SARS-CoV-2 Sタンパク質は、保存されたS2サブユニットを介してISGF3複合体の形成を妨害し、I 型インターフェロン応答に拮抗する。（論文の翻訳）

2025年1月13日 20:32

著者：Zeng Cai Https://orcid.org/0000-0001-5398-7193、ウェンジア・ニ Https://orcid.org/0009-0000-6763-5391、Wenkang Li、Zhixuan Wu、Xiaoqian Yao、Yucheng Zheng、Yongliang Zhao、すべて表示（15人の著者）、ケクス xuke03@whu.edu.cnです著者情報と所属

Https://doi.org/10.1128/jvi.01516-24

【要旨】

ウイルス免疫抑制は、感染した患者の宿主免疫応答とワクチンの保護効果に大きく影響します。ここでは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の主要なワクチン抗原であるスパイク（S）タンパク質が、S1とS2サブユニットの両方を介してインターフェロン刺激遺伝子（ISG）発現を阻害することにより、宿主の先天性免疫を強く抑制することを発見しました。メカニズム的に、Sタンパク質は、STAT1、STAT2、およびIRF9で構成される古典的なインターフェロン刺激遺伝子因子3（ISGF3）複合体の形成を抑制し、IRF9との結合のためにSTAT2と競合し、それによってISGの転写を妨げました。SとSTAT1/STAT2タンパク質の間の強い相互作用は、ISGF3複合体を内質網にさらに閉じ込め、ISGF3の核転座を妨げます。特に、Sタンパク質のインターフェロン阻害メカニズムは、SARS-CoV-2変異体およびSARS-CoV、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）、ヒトコロナウイルス229E（HCoV-229E）、ヒトコロナウイルスNL63（HCoV-NL63）、ヒトコロナウイルスHKU1（HCoV-HKU1）を含む他のヒトコロナウイルスの間で普遍的であり、S2サブユニットの最も進化的に保存された領域を介して。まとめると、この研究の結果は、コロナウイルスSタンパク質が宿主の抗ウイルス免疫応答を弱体化させる新しいメカニズムを明らかにし、免疫抑制効果を防ぐためのコロナウイルスSベースのワクチンの適切な設計に関する新しい洞察を提供します。

【重要性】

この研究では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質が宿主の抗ウイルス免疫応答を弱める新しいメカニズムを明らかにします。Sタンパク質のインターフェロン阻害メカニズムは、保存されたS2ドメインを通じて、SARS-CoV-CoV-2変異体およびSARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63、およびHCoV-HKU1を含む他のヒトコロナウイルスの間で普遍的でした。私たちの研究は、ワクチン抗原の設計と最適化にとって非常に重要な抗ウイルス免疫戦略を回避する上で、SARS-CoV-2およびその他のヒトコロナウイルスの理解を拡大し、したがってヒト抗コロナウイルス免疫の理論的基礎を提供し、宿主とコロナウイルスの相互作用を理解する。

【はじめに】

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、コロナウイルス科のベータコロナウイルス属に属し、4つの構造タンパク質（スパイク[S]、膜[M]、エンベロープ[E]、ヌクレオカプシド[N]）、16の非構造タンパク質（NSP1-NSP16）、および9つの付属タンパク質（ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF9b、ORF9c、およびORF10）を含む29のタンパク質をコードするコロナウイルス科のタンパク質をコードします。SARS-CoV-2に感染した患者は、主に発熱、乾いた咳、疲労などの症状を示した。しかし、いくつかの無症候性感染も観察された(4)。臨床研究では、コロナウイルス病2019（COVID-19）患者で強力なサイトカインとケモカインが生成されているにもかかわらず、SARS-CoV-2感染は実質的なインターフェロン（IFN）産生を誘発せず、IFN応答の欠如を示すことが報告されています（5–9）。さらに、血漿IFN-α2タンパク質レベルは、重症患者では、軽度から中等度の疾患を持つ患者よりも有意に低いです（10,11）。NSP1、NSP3、NSP6-NSP8、NSP12-NSP14、NSP16、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF9b、S、M、およびNを含む複数のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質は、I型IFN（IFN-I）産生と下流シグナル伝達（12–21）を阻害することにより、細胞生性免疫を抑制することが報告されていますが、膜タンパク質、特にワクチン開発の重要な抗原成分としてのSタンパク質による免疫応答の排他的な変調は、さらなる調査が必要です。

IFN-I応答は、侵入ウイルスに対するホスト防御の第一線です。IFN-I応答は、IFNの生成とその後のIFNに対する細胞応答の2つの主要な側面で構成されています。IFN産生の開始中に、先天性免疫細胞によって発現されたパターン認識受容体は、病原体関連ウイルスの分子パターンを検出します（22、23）。コロナウイルスなどのRNAウイルスは、それぞれRLR（RIG-IおよびMDA5）およびTLR（TLR3、TLR7、およびTLR8）を含む細胞質およびエンドソームRNAセンサーによって認識されます（24–26）。TLRとRLRによるRNAウイルスの認識は、核因子-カッパ光鎖エンハンサー（NF-κB）やIFN調節因子3（IRF3）などのさまざまな転写因子の活性化をもたらし、核への転座と炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、およびIFN-I発現の誘導につながります（27、28）。

その後のIFN応答ステップでは、IFN α/βはIFN受容体を介してヤヌスキナーゼ（JAK）シグナル伝達トランスデューサと転写活性化因子（STAT）シグナル伝達経路を活性化し、IFN応答シグナル伝達を刺激します。JAK-STATシグナルカスケードでは、JAK1とTYK2はSTAT1とSTAT2のリン酸化を媒介してヘテロ二量体を形成し、さらにIRF9に結合してIFN刺激遺伝子因子3（ISGF3）複合体を形成する（29、30）。その後、ISGF3複合体は核に転座し、コロナウイルス感染を制限するIFN誘発膜貫通タンパク質（IFITM）1、2、3を含む300以上のIFN刺激遺伝子（ISG）の転写を開始します（31、32）。

SARS-CoV-2 Sタンパク質は、S1とS2の2つのサブユニットで構成されています。高度に変異可能なS1サブユニットは、宿主受容体アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）へのウイルス結合を媒介し、進化的に保存されたS2はウイルス細胞膜融合を媒介する(33)。最近の研究では、S1サブユニットがSTAT1との相互作用を通じてIFN-α下流応答を阻害し、JAK1との関連をブロックすることが示されています(21)。この研究では、Sタンパク質と宿主IFN応答の間のクロストークをさらに調査し、S2サブユニットがIFNシグナル伝達経路の阻害にも重要な役割を果たしていることを発見しました。結果は、小胞体（ER）に位置するSタンパク質がIFN活性化下流シグナル伝達を阻害することを示した。具体的には、Sタンパク質はS2（aa 688–1273）ドメインを介してSTAT1、STAT2、およびIRF9と相互作用し、STAT2-IRF9相互作用を混乱させ、ISGF3の形成を阻害し、ER内のISGF3複合体を隔離し、最終的には下流のISG生成を抑制します。コロナウイルスの構造的類似性を考慮して、SARS-CoV-2の6つの変異体、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63、およびHCoV-HKU1ウイルスを含むSタンパク質の機能を分析しました。前述のコロナウイルスSタンパク質のS2ドメインは、IFN-Iシグナル伝達経路を阻害する保存機能に対応する高い保存性を示したことがわかりました。私たちの研究では、宿主IFN応答に対抗するSタンパク質を探索するための広域スペクトルコロナウイルス戦略を導入し、Sベースのワクチン抗原の最適化の必要性を示しています。

【結果】

コロナウイルスSタンパク質は、IFN刺激応答要素の活性化とIFN-I依存性ISG誘導を拮抗します

以前の報告では、SARS-CoV-2感染は、COVID-19患者、特に重篤な患者（5-9）に効果的なIFN-I応答を誘発しないことが示されています。私たちは、SARS-CoV-2の複数のタンパク質がIFN-Iシグナル伝達経路の調節に関与しているという仮説を立てました。この仮説を検証するために、コドン最適化後にSARS-CoV-2の29の遺伝子を複製し、11の非構造タンパク質、3の構造タンパク質、5つの付属タンパク質の19のタンパク質をうまく発現しました。IFN刺激応答要素（ISRE）をコードするプラスミドと内部制御プラスミドpRL-SV40をHEK293T細胞に共転写して遺伝子をスクリーニングし、続いてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。さらに、インフルエンザウイルス（A/WSN/33、H1N1）のNS1発現プラスミドが陽性対照として使用されました（図。1A）。予想通り、陽性対照（NS1）とNSP1、NSP3、NSP13、NSP16、ORF3a、ORF7a、ORF7b、ORF8、S、M、およびNタンパク質は、以前の記事で報告されているように、ISRE阻害効果を示した（12–21、34）。意外にも、S、NSP5、NSP7、NSP10、NSP16、およびORF9bタンパク質がISREの活性化を有意に阻害することもわかりました。Sタンパク質は、ウイルス侵入を媒介する構造タンパク質として機能し、ワクチン抗原として機能するため、その後の研究でISRE活性を阻害するSタンパク質の役割に焦点を当てました。用量依存アッセイは、Sタンパク質がIFN-I誘発のISRE、IFITM3、およびMxAレポーターの活性化を強く阻害することを明らかにしました（図。1BからDまで）。さらに、Sタンパク質は、IRF1レポーターのIFN-γ誘導活性化とISREレポーターのIFN-λ誘導活性化を阻害する可能性もあります（図。1E）。次に、Sタンパク質を過剰発現し、IFTM1、IFITM2、IFITM3、MxA、ISG15、ISG54、およびISG56の内因性発現を調べました。IFN-Iによって誘導された定量PCRと逆転写（qRT-PCR）分析。これらのISG遺伝子の発現がそれぞれ約200倍、192倍、8倍、20倍、115倍、13倍、72倍に有意に阻害されたことが観察されました（図。1F）。特に、D614G変異体、アルファ変異体（B.1.1.7）、ベータ変異体（B.1.351）、ガンマ変異体（P.1）、デルタ変異体（B.1.617.2）、およびオミクロン変異体（B.1.1.529）のSタンパク質がIFN-Iを介したISRE活性化を有意に阻害し、それらの抑制効果は野生型ウイルスのそれと有意に変わらないことがわかりました（図。1G）。SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1を含む他のヒトコロナウイルスのSタンパク質を比較すると、テストされたすべてのSタンパク質の中で、ISREプロモーターの活性化に対する同等の抑制効果が見つかりました（図。1H）、コロナウイルスのSタンパク質は、宿主IFN応答経路を抑制する上で保存された役割を果たすことを示しています。

図1

図1 SARS-CoV-2 Sタンパク質は、ISREの活性化とISGの誘導を阻害します。(A) HEK293T細胞は、pISRE-Luc、レニラルシフェラーゼ制御プラスミドpRL-SV40、およびSARS-CoV-2タンパク質発現プラスミドと共トランスフェクトされました。最初のトランスフェクションから24時間後、細胞をIFN-β（1,000 U/mL）で12時間刺激し、ルシフェラーゼアッセイを測定した。（B、C、およびD）HEK293T細胞は、pISRE-Luc、piFITM3-Luc、またはpMxA-LucとpRL-SV40プラスミドおよび0、0.01、0.05、0.25、および1.25 µgのプラスミドpCAGGS-Flag-Sとともに共トランスフェクトされました。すべてのプロモーター活性は、IFN-β（1,000 U/mL）を12時間刺激して測定されました。（E）24ウェルプレートで成長したHEK293T細胞は、pIRF1-LucまたはpiISRE-LucおよびpRL-SV40対照プラスミドと異なるSドメインタンパク質を発現するプラスミドで共トランスフェクトされました。トランスフェクション（hpt）後24時間で、細胞をIFN-γまたはIFN-λ1（1,000 U/mL）で12時間処理し、ルシフェラーゼ活性を測定した。(F) HeLa細胞を空のベクターまたはSARS-CoV-2 Sタンパク質発現プラスミドで24時間トランスフェクションし、その後12時間IFN-β（1,000 U/mL）で刺激した。収集された細胞のIFITM1、IFITM2、IFITM3、MxA、ISG15、ISG54、およびISG56のmRNA発現レベルはqRT-PCRによって検出された。(G) 24ウェルプレートで成長したHEK293T細胞は、piISRE-Luc、pRL-SV40コントロールプラスミド、および異なるSARS-CoV-2変異体Sタンパク質を発現するプラスミドと共感染しました。24 hptで、細胞はIFN-β（1,000 U/mL）で12時間処理され、ルシフェラーゼ活性が測定されました。(H) 24ウェルプレートで成長したHEK293T細胞は、piISRE-Luc、pRL-SV40コントロールプラスミド、およびSARS-CoV-2野生型および変異体または異なるコロナウイルスSタンパク質を発現するプラスミドと共トランスフェクトされました。24 hptで、細胞はIFN-β（1,000 U/mL）で12時間処理され、ルシフェラーゼ活性が測定されました。エラーバーは、3つの独立した実験からの平均±SDを表します。統計的有意性は、分散の一方向分析（ANOVA）テストによって決定されました。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、および ****P < 0.0001。

【SARS-CoV-2 Sタンパク質は、ISGF3を標的にすることで、JAK-STATシグナル伝達経路を拮抗します。】

SARS-CoV-2 Sタンパク質がIFN-β下流シグナル伝達経路を拮抗するメカニズムを調査するために、IFN-β刺激に応答してJAK/STAT経路におけるSTAT1/STAT2のリン酸化を調べました。したがって、HeLa細胞はSタンパク質または空のベクタープラスミドで一過性トランスフェクトされ、その後、IFN-βで6時間または12時間処理され、その後、STAT1/STAT2の発現とリン酸化レベルがウェスタンブロッティングによって測定されました。予想通り、SARS-CoV-2 Sタンパク質の過剰発現はSTAT1とSTAT2のリン酸化を弱めました（図。2A）。STAT1/STAT2がIFN-β刺激によってリン酸化されると、pSTAT1とpSTAT2はヘテロ二量体を形成し、IRF9を募集してSTAT1/STAT2/IRF9複合体（ISGF3）を形成します。その後、ISGF3は核に転座し、ISREに結合し、それによってISGの発現につながります。したがって、IFN-β誘発ISGF3核転座に対するSARS-CoV-2 Sタンパク質の影響を決定しました。HeLa細胞はSタンパク質または空のベクタープラスミドを一過性に発現し、その後IFN-βで3時間または6時間治療されました。西洋のブロッティングは、ISGF3核転座がSタンパク質の過剰発現によって破壊されたことを示しました（図。2B）。Sタンパク質はSTAT1/STAT2のリン酸化を抑制し、ISGF3核転座を抑制するため、次にSタンパク質がISGF3複合体の成分であるSTAT1、STAT2、およびIRF9と相互作用できるかどうかを調べました。Sタンパク質をSTAT1、STAT2、またはIRF9でコードするプラスミドを共感染させ、続いて共免疫沈降（Co-IP）を行った。図に示すように。2C、E、G、HAタグSTAT1、STAT2、およびIRF9で沈殿したFlagタグ付きSタンパク質。免疫蛍光データは、Sタンパク質がSTAT1、STAT2、およびIRF9と同局していることを示しました（図。2D、F、H）。これらの結果は、Sタンパク質がSTAT1とSTAT2のリン酸化を阻害するだけでなく、ISGF3成分にも結合することを示唆しています。

図2

図2 SARS-CoV-2 Sタンパク質は、STAT1/STAT2のリン酸化を阻害し、STAT1核転座をブロックします。(A) HeLa細胞は、空のベクタープラスミドまたはSARS-CoV-2 Sタンパク質発現プラスミドで24時間トランスフェクションされ、その後、IFN-βで6時間または12時間刺激され、抗pSTAT1、抗総STAT1、抗pSTAT2、および抗総STAT2抗体を使用してウェスタンブットで分析されました。タンパク質バンドの強度は、ImageJソフトウェアを使用して定量化されました。データは3つの独立した実験の手段を表しています。(B) HeLa細胞は、空のベクタープラスミドまたはSARS-CoV-2 Sタンパク質発現プラスミドでトランスフェクションされました。24時間後、細胞はIFN-βで3時間または6時間刺激され、細胞質および核画分に分画されました。分数は、STAT1、STAT2、およびIRF9検出のためにウェスタンブロッティングによって分析されました。 β-TubulinとLamin B1は、それぞれ細胞質マーカーと核マーカーとして使用されました。（C、E、およびG）HEK293T細胞は、示されたとおりプラスミドでトランスフェクションされました。48 hptで、細胞は採取され、抗HA磁気ビーズでCo-IPアッセイを受けました。 β-Tubulinは負荷制御（入力）として示されました。（D、F、およびH）HeLa細胞は、プラスミド発現HA-STAT1、HA-STAT2、またはHA-IRF9でFlag-Sとともに24時間トランスフェクトされました。細胞は固定され、透過性化され、一次抗体として抗HAと抗FLAG、二次抗体として抗アレクサフッ素488、反アレクサフッ素568で染色されました。スケールバー、10µm。

【SARS-CoV-2 Sタンパク質はISGF3をERに標的にし、固定する】

STAT1、STAT2、およびIRF9によるSタンパク質の細胞下コローカリゼーションをさらに調査するために、ベクターまたはSタンパク質プラスミドでGFP-Sec61b（ERマーカー）をHeLa細胞に一時伝達しました。図に示されているように。3AからC、STAT1、STAT2、およびIRF9は、最初は安静状態で細胞質に分布し、Sタンパク質はERで発見されました。しかし、Sタンパク質とのトランスフェクション後、STAT1、STAT2、およびIRF9はERと同局します。IFN-Iによる刺激により、個別にトランスフェクトされたSTAT1、STAT2、およびIRF9の実質的な核転座が観察されました。しかし、細胞がSタンパク質と共感染すると、STAT1、STAT2、およびIRF9の核転座が有意に抑制され、これらのタンパク質はERに固定されたSタンパク質と同局しました。この発見は、ERに固定されたSタンパク質が、STAT1、STAT2、およびIRF9と相互作用することにより、活性化されたISGF3複合体の核転座を有意に阻害することを示しています。まとめると、これらのデータは、Sタンパク質がSTAT1、STAT2、およびIRF9と相互作用し、ISGF3の核転座を防ぐためにそれらをERに固定したことを明らかにしました。

図3

図3 SARS-CoV-2 Sは、ERにISGF3を拘束しました。(A) HeLa細胞はプラスミド発現HA-STAT1、GFP-Sec61β(ERマーカー)、およびFlag-Sで24時間トランスフェストされ、その後IFN-β(1,000 U/mL)で30分間処理されました。細胞は固定され、透過性化され、一次抗体として抗HAと抗FLAG、二次抗体として抗アレクサ蛍光568と抗Cy5で染色されました。(B) HeLa細胞は、プラスミド発現HA-STAT2、GFP-Sec61β（ERマーカー）、およびFlag-Sで24時間トランスフェクションされ、その後、IFN-β（1,000 U/mL）で30分間処理されました。細胞は固定され、透過性化され、一次抗体として抗HAと抗FLAG、二次抗体として抗アレクサ蛍光568と抗Cy5で染色されました。(C) HeLa細胞は、プラスミド発現HA-IRF9、GFP-Sec61β（ERマーカー）、およびFlag-Sで24時間トランスフェクトされ、その後、IFN-β（1,000 U/mL）で30分間処理されました。細胞は固定され、透過性化され、一次抗体として抗HAと抗FLAG、二次抗体として抗アレクサ蛍光568と抗Cy5で染色されました。スケールバー、10µm。

【SARS-CoV-2 Sタンパク質はISGF3複合体の形成を妨害する】

ISGF3の形成はISGの発現において重要なステップであるため、次に、Sタンパク質がISGF3の活性化に不可欠なSTAT1-STAT2およびSTAT2-IRF9複合体の形成に影響を与えるかどうかを調査しました。STAT2およびSをSTAT1またはIRF9タンパク質で共トランスフェクトし、続いてCo-IPを転写しました。結果は、STAT1とSTAT2の間の相互作用がSタンパク質の影響を受けないことを示しました（図。4A）、Sタンパク質は、同じ条件下でSTAT2とIRF9の結合を強く阻害した（図。4B）。これらの結果は、Sタンパク質がない場合、STAT2とIRF9が完全に共局所化されているのに対し、この共局所化はSタンパク質の存在下で大部分が破壊されたことを示した免疫蛍光アッセイの結果によってさらに支持されました（図。4C）。これらの結果は、Sタンパク質がSTAT1/STAT2複合体によるIRF9の募集を阻害することを示しました。その後、Sタンパク質も発現した細胞における線量発現IRF9は、ISGF3複合体形成に対するSタンパク質の抑制的影響を逆転させる可能性があるという仮説を立てました。仮説を検証するために、Sタンパク質はHEK293T細胞で過剰発現され、IRF9は増加するレベルで発現されました。実験の結果は、IRF9のトランスフェクション量を増やすことで、IFN-Iを介したISREプロモーター活性化に対するSタンパク質の抑制効果を完全に回復できることを示しました（図。4D）。さらに、細胞がSタンパク質と低レベルのIRF9と同時にSTAT2の線量発現の増加、またはIRF9の線量発現の増加とともにSタンパク質と低レベルのSTAT2と共転写すると、IFN-Iによって誘発されたISREプロモーターの強力な活性化をもたらしました（図。4EとF）。これらのデータは、Sタンパク質がSTAT1とSTAT2の相互作用に影響を与えず、むしろIRF9と相互作用し、それによってSTAT2によるIRF9の募集を妨げていることを示しました。

図4

図4 SARS-CoV-2 Sは、STAT2-IRF9同族複合体の形成を妨害します。（A、B）HEK293T細胞は、示されたようにプラスミドで48時間トランスフェクトされ、その後、IFN-β（1,000 U/mL）で1時間処理されました。細胞は採取され、抗Myc磁気ビーズでCo-IPアッセイを被験しました。β-Tubulinは負荷制御（入力）として示されました。(C) HeLa細胞は、プラスミド発現HA-STAT2、GFP-IRF9、およびFlag-Sで24時間トランスフェクションされました。細胞は固定され、透過性化され、一次抗体として抗HAと抗FLAG、二次抗体として抗アレクサ蛍光568と抗Cy5で染色されました。スケールバー、10µm。（D）24ウェルプレートで成長したHEK293T細胞は、pISRE-Luc、pRL-SV40コントロールプラスミド、異なるSドメインタンパク質を発現するプラスミド、およびIRF9（0 ng、50 ng、250 ng、および1,250 ng）を発現するプラスミドと共トランスフェクトされました。24 hptで、細胞はIFN-β（1,000 U/mL）で12時間処理され、ルシフェラーゼ活性が測定されました。(E) 24ウェルプレートで成長したHEK293T細胞は、pISRE-Luc、pRL-SV40対照プラスミド、Sを発現するプラスミド、STAT2タンパク質を発現するプラスミド、およびIRF9を発現するプラスミド（0 ng、50 ng、250 ng、および1,250 ng）と共トランスフェクトされました。24 hptで、細胞はIFN-β（1,000 U/mL）で12時間処理され、ルシフェラーゼ活性が測定されました。（F）24ウェルプレートで成長したHEK293T細胞は、pISRE-Luc、pRL-SV40対照プラスミド、Sを発現するプラスミド、IRF9タンパク質を発現するプラスミド、およびSTAT2を発現するプラスミド（0 ng、50 ng、250 ng、および1,250 ng）と共トランスフェクトされました。24 hptで、細胞はIFN-β（1,000 U/mL）で12時間処理され、ルシフェラーゼ活性が測定されました。(G) STAT2とIRF9のドメイン組織。CCD、コイルドメイン、DBD、DNA結合ドメイン、IAD、IRFアソシエーションドメイン、LD、リンカードメイン、ND、Nドメイン、SH2、Srcホモロジードメイン、TAD、トランス活性化ドメイン。HEK293T細胞は、48時間示されたプラスミドでトランスフェクションされました。抗HA磁気ビーズでCo-IPが行われました。β-Tubulinはローディングコントロール（入力）として示されました。(H) HEK293T細胞は、L233A、R236E、L274A、およびF283Aを含むプラスミドコードされたCCD、Sタンパク質、およびIRF9野生型または変異プラスミド（4T）で48時間トランスフェクションされました。抗HA磁気ビーズでCo-IPが行われました。β-Tubulinはローディングコントロール（入力）として示されました。エラーバーは、3つの独立した実験からの平均±SDを表します。統計的有意性は、一方向ANOVAテストによって決定されました。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、および ****P < 0.0001。

以前の研究では、STAT2がコイルコイルドメイン（CCD）を介してIRF9と相互作用することが明らかになりました（35）。Sの存在がSTAT2-CCDとIRF9の関連に影響を与えるかどうかを判断するために、Co-IPアッセイを実施し、Sタンパク質の発現がIRF9とSTAT2-CCDの相互作用の顕著な減少につながることを発見しました（図。4G）。したがって、Sタンパク質はIRF9と結合するためにSTAT2-CCDと競合します。STAT2-IRF9複合体の形成を妨害するSタンパク質の機能部位をさらに特定するために、C末端IRF関連ドメイン（IAD）に位置し、IRF9とSTAT2（35）の間の相互作用を排除することが報告されているL233A、R236E、L274A、およびF283Aを含むIRF9変異プラスミド（4T）を構築しました。私たちの結果は、IRF9-WTがSまたはSTAT2-CCDと堅牢に共免疫沈降できる一方で、IRF9-WTとIRF9-（4T）の間の相互作用がバックグラウンドレベルに減少したことを示しました。簡単に言えば、STAT2とSの両方がIRF9上の同じドメインを介してIRF9と相互作用し、STAT2とSがIRF9に結合するために互いに競合します（図。4時間）。一緒に、私たちの発見は、SARS-CoV-2 Sタンパク質がISGF3複合体の形成を妨害し、JAK/STATシグナル伝達経路を抑制することを示しました。

【S2ドメインはISGF3の阻害機能において重要な役割を果たします】

JAK/STATシグナル伝達経路に対するSタンパク質の抑制効果に関与する重要なドメインを決定するために、フルレングスのSタンパク質を5つのドメインに分割しました：S1（aa 12–680）、N末端ドメイン（NTD）（aa 12–306）、RBD（aa 328–533）、SD1/2（aa 535–680）、およびS2（aa 688–1273）。HEK293T細胞は、piISRE-LucまたはpRL-SV40の5つのドメインを発現するプラスミドでトランスフェクトされ、続いてデュアルルシフェラーゼアッセイが行われました。その結果、Sタンパク質はISREの活性を~91%抑制し、S1とS2ドメインはISREの活性を~70%抑制したことが示されました。しかし、NTDはIFN-βによって誘発されたISREの活性に影響を与えなかった。RBDとSD1/2は、それぞれ57%と~36%のISRE活性をわずかに阻害しただけです（図。5A）。これらのデータは、S1ドメインとS2ドメインがISREプロモーターの活性を阻害する上で重要な役割を果たしていることを示しました。S2ドメインはコロナウイルスの中でより保存されており、IFNアンタゴニストとして解明されていないため、S2に焦点を当て、S2ドメインがSTAT1、STAT2、およびIRF9と相互作用できることを確認しました（図。5B）、そして免疫蛍光の結果はこれらの知見を確認しました（図。5CからEまで）。さらに、S2ドメインはIFN-βによって誘発されたSTAT1核転座を抑制した（データは示されていない）。したがって、他のコロナウイルスもS2領域を通るIFN応答経路を阻害すると推測します。SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1を含むさまざまなヒトコロナウイルスSタンパク質配列を整列し、Simplotソフトウェアで分析しました。S2ドメインは、異なるヒトコロナウイルスの間で非常に類似していました（図。5F）。予想通り、テストされたすべてのコロナウイルスSタンパク質のS2ドメインは、IFN-βによって刺激されたISREレポーターの活動に同様の抑制効果を発揮しました（図。5G）。まとめると、私たちのデータは、IFN-I経路を効果的に阻害するコロナウイルスの保存ドメインとしてのS2領域の重要な役割を強調しています。

図5

図5 S2ドメインは主に阻害メカニズムに関与しています。(A) 24ウェルプレートで成長したHEK293T細胞は、pISRE-Luc、pRL-SV40コントロールプラスミド、および異なるSドメインタンパク質を発現するプラスミドで共トランスフェクトされました。24 hptで、細胞はIFN-β（1,000 U/mL）で12時間処理され、ルシフェラーゼ活性が測定されました。FL、フルレングス。(B) HEK293T細胞は、示されたとおりプラスミドでトランスフェクトされました。48 hptで、細胞は採取され、抗HA磁気ビーズでCo-IPアッセイを受けました。 β-Tubulinは負荷制御（入力）として示されました。（C、D、およびE）HeLa細胞は、HA-STAT1、HA-STAT2、またはHA-IRF9を発現するプラスミドとFlag-S2を24時間トランスフェクトしました。細胞は固定され、透過性化され、一次抗体として抗HAおよび抗FLAG、二次抗体として抗アレクサフッ素488および反アレクサフッ素568で染色されました。スケールバー、10µm。(F) シンプロットは、異なるヒトコロナウイルスSタンパク質配列の類似性を分析します。アブシッサは、SARS-CoV-2 Sタンパク質のアミノ酸位置を表します。(G) 24ウェルプレートで成長したHEK293T細胞は、pISRE-Luc、pRL-SV40コントロールプラスミド、および異なるコロナウイルスS2ドメインを発現するプラスミドと共感染しました。24 hptで、細胞はIFN-β（1,000 U/mL）で12時間処理され、ルシフェラーゼ活性が測定されました。エラーバーは、3つの独立した実験からの平均±SDを表します。統計的有意性は、一方向ANOVAテストによって決定されました。**P < 0.01 と ****P < 0.0001。

【議論】

免疫抑制状態は、ワクチン接種者の免疫応答に強く影響し、ワクチン接種後の免疫応答が比較的最適ではない結果になります。臨床研究では、SARS-CoV-2に対する免疫の低下は、完全なワクチン接種後の最初の1か月以内に始まり、6か月目まで持続し、その時点で免疫レベルはSARS-CoV-2に対する十分な保護を提供しない可能性があることが示されています（36–41）。対照的に、牛痘、はしか、おたふく風邪、または風疹に対する抗体反応の長期研究は、これらの反応が一般的に10年以上の半減期で安定することを示唆しています（42、43）。SARS-CoV-2が効果的なIFN産生を制限するさまざまな戦略を開発する可能性があることを示唆する研究が増えており、NSP1、NSP3、NSP6、NSP7、NSP8、NSP12、NSP13、NSP14、NSP16、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF9b、M、S、およびNタンパク質は、IFN-I産生と下流シグナル伝達の両方を阻害することが以前に報告されています（12–21、34、44、45）。例えば、ORF6はC末端を介してIFN-I応答を拮抗し、STAT1核転座を阻害するが、リン酸化を阻害しない(12);別の研究では、ORF6がNup98をハイジャックしてSTAT核輸入をブロックすることが報告された(15)。Mは、NF-κBシグナル伝達を阻害し、STAT1のリン酸化とSTAT1の核転座を損ない、RIG-IとTRIM25に影響を与えることが示されています(46)。NはSTAT1とSTAT2のリン酸化と核転座を抑制します(14)。Sタンパク質（Sタンパク質）は、SARS-CoV-2の細胞侵入の重要な要因として機能し、COVID-19ワクチンの重要な抗原成分です（47）。COVID-19ワクチンの保護効果の大幅な低下は、Sタンパク質が細胞免疫応答の抑制に関与している可能性があることを示しています。ここでは、コロナウイルスSタンパク質がJAK-STAT経路を標的にして、特にISGF3複合体を破壊して宿主の抗ウイルス免疫シグナル伝達経路を阻害することによって、下流のISGの生成をブロックすることができると報告しました（図。6）。

図6

図6 作業モデルSARS-CoV-2 Sタンパク質は、STAT1/STAT2のリン酸化を妨げ、STAT2-IRF9同族複合体を破壊することによってIFN-βシグナル伝達をブロックします。

SARS-CoV-2 Sタンパク質は、S1とS2の2つのサブユニットで構成されており、ウイルス感染プロセスにおいて異なる役割を果たしています。S1には、宿主細胞の受容体に結合する役割を担う受容体結合ドメイン（48、49）が含まれていますが、S2は、ウイルス侵入に必要な融合ペプチドを含み、ウイルス細胞膜融合を媒介するか、またはエンドサイトーシスを介して細胞に入り、抗ウイルス薬設計の主要な標的の1つになります（50、51）。SARS-CoV-2の新しい変異体の継続的な伝播と出現にもかかわらず、変異体中のSタンパク質の突然変異部位はほとんどS1ドメインに集中しています。これらのアミノ酸変異は、ウイルスの感染性を変化させ、中和抗体の回避につながりますが、S2ドメインは、異なるSARS-CoV-2変異株の間で比較的保存されたままです（52、53）。この研究では、S2サブユニットがIFNシグナル伝達経路を弱体化させる上で重要な役割を果たしていることがわかりました。興味深いことに、私たちのデータは、SARS-CoV-2のSタンパク質（懸念される変異体）が野生型株と同様のISRE活性の阻害を示したことを示しました。さらに、私たちの分析は、S2ドメインが異なるヒトコロナウイルスの間で非常に類似していることを示しました。私たちの期待と一致して、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63、およびHCoV-HKU-1のS2ドメインもIFN-β誘発ISRE活性を阻害しました（図。5FとG）。これらの結果は、コロナウイルスSタンパク質がS2ドメインを介してISGF3の形成を抑制し、IFN-Iシグナル伝達経路の活性化を抑制する能力が保存されていることを示唆した。

IFN応答は、ウイルス感染中の侵入ウイルスに対する最初の防衛線です。以前の研究では、SARS-CoV-2感染の重度の症状を持つ患者で、IFN下流サイトカイン発現の重度の減衰が観察されることが示されています（7-9）。例えば、IFN-IとISG56はウイルス感染の初期段階ではほとんど誘発されないが、後期段階では増加する。この遅延した抗ウイルス反応は、SARS-CoV-2（5、6、12）によって誘発されたIFN-I反応の活性化と評価への窓を提供する可能性があります。外因性IFN-Iは、重度の症状を持つ患者および無症候性感染者のIFN-Iの産生が不十分であるため、臨床治療にも使用されています（54）。しかし、研究者はまた、IFN-βがCOVID-19の治療に有意な有効性を示さないことを証明しています（55、56）。これは、SARS-CoV-2がIFN-Iの産生を阻害するだけでなく、IFN-Iの反応も阻害し、IFN-Iの阻害の根底にあるメカニズムはまだ研究する必要があることを示しています。私たちの結果は、Sタンパク質がIFN-I下流のJAK-STAT経路を拮抗し、COVID-19患者におけるIFN-I応答の弱化を部分的に説明していることを示しています。細胞レベルの実験結果と一致して、SARS-CoV-2感染後のマウスモデルの結果は、下流のIFN応答遺伝子の大幅なダウンレギュレーションを確認しました（57）。以前の研究では、STAT1は安静時の細胞質に拡散して分布していることが示されていますが、STAT2とIRF9は複合体を形成し、核に転座してISGの低レベルの発現を維持することができます。IFN刺激の下で、STAT1とSTAT2はリン酸化され、IRF9とISGF3複合体を形成し、ISGの強力な生成の鍵となる核に入ります（15、46、58）。最近の研究では、Sタンパク質がSTAT1と相互作用してJAK1との関連をブロックすることが示されており、Sタンパク質を介したIFN-αダウンストリーム応答の減衰は、主にS1サブユニットに依存しています(21)。私たちの研究では、S1サブユニットがIFN-βダウンストリーム応答を弱めたという結果を確認しました。さらに、S2がIFN-β下流応答の阻害に重要な役割を果たしていることもわかりました。ベクターと比較して、フルレングスSタンパク質はIFN-β誘発ISREレポーター活性化を約91%減衰させ、IFNダウンストリームシグナル伝達に対するより包括的な阻害効果を示しました。興味深いことに、NTDはISREレポーターの活性化を阻害しなかったが、RBDとSD1/2はそれぞれ約57%と36%の阻害しか生じなかった。S1サブユニットとS2は、全長Sと同様の約70%の強力な阻害効率を示しました（図。5A）、IFNアンタゴニスト能力にはSタンパク質の無傷のサブユニットが必要であることを示唆しています。JAK1/STAT1がSTAT1リン酸化シグナル伝達を阻害することに加えて、下流のISGF3複合体が破壊され、S/S2タンパク質によって核の外側に閉じ込められていることをさらに明らかにしました。Sタンパク質の印象的なIFN拮抗作用を示唆しています。さらに、S2ドメインは、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1（図。5FとG）。これらの結果は、コロナウイルスのSタンパク質のS2ドメインもIFN-I経路の阻害を媒介することを示しました。IFN-αは生産段階でブロックされ、IFN-β応答がSARS-CoV-2と戦うための主要なターゲットであるため、主にIFN-αの代わりにIFN-βを調査しました（IFN-α産生はマウスモデルで減少します）（59）、IFN-αへの応答の可能性はCOVID-19患者では影響を受けませんでした（10）。

膜に位置するSタンパク質と細胞質STATタンパク質との相互作用を明らかにするために、Sタンパク質のIFN拮抗能力と膜貫通モチーフ（TM）ドメインのないS2ドメインをさらにテストしました。ルシフェラーゼアッセイの結果は、SΔTMとS2ΔTMがIFN-β誘発ISREプロモーター活性の活性化を依然として有意に抑制していることを示しました（図。S1A）。STAT1とSΔTMまたはS2ΔTMタンパク質を過剰発現する細胞では、SΔTMとS2ΔTMタンパク質は、両方のCo-IPアッセイでIFN-β刺激の有無にかかわらず、再びSTAT1と相互作用する可能性があります（図。S1BとC）と免疫蛍光のコローカリゼーションアッセイ（図。S1DとE）。これらのデータは、Sタンパク質がおそらくER内腔外の細胞質体ドメインを介してSTATと相互作用することを示しました。ER膜上のSの向きはまだ議論の余地があり、さらなる研究が必要です。

STAT2とIRF9のIADとの相互作用は、ISGF3の形成とISGの生成に不可欠です（60）。STAT2-IRF9複合体とNF-κBサブユニットp65は、IL-6発現を活性化する上で重要な要素であることが報告されています(61)。Marianiらはまた、STAT2-IRF9複合体がIFN-β-およびTNF-55刺激遺伝子の両方の発現を増加させたことを明らかにした(62)。したがって、STAT2-IRF9とISGF3は、プロモーターレベルでシグナル伝達経路を調節するための重要な複合体である可能性があります。私たちの研究では、Sタンパク質がERに局在しており、相互作用を介して細胞質のSTAT1とSTAT2とIRF9をERに固定できることが示されました。これにより、Sタンパク質がJAK1とSTAT1の間の相互作用を阻害する分子メカニズムが明らかになる可能性があります。さらに、Sタンパク質はSTAT2とIRF9の相互作用を中断し、ISGF3の形成を抑制し、IFNシグナル伝達経路を阻害することができます。以前の研究では、IRF9はIADにある4つの変異部位を含み、STAT2に結合できず、ISGF3の形成を混乱させることが明らかになりました（35）。興味深いことに、私たちの研究では、Sタンパク質がIRF9と強く相互作用することが示されました。しかし、IRF9のIADにある4つの突然変異部位は、Sタンパク質との相互作用を排除しました。この発見は、Sタンパク質がIADに競争的に結合することにより、STAT2とIRF9との相互作用を弱め、その後ISGF3の形成を抑制したことを示しました。要約すると、私たちのデータは、Sタンパク質がISGF3の形成を阻害する新しいメカニズムを明らかにし、無症候性COVID-19感染の証拠を提供しました。

まとめると、私たちの研究は、ワクチン抗原の設計と最適化にとって非常に重要な抗ウイルス免疫戦略を回避する上で、SARS-CoV-2およびその他のヒトコロナウイルスの理解を拡大し、したがってヒト抗コロナウイルス免疫の理論的基礎を提供し、宿主とコロナウイルスの相互作用を理解する。