SARS-CoV-2はCD4を使ってTヘルパーリンパ球に感染する（論文の翻訳）
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37523305/
【要旨】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、コロナウイルス病2019（COVID-19）として知られる呼吸器疾患の主要な世界的な発生の病原体です。SARS-CoV-2は主に肺に感染し、リンパ球減少症やサイトカインストームなど、いくつかの免疫関連の合併症を引き起こす可能性があり、それらは病気の重症度と関連しており、死亡率を予測します。SARS-CoV-2感染が免疫系機能障害を引き起こすメカニズムはまだ完全には理解されていません。ここでは、SARS-CoV-2がヒトCD4+ Tヘルパー細胞に感染しますが、CD8+ T細胞に感染せず、重度のCOVID-19患者の血液および気管支肺胞洗浄Tヘルパー細胞に存在することを示しています。私たちは、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質（S）がCD4分子に直接結合し、それがTヘルパー細胞へのSARS-CoV-2の侵入を媒介することを実証しました。これはCD4 T細胞の機能障害につながり、細胞死を引き起こす可能性があります。SARS-CoV-2に感染したTヘルパー細胞は、ウイルスの持続性と病気の重症度に関連するより高いレベルのIL-10を発現します。したがって、CD4を介したTヘルパー細胞のSARS-CoV-2感染は、COVID-19患者の免疫応答の低下に寄与する可能性があります。
【はじめに】
コロナウイルス病2019（COVID-19）は、2020年3月11日に世界保健機関によってパンデミックと宣言され、世界中に急速に広がっています。COVID-19は世界中で何百万人もの死者を出しました。死亡のほとんどは、急性肺炎、心血管合併症、低酸素症による臓器不全、炎症反応の悪化、および広範囲の細胞死に関連しています（Candido et al.、2020; Laing et al.、2020; Li et al.、2020; Moore and June、2020; Zhang et al.、2020）。COVID-19の重症段階に進行した個人は、全体的なタンパク質合成の低下、サイトカインストーム、リンパ球減少症、およびT細胞疲労を特徴とする免疫応答の顕著な変化を示します（Arunachalam et al.、2020; De Biasi et al.、2020; Moore and June, 2020; Thoms et al., 2020）。免疫系に対するこれらの急性効果に加えて、感染者のかなりの割合が中和抗体の低力価を示します（Robbiani et al.、2020; Souza et al.、2021）。さらに、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）に対する抗体のレベルは、感染した個人の一部の回復後に急速に低下し（Long et al.、2020）、SARS-CoV-2感染が適応性に深刻で長期的な合併症をもたらす可能性があることを示唆しています。最近、SARS-CoV-2がリンパ球に感染できることが示されています（Pontelli et al.、2022; Shen et al.、2022）。この文脈では、さまざまな免疫細胞、特にCD4+ Tリンパ球などの免疫学的記憶と効果的な適応反応の形成に関与する細胞におけるSARS-CoV-2複製の複製能力と効果を特徴付けることが急務です。
SARS-CoV-2感染の正規メカニズムとして提案されているものでは、SARS-CoV-2（sCoV-2）のスパイク糖タンパク質は、宿主アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）に結合し、その後TMPRSS2によって切断されます（Hoffmann et al.、2020）。TMPRSS2はヒト組織に遍在して発現するが（図1-図補足1）、ACE2は主に上皮および内皮細胞、ならびに腎臓、精巣、および小腸で発現する（図1-図補足1）。それでも、さまざまな細胞タイプがSARS-CoV-2（Codo et al., 2020; Crunfli et al., 2022; Lamers et al., 2020; de Oliveira et al., 2022; Pascoal et al., 2021; Saccon et al., 2022; Yang et al., 2020）に感染する可能性があります。これらの細胞の中には、非常に低いレベルのACE2を示すものもあります。私たちは、これがリンパ球の場合であることを示しました（図1-図補足2）。これらの所見は、SARS-CoV-2がこれらの細胞に入るために代替メカニズムを使用するか、形質膜の補助分子がACE2と相互作用するまでウイルスを安定させることで感染を促進する可能性があることを示唆しています。後者と一致して、特定の細胞表面タンパク質へのsCoV-2の結合はウイルスの侵入を促進する（Cantuti-Castelvetri et al.、2020; Cecon et al.、2022）。
SARS-CoV-1（sCoV-1）とsCoV-2タンパク質のスパイクの構造は類似しているため（Wrapp et al.、2020; Yuan et al.、2020）、P-HIPSTerアルゴリズムを使用して、スパイクと相互作用するヒトタンパク質を発見しました（Lasso et al.、2019）。71のヒトタンパク質がsCoV-1と相互作用すると予測されました（図1-図補足3）。次に、細胞表面にあるタンパク質を特定するために、形質膜タンパク質の5つのデータベースとタンパク質を相互参照しました（詳細は「方法」を参照してください）。CD4は、5つのデータベースすべてに登場したsCoV-1と相互作用すると予測された唯一のタンパク質でした（図1-図補足3）。CD4は主にTヘルパーリンパ球で発現し、HIVの共受容体であることが示されています（Shaik et al.、2019）。CD4+ Tリンパ球は先天性および適応性免疫応答をオーケストレーションするため（Gasteiger and Rudensky、2014; O'Shea and Paul、2010）、SARS-CoV-2によるCD4+ T細胞の感染は、重度のCOVID-19患者のリンパ球減少症と調節不全の炎症反応を説明する可能性があります。さらに、進化の観点から、CD4+ T細胞の感染は、ウイルスが免疫応答から逃れるための効果的なメカニズムを表しています（Xu et al.、2001）。
ヒトの一次T細胞がSARS-CoV-2に感染しているかどうかをテストするために、感染していない健康な対照群/ドナー（HC）の末梢血からCD3+CD4+およびCD3+CD8+ T細胞を精製し、これらの細胞をSARS-CoV-2で1時間インキュベートし、PBSで3回洗浄しました。ウイルス量は感染後24時間後に測定されました。CD4+ T細胞ではSARS-CoV-2 RNAを検出できましたが、CD8+ T細胞では検出できませんでした（図1Aおよび図1-図補足4A）。細胞内のSARS-CoV-2の存在を確認するために、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）遺伝子に対するプローブを使用したin situハイブリダイゼーション、スパイクタンパク質に対する抗体を使用したsCoV-2の免疫蛍光、および透過電子顕微鏡（図1BおよびC）を行いました。並行して、私たちは原発性CD4+ T細胞にVSV-mCherry-SARS-CoV-2擬似型ウイルスを感染させました（図1-図補足4B）。すべてのアプローチは、SARS-CoV-2がCD4+ T細胞に感染することを確認しました。特に、SARS-CoV-2 RNAの量は、感染後48時間までほぼ安定しています（図1D）。注目すべきは、ここに提示されたデータのほとんどは古代のSARS-CoV-2 B系統を使用して生成されたが、CD4+ T細胞もP.1（ガンマ）変異体に感染していた（図1-図補足4C）。さらに、感染した細胞にSARS-CoV-2の負の鎖（アンチセンス）の存在を特定しました（図1-図補足4D）、ウイルスがTヘルパー細胞で複製することを示しています。また、プラークアッセイ分析により、SARS-CoV-2に感染したCD4+ T細胞は、ベロ細胞（陽性対照）よりもはるかに効率が低いが、感染性ウイルス粒子を放出することを発見しました（図1Eおよび図1-図補足4E）。
図1。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、in vitroおよびin vivoでCD4+ T細胞に感染します。
末梢血CD3+CD4+およびCD3+CD8+は、連続攪拌の下で1時間、模擬制御またはSARS-CoV-2（CoV-2）（感染の多重性（MOI）=1）に1時間さらされました。(A) 感染後24時間後にRT-qPCRでウイルス負荷が評価されました。(B) 細胞は洗浄され、24時間培養され、4%のパラホルムアルデヒド（PFA）で固定され、in situハイブリダイゼーションまたは免疫蛍光のための抗sCoV-2のためのRdRpプローブで染色されました。細胞は共焦点顕微鏡で分析された。（C、C1–C5）感染後2時間後にリンパ球内のウイルス粒子（アスタリスク）を示す代表的な透過型電子顕微鏡（EM）顕微鏡写真。(D) ウイルス負荷は、感染後2時間、6時間、12時間、24時間、および48時間qPCRによって決定されました。(E) ベロ細胞は、モックコントロールの上清またはCoV-2に感染したCD4+T細胞で1時間連続攪拌してインキュベートした。ヴェロ細胞のウイルス量は、72時間後にプラークアッセイを使用して測定されました。PFU、プラーク形成ユニット。(F) 健康な対照群 (HC) と COVID-19 患者の末梢血 CD4+ および CD8+ T 細胞の RT-qPCR でウイルス量が測定されました。(G) 気管支歯槽洗浄液 (BALF) 単細胞 RNA シーケンシング データからの CD4+ T 細胞における CoV-2 RNA 検出は、CoV-2 RNA の存在を明らかにした。データは、少なくとも2つの独立した実験が3部または重複（f）で実行された平均±SEMを表します。***p<0.001; ND、検出されていません。
図1—図の補足1。ヒト組織および細胞型におけるACE2、TMPRSS2、およびCD4発現の包括的な分析。
(A) BioGPSデータベースとThe Human Protein Atlasによると、複数の組織と細胞タイプにおけるACE2、TMPRSS2、およびCD4の発現。(B) NX式は、複数のデータベース間のコンセンサスmRNA式を示します。(C) 免疫組織化学データによるタンパク質検出は、ヒトタンパク質アトラスの注釈に基づいてプロットされました（量分類は主観的です）。CD4の発現率が最も高い上位25個の細胞/組織がマークされています。
図1—図の補足2。末梢血白血球におけるACE2発現。
（A、B）末梢血球中のACE2のフローサイトメトリー分析（FMO：グレー；抗ACE2：オレンジ）：CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD19+、CD123+、CD14+およびCD16+。CD14-.(C) Tリンパ球、A3.01、A2.01、およびA2.04細胞におけるACE2およびTMPRSS2のmRNA発現。
図1—図の補足3。プロテオミック・イン・シリコ分析は、SARS-CoV-1とヒト細胞膜タンパク質の相互作用を明らかにします。
(A) P-HIPSTerによってsCoV-1と相互作用すると予測され、少なくとも1つのデータベースで細胞膜の一部として考慮されたヒトタンパク質のベン図。少なくとも2つのデータベースで見つかったタンパク質には注釈が付けられています。(B) P-HIPSterによると、sCoV-1と相互作用する71の予測ヒトタンパク質の分子機能濃縮。
図1-図の補足4。CD4+ T細胞におけるSARS-CoV-2感染動態の評価。
(A) モックコントロールまたはCoV-2に感染した末梢血CD4+ T細胞におけるウイルスエンベロープ（E）、ヌクレオカプシド（N）、およびRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）遺伝子の相対発現。(B) 一次ヒトCD4+ T細胞は偽型(VSV-mCherry-CoV-2)でインキュベートされた。(C) 末梢血CD3+CD4+は、継続的な攪拌の下で1時間、モックコントロールまたはSARS-CoV-2（CoV-2）系統（BおよびP.1）（MOI 1）に感染しました。ウイルス負荷は、感染後24時間後にRT-qPCRで評価されました。(D) アンチセンスCoV-2鎖のPCRは、モックまたはCoV-2に感染したCD4+ TおよびVero（陽性対照）細胞で実施されました。(E) ベロ細胞は、モックコントロールまたはCoV-2感染CD4+T細胞の上清で1時間連続攪拌してインキュベートされました。ヴェロのウイルス量は、プレートアッセイを使用して72時間後に測定されました。PFU、プラーク形成ユニット。
図1-図の補足4-ソースデータ1。モックまたはCoV-2に感染したCD4+ TおよびVero（陽性対照）細胞のアンチセンスCoV-2鎖のためのPCRを含むオリジナルアガロースゲル。
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図1—図の補足5。個々のCD4+ T細胞集団の遺伝子署名。
CD4+ T細胞サブ集団は、CD4、CCR7、IL7R、およびIL32遺伝子マーカーの高差分発現を考慮して注釈を付けました。
SARS-CoV-2が生体内でCD4+ T細胞に感染するかどうかを調べるために、COVID-19患者の末梢血球からCD4+およびCD8+ T細胞を精製しました（補足ファイル1）。私たちの生体内実験と同様に、SARS-CoV-2 RNAはCOVID-19患者のCD4+ T細胞で検出されました（図1F）。公開されている単細胞RNAシーケンシング（scRNAseq）データ（Liao et al.、2020）を使用して、重症COVID-19患者の気管支肺洗浄（BAL）のCD4+ T細胞の2.1%にSARS-CoV-2 RNAの存在を検出しました（図1Fおよび図1-図補足5）。したがって、私たちのデータは、SARS-CoV-2がCD4+ T細胞に感染することを示しています。
次に、SARS-CoV-2感染におけるCD4分子の役割を探ろうとしました。P-HIPSterを使用して見つかった推定相互作用に基づいて、分子ドッキング分析を行い、sCoV-2受容体結合ドメイン（RBD）がCD4 Ig様VタイプのN末端ドメイン（NTD）と直接相互作用することを予測しました（図2Aおよび図2-図補足1）。段階的な温度上昇を伴う分子力学（MD）シミュレーションは、ドッキングモデルの代表者の運動安定性に挑戦するために適用されました（図2B）。2つのモデルは、353 Kでのシミュレーションの3番目のステップの後も安定しており、CD4 NTDとsCoV-2 RBDの相互作用の候補である可能性が高い（図2B）。さらに、これら2つのモデルと同じクラスターに存在する密接に関連するバインディングモードモデルの動的挙動を評価しました。あるケースでは、CD4 NTDとsCoV-2 RBDの間のもっともらしく、かなり安定した相互作用を示す、推定モデルに向けた強い構造的収束が観察されました（図2-図補足1）。RBDとCD4の相互作用領域は、ヒトACE2の相互作用領域と重なると予測されています（図2CおよびD）。CD4とsCoV-2の相互作用は、共免疫沈降によって確認されました（図3A）。蛍光異方性アッセイによって得られた結合親和性等温は、RBDとCD4（Kd = 22 nM）とスパイクフルレングスとCD4（Kd = 27 nM）の間の物理的高親和性相互作用を確認しました。類似した親和性を考慮すると、これらの結果は、sCoV-2とCD4の間の相互作用界面がRBDで発生することを示唆しています（図3BおよびC）。感染にはCD4-sCoV-2相互作用が必要であるという仮説と一致して、可溶性CD4（sCD4）による事前インキュベーションがSARS-CoV-2にさらされたCD4+ T細胞のウイルス負荷を完全に鈍らせることが観察されました（図3D）。一緒に、これらのデータは、sCoV-2がCD4分子に結合することを示しています。
図2。sCoV-2受容体結合ドメイン（RBD）とCD4 N末端ドメイン（NTD）相互作用の分子力学シミュレーション。
(A) 相互作用エネルギー (dG 分離) 対 平均平方根偏差 (RMSD) プロットは、同様のエネルギーを持つ結合モードの多様性を示しています。500の最高のモデルの中から、分子力学シミュレーションによるさらなる評価のために、50人のクラスターの最高ランクの代表者（青い十字として示されている）が選ばれました。(B) 200 nsを超える分子力学シミュレーション時間と4段階の温度の関数として、最初のドッキング複合体へのRMSD。各温度ステップで、行儀の良いモデルは色付きの曲線として描かれ、発散した候補は灰色の曲線として表示されます。合理的な相互作用を可能にする動的に安定したモデルは、最初のドッキングされたコンフォメーションに近いままです。353 Kで50 nsの3番目のステップの後、2つのモデルだけが安定しています。両方のモデルについて、シミュレーション中の弾力性のある接点を図に示します。S5。(C) ACE2とsCoV-2 RBDの相互作用モデル。分子力学シミュレーションによる2つの最良の候補、モデル95とモデル148は、異なる結合モードを提示します。最初のケースでは、相互作用は主にCD4 NTDのN末端部分で発生しますが、後者はこのドメインの中央部分に重要な貢献をしています。(D) モデル148のsCoV-2 RBDをPDB 6vyb EM構造のsCoV-2 RBDオープンステートに合わせることによって得られたsCoV-2とCD4 NTD相互作用のフルレングスモデル。
図2—図の補足1。sCoV-2受容体結合ドメイン（RBD）とCD4 N末端ドメイン（NTD）相互作用の分子力学シミュレーション。
モデル95（A）とモデル148（B）に最も近い2つのクラスターメンバーは、303 Kで3倍に100 ns分子力学（MD）シミュレーションを3つずつ被験しました。基準モデル95に対する~2.6–3.8Aの平均平方根偏差（RMSD）範囲の隣接モデル3と43は、密接に関連する結合モードを表しています。同様に、モデル2と61はクラスター代表モデル148と密接に関連しています。右のパネルは、軌道時間の関数として参照モデルに対するRMSDを示しています。モデル61は、当初、クラスター代表（モデル148）から3.16 Aで、すべての実行でモデル148の構造に収束しました。この結果は、モデル148がCD4-RBD結合の候補である可能性が高いという追加の証拠を提供します。(C) モデル95の場合、界面領域で3つの極接点が明確に定義されています。CD4リジン29はsCov2グルタミン酸484に水素結合されています。CD4のグリシンカルボニル酸素とセリン125のアミド水素は、それぞれsCov2のグリシン502とスレオニン500のアミド水素にh結合します。（D）モデル148の場合、2つの極性接触は持続的です：CD4アスパラギン酸80とsCov2チロシン505の間の1つの水素結合と、CD4グルタミン酸92とsCov2アルギニン408の間の2番目の水素結合は、その側鎖の向きも3番目の残基であるsCov2アスパラギン酸405によってサポートされ、3つの残留水素結合ネットワークを完成させます。(E) 303 K と 323 K での sCov2 RBD と CD4 の両方のモノマーでの MD シミュレーション。(F) 記事で評価されたMD軌道上で観察された最大バックボーンRMSDのヒストグラム。赤い点線は、分布全体で4 Åがどこにあるかを示しています。RDD、受容体結合ドメイン。
図3。SARS-CoV-2によるCD4+ T細胞の感染は、CD4とACE2分子に依存します。
(A) 組換えsCoV-2（ツインストレップタグ付き）とCD4は、抗CD4と共にインキュベートされ、免疫沈殿されました。複雑な形成は、ストレプタビジン-HRPを使用したアフィニティブロッティングによって決定されました。（B、C）CD4標識タンパク質に結合するスパイク全長とスパイク受容体結合ドメイン（RBD）の蛍光異方性曲線、それぞれ27±3 nMと22±3nMの解離定数（Kd）を示します。CD4は、フッ素素イソチオシアネートプローブによるインキュベーションにより、モル比3FITC:1タンパク質、4°Cで3時間FITCで標識されました。プローブの過剰は、137 mM NaCl、10 mM リン酸Na、2.7 mM KCl、pH 7.4を含む緩衝液中の脱塩カラム（HiTrap 5 ml、GE）によって除去されました。結合親和性を評価するために、4.5 μMから100 nMまで、標識されたCD4の20 nMを超えるスパイク（RBDまたは全長）の連続希釈が行われました。測定はClarioStarプレートリーダー（BMG、放出に520 nm、励起に495 nmの偏光フィルターを使用）を使用して行われ、OriginPro 8.6ソフトウェアを使用してデータ分析が行われました。Kdsは、ヒルモデルを介してバインディング曲線に適合したデータから得られました。（D）細胞は、連続攪拌下で1時間、異なる濃度（200、100、または50μg/ml）の可溶性CD4（sCD4）の存在下で、モックコントロールまたはSARS-CoV-2（CoV-2）に曝露されました。ウイルス負荷は、感染後24時間後にRT-qPCRで評価されました。(E) 一次ヒトCD4+ T細胞は、モックコントロールまたはCoV-2への曝露の18時間前に、IgGコントロールまたはモノクローナル抗CD4（RPA-T4）抗体でインキュベートされました。ウイルス負荷は、感染後24時間後にRT-qPCRによって測定されました。（F）A2.01およびA3.01系統は、擬似型ウイルス（VSV-mCherry-CoV-2）で培養されました。感染細胞の割合とフローサイトメトリー分析。（G）ウェスタンブロッティング（上部パネル）とフローサイトメトリー（下パネル）によるCD4の豊富さ。(H) A2.01およびA2.04におけるCoV-2のウイルス量。(I) 末梢血CD4+ T細胞は、モックコントロールまたはCoV-2で1時間曝露される18時間前に、IgGコントロールまたは抗ACE2（αACE2）ポリクローナル抗体でインキュベートされました。ウイルス量は感染後24時間で測定されました。(J) CD4+ T細胞は、モックコントロールまたはCoV-2で1時間曝露する前に、車両またはカモスタッメシル酸塩で18時間インキュベートされました。ウイルス負荷はRT-qPCRで分析されました。データは、少なくとも2つの独立した実験を3部構成で行う平均±SEMを表します。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.0001。
図3—ソースデータ1。元の共免疫沈降ブロット。
組換えsCoV-2とCD4は、抗CD4と共にインキュベートされ、免疫沈殿しました。
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図3—ソースデータ2。T細胞株の西部ブロッティングによる元のACE2の豊富さ。
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図3—ソースデータ3。T細胞株の西部ブロットによるオリジナルのCD4の豊富さ。
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図3—ソースデータ4。T細胞株の西部ブロットによる元のGAPDH豊富さ。
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図3-図の補足1。SARS-CoV-2感染ダイナミクスに対するACE2およびCD4発現プロファイルの含意。
(A) Caco-2、A2.01、A3.01細胞、およびCD4+ Tリンパ球におけるACE2およびCD4のウェスタンブロッティング。（B）CD4（左）およびACE2（右）発現一次CD4+ T細胞（末梢血単核細胞[PBMC]）、A2.01およびA3.01のフローサイトメトリー分析。(C) A2.01およびA3.01系統細胞におけるSARS-CoV-2の時間的ウイルス量。
図3-図の補足1-ソースデータ1。Caco-2、A2.01、A3.01、およびCD4+ Tリンパ球におけるACE2のウェスタンブロッティング。
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図3-図補足1-ソースデータ2。Caco-2、A2.01、A3.01、およびCD4+ Tリンパ球におけるCD4のウェスタンブロッティング。
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図3—図の補足1—ソースデータ3。Caco-2、A2.01、A3.01、およびCD4+ Tリンパ球におけるB-アクチンのウェスタンブロート。
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CD4-sCoV-2がSARS-CoV-2感染に結合することの重要性についてさらに洞察を得るために、CD4+ T細胞を精製し、CD4モノクローナル抗体（RPA-T4）で事前にインキュベートしました（O'Shea and Paul、2010）。CD4阻害がSARS-CoV-2負荷を低下させることを観察しました（図3E）。さらに、CD4（A3.01）または非A2.01（Folks et al.、1985;図3-図補足1）を発現するヒトT細胞株を使用しました。一次CD4+ T細胞よりも高いレベルのACE2とTMPRSS2を発現しているにもかかわらず（図1-図サプリメント2および図3-図サプリメント1）、CD4の存在はA2.01と比較してA3.01細胞のウイルス量を増加させるのに十分でした（図3-図サプリメント1）。これらの結果は、VSV-mCherry-SARS-CoV-2擬似型モデル（図3F）を使用して確認されました。重要なのは、A2.01にCD4を導入すると、ウイルス量が増加したことです（図3HとH）。
私たちの免疫沈降実験では、CD4とACE2の間に物理的な相互作用がないことが示されました（データは示されていません）。CD4+ T細胞はACE2発現が非常に低いため、CD4だけでSARS-CoV-2の侵入を許可するのに十分かどうかをテストしました。ポリクローナル抗体（図3I）を使用したACE2の阻害により、CD4+ T細胞におけるSARS-CoV-2の侵入が減少しました。さらに、カモスタメシル酸によるTMPRSS2の阻害は、SARS-CoV-2負荷を減少させました（図3H）。全体として、これらのデータは、SARS-CoV-2によるCD4+ T細胞の感染を可能にするために、ACE2、TMPRSS2、およびCD4がすべて必要であることを示しています。
SARS-CoV-2がCD4+ T細胞に感染する結果を評価するために、SARS-CoV-2に曝露されたCD4+ T細胞で、生体外分析に基づくショットガンプロテオミクスを実施しました。SARS-CoV-2感染は、免疫系、感染症、細胞周期、および細胞代謝に関連する複数の家事経路を変化させることを発見しました（図4AとBおよび図4-図1と2）。SARS-CoV-2曝露は、翻訳、ミトコンドリア代謝、細胞骨格リモデリング、細胞老化、およびアポトーシスに関与するタンパク質の変化を含む「ストレスに対する細胞反応」に関連する変化を引き起こします（図4Bおよび補足ファイル2）。同意すると、CD4+ T細胞とSARS-CoV-2の生体外曝露は、低MOI（0.1）で感染してから24時間後に細胞の生存能力が10%低下しました（図4-図補足3）。SARS-CoV-2は、さまざまなメカニズムで細胞死を引き起こす可能性があります。SARS-CoV-2は、mTORシグナル伝達の阻害によるオートファジーの刺激を通じて、異なる細胞株のアポトーシスを誘発することができます（Li et al.、2021）。また、COVID-19患者からの原発性単球および末梢血単核細胞（PBMC）で炎症体の活性化と発熱性を誘発することができます（Alvim et al.、2020）。上皮呼吸器および腎臓細胞株では、SARS-CoVはマルチモーダル壊死を引き起こします（Yue et al.、2018）。しかし、リンパ球では、アポトーシスがSARS-CoV-2を介した細胞死の根底にあるメカニズムであることが実証されています（Crunfli et al.、2022）。これは、私たちのプロテオミクスデータと一致しています（図4-図1と2）。
図4。SARS-CoV-2によるCD4+ T細胞の感染は、細胞機能を変化させ、IL-10産生を誘発します。
(A) 差分発現タンパク質とその関連する生物学的プロセスのヒートマップ。(B) 差分発現タンパク質のネットワークとその関連する生化学的経路。(C) COVID-19患者（中等度または重度）および健康対照（HC）の末梢血CD3+ CD4+細胞におけるIFNγ、IL-17A、TGFβ、およびIL-10遺伝子の相対発現。データは平均±SEMを表します。各ドットは患者のサンプルを表しています。(D) SARS-CoV-2に感染した一次CD4+ T細胞におけるIL-10遺伝子の相対発現。(E) モックコントロールまたはSARS-CoV-2にさらされた末梢血CD3+ CD4+中のリン酸化CREB-1Ser133（pCREB）および全またはリン酸化STAT3の代表的な免疫ブロット。リン酸化ATF-1は、pCREBを検出するために使用されたのと同じ抗体によって検出されます。 ***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
図4—ソースデータ1。リン酸化CREB-1Ser133（pCREB）とリン酸化ATF-1のオリジナル免疫ブロット。
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図4—ソースデータ2。リン酸化STAT3のオリジナル免疫ブロッティング。
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図4—ソースデータ3。総STAT3の元の免疫ブロット。
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図4—ソースデータ4。ビンクリンのオリジナル免疫ブロッティング。
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図4—図の補足1。異なる発現タンパク質の分析と生物学的プロセスへの影響。
(A) 差分的に発現したタンパク質の影響を受ける生物学的プロセスによるフォームツリー。(B) クラスター ID で色付けされたリッチド項のネットワーク; 同じクラスター ID を共有するノードは、通常互いに近接しています。入力遺伝子リスト全体の濃縮項の棒グラフ、p値で色付け。
図4-図の補足2。感染したCD4+ T細胞における機能的タンパク質ネットワークと濃縮分析。
(A) タンパク質の機能的相互作用ネットワーク（遺伝子名で識別される）。(B) 感染したCD4+ T細胞における有意に変化したタンパク質のタンパク質相互作用（遺伝子名によって識別）は、上位5つの遺伝子オントロジー用語の0.7の信頼スコアと機能的濃縮です。ノードサイズはp値に関連し、ノードの色は表現の方向を示します。
図4-図の補足3。BAL CD4+ T細胞の統合分析は、COVID-19患者の免疫調節不全を示しています。
(A) 健康、中等度、重度のCOVID-19患者のヒトBAL（CD4+ T細胞のサブクラスター）のt-SNEベースの分析のフローチャート。(B) TGFB1の百万単位の遺伝子発現。(C) 百万人当たりのIL10の遺伝子発現。(D) 百万分の数でのIFNGの遺伝子発現。(E) 百万人当たりのIL17Aの遺伝子発現。各ドットはセルを表します。（F）モック（青）またはCoV-2（オレンジ）でインキュベート24時間後のCD4+ T細胞の生存率。***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
IL-10の発現と放出は慢性ウイルス感染と広く関連しており、ウイルスの持続性を決定しています（Brooks et al.、2006）。注目すべきは、IL-10の血清レベルの上昇はCOVID-19の重症度と関連している（Han et al.、2020; Zhao et al.、2020）。CD4+ T細胞によるIL-10発現は、重度のCOVID-19患者のBAL（図4-図補足3）および血液（図4C）でより高いことがわかりました。これらの変化は、SARS-CoV-2にさらされた精製されたCD4+ T細胞もより高いレベルのIL-10を発現したため、少なくとも部分的には細胞自律的でした（図4D）。IL-10の免疫調節作用により、CD4+ T細胞によって引き起こされた免疫応答に関与する主要な炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの発現を測定しました。重度のCOVID-19患者からのCD4+ T細胞は、中程度の疾患の患者または健康なドナーからの細胞に関連して、IFNγおよびIL-17Aの発現が減少しました（図4C）。これらの結果は、SARS-CoV-2がCD4+ T細胞でIL-10発現を誘発することを示しています。これは、IFNγやIL-17Aなどの主要な炎症誘発性サイトカインをコードする遺伝子の抑制に関連しており、病気の重症度と相関しています。
Ser133リン酸化による転写因子CREB-1の活性化は、IL-10発現を誘発する（Gee et al.、2006）。IL-10アップレギュレーションと一致して、SARS-CoV-2感染CD4+ T細胞でSer133でのCREB-1リン酸化が増加した（図4E）。したがって、SARS-CoV-2感染は、CD4+ T細胞におけるIL-10のアップレギュレーションで最高潮に達するシグナルカスケードを誘発します。全体として、私たちのデータは、SARS-CoV-2がCD4+ T細胞に感染し、細胞機能を損ない、IL-10発現の増加につながり、細胞の生存能力を損ない、ウイルスに対する免疫力を弱め、病気の重症度に寄与することを示しています。