食品特異的免疫グロブリンAは、ピーナッツや卵のアレルゲンに対する自然耐性と相関していない

食品特異的免疫グロブリンAは、ピーナッツや卵のアレルゲンに対する自然耐性と相関していない
ELISE G. LIU HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-7507-5045, BIYAN ZHANG HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-0329-2451, [...], AND STEPHANIE C. EISENBARTH HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-1244-208X +23 authorsAuthors Info & Affiliations
サイエンス トランスレーショナル メディシン
2022年11月16日
第14巻 第671号
DOI: 10.1126/scitranslmed.abq0599
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IgA の再考
腸内の食物特異的IgAの存在は、歴史的にIgEを介した食物アレルギーに対する防御を媒介すると考えられてきた。しかし、本研究でLiuらは、これが事実ではないことを示す証拠を示している。著者らは、食物アレルギーのない乳児およびアトピー性小児の大規模コホートにおいて、腸内ピーナッツ特異的IgAが検出可能な濃度で存在することを見いだした。腸内ピーナッツ特異的IgAの濃度は、将来のピーナッツ・アレルギーに対する防御とは関連せず、また、年長児におけるピーナッツ・アレルギーの耐性とも相関しないことがわかった。卵白特異的IgAと卵アレルギーの発症についても同様の知見が観察された。これらの知見は、食物特異的IgAが食物アレルギーに対して防御的であるという仮定を覆すものである。
要旨
免疫グロブリンA（IgA）は、腸内において優勢な抗体アイソタイプであり、腸内常在菌叢を制御し、毒素や病原体を中和する。腸管における食物特異的IgAの機能は不明であるが、食物アレルギーを防ぐと推定される。具体的には、食物特異的IgAは摂取したアレルゲンと結合し、免疫排除によって耐性を促進するという仮説が立てられている。しかし、この仮説を支持する証拠は間接的であり、まちまちである。健康な成人は腸内にピーナッツ特異的IgAを持つことが知られているが、小児も腸内にピーナッツ特異的IgAを持っているかどうかは不明である。我々は、食物アレルギーを持たない乳児コホート（n = 112）において、便中ピーナッツ特異的IgAが検出可能であり、成人の腸内ピーナッツ特異的IgAの量と類似していることを見いだした。このピーナッツ特異的IgAがピーナッツ耐性と関連しているかどうかを調べるために、アトピー児の別のコホート（n = 441）を調べたところ、腸管ピーナッツ特異的IgAは、乳児における将来のピーナッツアレルギー発症の予防を予測せず、年長児におけるピーナッツの同時経口耐性と相関しないことが判明した。血漿中ピーナッツ特異的IgAは、ピーナッツアレルギーのある子どもで高いことが観察された。同様に、卵白特異的IgAは乳児の便から検出可能であり、卵に対する耐性や卵アレルギーの進展を予測することはできなかった。ビーズを用いた腸管ピーナッツ特異的IgAのエピトープ解析では、ピーナッツアレルギー児と非児童でエピトープ特異性が類似していた。しかし、腸管ピーナッツ特異的IgAと血漿ピーナッツ特異的IgEはエピトープ特異性が異なっていた。これらの知見は、食物アレルギーにおける食物特異的IgAの保護的役割の推定に疑問を投げかけるものである。
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はじめに
食物アレルギーは、世界中で増加している問題である(1)。食物アレルギーは、食物抗原に対する免疫グロブリンE（IgE）の不適切な産生によって引き起こされる。原因となる食物抗原を摂取すると、IgEを介したマスト細胞メディエーター、特にヒスタミンの放出が起こり、じんましん、腫脹、嘔吐、下痢、呼吸・循環器障害などの症状が急速に発現し、まれに致死性のアナフィラキシーを引き起こす(2)。食物アレルギーを持つ人は、原因となる食品を厳格に避け、曝露した場合に備えて緊急用医薬品を携帯することが推奨される(3)。食物アレルギーは、経口免疫療法という食物アレルゲンを減感作する方法によって治療することができますが、まだ治療法は確立されていません（4）。そのため、耐性や食物アレルギーの発症に関与する因子をより深く理解する必要がある。
食物に対する経口耐性における体液性免疫の役割は、十分に理解されていない(5)。IgAは、粘膜表面を保護する優勢なアイソタイプであり、腸内の全抗体の約80％を構成している（6）。腸管IgAは、常在菌叢のバランスを調整し、毒素や病原性微生物を中和する。一般に、食物特異的IgAは摂取した食物アレルゲンと結合し、免疫排除による耐性をもたらすという仮説がある(5, 7, 8)。腸管食物特異的IgAは成人でも同定されており（9）、我々は以前に腸管ピーナッツ特異的IgAが健常成人にほぼ普遍的に存在することを報告したが（10）、その機能および食物アレルギーにおける役割の可能性は依然として不明であった。
一般に、腸管食物特異的IgAの防御的役割が推定されているにもかかわらず、この考えを支持する証拠は間接的かつ混合的なものでしかない。疫学的データによると、選択的IgA欠損のある人は、食物アレルギーを含むアレルギー性疾患の罹患率が高いことが示唆されている (11, 12)。しかし、乳児期の血清総IgAの高さは、将来の呼吸器アレルギーとも関連している(13)。血漿中の食物特異的IgAを検討した研究もまた、さまざまな結果をもたらしている。血漿卵特異的IgAに関するいくつかの研究では、卵特異的IgAが食物アレルギーの成長過程および経口免疫療法に対する免疫反応に関与している可能性が示唆されている（14-16）。同様に、唾液中IgAがピーナッツ舌下免疫療法の成績と相関していることを示す証拠もある(17)。しかし、別の研究では、血清オバルブミンおよびオボムコイドIgAは、経口免疫療法では増加せず、卵アレルギーの自然脱却とも相関しないことが示されている(18)。さらに、別の研究では、血清オバルブミン特異的IgAが将来のアトピー発症と関連していた(19)。これらの研究では、循環型IgAとは異なる特異性や機能を持つ可能性のある腸管食物特異的IgAを調べたものはない(20-22)。
本研究の目的は、乳児の腸管食物特異的IgA反応の特徴を明らかにし、腸管および血漿の食物特異的IgAが食物アレルゲンに対する耐性と関連しているかどうかを明らかにすることであった。我々は、食物アレルギーのない乳児が腸管ピーナッツ特異的IgAを産生することを見いだした。次に、腸管ピーナッツ特異的IgAは、将来のピーナッツアレルギーの転帰の指標と相関せず、ピーナッツ耐性とも相関しないことを証明した。また、腸管卵白特異的IgAは卵アレルギー児で高く、卵アレルギーの脱却を予測しないことが確認された。さらに、腸管ピーナッツ特異的IgAが標的とするエピトープには、ピーナッツアレルギー児と非アレルギー児で違いはないが、エピトープ特異性は腸管ピーナッツ特異的IgAと血漿ピーナッツIgEで異なることが明らかとなった。これらの知見は、一般に推定されている食物特異的IgAの防御的役割に疑問を投げかけるものである。
結果
便中ピーナッツ特異的IgAは、非食物アレルギー児で検出可能である。
我々は以前、腸管ピーナッツ特異的IgAが成人の便サンプルにおいてほぼ例外なく検出可能であり、高い特異性を示すことを報告した(10)。我々は、ピーナッツが食物アナフィラキシーの最も一般的な原因の一つであることから、ピーナッツに着目した(23)。腸内IgAの代用として、便中IgAを測定した。我々は、以前に検証した便中ピーナッツ特異的IgA酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いて、Gastrointestinal Microbiome and Allergic Proctocolitis（GMAP）研究（24）に登録された生後1週間から19ヶ月の非食物アレルギー乳児51人の112便サンプルでピーナッツ特異的IgAの測定を行い、IgEによる食物アレルギーまたはアレルギー性直腸炎歴が全くないものを使用しました。便中ピーナッツ特異的IgA値がよく希釈されなかったため、3検体を解析から除外した。これは、8回の連続2倍希釈で1 log以上の範囲にまたがる計算濃度が得られた検体と定義された。その結果、これらの幼児の便からピーナッツ特異的 IgA が検出され [n = 109, 平均 = 3.29 log10 任意単位 (AU) /g of stool, SD = 0.81 log10AU/g of stool] 、我々が以前に報告した成人の値 (n = 32, 平均 = 3.32 log10AU/g of stool, SD = 0.72 log10AU/g of stool) と同等であることがわかった (Fig. 1A) (10)．乳児 8 名のサブセットを用いた ELISA 阻害法では、ピーナッツ抗原は、大豆、オバルブミン、オボムコイド、小麦抗原の便中ピーナッツ IgA との結合を阻害することができ（図 1B）、乳児の便中ピーナッツ IgA は、抗原特異性を有することが示唆された。乳児の便中ピーナッツ特異的IgAは、乳児の腸管に由来するか、ピーナッツ特異的IgAを含む母乳からの摂取に由来する可能性がある（25）。乳児の便中ピーナッツ特異的IgAの起源を調べるため、母乳育児歴のある0-6ヶ月乳児のサンプルの一部を分析したところ、母乳育児児は便中ピーナッツ特異的IgAが高い（n = 41、平均 = 3. 17 log10AU/g of stool, SD = 0.64 log10AU/g of stool）は、非母乳育児児（n = 7, mean = 2.52 log10AU/g of stool, SD = 0.43 log10AU/g of stool）と比べて高かった（Fig. 1C）。しかし、母乳保育をしていない乳児の多くも便中ピーナッツ特異的IgAが検出されたことから、乳児の腸内ピーナッツ特異的IgAは母親と子どもの両方に由来する可能性があることが示された。ピーナッツを摂取しているとは考えにくい生後4ヶ月未満の小児でも、便中ピーナッツ特異的IgAが検出された。1つの可能性として、腸管IgAが非経口的経路による抗原曝露によって誘導されることが考えられるが、これは湿疹性皮膚曝露によってアレルゲン特異的IgE反応が誘導されるのと同様である (26-28)。しかしながら、この非食物アレルギー児のコホートでは、湿疹のある乳児（n = 40）は湿疹のない乳児（n = 69）に比べて便中ピーナッツ特異的IgAが高くなかった（Fig. 1D）。これらのデータから、食物アレルギーを持たない乳児は、依然として不明なメカニズムによって検出可能な腸管ピーナッツ特異的IgAを産生することが示唆された。

図1. 図 1. 非食物アレルギー児の便中ピーナッツ特異的 IgA は検出可能である。
この図では、GMAP研究のサンプルを使用した。(A) 0.1 〜 19.1 ヶ月の非アレルギー児 51 名の乳児便サンプル (n = 109) からピーナッツ特異的 IgA を測定した。3検体はELISA法での希釈が不十分であったため除外した。破線は、便中ピーナッツ特異的IgAの10%および90%における健常成人の既定値を示す。線は単純な線形回帰で最も適合する線を示した。(B）ピーナッツ、大豆、オバルブミン、オボムコイド、小麦タンパク質（200μg/ml、n = 8、生後 0.3 か月から 12.6 か月）でブロッキングし、競合 ELISA で便中ピーナッツ特異的 IgA の特異性を決定した。サンプルは個人別に色分けされている。(C) 便中ピーナッツ特異的IgAは、母乳育児をしている（n = 41）または母乳育児をしていない（n = 7）0.1〜6.5ヶ月齢の乳児で測定された。(D）湿疹のない乳児（n＝69）および湿疹のある乳児（n＝40）の便中ピーナッツ特異的IgAを測定した。B）〜（D）の点線は検出限界を示す。データは平均値とSEMで示した。平均値は、(B)ではDunnettの多重比較検定を用いた一元配置反復測定ANOVAで、(C)と(D)では対応のないt検定で比較し、P値はラベルで表示した。*p < 0.05; ****p < 0.0001。
アトピー児はピーナッツ特異的IgAを作る
ピーナッツに対する腸内IgA反応が食物アレルギー児で異なるかどうかを調べるため、多施設観察型Consortium of Food Allergy Research 2（CoFAR2）コホートの便サンプルを調べた（29）。このコホートには、生後3カ月から15カ月のアトピー性非ピー児512人が登録され、ベースライン時にミルクアレルギー、卵アレルギー、またはその両方を持つか、ミルク感作、卵感作、またはその両方を持つ湿疹が見られた。これらの乳児は、少なくとも年1回の臨床データ収集により長期にわたって追跡され、追跡期間の中央値は7年であった。ベースラインの登録時点から、441の便と330の血漿を採取した（図2A）。これらのベースライン検体の総IgAを測定し、2検体は希釈がうまくいかなかったため除外した。その結果、ほぼすべての乳児が検出可能な便中総 IgA を有していた（n = 439、平均 = 1.56 log10μg/g of stool、SD = 0.71 log10μg/g of stool）（図2B）。次に、このアトピー患者コホートにおいて、便中ピーナッツ特異的IgAを評価した。9検体は希釈がうまくいかなかったため、解析から除外した。その結果、便中ピーナッツ特異的 IgA はほぼすべての乳児で検出された（n = 432, 平均 = 2.79 log10AU/g of stool, SD = 0.73 log10AU/g of stool）（図 2C）。便中総IgAと便中ピーナッツ特異的IgAの間には、低い正の相関（r = 0.34, P < 0.0001）があった（図S1A）。

図2. アトピー児はピーナッツ特異的IgAを作る。
(A) CoFAR2コホートのアトピー性乳幼児から得られたサンプルの模式図。ベースラインのCoFAR2サンプルはこの図で解析された。(B) 幼児 (n = 439) の年齢別便中総 IgA を示す。(C) 幼児 (n = 432) の年齢別の便中ピーナッツ特異的IgAを示す。(D）母乳育児をしている乳児（n＝86）と母乳育児をしていない乳児（n＝53）の便中ピーナッツ特異的IgAを測定した。(E）ピーナッツを摂取している（n＝17）および摂取していない（n＝262）9.2～15.6 ヶ月の乳児の便中ピーナッツ特異的 IgA を測定した。 F）ピーナッツ、大豆、オバルブミン、オボムコイド、小麦タンパク質（200 μg/ml、n＝8、年齢 3.1～6.0 ヶ月）のブロッキングを用いて競合 ELISA で便中ピーナッツ特異的 IgA を測定し た。サンプルは個人ごとに色分けされている。(G）乳児（n＝330）の年齢別血漿ピーナッツ特異的IgAを示す。点線は検出限界を示す。破線は、10％および90％の値で以前に決定された健常成人を示す。ベストフィットの線は2次多項式または単純な線形回帰で得られた。データは平均値とSEMで示し、(E)に範囲を表示した。平均値は(E)では対応のないt検定、(F)ではDunnettの多重比較検定付き一元配置反復測定ANOVAを用いて比較した。P値にはラベルをつけた。****P < 0.0001.
このアトピーコホートにおける腸内ピーナッツ特異的IgAの発生源を調べるために、母乳育児のデータを収集した参加者のサブセットにおいて、便中ピーナッツ特異的IgAを調査した。母乳育児の有無は、このコホートの便中ピーナッツ特異的IgAに影響を与えないようであった。母乳育児をしていない乳児の大多数は、検出可能な便中ピーナッツ特異的IgAを有しており、アトピー乳児は、自身の腸内ピーナッツ特異的IgAも産生することが示唆された（図2D）。ピーナッツの経口摂取が腸内ピーナッツ特異的IgAの誘導につながるかどうかを調べるために、まず、ピーナッツを摂取しているかどうかを示す食事データがある乳児の部分集合を調べた。ピーナッツを食べている乳児（n = 17）とピーナッツを避けている乳児（n = 262）の間で、便中ピーナッツ特異的IgAに差はなかった（図2E）。
8 人の乳児のサブセットから得たベースライン便サンプルの阻害 ELISA により、3-6 ヶ月の乳児の便中ピーナッツ IgA はピーナッツに特異的であったが、他の食物抗原には特異的ではなかった（図 2F）。便中ピーナッツ特異的 IgA に加え、血漿中ピーナッツ特異的 IgA（n=330、平均 2.07 log10AU/ml, SD=0.72 log10AU/ml）もこれらのアトピー児の大半で検出できた（Fig. 2G）。腸管および血漿中の食物IgAが関連しているかもしれないという仮説を立てたグループがあるため（14）、この2つの区画の関係を調べたところ、アトピー性乳幼児の便と血漿中のピーナッツ特異的IgAの間に弱い正の相関（r = 0.37, P < 0.0001）を認めた（図S1B）。
ピーナッツ特異的IgAは、将来のピーナッツ感作およびアレルギーからの保護を予測しない
食物特異的IgAは、食物抗原の中和とIgE感作の防止に役立つと考えられるため、食物アレルギーに対する防御となることが長い間想定されてきた。この仮説に取り組むため、我々は、乳児の腸および血漿ピーナッツ特異的IgAが、将来のピーナッツアレルギーからの保護と関連しているかどうかを調べた。CoFAR2試験には、ピーナッツアレルギーの臨床歴がない乳児が登録された。しかし、これらの小児のほとんどは、当時、曝露を遅らせるようにというコンセンサスに基づく助言によりピーナッツを避けていたため（30）、ピーナッツに対するアレルギーがあるかどうかは分からないであろう。その結果、登録された小児の約 4 分の 1 は、ベースラインのピーナッツ特異的 IgE が 5 kU/リットル（kUA/リットル）を超えて上昇していた(29)。ベースライン時にピーナッツアレルギーと診断されていない可能性のある小児を除外するために、登録時にピーナッツ特異的IgEが0.1 kUA/リットル以下であった小児のサブセットを調査した。これらの未感作児のうち、登録後少なくとも2年間のフォローアップがあった児について、アレルギーの転帰を検討した。その結果、ベースライン時の便中ピーナッツ特異的 IgA とピーナッツ特異的 IgE 濃度（図 3A）、皮膚プリックテスト（SPT）スコア（ピーナッツ膨疹サイズから生理食塩水膨疹サイズを引いた値）（図 3B）およびフォローアップ時の臨床アレルギー（図 3C）には関連を認めないことが判明した。同様に、ベースライン時の血漿中ピーナッツ特異的 IgA は、フォローアップ時のピーナッツ特異的 IgE、SPT スコア、臨床的アレルギーの欠如の低さと対応しなかった（図 3、D から F）。これらのデータは、ピーナッツ特異的IgAが、感作されたことのない乳児群における将来のピーナッツ感作またはアレルギーを予防しないことを示唆している。

図3. ピーナッツ特異的 IgA は、感作されていないコホートにおける将来のピーナッツ感作またはアレルギーからの保護を予測しない。
ベースラインの血漿ピーナッツ特異的 IgE が 0.1 kUA/liter 以下で、少なくとも 2 年間のフォローアップを受けた CoFAR2 患者をこの図で分析した。ベースラインの便中ピーナッツ特異的IgA濃度を、追跡調査により層別化して示した（A）ピーナッツ特異的IgE（n = 55 ≤ 0.1 kUA/ml および n = 39 > 0. 1 kUA/ml）、（B）ピーナッツ SPT スコア（ピーナッツ膨疹-生理食塩水膨疹）（n = 68 ≤ 3 mm および n = 25 > 3 mm）、および（C）臨床ピーナッツアレルギー（n = 92 アレルギーではない、n = 17 ピーナッツアレルギー、n = 5 不明瞭なピーナッツアレルギー試料を除く）、である。ベースラインの血漿ピーナッツ特異的 IgA 濃度を、（D）ピーナッツ特異的 IgE（n = 42 ≤ 0.1 kUA/ml および n = 33 > 0.1 kUA/ml）、（E）ピーナッツ SPT スコア（n = 54 ≤ 3 mm および n = 21 > 3 mm）、および（F）臨床ピーナッツアレルギー（n = 77 not allergic, n = 13 peanut-allergic, および n = 6 equivocal ピーナッツアレルギー標本を除く）別に層別にして示した。データは平均値および SEM で示した。平均値は対応のないt検定で比較し、P値はラベルで示した。
より厳密な解析を補完するために、ベースラインのピーナッツ特異的IgEが≦0.1 kUA/リットルである小児のサブセットを用いて実施し、登録後少なくとも2年間のフォローアップがあったベースラインの全参加者の解析も行った。この拡張グループでも、ベースライン時の便中ピーナッツ特異的 IgA は、同様に、フォローアップ時のピーナッツ特異的 IgE、SPT スコア、臨床アレルギー判定と関連しなかった（図 S2, A～C）．しかし、IgEやSPTでピーナッツに感作された子供やフォローアップでピーナッツアレルギーを発症した子供は、ベースラインの血漿ピーナッツ特異的IgAが高かった（図S2、DからF）。ベースラインで感作されていない者では、血漿ピーナッツ特異的IgAとアレルギー転帰の指標との間にこの関係が見られなかったので（図3、DからF）、ピーナッツ特異的IgAとIgEの間に関連性があるかどうかを検討した。その結果、血漿ピーナッツ特異的IgEと便中ピーナッツ特異的IgA（r = 0.11, P = 0.02） （図S2G）および血漿ピーナッツ特異的IgA（r = 0.39, P < 0.0001） （図S2H）には低い正の相関が認められた。
血漿ピーナッツ特異的IgAおよびIgEがピーナッツアレルギーの転帰にどのように関連するかを明らかにするために、血漿ピーナッツ特異的IgAのアレルギー転帰への影響を調べる単変量回帰を行い、その結果を血漿ピーナッツ特異的IgAおよびIgEの両方を変数として含む多変量解析と比較検討した。この解析により、ベースラインの血漿ピーナッツ特異的IgEは、ベースラインの血漿ピーナッツ特異的IgAが高い小児に見られるアレルギーマーカーの増加および臨床アレルギーを説明しうる交絡因子であることが判明した（図S2I）。
腸管ピーナッツ特異的IgAはピーナッツ感作やアレルギーの同時発生とは相関しない
食物特異的IgAは、腸管内腔で摂取されたアレルゲンを中和し、肥満細胞へのアクセスを防ぐことにより、症候性食物アレルギーから保護するとの仮説も立てられている。この仮説を検証するため、7.6歳から9.9歳の小児から収集したCoFAR2追跡調査サンプルを使用した（図2A）。予想通り、この高リスクコホートでは、この時点までに小児の40.1％がピーナッツ・アレルギーを発症しており（31）、同時期のアレルギー状態に対するピーナッツ特異的IgAの効果を評価することが可能であった。この追跡調査時点から、代表的なサブセットの便124検体および血漿84検体を入手した。これらのサンプルで便中ピーナッツ特異的 IgA を測定し、血漿中ピーナッツ特異的 IgE、SPT スコア、および同時点での臨床的アレルギー状態によってサンプルを層別化した（図 4、A ～ C）。これらのピーナッツアレルギーの指標はいずれも便中ピーナッツ特異的IgAと関連していないようであった。同様に、この追跡調査時点の血漿ピーナッツ特異的 IgA を分析し、これらの値をピーナッツ特異的 IgE、SPT スコア、および臨床アレルギー状態の同時測定値で層別した（図 4、D ～ F）。血漿ピーナッツ特異的IgAは、臨床的ピーナッツアレルギー患者（n = 27, 平均 = 2.67 log10AU/ml, SD = 0.55 log10AU/ml）では、アレルギーでない患者（n = 40, 平均 = 2.25 log10AU/ml, SD = 0.50 log10AU/ml）に対して高値であった。血漿ピーナッツ特異的IgA、便ピーナッツ特異的IgAは、フォローアップ時点において血漿ピーナッツ特異的IgEと低い正の相関（r = 0.43, P < 0.0001） を示した（図4、GおよびH）。血漿ピーナッツ特異的IgAは単変量解析ではアレルギー転帰の予測因子であったが、多変量ロジスティック回帰では血漿ピーナッツ特異的IgEが血漿ピーナッツ特異的IgAとアレルギー転帰の相関の交絡因子として特定された（図4I）。これらのデータは、腸管ピーナッツ特異的IgAはピーナッツアレルギーの指標と関連せず、血漿ピーナッツ特異的IgAが血漿ピーナッツ特異的IgEおよびピーナッツアレルギーと実際に相関していることを示している。

図4. 腸管ピーナッツ特異的IgAは、同時期のピーナッツ感作またはアレルギーと相関しない。
CoFAR2 のフォローアップサンプルを分析した。便中ピーナッツ特異的IgA濃度は、(A)ピーナッツ特異的IgE（n = 18 ≤ 0.1 kUA/ml、n = 102 > 0.1kUA/ml）、(B)ピーナッツ特異的IgE（n = 18 ≤ 0.1 kUA/ml）、(C)便中ピーナッツ特異的IgA濃度を示しています。 1 kUA/ml）、（B）ピーナッツ SPT スコア（n = 31 ≤ 3 mm および n = 89 > 3 mm）、および（C）臨床的ピーナッツアレルギー（n = 50 アレルギーなし、n = 55 ピーナッツアレルギー、および n = 19 不明瞭ピーナッツアレルギー試料は除外）により層別化した。フォローアップ血漿中ピーナッツ特異的IgA濃度を、同時発生した(D)ピーナッツ特異的IgE（n = 17 ≤ 0.1 kUA/ml、n = 67 > 0.1kUA/ml）で層別化して示した。 1 kUA/ml）、（E）ピーナッツSPTスコア（n＝27≦3 mm、n＝57＞3 mm）、および（F）臨床的ピーナッツアレルギー（n＝40アレルギーなし、n＝27ピーナッツアレルギー、およびn＝17ピーナッツアレルギーがはっきりしないサンプルを除く）により層別化した。追跡調査血漿ピーナッツ特異的IgEと(G)追跡調査便ピーナッツ特異的IgA（n = 120組）および（H）追跡調査血漿ピーナッツ特異的IgA（n = 84組）の相関を示した。(I）血漿ピーナッツ特異的IgA±血漿ピーナッツ特異的IgEのアレルギー転帰への影響の一変量回帰および多変量回帰の要約を示す。点線は検出限界を示す。データは平均値およびSEMで示した。平均値は対応のないt検定を用いて比較した。相関は、両側Pearson検定を用いて評価し、Pearsonのrおよび95％信頼区間（CI）を表示した。P値はラベルの通りである。**P < 0.01.
ピーナッツアレルギー児の腸内ピーナッツ特異的IgAは経時的に増加する
CoFAR2 から、ベースラインとフォローアップの時点の便と血漿のサンプルを得た（図2A）、中には両時点で同じ患者からのものもあった。便108検体、血漿59検体について、ベースラインとフォローアップの時点の一致した検体があった。便および血漿中のピーナッツ特異的IgA量が経時的にどのように変化するかを理解するために、一致した検体について、これらのマーカーのベースラインとフォローアップの値を比較検討した。その結果、フォローアップ時にピーナッツに対して非アレルギーと判断された小児では、便中ピーナッツ特異的 IgA の平均値は安定していたのに対し、フォローアップ時にアレルギーと判断された小児では、ベースライン時よりもフォローアップ時の方が便中ピーナッツ特異的 IgA が高かった（n = 48、平均差 = 0.26 log10AU/g便、SD = 0.80 log10AU/g便）（図 S3、A および B）。非アレルギー児もピーナッツアレルギー児も、ベースラインとフォローアップの血漿ピーナッツ特異的IgAの平均値はほぼ同じであった（図 S3、C および D）。血漿ピーナッツ特異的 IgE は、追跡調査時にピーナッツ・アレルギーになった小児（n = 55、平均差 = 0.99 log10kUA/リットル、SD = 1.29 log10kUA/リットル）でのみ増加した（図 S3、E および F）。これらのデータを合わせると、アレルギー患者においてピーナッツ特異的IgAとIgEが経時的に増加することが示される。
腸管ピーナッツ特異的IgAは血漿ピーナッツ特異的IgEとは異なるエピトープを標的としている
アレルギー児では、便中ピーナッツ特異的IgAが経時的に増加し（図S3B）、血漿中ピーナッツ特異的IgEの上昇を反映している（図S3F）。ピーナッツアレルギー患者の腸組織および血液中の腸管ピーナッツ特異的IgA2およびIgE B細胞の間にクローン関係があることを示す証拠があるため（32）、腸管ピーナッツ特異的IgAおよび血漿ピーナッツ特異的IgEのエピトープ特異性を評価し、クローン関係の証拠を探すことを目指した。我々は、便中ピーナッツ特異的IgAと血漿中ピーナッツ特異的IgEのエピトープ特異性を決定するために、ビーズベース・エピトープアッセイ（BBEA）を用いてピーナッツアレルギー患者のCoFAR2追跡時点便と血漿の一致する9検体を解析した（33）。我々は、ピーナッツの3つの主要なアレルゲン性タンパク質にある連続した線状エピトープに対するこれらのアイソタイプの結合を分析した。Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3。便中ピーナッツ特異的IgAと血漿中ピーナッツ特異的IgEのエピトープ特異性パターンにはほとんど重複がなく（図5、AからC）、ピーナッツ特異的IgAおよびIgEの優勢な反応は、クローン前駆体を共有せず、おそらく異なる細胞メカニズムによって生じることが示唆された。

図5. 腸管ピーナッツ特異的IgAは、血漿ピーナッツ特異的IgEとは異なるエピトープを標的としている。
この図では、CoFAR2追跡調査時点の一致した便および血漿サンプル（n = 9組）を分析した。(A) Ara h 1, (B) Ara h 2, (C) Ara h 3 の連続エピトープに対する便中ピーナッツ特異的 IgA および血漿中ピーナッツ特異的 IgE BBEA を示し、スケール MFI のヒートマップで表現した。
ピーナッツ特異的IgAは、ピーナッツ経口チャレンジに対する耐性とは無関係である。
CoFAR2 試験では、アレルギーの状態は臨床的に判断された。アレルギーの臨床的判定は正確で広く用いられているが (34, 35)、経口食物負荷 (OFC) はアレルギー診断のゴールドスタンダードである (36) 。ピーナッツ特異的IgAとOFCで確認されたアレルギー状態との相関を明らかにするために、ピーナッツOFCを受けたCoFAR2患者のサブセットを分析した。ベースライン患者のうち、n = 107人は中央値4.4歳（範囲：1.7〜10歳）でピーナッツOFCを受け、フォローアップ患者のうち、n = 40人は中央値4.4歳（範囲：1.7〜9.2歳）でピーナッツOFCを受けた。OFC陽性者と陰性者の血漿中ピーナッツ特異的IgEのベースラインはほぼ同じであり、おそらくピーナッツアレルギーが発現する前であった（図S4A）。予想通り、OFC陽性群は、OFC陰性群と比較して、ピーナッツアレルギーが既に発症している追跡調査時点の血漿中ピーナッツ特異的IgEが高かった（図S4B）。OFCを発症した患者では、ベースライン時、フォローアップ時ともに便および血漿ピーナッツ特異的IgAはOFCの転帰と関連せず（図6、A～D）、ピーナッツ特異的IgAはピーナッツ摂取に対する臨床的アレルギーまたは耐性のマーカーではないことが示唆された。

図6. ピーナッツ特異的IgAは、ピーナッツ経口摂取に対する耐性と関連しない。
CoFAR2の小児のうち、ピーナッツに対するOFCを有するサブセットについて、（A）〜（D）の解析を行った。(A) ベースラインの便中ピーナッツ特異的IgA濃度を、OFCの結果で層別して示す（n = 79陰性およびn = 28陽性）。(B）フォローアップ便のピーナッツ特異的IgA濃度を、OFCの結果によって層別化して示す（n＝21陰性およびn＝19陽性）。(C）ベースラインの血漿ピーナッツ特異的IgA濃度を、OFCの結果によって層別化して示す（n＝62陰性およびn＝23陽性）。(D）フォローアップ血漿中ピーナッツ特異的IgA濃度を、OFCの結果によって層別化して示す（n＝17陰性およびn＝10陽性）。(E）スタンフォード双子登録の健常者とマッチしたピーナッツアレルギーPOISED試験患者の人口統計学的情報を示す。(F) Twins RegistryとPOISED試験の健常者（n = 9）とピーナッツアレルギー患者（n = 9）において、それぞれ便中ピーナッツ特異的IgA濃度を測定した。破線は、便中ピーナッツ特異的IgAの10%および90%における健常成人を示す。点線は検出限界を示す。データは平均値とSEMで示した。平均値は対応のないt検定で比較し、P値はラベルで示した。
CoFAR2 には、ピーナッツアレルギーの高リスクのアトピー児のみが登録された。便中ピーナッツ特異的 IgA がピーナッツアレルギー患者と健常対照者の鑑別に役立つかを調べるため、Peanut Oral Immunotherapy Study から OFC でピーナッツアレルギーが確認された 9 サンプルを入手した。POISED (Safety, Efficacy, and Discovery) 試験 (37) と Stanford Twin Registry (38) の健康で非アレルギーの対照者 9 例を入手した (Fig. 6E) (38). これらの健常者と OFC でピーナッツアレルギーが確認されたサンプルの間で便中ピーナッツ特異的 IgA に差は認められなかった（図 6F）。これらのデータを総合すると、ピーナッツ特異的IgAはピーナッツに対する経口耐性とは関係がないことが示唆される。
腸管ピーナッツ特異的IgAサブタイプは、アレルギーからの保護と相関していない
ピーナッツ特異的IgAの量はピーナッツの経口耐性と正の相関がないように見えるが、我々は耐性に寄与する可能性のあるピーナッツ特異的IgAの質の違いがあるかどうかを疑問視した。まず、ピーナッツ特異的IgAのサブタイプが耐性に関係するかどうかを検討した。その結果、CoFAR2 の追跡期間中の 14 検体からランダムに選んだサブセットでは、ピーナッツ特異的 IgA1 はほぼすべての検体で検出されないが、同じ患者からの血漿中のピーナッツ特異的 IgA1 はすべての検体で検出された（図 7A）。このことは、便中のピーナッツ特異的IgA1はほとんど存在しないことを示唆しており、便中の総IgA1が総IgA2に比べて少ないこと（図S5A）、また便中のピーナッツ特異的IgA2とピーナッツ特異的総IgAの間に高い正の相関があること（図S5B）からも支持されている。一方、CoFAR2の追跡調査時点の同じ14検体では、ピーナッツ特異的IgA2が便中と血漿中の両方で容易に検出された（図7B）。血漿と便のサンプルの基質は異なるが、血漿と便のピーナッツ特異的IgA2の光学濃度範囲はELISAで類似しており、両者には同等かつ十分に検出可能な量のピーナッツ特異的IgA2が含まれていることが示唆された。全体として、我々のデータは、血漿中にピーナッツに対するIgA1およびIgA2の両方が相当量存在するが、便中にはピーナッツに対するIgA2が主に存在することを示唆している。

図7. ピーナッツ特異的IgAサブタイプおよびエピトープ特異性パターンは、アレルギーからの保護と相関しない。
(A)〜(G)はCoFAR2のフォローアップ時点の試料を、(F)と(G)はGMAP、POISED、Twinsの試料を使用した。(A) IgA1 と (B) IgA2 の光学密度 (OD) 希釈曲線は、血漿と便をマッチさせたサンプル (n = 14) について示したものである。(C) 血漿ピーナッツ特異的 IgA1, (D) 便ピーナッツ、および (E) 血漿ピーナッツ特異的 IgA2 濃度を、同時期のアレルギー状態別に示す [stool: n = 45 not allergic, n = 46 peanut-allergic, and n = 33 excluded samples (18 equivocal peanut allergy, one poor dilution, and 14 completely depleted by other assays); plasma: n = 40 not allergic, n = 27 peanut-allergic, and n = 17 samples excluded for equivocal peanut allergy]. ピーナッツアレルギー患者 n = 20 名、非アレルギー患者 n = 20 名、ピーナッツ特異的 IgA 欠損者 n = 7 名の便サンプルの (F) Ara h 1, (G) Ara h 2, (H) Ara h 3 連続エピトープに対する便特異的 IgA BBEA 結果をスケール MFI のヒートマップで表示。点線は検出限界を示す。データは平均値およびSEMで示した。平均値は対応のないt検定（CおよびE）またはMann-Whitney検定（D）を用いて比較し、P値はラベルで示した。**P < 0.01.
我々は、利用可能なすべての追跡調査サンプルについて、血漿中のピーナッツ特異的IgA1および便と血漿中のピーナッツ特異的IgA2の測定を進め、これらの値を同時期のアレルギー状態によって層別化した。血漿中の総ピーナッツ特異的IgA（図4F）と同様に、血漿中のピーナッツ特異的IgA1は、ピーナッツアレルギーのある患者で、ない患者と比較して高いことがわかった（図7C）。一方、便および血漿中のピーナッツ特異的IgA2は、ピーナッツアレルギー児と非アレルギー児の間で差がなかった（図7、DおよびE）。これらのデータは、どちらのIgAサブタイプも耐性に関係せず、血漿ピーナッツ特異的IgA1がアレルギー患者で実際に高いことを示している。
腸管ピーナッツ特異的IgAは、ピーナッツアレルギーの有無にかかわらず、同様のピーナッツエピトープを標的としている。
次に、便中ピーナッツ特異的IgAのエピトープ特異性がアレルギーの予後に寄与しているかどうかを検討した。そこで、CoFAR2、POISED、GMAP、Stanford Twin Registryから、便中ピーナッツ特異的IgAの平均値が同程度のアレルギー患者20名と非アレルギー患者20名、および便中ピーナッツ特異的IgAの値が低いか検出できない陰性対照7名の便中ピーナッツ特異的IgA Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 エピトープ特異性をBBEAを用いて比較検討した。ELISA でピーナッツ特異的 IgA が低値または検出されない人は、BBEA でも Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3 に対するエピトープ特異的結合が低いことがわかった（図 7、F から H）。ピーナッツアレルギー患者と非アレルギー患者の便中ピーナッツ特異的 IgA は類似したエピトープ結合パターンを有していた（図 7, F〜H）ことから、ピーナッツアレルギー患者と非アレルギー患者で同じエピトープに対して同様の方法で IgA が誘導され、ピーナッツアレルギーと耐性とを区別していないことが示唆された。
卵白に対する腸管IgAは、耐性とは無関係であり、卵アレルギーの進展を予測することはできない。
我々のデータでは、ピーナッツ特異的IgAとピーナッツに対する耐性の複数の指標との間に関係がないことが示された。しかし、このことが他の食物抗原にも当てはまるかどうかは不明であった。血漿卵白特異的IgAとアレルギーの転帰との関係について報告しているグループもあるが（14, 16）、腸からのIgAについて検討したものはない。我々は、卵白特異的IgA ELISAを開発し、それを用いて、ベースラインとフォローアップの両時点のCoFAR2サンプル中の便中卵白特異的IgAを測定し、検証を行った。ベースラインの3サンプルは、ELISA法での希釈が不十分であったため除外された。ピーナッツと同様に、ベースライン時点では大多数の乳児で便中卵白特異的 IgA を検出することができた [n = 438, 中央値 = 0.55 log10AU/g of stool, 四分位範囲 (IQR) = 0.19 to 1.15 log10AU/g of stool] (Figure 8A). この便の卵白IgAは卵白に特異的であり、ほとんどが卵白成分タンパク質であるオバルブミンに対して向けられているようであった（図S6A）。母乳栄養児は、非母乳栄養児（n＝57、中央値＝0.65 log10AU/g、IQR＝0.19〜1.07 log10AU/gの便）より有意に高い（P＝0.01）卵白特異的IgA（n＝87、中央値＝0.92 log10AU/gの便）（図8B）、このことから母体が卵白特異的IgA源である可能性を示唆した。ピーナッツと同様に、卵の摂取は便中卵白特異的IgAに影響を与えなかった（図8C）。CoFAR2への登録は卵または牛乳のアレルギーまたは感作が基準であったため、ベースライン時に卵アレルギーを持つ小児が大半を占めた。ベースライン時に卵アレルギーを有する児童を、いずれアレルギーが治る児童と臨床的卵アレルギーが継続する児童に層別化したところ、ベースラインの平均便中卵白特異的IgAは、これら2群の間で差がなかった（図8D）。

図8. 卵白に対する腸管IgAは耐性とは関係なく、卵アレルギーの伸長を予測しない。
CoFAR2サンプルを使用した。ベースラインの便中卵白特異的IgA濃度は、（A）月齢別（n＝438）、（B）母乳育児をしている（n＝87）、していない（n＝57）、（C）卵を食べている（n＝24）、避けている（n＝379）、（D）卵アレルギーが治まった（n＝163）、持続性のある（n＝88）、（E）臨床的にアレルギーではない（n＝60）または卵アレルギーである（n＝274）幼児において示されている。n = 103 の卵アレルギーを除外した。(F) 卵白特異的便中IgA濃度は、アレルギーでない（n = 79）および卵アレルギー（n = 31）；n = 14 等質卵アレルギー試料を除外した小児の追跡調査を示す。(G) 卵OFC陰性（n = 102）および陽性（n = 16）の乳児のベースライン便中卵白特異的IgA濃度を示す。(H）卵OFC陰性（n=35）および卵OFC陽性（n=10）の小児の追跡調査便の卵白特異的IgA濃度を示す。点線は検出限界を示す。(A)のベストフィットの線は、単純な線形回帰で決定された。データは中央値とIQRで示し、Mann-Whitney検定で比較し、P値はラベルで示した。*P < 0.05.
次に、ベースライン検体の便卵白特異的IgAを比較したところ、卵アレルギー児は非アレルギー児（n＝60、中央値＝0.33 log10AU/g便、IQR＝0.19〜0.88 log10AU/g便）に比べて便卵白特異的IgA（n＝274、中央値＝0.62 log10AU/g便）は高値だった（Fig. 8E）。しかし、フォローアップの時点では、卵アレルギー児と非アレルギー児の間で便中卵白特異的IgAに差はなかった（図8F）。CoFAR2患者のサブセットもまた、卵に対するOFCを受けた。ベースラインの患者では、n=118が3.2歳（範囲：1.3〜9.5歳）の中央値で卵OFCを受け、フォローアップの患者では、n=45が4.5歳（範囲：1.8〜9.0歳）の中央値で卵OFCを受けた。このアレルギー判定のゴールドスタンダードを用いて、ベースラインおよびフォローアップの便中卵白特異的IgAは、卵に対する耐性とは関係がないことがわかった（図8、GおよびH）。また、追跡調査時点の便中卵白特異的IgA2サブタイプを調べたところ、その値は便中卵白特異的総IgA測定値と中程度の正の相関を示した（図S6B）。したがって、卵アレルギー児と非アレルギー児の間で便中卵白特異的IgA2に差は見られず（図S6C）、この時点の便中卵白特異的総IgAで観察されたのと同様であった（図8F）。これらのデータを総合すると、腸管卵白特異的IgAの上昇は、卵耐性や卵アレルギーのアウトグロースのマーカーではなく、乳児期の卵アレルギーと相関している可能性があることが示唆される。
考察
食物特異的IgAが食物アレルギーの発症に保護的な役割を果たすという仮説が広く提唱されている。したがって、食物アレルギーにおけるIgAの機能をより深く理解することは、治療上重要な意味を持つ可能性がある。例えば、IgAは食物アレルギーの治療における増強のための魅力的なターゲット、あるいはアレルギー重症度の有用なバイオマーカーとなる可能性がある。しかし、我々は、アトピー性乳幼児のコホートにおいて、便中ピーナッツ特異的IgAは、ピーナッツに対する耐性や将来のピーナッツアレルギーの発症予防に関係しないこと、健常者とピーナッツアレルギー患者の間で便中ピーナッツ特異的IgAまたはIgA2量に差があることを見出した。さらに、腸管ピーナッツ特異的IgAエピトープ特異性は、非アレルギー患者とピーナッツアレルギー患者で類似しており、共通の誘発機序があることが示唆された。
腸管ピーナッツ特異的IgAは血漿ピーナッツ特異的IgAおよびIgEと相関しており、コンパートメントやアイソタイプを超えたピーナッツ特異的B細胞がどのように関連しているのかという疑問が生じた。血漿と腸におけるピーナッツ特異的IgAの相関は、2つのコンパートメント間でのIgAの移動、両コンパートメントにおける同様のメカニズムによるIgAの誘導、あるいは並行するが異なるプロセスを示すのか、我々のデータからは識別できない。ピーナッツ特異的IgAはアレルギー児および非アレルギー児の両方に存在するが、ピーナッツ特異的IgEはアレルギー児にのみ存在する。このことは、腸管IgAと血漿IgEの線状エピトープ特異性が異なるという我々の知見によって支持される仮説であり、ピーナッツ特異的IgAとIgEの産生が異なる形で制御されていることを示唆するものである。もしピーナッツ特異的IgAとIgEが順次クラススイッチングによって関連しているならば、エピトープ特異性が重複していることが予想される。しかし、血漿中IgAと血漿中IgEのエピトープ特異性が類似している可能性も否定はできない。血漿卵白特異的IgAとIgEはエピトープ特異性が重複していないことが以前の研究で示されているので、この可能性は低いと考えている(39)。もし、両者がクローン的に関連していないとしても、血漿中ピーナッツ特異的IgAとIgEが共通の刺激または経路によって誘導されるのであれば、相関がある可能性がある。このことを裏付けるように、我々は、一般的に使用されている食物アレルギーのコレラ毒素マウスモデルにおいて、マウスが食物抗原に感作されると、食物特異的血漿IgAと血漿IgEが同時に生成されることを観察している(10)。
また、腸管卵白特異的IgAはアレルギーの成長とは無関係であり、卵アレルギーの乳児で高かったことから、我々の発見はピーナッツに限定されたものではない。これらのデータは、血漿卵白特異的IgA2およびエピトープ特異的血漿卵白特異的IgAについて発表された過去のデータとは逆の傾向を示し、いずれも卵アレルギー患者で低く、前者は卵アレルギーを脱却した患者で上昇することが示された（14, 39）。腸管および血漿卵白特異的IgAと卵アレルギーの転帰との不一致は、腸管および血漿食物特異的IgAに相関があっても、これらの異なる区画のIgAは異なる特異性または機能を有する可能性があることを示すものである。
乳児の腸管IgA反応に関するこれまでの研究のほとんどは、マイクロバイオームに焦点を当てたものであった（40, 41）。ある先行研究では、腸管ミルク特異的IgAが乳児の半数以下で確認されたが（42）、我々は腸管ピーナッツおよび卵特異的IgAが健常児およびアトピー児で広く検出されることを証明した。血清IgAは生後10年間ゆっくりと増加するが(43)、我々の結果は、粘膜IgA反応はより早く成熟するという報告と一致している(44, 45)。我々のデータは、腸管食物特異的IgAの一部は母親由来である可能性が高いことを支持しており、これは、母乳が生後早期の腸管総IgAに寄与し（46）、食物特異的IgAを含んでいるという過去の文献と一致している（25）。あるいは、母乳中には食物抗原やサイトカインなど、乳児の腸管における食物特異的IgA反応を促進する因子が存在すると考えられる（47, 48）。食品特異的IgAは、母乳育児をしていない乳児でも検出されたことから、乳児も内在性の腸管食品特異的IgA反応を生成することが示唆される。ピーナッツに対する腸管IgA反応は普遍的であるように思われるが、これはおそらく、幼少期に生じる偏在的な免疫シグナルによるものであろう。この反応は、ピーナッツの摂取や湿疹には依存しないようであり、腸内の交差反応性抗原や無傷の皮膚や気道からのシグナルが、腸内のピーナッツ特異的IgA反応を生じさせるのではないかという疑問が生じている。
この研究は、いくつかの要因によって制限されている。第一に、小腸液に比べて糞便のサンプリングが比較的容易であるため、食物特異的IgAが作用すると推定される小腸のIgA量の代理として便の食物特異的IgAを使用したことである。食物特異的IgAの一部は消化管で分解されたり、小腸より遠位で産生される可能性があり、小腸と便の測定値の間に不一致が生じる可能性がある。次に、便中ピーナッツ特異的IgAと血漿中ピーナッツ特異的IgEのエピトープ特異性を線形エピトープのみに対して評価した。コンフォメーション型エピトープ特異性を解析すると、ピーナッツ特異的IgAとIgEで異なるパターンが明らかになる可能性がある。さらに、本研究に参加した小児の大多数は、本研究が実施された時点では、専門家の推奨によりピーナッツを避けるか、最小限の量を摂取していたことに留意されたい。したがって、現在、アレルギー予防のために広く推奨されているような、より大量のピーナッツを定期的に摂取することが、ピーナッツ特異的 IgA にどのような影響を及ぼすかは不明です。最後に、本研究は、食物アレルギーの発症および治癒の自然史におけるピーナッツおよび卵白特異的IgAを検討した。食物特異的IgAは、経口免疫療法などによる寛容の誘導において、異なるパターンをたどり、異なる機能を持つ可能性がある。例えば、経口免疫療法は、食物に対する高親和性IgA抗体の産生を誘導または増強する可能性によって、食物特異的IgAの質および量を変化させ、これが獲得耐性に関与している可能性がある。
以上より、食物特異的IgAが食物アレルギーの発症を予防する役割を持つという一般的な考え方を検討した結果、食物特異的IgAは食物耐性、将来の食物アレルギー発症の予防、食物アレルギーの伸長と相関がないことが判明した。また、便中ピーナッツIgAのエピトープ特異性は、ピーナッツアレルギー児と非アレルギー児を区別していない。これらの知見は、一般に推定されている食物特異的IgAの寛容性の役割を覆すものであり、どのような種類の偏在的な早期生活シグナルが腸管食物特異的IgAの産生につながるのか、また、これらのシグナルが食物特異的IgEの産生につながるシグナルとどのように分離されているかについて新しい疑問を提起するものである。
研究方法
研究デザイン
本研究は、ピーナッツおよび卵白特異的IgAと、食物耐性または食物アレルギーからの防御の指標との間に何らかの関係があるかどうかを明らかにすることを目的とした。これを達成するために、以下に述べるように、いくつかの食物アレルギー研究からの臨床データとともに、非同定の便および血漿試料を入手した。すべての研究の参加者全員からインフォームド・コンセントを得た。我々は、入手したすべての試料について、便中ピーナッツおよび卵白特異的IgAと血漿中ピーナッツ特異的IgAをELISA法により測定し、それぞれ5から8回の技術的複製を行った。希釈が不十分な試料（2倍希釈8回で計算濃度が1 log以上の幅を示した試料と定義）は解析から除外し、その他の試料はすべて解析に含めた。これらのマーカーが食物耐性の様々な臨床指標と関連しているかどうかを判断するために、統計解析を行った。また、ピーナッツ特異的 IgA のエピトープ特異性がアレルギー患者と非アレルギー患者で異なるかどうか、またピーナッツ特異的 IgE のエピトープ特異性と異なるかどうかを調べるために BBEA を実施した。
GMAP試験参加者
GMAP 研究は、マサチューセッツ州ニュートンの民間小児科医院である Pediatrics at Newton Wellesley から募集した乳幼児の大規模な前向き観察コホートである。この研究の目的は、食物タンパク誘発性アレルギー性直腸炎（FPIAP）およびその他のアレルギー性転帰を発症する小児の有病率と特徴を明らかにすることでした。2014 年 4 月～2017 年 2 月に診療所を順次受診した生後 2 ヵ月までの新生児計 1162 例を対象に適格性を評価し，1003 例を登録した．これらの乳児は、定期的な赤ちゃん健診および病気受診時にフォローされ、食事、IgE介在性食物アレルギー、FPIAP状態などの臨床データは各受診時に収集された。便サンプルは、これらの訪問の多くで採取された。GMAP研究では、IgE介在性食物アレルギーやFPIAPの既往歴のない、無作為に抽出した51人の乳児から112の非識別化便検体と臨床データを入手した。GMAP研究は、Massachusetts General HospitalのInstitutional Review Board（IRB）により承認されました。すべてのサンプルとデータは非特定化されているため、地域のIRBの承認は必要なかった。
CoFAR2 コホート研究参加者
CoFAR2 は、ピーナッツアレルギーのリスクが高いアトピー患者3-15ヶ月児を登録した前向き、観察型、多施設共同試験である(29, 31)。前述のとおり、5施設（Icahn School of Medicine at Mount Sinai、Duke University Medical Center、Johns Hopkins University School of Medicine、National Jewish Health、Arkansas Children's Hospital）が512人の患者を登録しました。登録時には、牛乳アレルギー、卵アレルギー、またはその両方、あるいは牛乳感作性、卵感作性、またはその両方を伴うアトピー性皮膚炎を有する子どもたちが登録されました。ピーナッツアレルギーの臨床歴がある、または過去にピーナッツ特異的IgEが5 kUA/リットル以上であった小児は除外された。ピーナッツアレルギー児と非アレルギー児の臨床的特徴については、以前に報告されている(31)。参加者は定期的な訪問により追跡され、便および血漿を含む臨床検体が登録時および追跡時点において採取された。我々は、登録時点（n = 441便およびn = 330血漿サンプル）と、小児が7.6歳から9.9歳になった時点（n = 124便およびn = 84血漿サンプル）のサンプルを入手した（Fig. 2A）。さらに、これらの人々に関する臨床データも入手した。臨床的なアレルギーの状態は、以前に記載された方法を用いて決定した(31)。この研究は、National Institute of Allergy and Infectious Diseases Data Safety Monitoring Boardおよび各地域のIRBによって承認されている。CoFAR2 からは非識別化された試料とデータを入手したため、追加の施設 IRB 承認は必要なかった。
POISED試験参加者
POISEDは、スタンフォード大学のSean N. Parker Center for Allergy and Asthma Researchで実施された二重盲検、無作為化、プラセボ対照試験であった（37）。前述のとおり、この試験は、ピーナッツ経口免疫療法の 2 つの投与スケジュールをプラセボ対照と比較し、4g のピーナッツタンパク質の耐容性を主要評価項目として、その有効性を検証するよう設計されました。年齢 7～55 歳のピーナッツアレルギー患者で、二重盲検プラセボ対照フードチャレンジが陽性、ピーナッツ SPT が 5ml 以上、ピーナッツ特異的 IgE が 4kUA/liter 以上の患者が募集され、120 名が登録されて 3 群のいずれかに無作為に振り分けられた。プラセボ（オート麦粉）経口免疫療法、ピーナッツ免疫療法を104週後に中止、または104週後に300mgの維持投与を継続する3群に無作為に割り付けた。これらの患者の一部は、試験登録時に、いずれの経口免疫療法を開始する前にも便のサンプルを提供している。これらの便サンプルのうち9つを「ピーナッツアレルギー」と確認されたサンプルとして入手しました。この試験は、アレルギー・免疫・移植部門および国立アレルギー・感染症研究所データ安全管理委員会により承認されました。また、この研究は、地元スタンフォードのIRBによって承認された。我々はPOISED試験から非識別化された試料とデータを入手したため、さらなるIRBの承認は不要であった。
Stanford Twin Registryのサンプル
Stanford Twin Registryは、0歳から80歳までの双子である340人の参加者を登録した観察コホートであった。患者は、スタンフォード大学のSean N. Parker Center for Allergy and Asthma Researchから募集された。この試験の目的は、アレルギー疾患を持つ双子と持たない双子における免疫因子を理解することであった。食物アレルギーは、この試験でOFCにより診断された。参加者から臨床データおよび糞便を含む各種試料が収集された。この試験では、健康でアレルギーのない9人から糞便を採取した。この研究はスタンフォード大学のIRBによって承認された。スタンフォード双子レジストリから非識別化されたデータとサンプルを入手したため、さらなる機関IRBの承認は不要であった。
便サンプルの処理
GMAP、CoFAR2、POISED、およびStanford Twin Registry試験から新鮮な凍結便を入手した。凍結便はウェットアイスで分注し、ドライアイスで輸送し、処理前に-80℃で保存した。既報の通り（10）、糞便サンプルを秤量し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（4 ml/g; MP Biomedicals）をサンプルに添加した。試料を1分間ボルテックスしてホモジナイズし、4℃のシェーカー上で一晩インキュベートした。糞便サンプルを再び短時間ボルテックスした後、9000gで10分間遠心分離した。上清を回収し、9000gで10分間再遠心分離した。この上清を集め、1.2μmの低タンパク質結合セルロースアセテートシリンジフィルター（Whatman）で濾過した。得られた上清を1％ウシ血清アルブミン（BSA）でコーティングしたマイクロチューブに分注し、-80℃で保存した。
酵素結合免疫吸着法（Enzyme-linked immunosorbent assay
ELISAプレート（Nunc MaxiSorp）に、粗ピーナッツ抽出タンパク質（20μg／ml；Greer）、鶏の卵白（20μg／ml；Sigma-Aldrich）、またはマウス抗ヒトIgA1／IgA2抗体（2μg／ml；BD Biosciences、555886）を炭酸緩衝液中で4℃にて一晩コートした。プレートは、便中IgA測定では5%BSAで、血漿中IgAおよび総IgA測定では2%BSAで37℃、1時間ブロッキングした。便抽出物（抗原特異的IgA、IgA1、IgA2は1：2、総IgAと総IgA2は1：500、総IgA1は1：100の最高濃度）および血漿（抗原特異的IgAは1：8、抗原特異的IgA1およびIgA2は1：4）は2％BSAで5〜8倍に順次希釈された。競合ELISAでは、便をピーナッツ（Greer）、卵白（Sigma-Aldrich）、オボムコイド（Sigma-Aldrich）、小麦（Greer）、または大豆（Sigma-Aldrich）などの食品タンパク質（200 μg/ml）で希釈した。食品特異的抗体については、3人の便抽出物または血漿をプールした標準品を任意標準品として使用した。総 IgA およびサブタイプアッセイには、精製ヒト IgA1 または IgA2 の絶対標準物質（Bethyl Laboratories）を使用した。サンプルは4℃で一晩インキュベートした。結合したIgAとIgA2は、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）（SouthernBiotech、2050-05/9140-05）に結合した1：4000抗ヒトIgAまたはIgA2抗体と37℃で1時間インキュベーションして検出された。IgA1は、1:4000抗ヒトIgA1-ビオチン（SouthernBiotech、2050-08）と共に37℃で1時間インキュベートし、その後1:500ストレプトアビジン-HRP（Sigma-Aldrich、RABHRP3）を用いて検出された。プレートは安定化発色剤テトラメチルベンジジン（Thermo Fisher Scientific）で現像し、3 Nの塩酸で停止した。450 nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で測定した。データは SoftMax Pro (Molecular Devices) と Microsoft Excel を用いて解析した。
ビーズベースエピトープアッセイ
先に述べた方法(33)を用いて、便および血漿サンプルのピーナッツエピトープ結合をアッセイした。まず、蛍光LumAvidin xMAP microsheres (Luminex Corporation) を3つの主要なピーナッツアレルゲン、Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 のエピトープを表すビオチン化15核オリゴマー連続ペプチド (CSBio) に結合させる。これらのペプチド結合ビーズを0.02% Tween 20と0.1% BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS-TBN緩衝液）中で混合し、マスターミックスを作製した。100マイクロリットルのマスターミックスを96ウェルプレートにロードし、便上清または血漿試料を3回に分けて加えた。プレートは室温でシェーカー上で2時間インキュベートした後、洗浄した。結合した抗体を二次抗体で検出した。50μmの1:50フィコエリスリン（PE）標識マウス抗ヒトIgE（Thermo Fisher Scientific, MA1-10375）または1:400 PE標識マウス抗ヒトIgA（SouthernBiotech, 9130-09）を各ウェルに加え、プレートを30分室温でインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、マイクロスフェアを100μmのPBS-TBNバッファーに再懸濁させた。次に、サンプルを、xPONENTソフトウェア（Luminex Corporation）を備えたLuminex 200装置で読み取り、各エピトープについて平均蛍光強度（MFI）値を得た。MFI 値は、アイソタイプ間の比較を可能にするために、各アイソタイプの最大平均 MFI 値を 1 にスケーリングした。
統計解析
n < 20の実験の個人レベルの生データは、データファイルS1に示されている。すべての統計解析は、GraphPad Prism ソフトウェアを使用して行った。ELISA抗体のデータはlog10変換した。P < 0.05を有意とした。ピーナッツ特異的IgAデータは、平均値およびSEMでプロットした。平均値は、両側ペアt検定、両側ペアでないt検定、一元配置反復測定分散分析（ANOVA）を用いて比較された。卵特異的IgAデータは中央値およびIQRでプロットし、卵特異的IgAデータの比較には両側Mann-Whitney検定またはFriedman検定（Dunnの多重比較検定付き）を実施した。解析は探索的であり、P値は多重比較のために調整されていない。相関関係は、ピーナッツ特異的データにはPearson相関検定を、卵特異的データにはSpearman相関検定を用いて評価した。線形回帰または 2 次多項式回帰を用いて、データに最もフィットする直線を求めた。単変量または多重ロジスティック回帰を使用して、アレルギーの転帰に対する変数の影響を分析した。BBEA のデータは、比較を可能にするために、アイソタイプ間でスケーリングされた。
謝辞
CoFAR2試験、GMAP試験、POISED試験、Stanford Twin Registryに参加したすべての患者および家族に感謝する。CoFARの科学・医学担当者であるM. Plautに感謝する。さらに、CoFAR2各施設の臨床研究ユニットのスタッフ、およびCoFAR2の統計・臨床調整センターに感謝する。K. Jarvinen-Seppoには、丁寧な議論とアッセイへの協力に感謝する。Eisenbarth研究室のメンバーの支援と議論に感謝する。GMAP研究に対するGerber FoundationとDemarest Lloyd Jr.Foundationの支援に感謝する。
資金提供 E.G.L.はT32 Institutional Training Grant (5T32AR007107) の支援を受けている。V.M.は、米国国立衛生研究所（NIH）の国立アレルギー感染症研究所（NIAID）からのK23賞（1K23AI151555-01A1）の支援を受けている。M.K.はドイツ研究財団（464546188; KR 5534/1-1）よりフェローシップの支援を受けている。S.C.E. は、Food Allergy Research and Education (FARE) の Ira & Diana Riklis Food Allergy Research Award、Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research、Colton Foundation、Food Allergy Science Initiative (FASI) Inc の助成、NIAID grant R01 AI136942 と R56 AI155497 の支援を受けている。CoFAR2研究は、NIH (U19AI066738 and U01AI066560), National Center for Research Resources (NCRR)/NIH, NIH/National Center for Advancing Translational Sciences (National Jewish Health) からの UL1 TR002535, NCRRからの UL1 TR000067 (Mount Sinai), UL1 TR000039 (Arkansas), UL1 RR024128 (North Carolina) 及び UL1 RR 025005 (Johns Hopkins) による支援を受けて実施されました。K.N.はNIAID、NHLBI、NIEHS、FAREから助成金を得ている。
著者の貢献 本研究は、E.G.L.とS.C.E.により構想された。臨床試験方法とサンプル収集は、V.M.、A.G.、J.R.C、 S.C.., T.S., M.M., A.Z.Q., K.N., A.W.B., E.H.K., M.D.K., A.K.H., S.M.J., D.Y.M.L., S.H.S., R.A.W., Q.Y., W.S., and H.S. ELISA assay は E.G.L.. が実施した．データ解析は、E.G.L., J.A., M.K., G.G., A.K.H., J.R.C., H.S., V.S., S.C.E. が行った。初稿は E.G.L. と S.C.E. がまとめ、全著者がレビューと原稿編集に参加した。
競合する利益 A.G.はN-Fold LLCからコンサルティング料を受け取っている。S.C.は、Alladapt Immunotherapeutics、Novartis、Genentech、Sanofi、Allergenis、Nutriciaの諮問委員会に所属している。K.N.は、IgGenix、Seed Health、ClostraBio、およびImmuneIDからのストックオプション、Excellergy、Red Tree ventures、Eli Lilly、およびPhylaxisからのコンサルティング料、COUR Pharmaceuticalsでの顧問、スタンフォードの世界アレルギー機構センターオブエクセレンスの指導、Before Brands、Alladapt Immunotherapeutics、Latitude、IgGenixの共同設立、免疫寛容ネットワークおよびNIH臨床研究所での国家科学委員としての役割を報告しています。さらに、K.N.は、スタンフォード大学が保有する特許番号US9731003B2、US9891213B2、US10114012B2の発明者であり、それぞれ、混合アレルゲン組成物とその使用方法、顆粒球ベースの免疫系障害の検出・モニタリング方法、免疫系障害における白血球の純粋亜集団を検出・定量する方法およびアッセイを対象としています。E.H.K. は、ALK、DBV Technologies、Kenota Health、および Akko の諮問委員会のメンバーであり、Allergenis、Allergy Therapeutics、Belhaven Biopharma、Duke Clinical Research Institute、Genentech、Nutricia から顧問料を受け取っていることを報告します。W.S.はAimmune, Angany, DBV Technologies, FARE, FASI, Novartis, NIAID, Regeneronから助成金を、Aimmune, DBV Technologies, Merck, Novartis, Regeneron, UpToDateから個人使用料を得ていることを報告。その他の著者は、競合する利害関係がないことを宣言している。
データおよび材料の利用可能性 本研究に関連するすべてのデータは、論文または補足資料に記載されている。POISEDおよびTwins Registryの便サンプルは、K.N.に連絡し、スタンフォード大学との材料提供契約を完了することにより、スタンフォード大学から入手可能である。
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参考文献と注釈
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