トンネリングナノチューブがSARS-CoV-2の拡散経路となる（論文の重要部分の翻訳）
Tunneling nanotubes provide a route for SARS-CoV-2 spreading
【要旨】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）感染による神経症状は、長いコロナウイルス感染症における大きな問題である。SARS-CoV-2がどのようにして脳に侵入し、感染によってどのようにして神経症状が生じるかは、エンドサイトーシスによるウイルス侵入の主要な手段であるアンジオテンシン変換酵素2受容体が脳ではほとんど検出されないために明らかではない。われわれは、エンドサイトーシス経路による感染に対して非許容的なヒト神経細胞も、許容的な感染上皮細胞と共培養すると感染することを報告した。SARS-CoV-2はトンネルナノチューブ（TNT）の形成を誘導し、この経路を利用して非感染細胞に拡散する。細胞内相関蛍光法とクライオ電子線トモグラフィーは、SARS-CoV-2が寛容細胞間のTNTと関連していることを明らかにした。さらに、ウイルスの複製部位である二重膜小胞のような複数の小胞構造が、寛容細胞と非寛容細胞の間のTNT内に観察された。我々のデータは、これまで知られていなかったSARS-CoV-2の拡散メカニズムを浮き彫りにするものであり、おそらく非許容性細胞に侵入し、許容性細胞での感染を増強する経路として利用されているものと思われる。
【はじめに】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によるコロナウイルス症2019（COVID-19）は、2019年12月に初めて報告されて以来、世界的な大流行へと発展している（1、2）。SARS-CoV-2は主に呼吸器を標的としており、COVID-19患者のほとんどが重篤な呼吸器症状を呈するが（3）、腸、肝臓、腎臓、心臓、脳などの他の臓器も罹患する可能性がある。さまざまな重力の神経学的症状も報告されている(4-7)。神経症状は急性のもので、罹患とともに消失することもあれば、COVIDが長期化した場合には大きな問題となることもある(8-10)。SARS-CoV-2が中枢神経系（CNS）に侵入することは、いくつかのタイプのCoVがCNSに侵入して持続することが報告されている（SARS-CoVや中東呼吸器症候群-CoVなど）ことから予想される（11、12）。さらに、COVID-19後に死亡した患者の脳組織がSARS-CoV-2 RNA陽性であったという症例報告もある(13)。
SARS-CoV-2がどのようにして神経細胞に侵入するかを調べることは、COVID-19に関連する神経学的症状を理解するために不可欠である。しかし、SARS-CoV-2がどのようにしてCNSに侵入し、どのようにして感染が神経症状を引き起こすのかは、まだ明らかになっていない(14-18)。SARS-CoV-2の神経侵入はいくつかの経路で達成される可能性があり（19）、いったんCNSに到達すると、神経細胞上に露出したアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体と結合して脳に感染する可能性がある（20）。ACE2受容体は、下気道におけるウイルス侵入の主役である（13、21、22）。宿主細胞に侵入するために、CoVのウイルススパイク（S）タンパク質はACE2受容体の酵素ドメインと結合する。細胞質に入るためには、SARS-CoV-2はエンベロープを細胞膜と融合させなければならない。これはエンドサイトーシスの後、エンドソームで起こりうるSタンパク質のタンパク質分解活性化によって媒介され、エンドソームの酸性化がウイルス融合の呼び水となるエンドリソームプロテアーゼを誘発する(23)。あるいは、細胞膜（PM）にTMPRSS2（膜貫通型セリンプロテアーゼ2）(24)が存在すると、ACE2レセプターに結合した後、SARS-CoV-2はpHに依存しない高速の経路で細胞内に侵入し、ウイルスとPMの直接融合を可能にする(23)。ACE2レセプターは、口腔や口腔咽頭を形成する細胞の表面に露出している(24-26)。ACE2レセプターの発現は、多くの細胞型や組織でよく報告されているが(24, 25)、ヒトの脳では、視床や脈絡叢などの脳領域を除いて、ACE2レセプターのレベルは非常に低い(27)。このため、ウイルスがどのようにして脳内を伝播するのかは不明である。ここでわれわれは、SARS-CoV-2の神経侵入性を調べ、トンネルナノチューブ（TNT）が細胞間拡散に関与しているかどうかを調べた。TNTはアクチンが豊富な薄い膜状の導管であり(28, 29)、細胞小器官、アミロイドタンパク質(28, 30)、ウイルス粒子を含む荷物を離れた細胞間で直接輸送することができる(30-35)。われわれは、SARS-CoV-2がTNTを利用して、ウイルスの侵入に必要な膜レセプターを持たない寛容な細胞からそうでない細胞へと拡散し、その結果、ウイルスの病原性が広がり、免疫監視から逃れることができるのではないかという仮説を立てた。この仮説を検証するために、SARS-CoV-2の分離、増殖、抗ウイルス試験に広く使われているVero E6細胞株を上皮モデルとして用いた(36-38)。非許容性細胞の神経細胞モデルとして、SH-SY5Y細胞株を使用した。これらは神経細胞モデルとして広く使用されているヒト細胞であり、そのTNTも徹底的に特性化されており（39）、高い信頼性で同定可能である（39, 40）。初代神経細胞が望ましいが、残念ながらTNT様構造を識別するのは非常に困難であり（41）、今回開発したクライオ相関光・電子顕微鏡（CLEM）とクライオ電子トモグラフィー（ET）の高度なアプローチを適用するのはさらに困難である。
共焦点顕微鏡を用い、in cellulo cryo-CLEMとcryo-ET(39)を確立することにより、SARS-CoV-2に寛容でないSH-SY5Yヒト神経細胞が、感染したVero E6寛容上皮細胞と共培養すると、TNTを介したメカニズムで感染することを証明した。これらの結果から、TNTに関連するウイルス粒子の構造が明らかになり、SARS-CoV-2の感染と伝播の分子メカニズムに関する情報が得られた。In vitroでの研究の限界の範囲内ではあるが、これらのデータは、ウイルスの拡散におけるTNTの役割を支持し、おそらくウイルスの体内伝播の効率を高めるものであろう。
【結果】
SARS-CoV-2は受容体を介したエンドサイトーシスとは無関係に細胞内に拡散することができる
TNTがSARS-CoV-2感染に寄与している
TNTは寛容細胞間でのSARS-CoV-2感染を促進する
クライオ電子顕微鏡でTNTに関連したSARS-CoV-2が発見される
クライオ電子顕微鏡によりTNTのウイルスコンパートメントが寛容細胞と非寛容細胞の間で明らかになった
【考察】
COVID-19患者はさまざまな神経症状を示すことから、SARS-CoV-2が中枢神経系に侵入することが示唆されている(64)。COVID-19患者の脳を剖検した結果、CoV RNAが検出され(65)、ウイルスの侵入経路として嗅粘膜が示唆されている(19)。SARS-CoV-2はACE2と結合することでヒトの宿主細胞に感染することが知られているが、神経細胞での発現は低い(27)。それにもかかわらず、いくつかの研究でヒト多能性幹細胞や初代神経細胞におけるSARS-CoV-2の存在が報告されている(5, 66)。このように、SARS-CoV-2がどのようにして神経細胞内に侵入するのかは、まだ未解決の問題である。インフルエンザウイルス、HIV、単純ヘルペスウイルス(31)などのいくつかのウイルスは、TNTを使ってゲノムをナイーブな細胞に移すことができる。ここで我々は、エキソサイトーシス／エンドサイトーシス依存性経路（図S1）を介してSARS-CoV-2に非許容的なヒト神経細胞SH-SY5Y細胞を、SARS-CoV-2に感染したことのある寛容なVero E6上皮細胞と共培養した後に感染させることができることを証明した（図1）。さらに、レムデシビルとウイルス複製マーカーであるJ2とnsp3の免疫染色を用いた我々のデータは、SARS-CoV-2が神経細胞内で一度複製できることを裏付けている（図2および図S5）。ACE2を介したウイルスの侵入を中和抗体でブロックすることにより、SARS-CoV-2が分泌に依存しない経路で寛容な細胞間に広がることも証明された。我々は、TNTが寛容細胞間であっても感染の伝播を加速すると推測している。TNTは動的な一過性の構造であり（28）、アクチンが急速に重合と解重合を繰り返すことができる（すなわち、30秒から60秒）ので（68、69）、ウイルスは他の経路よりもTNTを介してより速く広がる可能性がある（67）。以前の証拠によると、細胞突起と相互作用したウイルスは、細胞表面で "サーフ "することにより、アクチンとミオシンIIを介した迅速な輸送を経て、細胞体により近い侵入部位に到達することが示されている(60)。さらに、TNTは、ミオシンVa（MyoVa）やMyoXのような、従来とは異なるアクチンに基づくミオシンモータータンパク質を含んでいる可能性がある(28, 70)。MyoVaは、TNTにおけるエンドサイトーシス小胞のアクトミオシン依存性輸送を仲介することが示唆されており(28)、一方、MyoXはTNT形成の主要なプレーヤーとして提唱されている(71)。
注目すべきは、SARS-CoV-2感染によって、Vero E6細胞間でも、Vero E6とSH-SY5Y細胞間でも、TNT結合細胞の割合が増加したことである（図5および図S7）。この証拠は、SARS-CoV-2が、HIV（30, 72）のような他のウイルスと同様に、TNT形成の誘導因子であり、TNT連結細胞間での拡散を促進するという我々の仮説を支持するものである。SARS-CoV-2はいくつかの機序でTNT形成を誘導できるかもしれない。最近の発表によると、SARS-CoV-2感染は、カゼインキナーゼII(CK2)が関与するフィロポディア突起の顕著な増加を誘導する(63)。SARS-CoV-2に感染したVero E6細胞では、CK2活性が有意に上昇した(63)。CK2はアクチンの重合を促進し、細胞骨格の構成を制御することから、TNTの増加にも関与している可能性がある(73)。CK2はエンドサイトーシス部位でミオシンタンパク質をリン酸化し、アクチン重合を促進することが知られている(74)。例えば、マールブルグウイルスは非従来型モータータンパク質MyoXをハイジャックし、フィロポディアの形成とそれに沿ったウイルスの輸送を促進する(31)。我々は以前、MyoXが神経細胞におけるTNT形成の正の制御因子であることを示した(71)。MyoXがSARS-CoV-2によって誘導されるTNT形成とTNTに沿ったウイルスの移動にも関与しているかどうかを調べることは興味深い。さらに、Bouhaddouら(63)は、SARS-CoV-2細胞感染後、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路の活性化を示した。p38 MAPKの活性化もTNT形成を増加させる可能性がある(75)。共焦点顕微鏡により、TNT内でウイルスタンパク質（SとN）と複製マーカー（J2とnsp3）が検出され、TNTがウイルス物質を伝達する可能性が示唆された。TNTを介したSARS-CoV-2の移行をより詳しく調べるために、CLEM、低温電子顕微鏡、低温電子顕微鏡と呼ばれる困難なアプローチを設定した(39)。これらの手法により、SARS-CoV-2とTNTの両方の構造を、最もネイティブに近い条件下で（相関モードで）評価することができた。我々は、複数のSARS-CoV-2ビリオン（抗S抗体を用いて検出）が、透過性細胞間に形成されたTNTのPMに結合していることを発見した（図6と7）。また、TNT内のビリオンの蛍光シグナルに対応して、異なるサイズの小胞構造が観察された。同様のウイルス小胞構造とDMVが、寛容細胞と非寛容細胞間のTNT内に存在した（図8）。注目すべきは、寛容細胞間で形成されたTNTの上部にウイルスが観察され、神経細胞との異型共培養では観察されなかったことである。この矛盾は、ACE2レセプターがSH-SY5Y細胞ではなく、Vero E6細胞由来のTNT膜上にのみ存在することで説明できる。しかし、TNT膜の脂質組成も細胞種によって異なる可能性がある。我々は、SARS-CoV-2粒子が2つの透過性細胞をつなぐ細胞突起（すなわちTNT）の表面に付着することを観察したので、SARS-CoV-2が細胞膜上で "サーフ "している可能性があると仮定した。我々の観察によれば、SARS-CoV-2の移動はTNTを介して、細胞外接着（すなわち、サーフィン）と細胞内輸送の両方によって起こる。しかし、SARS-CoV-2の非感染細胞への拡散には、細胞間直接接触の他のメカニズムが関与している可能性も否定できない。例えば、HIVはTNTを "ハイジャック "するだけでなく、感染していないアストロサイトに毒性シグナルを拡散させるために、ギャップ結合コミュニケーションを行うことができる(76)。Kleinら(45)は、SARS-CoV-2ビリオンは、Sタンパク質とACE2との相互作用によって、エキソサイトーシス後も細胞表面に付着したままであると報告している。したがって、クライオCLEMやクライオETでTNTの上に観察されたビリオンは、細胞から排出される可能性もある。TNTがウイルスの排出に関与しているかどうかは不明である。TNTから排出されるウイルスは観察されなかったが、我々のデータは、TNT上に付着したビリオンが排出されるのか、あるいは細胞培地から排出されるのかを区別していない。それにもかかわらず、TNTはフィロポディアとは異なる突起であることを以前に示したように（39, 53）、我々の観察は、クライオFIBとクライオETを用いて、ウイルス粒子が拡張した突起から排出されることを示したMendonçaらの発表した結果（77）とは異なる可能性がある。