SARS-CoV-2スパイクアミロイド原線維は、ヒトプリオンタンパク質とアミロイドβペプチドのアミロイド原線維形成を特異的かつ選択的に加速する。（論文の重要部分の翻訳）
https://doi.org/10.1101/2023.09.01.555834
【要旨】
COVID-19感染症と、アルツハイマー病(AD)やクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)を含む神経変性疾患(NDs)の発症または加速との関連を示す報告が増えている。これらの疾患と他のいくつかのNDsは両方とも、ヒトタンパク質が誤って折り畳まれ、凝集したアミロイド原線維状態に変換されることによって引き起こされる。フィブリル形成プロセスは、あらかじめ形成されたフィブリルシードからのシード変換によって自己永続的である。私たちは最近、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のアミロイド原線維形成のもっともらしいメカニズムについて報告した。スパイクタンパク質は、COVID-19感染症に対する炎症反応に豊富に含まれる好中球エラスターゼによって切断されるとアミロイド原線維を形成した。
我々はここで、in vitro変換アッセイを用いて、CJD関連ヒトプリオンタンパク質(HuPrP)のアミロイド形成が有意なスパイクアミロイド線維の播種によって著しく促進されるという証拠をここに提示する。HuPrPの変換アッセイに、他のin vitroで生成された疾患関連アミロイド線維を播種することにより、これが一般的な効果ではなく、スパイクアミロイド線維の特異的な特徴であることを実証した。また、AD関連Aβ1-42のアミロイド原線維形成が、スパイクアミロイド原線維の種によって促進されることも示した。７つの異なる20アミノ酸長ペプチドのうち、スパイク532(532NLVKNKCVNFNFNGLTGTGV551)はHuPrPの播種に最も効果的であり、スパイク601(601GTNTSNQVAVLYQDVNCTEV620)はAβ1-42の播種に最も効果的であったことから、クロスシーディング活性の基質依存的選択性が示唆された。
純粋にin vitroではあるが、我々のデータは、スパイクアミロイド原線維による交差播種が、COVID-19感染症の後、CJD、AD、そしておそらくは他のNDsの報告数の増加に関与している可能性があることを示唆している。
【はじめに】
アミロイドとウイルスは、それぞれ人間の健康に有害な影響を及ぼすことで悪名高い。また、これらの２つの病気を引き起こす実体の間ではクロストークが起こり、宿主に害を及ぼすリスクが増大するさまざまな方法がある。いくつかの神経変性疾患(NDs)は、内因的に発現されたタンパク質のミスフォールディングやアミロイド形成と密接に関連している。しかし、これまでの研究では、なぜ一部の人々がこれらの病気の犠牲者になり、他の人々は犠牲にならないのかを説明できていない。フィンランドと英国のバイオバンクから得られた80万人を対象としたレトロスペクティブ研究では、最も一般的なウイルスのいくつかによる感染が明らかであった。インフルエンザと帯状疱疹は、アルツハイマー病(AD)やパーキンソン病(PD)などの最も一般的なNDsのリスク増加と関連している。
SARS-CoV-2感染症の急性期および長期にわたる続発症としてのCOVID-19の神経学的症状は、COVID-19のパンデミック中に広く観察され、報告されている。これについての主な原因は神経炎症である。神経炎症はNDsの共通の特徴である。プリオン病における神経炎症の特定の役割については最近再検討されている。
NDsは、脳内タンパク質のミスフォールディングとアミロイド形成に特に関連している。
ADは、主成分としてAβペプチドを含む細胞外アミロイド斑の形成と、タウタンパク質で構成される細胞内神経原線維変化に関連している。プリオン病は、哺乳動物のすべての神経細胞の細胞外表面に豊富に存在するプリオンタンパク質、PrPの誤った折り畳みと凝集によって引き起こされる。それぞれの異なる疾患は、独自のミスフォールドタンパク質のセットと関連しているが、クロスシーディングの可能性、つまり、ある種類のタンパク質から形成されるアミロイドが、別のタンパク質のアミロイド形成を誘導する可能性があることを示す証拠がますます増えている。
いくつかのSARS-CoV-2タンパク質はアミロイドを形成することが知られている。ウイルスのオープンリーディングフレーム遺伝子(ORFs)から翻訳されたタンパク質は、多くの場合、本質的に無秩序であるか、ウイルス粒子の中でのみ折り畳まれる。SARS-CoV-2 ORF6およびORF10はアミロイド生成性であり、得られたアミロイドは培養細胞に対して神経毒性特性を示す。ヌクレオカプシドタンパク質(NCAPs)は、ウイルス粒子の構築に不可欠である。これらのタンパク質には、ウイルス粒子の自己集合に重要な低複雑性ドメインが含まれているが、隣接するポリペプチド鎖間の相補性によってアミロイド構造の形成も促進される可能性がある。SARS-CoV-2 NCAPの低複雑性ドメインは、in vitroでアミロイドを形成し、このアミロイドは最近、COVID-19の治療薬候補として示唆された。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、好中球エラスターゼによって切断されるとアミロイドを形成する。エラスターゼはCOVIDによる炎症に豊富に含まれている。SARS-CoV-2スパイクタンパク質由来のアミロイドは、播種されたフィブリンの線維素溶解を妨げる可能性があり、したがって、重症かつ長期にわたるCOVID-19における微小凝固形成の説明の１つとなる可能性がある。Brognaらのデータは、特定のアミノ酸置換から推測されるように、mRNAワクチンに反応して宿主内で産生されたスパイクタンパク質が、mRNAワクチン接種後67～187日間、ワクチン接種を受けた個体の50%の血液サンプル中に残留することを実証している。このような長期にわたるスパイクタンパク質への曝露は、これまで残留ウイルス保有源に起因するという仮説が立てられてきたが、明らかにこれはmRNAワクチン接種の結果としても発生する可能性がある。
異なる科の他のウイルスにも、アミロイド形成タンパク質が存在する。一例として、季節性インフルエンザを引き起こすインフルエンザAのいくつかのタンパク質は、アミロイド形成性であることが知られている。組換え発現したPb1-F2タンパク質は、in vitroおよび実験的に感染した細胞内でアミロイドを形成する。インフルエンザA型非構造タンパク質１(NS1)は、in vitroでアミロイドを生成する。インフルエンザA感染は、PrPのミスフォールディングを誘発することが示されている。
過去３年間に、COVID-19感染またはワクチン接種と並行してクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)が発症したといういくつかの症例報告が発表された。最近、Stefanoらにより、長期にわたるCOVID-19の病因に対処する際には、PrPcからPrPscへの変換とその後のミトコンドリア機能不全を考慮すべきであることが示唆された。
ADは非常にゆっくりと進行する疾患であるが、COVID-19感染とADの下流リスクとの関連を示唆する兆候がすでに存在している。初期株のCOVID-19感染症後に感染した患者では脳萎縮が蔓延していた。Aβ凝集体は、若いCOVID-19感染患者の死後の脳で発見された。COVID-19により、65歳以上の場合、360日以内に新たにADと診断されるリスクが1.69倍増加した。
最近のin vitro研究では、SARS-CoV-2スパイクタンパク質ペプチド1058-1068からのあらかじめ形成されたシードによって誘導されるAβ1-42原線維形成の増強が示された。ここでは、NDタンパク質とSARS-CoV-2スパイクアミロイド原線維のクロスシーディンブの概念を追跡する。
クロスシーディングは検証可能な仮説であり、我々はヒトプリオンタンパク質とAβ1-42ペプチドをSARS-CoV-2スパイクタンパク質のペプチドからの７つの異なるアミロイドフィブリルとクロスシーディングすることにより、十分に確立されたin vitroシーディングアッセイでこの仮説に取り組んだ。
＊我々は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に由来するアミロイドが、それぞれヒトプリオンタンパク質(HuPrP)とヒトAβペプチドのより速い原線維形成を引き起こすかどうかを判断することを目的とした。そこで、SARS-CoV-2スパイクタンパク質（武漢株）のアミロイド形成性配列に由来する７つの異なる20アミノ酸長ペプチドの予め形成されたフィブリルを追加した。（これ以降、スパイクタンパク質の最初のアミノ酸配列に対応する番号をつけてスパイクシードと呼ぶ。）
【考察】
組換えタンパク質のアミロイド線維形成反応は、多くのアミロイド関連疾患を理解するための重要な研究ツールとして使用されている。タンパク質が、同じタンパク質配列の予め形成された少量のアミロイド原線維によって損傷される反応は、相同シーディングまたは自己シーディングとして知られている。組換えにより生成および精製されたタンパク質の相同シーディングの概念は十分に確立されており、文献は膨大である。基質として組換えプリオンタンパク質を使用するシーディングアッセイは、プリオン病の臨床診断に使用され、RT-QuiCとして知られている。追加されたアミロイド原線維が別の原線維で構成されている場合、これは異種播種または交差播種と呼ばれる。異種播種は、基質とは異なる単一の点突然変異を有するタンパク質、同じタンパク質であるが異なる種に由来するタンパク質、または全く異なるタンパク質であるが同じ疾患に関係しているタンパク質である可能性を考える。クロスシードが自己シードほど効率的であることは稀である。多くの場合、異種シードの添加は、Aβペプチドまたはヒトプリオンタンパク質の原線維形成を有意に増加させない。クロスシーディングの概念は現在多くの研究室で研究されており、さまざまな疾患に関連するタンパク質とアミノ酸の相補性、ならびにアミロイド中心部分の有益な三次（三次元）配列が異種シーディングの成功の調節因子として示唆されている。
我々はここで、AD関連ペプチドAβ1-42とCJD関連ヒトプリオンタンパク質の両方が、SARS-CoV-2スパイクタンパク質由来のアミロイドからの交差播種を受けやすいことを実証する。HuPrPでは、スパイク532アミロイドは他の６つのペプチドアミロイドよりもアミロイド形成のラグタイムを大幅に短縮するが、特にスパイク192アミロイドはラグタイムの有意な減少を誘導しなかった。スパイク532播種の劇的な効果は用量依存的であった。
10%（0.1mg/ml基質タンパク質中0.01mg/ml）スパイク532を添加すると、ラグタイムが中央値712分から中央値135分までほぼ80%短縮された。スパイクシードを10倍に希釈すると、スパイクペプチドアミロイドのシード活性がほぼ完全に消失した。しかし、スパイク532アミロイドは依然としてラグタイムを大幅に短縮する能力を維持しているが、10倍希釈ではラグタイムが中央値397分から中央値360分まで10％しか減少しなかった。それぞれのペプチドの0.0014mg/mlに相当する0.01mg/mlのスパイク混合物は、タイムラグを405分から307分まで25%減少させた。
いくつかのよく知られ、よく研究されているアミロイドを用いた対照反応を使用して、ヒトプリオンタンパク質を交差播種する一般的な傾向を調べた。対照シードを、スパイクペプチドアミロイドの最高濃度に対応する最終濃度0.01mg/mlまでHuPrPに添加した。0.001mg/mlの線維状HuPrP90-231を陽性対照として含めた。共凝集した７つのスパイクペプチドのそれぞれの14%(1/7)を含むスパイクミックスは、この非常に低い個別のペプチド濃度でもシーディング活性を示した。インスリン原線維はHuPrP原線維化のラグタイムを適度に減少させたが、リゾチーム、TTR、およびAβ1-42の原線維は減少しなかった。
ADの病態生理学と最も関連しているため、Aβ1-42ペプチドを実験に選択した。脳脊髄液中の疾患バイオマーカーとしてAβをモニタリングすると、CSF中のAβ1-42/40比が疾患の重症度の増加とともに減少することが明らかである。生成されたAβ1-42が脳内のアミロイド斑に蓄積し、CSFへのペプチドの漏出を防ぐ分子シンク効果が、このバイオマーカー観察の実行可能な説明と考えられる。Aβ1-42とAβ1-40の間の比率の同様な変化は、SARS-CoV-2パンデミックの初期に神経学的症状を呈したCOVID-19患者でも見られた。著者らは、COVID-19症例におけるAβ1-42/40比の減少については分子学的な説明を提供していないが、一時的または持続的なAβ1-42の蓄積は考えられるいくつかの説明のうちの１つであり、この観察を理解するにはさらなる研究が必要である。
私たちの実験では、HuPrPのクロスシーディングの場合と同様に、７つのスパイクアミロイドペプチドすべてがAβ1-42線維形成を同じように加速するわけではないことがわかった。HuPrPの場合とは異なり、テストした７つのスパイクペプチドアミロイドすべてが、原線維形成の時間を大幅に短縮し、特にすでに急速な非シード反応を大幅に短縮することを発見した。HuPrPを用いた実験と同様に、１つのスパイクペプチドアミロイドが最も活性の高いシードとして際立っていた。興味深いことに、この配列は、HuPrPと比較してAβ1-42では異なっていた。スパイク532はHuPrPの播種において最も効率的であったが、スパイク601はAβ1-42の播種において最も効率的であった。
ヒトプリオンタンパク質は、自己播種に敏感であることで有名であり、これまでのところ、個体間伝播について議論の余地のない能力を有する唯一のタンパク質である。一方で、HuPrPに異種配列のアミロイドを伝播することは困難であることが証明されている。
ヒトプリオンタンパク質とAβペプチドはどちらもヒトの脳に遍在しているが、ミスフォールディング状態にある場合にのみ疾患（それぞれ散在性CJDとAD）に相関する。しかし、科学はこれまでのところ、なぜ一部の人がこれらの病気の犠牲者になり、他の人は犠牲にならないのかを説明できてはいない。PrPプリオンの伝播特性は十分に確立されているが、AD病態の宿主間伝播についてはまだ議論の余地がある。
私たちが最近総説で議論したように、ウイルスタンパク質が完全で、成功し、定量的なタンパク質のフォールディング（折り畳み）を目指すという進化的圧力は低い。同様の推論で、ヒトとウイルスのプロテオーム間の共進化の欠如により、ヒトは自己生成アミロイドよりもウイルスのアミロイドからの交差播種から保護されにくくなっている。一般に、NDsの多数の散発的な症例の病因については、現時点ではコンセンサスがない。最近、Jaunmuktaneらは、ADドナーに由来すると推定される血管性Aβアミロイドーシスについて、罹患から発病までの膨大な潜伏期間を強調した。ここで、Aβアミロイドシードの医原性伝播の被害者とされる者は、汚染された硬膜移植片を移植された後、または汚染された脳外科手術器具に触れたりした後、40年以上も経ってからAβアミロイドーシスを呈した。これを、ウイルス感染後数十年経っても残るNDsのリスク増加に関するLevineらによる厳密な調査と組み合わせると、NDsにおけるタンパク質のミスフォールディングとアミロイド形成の潜在的な誘発因子としてのウイルスアミロイドの概念に関する研究活動の強化が提唱される。SARS-CoV-2感染またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質誘導体によるワクチン接種に一時的に近いCJDが発現するという最近のいくつかの報告も、可能性のある関連性を調査する必要性を強調している。