが示された。一方では、1型インターフェロン応答はウイルス感染からの防御に重要であり、実際にSARS-CoV-2は免疫回避戦略として1型インターフェロン応答に拮抗する。おそらく、IL-10やIL-22のような、免疫調節やバリア機能を促進するサイトカインの分泌を、1型インターフェロンの部分的な抑制と同時に促進することが、ウイルスによる組織障害からの保護に重要なのかもしれない。ウイルス誘発炎症に対するIPAの効果を支えるシグナル伝達機構をさらに解明し、IPAが感染経過の初期に有益か後期に有益かを決定するためには、今後の研究が必要である。

引用48-50全体として、種の多様性と豊かさは、マラウイ人やアメリカ原住民と比較して、アメリカ人では約3分の1に減少していることが示されている。 引用51植物性またはペスカタリアンの食事を定期的に摂取している成人は、重度のCOVID-19を発症する可能性が低いようである。引用52-54しかし、このような正の相関をもたらす特定の植物性基質（食物繊維の種類、脂肪酸、ポリフェノールなど）は不明である。トリプトファンの微生物による生合成は、コリスミン酸の利用可能性に依存しており、コリスミン酸はシキメート経路を介して生成される。今後の研究で、植物由来のコリスメート摂取量がCOVID-19の重症度と相関するかどうかを評価することは興味深い。

注意すべきいくつかの限界がある。本研究に組み入れられたCOVID-19の患者数は比較的少数であり、そのため本研究で得られた知見の一般化には限界がある。特に、ここで報告した長期COVID患者集団は急性疾患中に入院しており、多くの長期COVID患者はSARS CoV2感染の軽症経過後に発病している。今回の知見が、急性感染時に入院していない長期COVID患者にも関連するかどうかはまだわからない。微生物代謝産物とサイトカインレベルの相関解析は、関連性を示すものであり、必ずしも因果関係を示すものではない。SARS-CoV-2感染前の微生物トリプトファン代謝には、食事、薬物、合併症、ライフスタイルなど、複数の交絡因子が影響している可能性がある。

SARS-CoV-2に感染すると、無症候性反応から急性呼吸困難や死亡に至るまで、さまざまな転帰をたどる可能性がある。この研究は、微生物のトリプトファン代謝のような寛容促進分子とエフェクター分子の欠如が、不十分な免疫トレーニングと、SARS-CoV-2感染のようなチャレンジに不適切に反応する過敏な免疫系をもたらすという概念を支持している。これらの免疫調節代謝産物は、免疫系の意思決定過程に期待され、進化的に組み込まれたものである。今後の臨床研究では、早期の抗ウイルス防御反応を促進し、多臓器不全につながる炎症性サイトカインや可溶性メディエーターの壊滅的な過剰産生を抑制する負のフィードバック機構をサポートする、微生物由来のトリプトファンとインドールの産生促進に焦点を当てるべきである。特に、トリプトファンを産生する微生物を適切な食事補助食品（コリスメートなど）と組み合わせて補充することは、急性感染症に対する異常な炎症反応を予防し、COVIDが長い患者のような慢性症状を有する患者の炎症の解消を促進するための新規の標的アプローチとなる可能性がある。

材料と方法

メタボロームとサイトカインの相関

入院中のCOVID-19患者（n=174）、長期COVID患者（n=20）、および健常ボランティア（n=29）について、特に微生物のトリプトファン代謝物に着目して、以前発表したサイトカインおよびメタボロームデータを再分析した。簡単に説明すると、HD4プラットフォームを使用してMetabolonにより患者血清のアンターゲットメタボロミクスが実施された。各サンプルの代謝物ピークはarea-under-the-curveを用いて定量した。データは、実験サンプルの生のピーク値をテストされた全サンプルの中央値で割ることによって各代謝物について正規化され、結果は中央値スケールのデータとして示される。また、血清中の54種類のサイトカインと成長因子のレベルも調べた（MSDマルチプレックスキットを使用し、製造元の指示に従って）、 IL-16、IL-17A、IL-17A/F、IL-17B、IL-17C、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、TNF-α、TNF-β、IFN-γ、IP-10、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MCP-1、 MCP-4、Eotaxin、Eotaxin-3、TARC、MDC、TSLP、CRP、SAA、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、sTie-2、Flt-1、sICAM-1、sVCAM-1、bFGF、PIGF、GM-CSF。ピアソン相関はGraph Pad Prismを用いて計算し、統計的有意性は両側検定を用いて推定した。タイプIエラー率は、ボンフェローニ法を用いて多重比較を補正することでコントロールした。

メタゲノム解析

トリプトファン経路に関連する遺伝子の相対的存在量とCOVIDの状態との関連を調べるため、これまでに発表された8件のショットガンメタゲノム研究（補足表S1）Citation33、Citation34、Citation57-62を対象とした。患者はCOVIDとコントロールのいずれかに分類され、COVIDの重症度によって分類された。重症度はメタデータに含まれるピーク時の重症度に基づいた。軽度および中等度の重症度は、重度および重篤と同様にグループ化された。重症度データがない（PRJNA689961、PRJNA714459）、または重症度症例数が偏っている（PRJNA740067）ため、3つのコホートを重症度解析から除外した。解析は、パスウェイの存在量および遺伝子ファミリーのデータに由来する相対的存在量データを用いて実施した。メタゲノムシーケンスデータからEnzyme Commission（EC）番号を抽出するためにHUMAnN3ソフトウェアを利用したCitation63HUMAnN3は、シーケンスリードをEC番号で表される既知の酵素機能にマッピングすることにより、微生物群集の機能プロファイリングを容易にする。その後、MetaCycデータベースのクラスヒエラルキーナビゲーションシステムを利用してEC番号情報にアクセスした。引用37このシステムにより、関心のある特定のカテゴリーに基づいてデータを検索することが可能になり、調査対象の微生物群集内の機能的多様性の解析が強化された。メタゲノミックサンプル中の遺伝子存在量は、HUMAnN3パイプラインを使用して解析した。各RPK値は、遺伝子ファミリーにマップされたすべてのリードのアライメントスコアを合計し、正規化のためにキロベース単位で参照遺伝子の長さでこれらのスコアを割ることで導き出される。さらに、1つの配列が複数の参照遺伝子にアライメントする場合を考慮してスコアを調整し、遺伝子ファミリーの存在量を正確に表現している。RPK値から相対存在量（RELAB）を導出するために、HUMAnN3 renorm_tableツールをunits relabオプションで利用した。この正規化方法は、サンプル内の全遺伝子ファミリーの割合として遺伝子存在量を表現する。すべての統計解析はR 4.3.2で行った。R のパッケージ dplyr と ggplot2 を用いてデータを変換し、グラフを作成した。引用64,引用65サンプルの10%未満にしか存在しない遺伝子は解析から除外した。グループ間の差は、Kruskal-Wallis検定およびDunnの多重比較検定を用いて算出した。

試験管内培養試薬

大腸菌由来のLPSをTLR4のリガンドとして、2'3'-cGAMPをSTINGのリガンドとして、Poly I:C (LMW)/LyoVec™をRIG-I/MDA-5のリガンドとして使用した。これらのリガンドとレポーターシステム検出溶液（QUANTI-Blue™およびQUANTI-Luc™ 4 Lucia/Gaussia）はすべてInvivoGen社から入手した。細胞培養培地はGibco社から購入した。I3S、ILA、IPAおよびIAAはSigma-Aldrichから入手した。ナイーブCD4+ T細胞単離キットおよびヒトT細胞TranAct™ はMiltenyi Biotec社から入手。細胞培養プレートはすべてコーニング社から購入した。IL-10、TNF-α、IP-10、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-17A、およびIL-22の分泌はELISAで測定し、製造業者の説明書（R&D Systems）に従って実施した。サイトカイン分泌の有意差を推定するために、Studentのt検定（両側検定）またはTukeyの事後検定付き一元配置分散分析をGraphPad Prismソフトウェアバージョン10.2によって行った。p値が0.05未満を統計的に有意とみなした。結果は、各ヒトドナーのポジティブコントロールのサイトカイン値で正規化した。

THP-1細胞

デュアルレポーターTHP-1単球細胞は、InvivoGen社のプロトコールに従い、37℃、5%CO2の標準条件下で培養した。デュアルTHP-1細胞は、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）の活性をモニターすることにより、核因子κB（NF-κB）経路を、分泌型ルシフェラーゼであるルシアルシフェラーゼの活性を評価することにより、IRF3経路を同時に研究することを可能にする。THP-1細胞は、10％（v/v）ウシ胎児血清（FBS）、2 mm L-グルタミン、1％（w/v）ペニシリン／ストレプトマイシン、100 μg/mLNormocinTM を添加したRPMI 1640で培養した。THP-1細胞を10-1000μMのインドール（I3S/ILA/IPA/IAA）で30分間前処理した後、3μg/mLの2′,3′-cGAMPまたは1μg/mLのPoly I:C (LMW)（LyoVecTM）で刺激した。陰性対照は刺激を受けず、陽性対照は3μg/mLの2′,3′-cGAMPまたは1μg/mLのPoly I:C (LMW)(LyoVec™)を受けた。24時間後、細胞上清を96ウェル透明プレートに移した。620nmでのODは、SEAP活性によるQuanti-Blue色の変化を定量した。一方、白色96ウェルプレートは、基質としてQuantiLucを用いたルシフェラーゼ検出に使用した。

初代ヒト末梢血単核球（PBMC）

PBMCは、密度勾配遠心法に従って血液サンプルから単離した。簡単に説明すると、バフィーコートサンプルは、Irish Blood Transfusion Serviceが承認したプロトコールに基づき、健康なドナーボランティアから採取した。サンプルは、Ficoll-Paque 1.077 g/mL pre-filled tube (Greiner bio-one)中で、室温でPBS中2% FBSと1:2の割合で混合した。800g（RCF）で20分間、室温でブレーキをかけずに遠心した。単核層を回収し、2回洗浄した後、300 gで8分間、室温で遠心した。洗浄後、細胞ペレットを10％(v/v)熱不活性化FBS、2mm L-グルタミン、1％(w/v)ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した完全RPMI培地に再懸濁した。PBMCを96ウェルプレートに1×106cells/mLで播種した（ウェルあたりの最終容量は200μL）。刺激の前に、細胞を10-1000μMのインドール（I3S/ILA/IPA/IAA）の存在下または非存在下で30分間プレインキュベートした。その後、細胞をLPS、またはPoly I:C(LMW)(LyoVec™)で24時間刺激した。陰性対照は培地のみで刺激を受けず（Medium-Medium）、陽性対照は100ng/mLのLPS、または1μg/mLのPoly I:C (LMW)（LyoVec™）を受けた。培養時間が経過したら、全ての培養液を300g、4℃で8分間遠心した。上清を採取し、その後の炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカイン分泌の定量化のために-20℃で保存した。

ナイーブCD4+リンパ球の調製と刺激

Naïve CD4+ T cell Isolation Kitを用いて、PBMCから未触合のNaïve CD4+ T細胞をネガティブ選択した。ソーティング純度は、フローサイトメトリー分析で日常的に90%以上であった。PBMCと選別したNaïve CD4+リンパ球を96ウェル細胞培養プレートに播種し、抗CD3および抗CD28刺激によるヒトT細胞のin vitro活性化と増殖にすぐに使用できるT Cell TransAct™で24時間予備活性化した。活性化後、10-1000μMのインドール（I3S/ILA/IPA/IAA）をリンパ球培養に加え、さらに48時間培養した。その後、細胞上清を採取し、-20℃で保存し、その後のT細胞関連サイトカイン分泌の定量に用いた。

CCK-8細胞生存率アッセイ

まずPBMCまたはレポーター細胞を数え、1ウェルあたり約1×105個の細胞を96ウェル細胞培養プレートに播種した。次に、5％CO2を含む加湿雰囲気下、37℃で一晩培養した後、対応する培養液で希釈した一連の濃度のインドールで培養液を置換した。各測定について5反復を行い、共培養の最大時間は48時間であった。最後に、20μLのCCK-8試薬を製造元の指示に従って各ウェルに添加し、37℃で1～4時間培養した後、BioTekマイクロプレートリーダーを用いて450nmのODを測定した。

データと材料の入手

メタゲノム配列データは、Bioprojects PRJNA740067, PRJNA624223, OEPOO2590, PRJEB43555, PRJNA650244, PRJNA714459, PRJNA689961, PRJNA660883として過去に発表され、一般に入手可能である。代謝物データはFigShareで公開されている（DOI 10.6084/m9.figshare.18046400）。

補足資料

補足資料

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謝辞

アイルランド輸血サービス（Irish Blood Transfusion Service）より、匿名化された未輸血血液成分を研究に使用することを承認していただき、本研究を支援していただいたことに感謝いたします。

情報開示

LOMはPrecisionBiotics社のコンサルタントであり、GSK社、Chiesi社、Reckitt社、Fonterra社から研究助成を受けている。LOMはNestle、Nutricia、Yakult、Reckitt、Abbottの講演会に参加したことがある。PWOTはFonterra New Zealandから資金提供を受け、Yakult-Springer/NatureのSpeaker's Bureauに参加したことがある。他の著者はいずれも利益相反の可能性を報告していない。

補足資料

本論文の補足データは、https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2429754からオンラインでアクセスできる。

追加情報

資金提供

本研究は、アイルランド科学財団研究センター[助成金12/RC/2273_P2]およびアイルランド科学財団Frontiers for the Future賞[21/FFP-A/10000]の支援を受けた。

参考文献

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