SARS-CoV-2エンベロープ（E）タンパク質は、宿主のタイトジャンクションタンパク質ZO1のPDZドメイン-2と相互作用します。（論文の重要部分の要約）
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0251955
リエル・シェプリー・マクタガート、カリ・ア・サガム、イザベラ・オリバ、エリザベス・リバコフスキー、ケイティ・ディギリオ、ジンジン・リャン、マーク・T・ベッドフォード、ジョエル・カッセル、マリウス・スドル、ジェームズ・M・マリン、ロナルド・N・ハーティ
編集者：マイケル・コバル6
PMCID: PMC8189464 PMID: 34106957
利用可能な以前のバージョン：この記事は、2020年12月23日にbioRxivに投稿された以前に利用可能なプレプリントに基づいています：「SARS-CoV-2エンベロープ（E）タンパク質は、ホストタイトジャンクションタンパク質ZO1のPDZ-ドメイン-2と相互作用します」。
【要旨】
SARS-CoV-2は、気道と肺の上皮細胞を標的とし、塩化物分泌の増幅と上皮バリアの漏出の増加につながり、多くのCOVID-19患者に見られるように、重度の肺炎と肺の固化に寄与します。SARS-CoV-2誘発病因に寄与する分子的側面のより良い理解と、これらの有害な病状を軽減するためのアプローチの開発が急務です。多機能SARS-CoV-2エンベロープ（E）タンパク質は、ウイルスの組み立て/排出に寄与し、膜タンパク質として、上皮バリア損傷、病因、および疾患の重症度に寄与する可能性のあるビロポリンチャネル特性も持っています。Eの極C末端（ECT）配列には、SARS-CoV-1のEタンパク質で同定されたものと同様の推定PDZドメイン結合モチーフ（PBM）も含まれています。ここでは、SARS-CoV-2 Eタンパク質のビオチン標識WTまたは変異ECTペプチドを使用して、一連のGST-PDZドメイン融合タンパク質をスクリーニングしました。特に、WT Eペプチドとヒトゾナオクルーデンス-1（ZO1）の2番目のPDZドメインとの間に特異な特異的な相互作用を特定しました。これは、すべての上皮組織におけるTJ形成/完全性の主要な調節因子の1つです。この新しいモジュラーE-ZO1相互作用をさらに検証するために、2番目の補完的なアプローチとして均質な時間分解蛍光（HTRF）を使用しました。
私たちは、SARS-CoV-2 Eが感染した上皮細胞でZO1と相互作用し、この相互作用は、これらの細胞層におけるタイトジャンクションの損傷と上皮バリアの破綻に部分的に寄与し、ウイルスの拡散と罹患率につながる重度の機能不全につながる可能性があると仮定します。このウイルスと宿主の相互作用を標的とする予防的/治療的介入は、気道および/または消化管バリアの損傷を効果的に軽減し、ウイルスの拡散を緩和する可能性があります。
【はじめに】
まず、この新型SARS-CoV-2が宿主とどのように相互作用してそのような重篤な病気の病理を引き起こすかを調べることが不可欠です。
スパイク（S）、膜（M）、ヌクレオカプシド（N）、およびエンベロープ（E）タンパク質は、ウイルスRNAゲノム[2、3、5、15、16]の3'端内にコードされている4つのビリオン構造タンパク質です。Sタンパク質は、侵入と膜融合に関与しています[3, 15, 17]。Mタンパク質は最も豊富で、ビリオンにその形を与えます。一方、多機能Nタンパク質はウイルスゲノムRNAに結合して保護し、組み立て中にウイルス膜タンパク質と相互作用し、ウイルス転写の効率を高めます[3、18、19]。多機能Eタンパク質は、ビリオンの成熟、組み立て、および排出において役割を果たし、SARS-CoV-1のEタンパク質は、Eタンパク質を欠くSARS CoV-1ウイルスによる生体内での病原性の減弱によって示されるように、感染において重要な役割を果たします[24–26]。SARS-CoV-1のEタンパク質の極C末端アミノ酸には、重要な病原性因子であるPDZドメイン結合モチーフ（PBM）が含まれており、その欠失はウイルス病原性を低下させる[24, 25]。特に、SARS-CoV-1 Eタンパク質のPBMは、TJ関連タンパク質である宿主タンパク質PALS1のPDZドメインと相互作用し、腎上皮モデルにおける細胞TJの形成の遅延と細胞極性の破壊につながる[27]。興味深いことに、SARS-CoV-2のEタンパク質の極端なC末端（ECT）配列はSARS-CoV-1のそれと類似しており、この推定PBMを介して特定の宿主PDZドメイン担体タンパク質と相互作用する可能性があることを示唆しています。実際、最近の研究では、SARS-CoV-2 Eタンパク質がPALS1に対する親和性の増加を示したことが示されました[13, 28–31]。
私たちは、SARS-CoV-2 Eタンパク質のECTが、病気の進行と重症度を高める機能を持つ可能性のある特定の宿主PDZドメインを持つタンパク質に関与しているかどうかを判断しようとしました。この目的のために、SARS-CoV-2 Eタンパク質からのビオチン標識WTまたはC末端変異ペプチドで固体サポートに固定された約100の哺乳類PDZドメインのGST融合アレイを調査しました。驚くべきことに、WT Eペプチドと
ヒトZona Occludens-1（ZO1）のPDZ-ドメイン#2との間に単一の堅牢な相互作用が特定されましたが、C末端変異体EペプチドとZO1の間には確認されませんでした。ZO1は、複数のタンパク質とタンパク質の相互作用を促進する3つのPDZドメインを介してTJ複合体の形成と完全性を組織化する重要な足場タンパク質です。具体的には、ZO1のPDZドメイン#2は、上皮全体の正常なバリア機能の確立に不可欠なZO1とTJバリアタンパク質、オクルジンとクラウジン-2の特徴的な連続バンドを確立するために必要です[32, 33]。我々は、HTRFによるE-ZO1相互作用をもう一度確認し、ZO1のGST-PDZドメイン#2がSARS-CoV-2 E WTペプチドに結合するが、E変異ペプチドとは濃度依存的に結合しないことを示した。
重度の肺炎と肺の固化はしばしばCOVID-19の症状であるため[11, 12]、SARS-CoV-2 Eタンパク質が宿主ZO1と相互作用して、ウイルスの拡散と病気の重症度を高めるメカニズムとして、ヒト気道上皮バリア細胞のTJ複合体とバリア機能を破壊または損傷する可能性があると推測する傾向があります。さらに、胃腸（GI）管はSARS-CoV-2による持続性および非細胞溶解感染の主要な標的部位でもあるため、E-ZO1相互作用によるGIバリア機能と結合複合体の侵害も重篤な疾患の病理に寄与する可能性があります[34]。SARS-CoV-2 Eタンパク質とZO1の相互作用に関するさらなる調査は、SARS-CoV-2ウイルス誘発性罹患率の理解を深め、治療戦略に焦点を当てるために活用することができます。推定されたE/ZO1インターフェースは、薬物可能な標的であることが証明され、SARS-CoV-2の伝播または疾患の病理を治療的に減少させるのに役立つ可能性があります。
【結果】
『SARS-CoV-1とSARS-CoV-2 Eタンパク質のC末端配列の比較』
SARS-CoV Eタンパク質は、N末端、膜貫通ドメイン、およびC末端ドメインを含む3つの主要な領域に分割でき、感染した細胞に複数の機能を持つ成熟したビリオンに組み込まれた小さな膜タンパク質です[15,20, 22, 25, 26, 37]。さらに、SARS-CoV-1 E（DLLV）の極端なC末端アミノ酸は、検証されたPDZドメイン結合モチーフ（図1）[24、27]で構成されています。DLLVコアモチーフはSARS-CoV-2 Eタンパク質（Wuhan-Hu-1株）で完全に保存されており、隣接するアミノ酸は同一ではありませんが、SARS-CoV-1 E（図1）のアミノ酸と高度に保存されているため、SARS-CoV-2 Eタンパク質が宿主タンパク質の選択されたPDZドメインとも相互作用する可能性は高いです[13、21、28、29、31、38]。
図1。SARS-CoV-1およびSARS-CoV-2 Eタンパク質のC末端アミノ酸配列。
保存されたC末端VPDLLV配列と推定PBMモチーフに下線が引かれます。アミノ酸の違いは赤で強調表示されます。
『SARS-CoV-2のEタンパク質とのPDZドメイン相互作用体としてのZO1の同定』
ここでは、SARS-CoV-2 Eタンパク質内に存在する推定PBMが、幅広い宿主PDZドメインを含むタンパク質と相互作用できるかどうかを判断しようとしました。私たちは、SARS-CoV-2 Eタンパク質のWTまたは変異したC末端配列を含む蛍光標識のビオチニル化ペプチドを使用して、哺乳類タンパク質由来の90のPDZドメインと9つの14-3-3様ドメインで構成される配列をスクリーニングし、新しい宿主相互作用を検出しました（図2、上）。驚くべきことに、SARS-CoV-2 WT EペプチドとヒトZO1の2番目のPDZドメインとの間の特異的相互作用を特定しました（図2、左下パネル、赤い楕円形、位置J6）。対照として、SARS-CoV-2変異Eペプチドは、アレイに存在するPDZドメインまたは14-3-3-ドメインのいずれとも相互作用しませんでした（図2、下部中央パネル）。すべてのGST融合タンパク質は、抗GSTアンチ血清の使用によって示されたように、アレイに存在していました（図2、右下のパネル）。私たちの結果は、SARS-CoV-2 Eタンパク質[39]のC末端配列との相互作用因子として、ヒトZO1のPDZドメイン#2を初めて特定したものです。その後の研究では、私たちの発見が確認され、SARS-CoV-1とSARS-CoV-2 Eタンパク質の両方のPBMとの追加の宿主相互作用が特定されました[40]。
図2。GST-PDZドメイン融合タンパク質のスクリーニング配列。
示されたGST-PDZとGST-14-3-3ドメイン融合タンパク質は、文字ボックスごとに2倍に並べられました。各ボックスの右下のサンプル（M）は、負のコントロールとしてGSTのみを表しています。配列は、SARS-CoV-2 Eタンパク質のビオチニル化E-WTまたはE変異ペプチドでスクリーニングされました。E-WTペプチド（ビオチン-SRVKNLNSSRVPDLLV）（100μg）、およびE変異ペプチド（ビオチン-SRVKNLNSSRVPAAA）（100μg）の代表的なデータが示されています（下部パネル）。E-突然変異ペプチドは、GST-PDZまたはGST-14-3-3ドメイン融合タンパク質と相互作用しませんでしたが、E-WTペプチドは、ボックスJ（赤い楕円形）の位置6にあるヒトZO1からのGST-PDZドメイン#2と強く、単独で相互作用しました。すべてのGST融合タンパク質の発現に対する陽性対照が示されています（抗GST）。
『E-ZO1相互作用を確認するための均質時間分解蛍光（HTRF）の使用』
私たちは、スクリーニングアレイで特定されたE-ZO1相互作用を検証するために、2番目の補完的なアプローチを使用しようとしました。この目的のために、HTRFアッセイを使用して、精製されたGST-ZO1 PDZドメイン#2へのSARS-CoV-2 WTおよびECT変異Eペプチドの結合を評価しました（図3）。GST-ZO1 PDZドメインタンパク質とWTまたは変異Eペプチドの連続希釈を1時間一緒にインキュベートし、HTRF信号を測定し、XIFitを使用してプロットしました。確かに、GST-ZO1 PDZドメイン#2とWT Eペプチド（図3、左パネル）への明確な濃度依存結合が観察されましたが、ECT変異ペプチド（図3、右パネル）は、ペプチド濃度の範囲にわたって観察されません。SARS-CoV-2 WT EペプチドとGST-ZO1 PDZドメイン#2の3nM濃度との相互作用のKdは29nMでした（図3、下のパネル）、これはPDZドメインとその同族ペプチドについて計算されたものと一致しています。
これらの所見は、SARS-CoV-2 Eタンパク質のC末端配列がヒトZO1タンパク質のPDZドメイン#2と堅牢に相互作用することを示す上記のものを裏付けています。
図3。均質時間分解蛍光（HTRF）。
ZO1の精製GST-PDZドメイン#2を持つSARS-CoV-2 E-WT（Bt-WTペプチド、左パネル）およびE-変異体（Bt-Mutペプチド、右パネル）ペプチドの濃度依存結合特性が示されています。0–50 nM（さまざまな記号で示される）範囲のGST-PDZドメイン融合タンパク質の濃度は、示された濃度E-WT（左）またはE-変異（右）ペプチド（x軸）でインキュベートされ、HTRF信号が測定されました。E-WTペプチドはGST単独に結合しませんでした（左パネル、青い点）。しかし、ZO1のGST-PDZドメイン2へのE-WTペプチドの明確な濃度依存結合が観察されました。E-変異ペプチドは、ZO1テストのGST-PDZドメイン2の濃度に結合しませんでした（右パネル）。GST-ZO1 PDZドメイン#2（ボトムパネル）の3nM濃度に対するE-WTペプチド結合について、29nMのKd値が計算されました。
【議論】
コロナウイルスEタンパク質は、ER-Golgi複合体からの感染性ビリオンの組み立て、発芽、細胞内輸送など、感染中に多くの機能を持っています[2, 21, 23, 25]。SARS-CoV-2 Eタンパク質[22]のモデリングは、Eが動的開状態と閉状態を持つ広域カチオン（陽イオン）選択イオンチャネルを形成することができ、したがってSARS-CoV-1 Eタンパク質[25, 37]と同様のビロポリンとして作用する可能性があることを示唆しています。SARS-CoV-2のゲノムはSARS-CoV-1のゲノムと約80%の同一性しか共有していませんが、DLLVコアモチーフと隣接するアミノ酸を含むSARS-CoV-2 Eタンパク質のECTは、SARS-CoV-1 Eタンパク質のゲノムと高度に保存されています（図1）[13、15、30、31]。SARS-CoV-1とSARS-CoV-2 Eタンパク質の配列アライメント（図1）は、両方のタンパク質のECTに位置する配列の類似性と推定PBMを強調しています。
スクリーニングアレイを使用して、SARS-CoV-2 Eタンパク質の推定PBMと相互作用する可能性のある宿主PDZドメインを含むタンパク質を特定しました。その結果、TJ足場タンパク質ZO1のPDZドメイン#2が一つだけヒットし（図2）、HTRFを使用してこの新しい相互作用を確認しました（図3）。
コロナウイルスEタンパク質が宿主PDZドメインと相互作用する前例があります。実際、SARS-CoV-1 Eタンパク質は、TJタンパク質PALS1のPDZドメインと相互作用することが示され、その結果、腎臓モデルにおいて、PALS1の誤局性が示され、TJの形成が遅れました[27]。その後の研究では、SARS-CoV-2 Eタンパク質のC末端配列もPALS1のPDZドメインに結合すると予測されました[28–30]。PALS1のPDZドメインはスクリーニングアレイに含まれていませんでしたが（図2）、PALS1は最近のレポートでSARS-CoV-2 Eタンパク質との弱い相互作用体として特定されました[40]。
重要なのは、ZO1、ZO2、およびZO3の2番目のPDZドメインは、その構造においてかなりよく保存されており、ホモおよび/またはヘテロ二量体化して、タイトジャンクションにおいて、ZOタンパク質の機能的多成分複合体を形成することです[41–43]。したがって、ZO2とZO3の2番目のPDZドメインもSARS-CoV-2 Eタンパク質のECTと積極的に相互作用する可能性があると推測し、これらの研究は現在進行中です。
呼吸器ウイルスを含むいくつかの病原体は、ウイルスと肺上皮細胞TJの間の相互作用を含むメカニズムによって、肺の細胞バリア（および細胞極性および組織特異的単方向輸送プロセス）の破壊を引き起こし、漏出を引き起こす可能性があります[44]。これらの病原体は、TJ複合体を含む細胞タンパク質と相互作用し、それによってそれらの破壊を引き起こし、その後、上皮および内皮バリアを越えて広がる全身へのウイルス拡散を強化することができます[44, 45]。E-ZO1相互作用がTJ、バリアの完全性、生理学的に重要な細胞間輸送プロセス、およびおそらく細胞極性を破壊させる可能性のあるいくつかの独立したメカニズムがあります。例えば、SARS-CoV-2 Eタンパク質は、TJ複合体の他のタンパク質（例：ZO2、ZO3、またはZO1自体[ホモジマー化]）と、ZO1のPDZドメイン#2への結合と競合し、クラウジンが実際のバリア形成ストランドに組織化できなくなる可能性がある[33、46]。あるいは、E-ZO1相互作用は、アクチン-ミオシン環のアクチンフィラメントへのZO1結合を変化させる可能性があり、それによってミオシン軽鎖キナーゼシグナル伝達によるバリア調節を変える可能性がある[47]。さらに、TJ複合体でのE-ZO1相互作用は、ZO1のZONAB（ZO1関連核酸結合タンパク質）への結合親和性の低下をもたらし、TJ複合体からZONABを遊離させ、核へのZONAB転座を増加させ、上皮間葉系転換（EMT）の増加と、一般的な上皮脱分化による上皮バリア機能（および一方向塩化物分泌）の併発的な減少につながる可能性があります[46、48、49]。TJの完全性を破壊することにより、E-ZO1相互作用は、傍細胞横断的な上皮漏出の増加と、単方向の細胞横断的な塩分と水の輸送の変化をもたらし、COVID-19患者の肺に水分の蓄積に寄与します。実際、最近の研究では、SARS-CoV-2感染がZO1局在化を破壊させ、経上皮電気抵抗（TEER）の減少によって示されているように、バリア機能障害を引き起こすことが示されています[50]。著者らは、感染した細胞におけるバリア機能のこの低下は、二次炎症反応におけるサイトカイン放出によるものかもしれないと推測している。E-ZO1相互作用が、上記のように、感染細胞におけるこの観察されたバリア機能の低下とZO1の局在化の変化に寄与するより主要なメカニズムを表すかどうかはまだ決定されていません。
進行中の研究では、このウイルスと宿主の相互作用の生物学的意義を確立するために、ウイルス感染細胞における全身のSARS-CoV-2 Eが内因性ZO1と相互作用するかどうかを判断します。さらに、SARS-CoV-2 WTと突然変異Eタンパク質をヒト肺気道細胞（Calu-3および16HBE）および腸管モデル（CACO-2細胞）で単独で発現するように設計されたレンティウイルス粒子の実験が進行中であり、分離中のE/ZO1相互作用と、TEER分析とパラセルプローブ分子の経上皮拡散を介してTJ完全性に対する潜在的な影響を調査します。ウイルス感染細胞におけるE/ZO1相互作用の検証は、重度のCOVID19患者の肺および/または消化管罹患率と疾患症状を治療的に軽減するための低分子化合物の将来の開発にとって重要になります。治療のためにE/ZO1インターフェースをターゲットにすると、バリア細胞の損傷を効果的に減らし、この大きな健康上の脅威に関連する罹患率と死亡率を低下させる可能性があります。