ミスフォールドした腫瘍抑制因子の凝集とプリオン様特性：がんはプリオン病か？（論文の重要部分を中心に要約）
【要旨】
プリオン病は、多くの神経変性疾患に特徴的ないくつかの特徴を持つ疾患である。最近、いくつかの研究がプリオンの概念を、ミスフォールドしたp53（がん抑制タンパク質）が関与する悪性腫瘍における病理学的凝集に拡張した。p53の凝集と、p53ファミリーメンバーであるp63やp73との共凝集が示されている。ある種のp53変異体は、野生型(WT)p53に対してドミナントネガティブな制御効果を発揮する。このドミナントネガティブ効果の根拠は、アミロイド様変異体p53がWT p53を凝集種に変換し、機能獲得（GoF）表現型とその腫瘍抑制機能の喪失をもたらすことである。最近、p53凝集体が細胞内に取り込まれ、内因性p53と共凝集することが示され、p53凝集体のプリオン様特性が裏付けられた。がん原性p53変異体のプリオン様挙動は、p53変異を持つがん細胞の高い転移能など、そのドミナントネガティブおよびGoFの特性に対する説明を提供する。p53の凝集を阻害することは、悪性腫瘍患者に対する治療的介入の有望な標的となるようである。
アミロイド様変異型p53は野生型p53を凝集型に変換することができ、p53凝集体は細胞から細胞へと伝達される。これらの性質は、腫瘍形成や悪性腫瘍におけるp53の役割に寄与している可能性がある。
プリオン病は、多くの神経変性疾患に典型的ないくつかの特徴を持つ疾患である（Prusiner 1998, 2013, 2014）。近年、プリオンの概念がいくつかの神経変性疾患に拡張される可能性があることを示す研究がなされている(Silva et al. 2008; Polymenidou and Cleveland 2011; Prusiner 2012; Soto 2012; Irwin et al. 2013)。Aβ、タウ、α-シヌクレイン、SOD1、TDP43など、これらの疾患に関与する主要タンパク質は、動物や培養哺乳類細胞における伝達性によって示されるように、プリオンとして働く可能性がある（Polymenidou and Cleveland 2011; Prusiner 2012; Soto 2012; Irwin et al.） 。これらの変性疾患は、プリオンのように正しく折り畳まれたタンパク質がミスフォールディングしたタンパク質に変換され、その結果、細胞死につながる有害な機能獲得（GoF）が生じることに基づいている。新たな知見により、病理学的凝集の概念は、ミスフォールドしたp53（がん抑制タンパク質）が関与する悪性腫瘍にまで拡大された（石丸ら 2003a; Silvaら 2010, 2014; Ano Bomら 2012; Wilckenら 2012）。p53の凝集や、類縁タンパク質であるp63やp73との共凝集が、アミロイドオリゴマーやフィブリルを含む様々なタイプの凝集体になることは、数多くの研究で立証されている（Bullockら 1997; Ishimaruら 2003a; Leeら 2003; Rigacciら 2008; Silvaら 2010; Xuら 2011; Ano Bomら 2012; Wilckenら 2012）。
p53はTP53遺伝子によってコードされる四量体タンパク質であり、細胞の恒常性とDNAの安定性を制御するマスター因子である。p53は特定のDNA配列に結合して転写因子として働き、DNA修復、老化、アポトーシスなどの細胞周期停止制御に関与する遺伝子の転写を誘導する(Vousden and Lane 2007)。細胞の恒常性におけるp53の重要性から、その機能はいくつかのメカニズムによって細かく制御されている。細胞内でのp53の半減期は非常に短く、p53はMDM2やMDM4（MDMXとも呼ばれる）などの細胞内タンパク質の標的となっている（Schon et al.）。 これらのタンパク質はどちらもp53に結合して不活性化するが、MDM2だけがユビキチンE3リガーゼ活性を示し、p53をプロテアソーム分解に導く（Fangら、2000）。
p53の突然変異は、がんに見られる最も一般的な遺伝子変化であり、全腫瘍の50％以上で観察される。p53に既に報告されている約200種類の変異から、R248、R175、G245、R273、R249、R282を含むいくつかの残基がホットスポットと考えられている（Petitjean et al.2007）。これらの残基はすべてp53のコア・ドメインにあり、DNAとの相互作用を担っている。このため、これらの変異体のほとんどは、野生型（WT）レベルの転写活性を発揮することができない（Bullock et al. 1997）。p53変異の最も頻繁な影響は機能喪失（LoF）であるが、遊走、浸潤、転移の増加などのGoF効果も観察されている（Muller and Vousden 2013）。p53変異に関連するもう一つの重要な特徴は、同一細胞内に異なる突然変異対立遺伝子が存在するために、変異型p53がWT p53に対して発揮するドミナントネガティブ効果である（Freed-Pastor and Prives 2012）。このような場合、p53は通常不活性化され、細胞内での機能を失う。この効果に関する古典的な説明は、変異型p53とWT p53のヘテロ4量体化によって、遺伝子標的と結合できない不活性なコンフォメーションが生じるというものである。あるいは、われわれのグループは、p53の不活性化は、変異型p53がWT p53に及ぼすプリオン様作用に関係していることを示唆している（Ano Bom et al.2012）。この概念により、変異型p53のGoF効果や変異型p53特異的タンパク質間相互作用が説明できる。
この総説では、p53凝集体の特性について述べ、これらの凝集体の細胞運命と結果についてコメントする。これらのタンパク質のプリオン様特性と細胞間伝達性、そしてこの過程におけるp53オリゴマーの役割についても考察する。
【がん抑制タンパク質の機能とがん発生における秩序ドメインと本質的に無秩序なドメインの役割】
腫瘍抑制因子は、通常、無秩序なセグメントに囲まれたマルチドメインタンパク質である。p53には、3つのよく組織化された領域がある：残基1-70にまたがるN末端のトランス活性化ドメイン（Dawson et al.2003）、残基94-293の配列特異的DNA結合ドメイン、残基324-355からなるオリゴマー化ドメインである（図1）。これらの領域の側面には、２つの無秩序なポリプロリン領域がある。1つは残基71-93からなるポリプロリン領域で、トランス活性化ドメインとDNA結合ドメインをつないでおり、もう1つは残基294-323からなるポリプロリン領域で、DNA結合ドメインとオリゴマー化ドメインをつないでいる。C末端（残基356-393）には構造化されていない基本領域がある。
図1.
～p53の立体構造。活性型p53は、オリゴマー化ドメイン（OD）、DNA結合ドメイン（DBD）、トランス活性化ドメイン（TAD）からなる4量体タンパク質である。電子顕微鏡法およびX線小角散乱再構成法（Tidow et al. 2007; Melero et al. 2011）に基づいて予測された活性コンフォメーションにおけるp53モノマー（緑、赤、青、金）の模式図（左）と結晶構造（右；PDB ID: OD, 2J0Z; DBD, 2XWR; and TAD, 2L14）。～
p53の活性と安定性は、その転写活性化ドメインの特定のセリンとスレオニン領域のリン酸化によって制御されている（Botuyanら 1997; Leeら 2000）。転写因子p300/CBPとユビキチンタンパク質リガーゼMDM2（ヒトのオルソログではHDM2）は、このN末端領域内の重複する結合部位に結合する。DNA損傷後、p53がSer15、Thr18、Ser20でリン酸化されると、MDM2が転写活性化ドメインから解離し、p300/CBPとの親和性が高まり、p53の転写活性が促進される（Kussie et al.）。 MDM2が転写活性化ドメインに結合する直接的な作用はp53の転写活性の阻害であるが、MDM2のp53に対する主な作用はE3ユビキチンリガーゼ活性を介して起こる（Michael and Oren 2003）。MDM2欠損マウスの致死性は、TP53遺伝子の同時欠失によって救済されたことから、p53-MDM2相互作用が重要であることが示された（Jonesら 1995; Montes de Oca Lunaら 1995）。さらに、p53コアドメインにある第二のMDM2結合部位は、分解中のMDM2-p53相互作用を安定化させると推測されている（Yu et al.2006）。
MDMX（ヒトのオルソログではHDMX）はp53のもう一つの重要な制御因子であり、p53の転写活性化ドメインに結合し、その転写活性を阻害する（Shvartsら、1996, 1997; Böttgerら、1999）。MDMXはMDM2のパートナーでもあり(Sharp et al. 1999; Tanimura et al. 1999)、マウスの初代胚線維芽細胞でレトロウイルスを介したMDMXの過剰発現によって示されるように、腫瘍形成に寄与し、HRasV12との併用で不死化と腫瘍性形質転換を誘導する(Danovi et al. 2004)。腫瘍細胞株のかなりの割合が、正常細胞株と比較して高レベルのHDMXを発現している(Ramos et al. 2001)。異なる起源を持つ500以上のヒト腫瘍におけるHDMXの発現または増幅を系統的にスクリーニングしたところ、その多くでHDMXの過剰発現が認められた(Danovi et al. 2004)が、それはHDMXががん遺伝子であることを示唆している。さらに、MDMXはp300/CBPを介するp53のアセチル化を阻害することが示された（Sabbatini and McCormick 2002）。このアセチル化はp53のがん抑制機能に重要な修飾である（Brooks and Gu 2011）。
p53の最初の無秩序ポリプロリン領域には、部分的に保存された5つのPxxPモチーフがあり、これがp53の活性を制御している。このポリプロリン領域の欠損は、p53が介在する転写活性化には影響を及ぼさないが、腫瘍増殖の抑制には深刻な影響を及ぼす（Walker and Levine 1996）。WalkerとLevine(1996)の研究は、p53の転写活性と腫瘍増殖抑制が非連続的な事象であり、最初のポリプロリン領域がp53依存性の腫瘍抑制に関与する重要な活性を媒介するという最初の証拠を提供した。さらなる研究により、この領域はp53が介在するアポトーシスには重要であるが、p53が介在する細胞増殖停止や細胞形質転換の抑制には必要ないことが示された（Sakamuro et al. 1997）。最初のポリプロリン領域もp53の制御に重要である。このドメインがないと、p53に対するMDM2の親和性が高まり、p53が負の制御を受けやすくなり、このタンパク質のユビキチン化と核輸出が促進される（Berger et al. 2011）。さらなる研究により、ポリプロリン領域がp53をMDM2阻害に敏感にするメカニズムが明らかになった。最初のポリプロリン領域のPro82は、DNA損傷に応答したp53-Chk2相互作用と、それに続くp53のSer20でのリン酸化に必要である（Bergerら、2005）。Li-Fraumeni症候群と卵巣がんのがん患者における生殖細胞系列のPro82（P82L）変異（Sun et al. 1996）と膀胱腫瘍における体細胞変異（P85SとP89S）の存在は、このタンパク質の活性を調整する上で、p53の最初のポリプロリン領域の重要性をサポートしている（Taylor et al. 1996)。
p53の無秩序なC末端基本領域は、複数の翻訳後修飾、特にアセチル化のもう一つの部位である。基本領域にはヒストン末端と同様に機能する複数のアセチル化リジンがある。p300/CBPアセチルトランスフェラーゼがp53の転写活性化ドメインに結合すると、ヒストンだけでなくp53自体もアセチル化される（Gu and Roeder 1997）。p53の基本C末端領域はDNA中の非特異的配列に結合し（Wangら 1993; Wuら 1995; Jayaraman and Prives 1999）、コアドメインの配列特異的結合を制御する（Huppら 1992; Ahn and Prives 2001）。
【がん発生におけるp53の突然変異とミスフォールディングの影響】
12の腫瘍型に分類された3281検体から、多様なシグナル伝達および酵素プロセスに関与する127の突然変異遺伝子が同定された。これらのサンプルでは、TP53が最も頻繁に変異した遺伝子であった（サンプルの42％）（Kandoth et al.） 。TP53変異体の現在のデータベース（p53.iarc.fr）には45,000の体細胞変異が含まれており、そのほとんどが微小環境において特定の細胞クローンに選択的優位性を与え、生存や生殖を増加させる。これらの変異はドライバー変異とも呼ばれ、一般にクローン拡大や腫瘍形成に関与している（Stratton et al.）。
腫瘍におけるTP53の突然変異頻度には、少なくとも3つの主要な因子が影響する：(1)腫瘍が非常に不均一で、異なるサブタイプから構成されている；(2)発生段階；および(3)ウイルス感染や細菌感染などの外因性因子。がんの種類によって、TP53突然変異の割合は5％未満（子宮頸がんのように）から90％（卵巣がんのように）まで様々である。例えば乳がんでは、分子プロファイリングにより、TP53突然変異の頻度が異なる4つの主要なサブタイプが明らかになった： それぞれ、内腔A型、内腔B型、HER2-E型、基底様型で、それぞれ12％、30％、72％、80％であった（Weigeltら、2010；Curtisら、2012）。発生段階を考慮すると、原発性前立腺腫瘍（10％から20％）では、転移性腫瘍（最大50％）よりもTP53突然変異の頻度が低いことが報告されている（Schlommら、2008年）。二相性の慢性骨髄性白血病では、TP53突然変異は芽球相で最も頻繁に起こる（Calabretta and Perrotti 2004; Malcikova et al.）。 外因性因子の中では、いくつかのヒトウイルスがp53活性を障害する。子宮頸がんでは、ヒトパピローマウイルスE6タンパク質がp53を標的として分解する（Scheffnerら、1990）。さらに、p53のR249S変異体は、アフラトキシンB1食品汚染に関連した肝臓がんでよく観察される（Aguilarら、1993）。
非同義単一ヌクレオチド変異体またはミスセンス突然変異（すなわちアミノ酸配列に影響する変異）が最も一般的なTP53の変化である。二対立遺伝子置換はがん抑制遺伝子では非常に一般的であるが、TP53はDNA結合ドメイン内の6つのホットスポット（R175、G245、R248、R249、R273、R282）を含む単一対立遺伝子置換による影響を最もよく受ける。非同義単一ヌクレオチド変異体が優勢であるにもかかわらず、同義単一ヌクレオチド変異、フレームシフト変異、サイレント変異、スプライス変異、CpGジヌクレオチド遷移、TP53の翻訳後領域に影響を及ぼす突然変異もさまざまな腫瘍型で報告されている（Leroy et al.）。 例えば骨肉腫では、高い頻度でTP53遺伝子の欠失が報告されている（Masudaら 1987; Barretinaら 2010）。TP53の非継承的変異体はいくつかのタイプのがんと関連しているが、生殖細胞系列変異は、Li-Fraumeni症候群と呼ばれるまれな常染色体優性遺伝性がん素因を引き起こす（Li 1969a,b）。ほとんどのLi-Fraumeni患者は、単一の部位特異的な腫瘍を呈するのではなく、様々なタイプの腫瘍を早期に認め、そのほとんどが約90％～95％の浸透率を示す特異的なp53生殖細胞系列変異を有する（Malkinら、1990年）。散発性膠芽腫では、ドミナントネガティブのp53変異体が腫瘍の増殖と発生を促進することが示された。なぜなら、これらの変異を有する患者では、診断時の平均年齢が劣性突然変異を有する患者よりも若かったからである（Marutaniら、1999年）。
p53遺伝子の変異はヒトのがんの半数以上に見られ、しばしば転写活性の変化をもたらす。対照的に、p63とp73遺伝子の突然変異はがんではあまり観察されない（Levrero et al.2000）。ほとんどの場合、p53の欠損はDNA結合ドメインの単一アミノ酸の突然変異によって引き起こされる。このような突然変異は2つのクラスに分けられる：クラスI（コンフォメーション変異体）はp53の構造維持に重要なアミノ酸（すなわち、R175H、G245S、R249S、R273H）を含む；クラスII（コンタクト変異体）はDNAと直接相互作用するアミノ酸（すなわち、R248とR273）を含む（p53.free.fr）。また、R248Qのようなコンタクト変異体が構造的な影響を持つことも示されている(Wong et al. 1999; Ishimaru et al. 2003a,b)。
現在のところ、p53ががん抑制因子またはがん遺伝子として働く状況について、一致した説明は得られていない。2000以上のp53変異体の酵母モデル解析から、p53変異体の転写活性は、WT p53と比較して、完全な不活性化から亢進した活性化まで様々であることが明らかになった（Kato et al.）。 いくつかの腫瘍におけるp53突然変異の高い頻度や、p53-/-マウスが早期発症がんの劇的な素因を示すという観察から、p53が重要ながん抑制因子として働くことが確認された（Vogelstein et al. 2000; Kenzelmann and Attardi 2010）。対照的に、マウスモデルでは、p53は腫瘍抑制因子として、急性のDNA損傷ではなく、がん遺伝子によって誘導された腫瘍抑制因子p19ARFの発現に反応し、MDM2の隔離と阻害を介してp53を活性化することが示されている（Christophorouら 2006; Efeyanら 2007）。さらに、p21、Puma、Noxaを欠損したマウスは、p53が介在するアポトーシス、G1/S細胞周期停止、老化を起こすことができなかったが、少なくとも500日間は腫瘍の発生がなかった（Velente et al.）。 これらの知見は、アポトーシス、細胞周期停止、老化の誘導は、p53が介在する腫瘍発生の抑制には必要ないことを示唆している（Li et al.2012）。
分子レベルでは、そして最も単純化された組み合わせの観点からは、p53の単一対立遺伝子変異は次のような効果をもたらす： (1)ある種のp53変異体はWT p53の活性を欠く、(2)ある種のp53変異体はWT p53の活性を妨げることなく発がん活性を獲得する、(3)ある種のp53変異体はドミナントネガティブ効果によってWTタンパク質を阻害し、発がん活性を示す、(4)ある種のp53変異体はドミナントネガティブ効果によってWTタンパク質を阻害するが、他の活性は示さない（図2）。変異型p53による発がん活性の獲得は、TP53ヌル細胞への変異型p53のトランスフェクションによって初めて証明され、これらの細胞にマウスで腫瘍を発生させる能力を付与した（Wolfら、1984；Halevyら、1990；Shaulskyら、1991）。このGoF効果に加えて、ある種のp53突然変異体は、突然変異体とWT p53タンパク質の間でヘテロオリゴマー化／凝集が起こるドミナントネガティブ機構を介して作用する（Milner and Medcalf 1991; Milner et al.）。 このモデルでは、変異型p53とその祖先であるp63およびp73パラログにもドミナントネガティブ効果が観察されるかもしれない。ナノフローエレクトロスプレーイオン化質量分析を用いると、p63とp73のホモ4量体が30分のインキュベーションで形成され、3：1、2：2、1：3の混合4量体も形成されることが示された。これらの結果とは対照的に、p53ホモ4量体をp73ホモ4量体やp63ホモ4量体とインキュベートしても、24時間後には交換は起こらなかった。このことは、p53ファミリー内でオリゴマー化ドメインが多様に進化していることを示している（Joerger et al.）。 さらに、ある種のp53変異体では、p63やp73との共凝集に基づくGoF表現型が示された（Xu et al.）。 ドミナントネガティブ効果もまた、凝集した変異型p53がWT p53を混合オリゴマーに隔離する高レベルオリゴマー状態を介して起こる可能性が高い（Ano Bomら、2012年）。変異型p53のいくつかの発がん性機能が特徴づけられているが（Muller and Vousden 2013; Bisio et al. ）、これらの機能はこのレビューの範囲を超えている。
図2.
～p53変異がその活性に及ぼす影響。ある種のp53変異体は、(1)野生型(WT)活性を失う(loss-of-function [LoF])、(2)WT p53の活性を妨げることなく発がん活性を獲得する(gain-of-function [GoF])、(3)ドミナントネガティブ効果によってWT p53タンパク質を阻害し、発がん活性を示す(GoF)、(4)ドミナントネガティブ効果によってWT p53タンパク質を阻害するが、他の活性は示さない(LoF)。ドミナントネガティブのメカニズムが例示されている（すなわち、ヘテロ四量体、凝集、共凝集）。細胞パートナー（例えば、WT p53、p63、p73、HSP、まだ発見されていないタンパク質など）は変異型p53と共凝集する。～
1990年代後半、Sir Alan Fershtのグループは差動走査熱量測定と分光法を用いて、WTと変異型（R175H、C242S、R248Q、R249S、R273H）p53の熱力学を評価し、特定の条件下でこれらの型の不可逆的変性と凝集を観察した（Bullock et al.1997）。2003年、我々のグループによる研究は、p53コアドメインの凝集を理解するための基礎を提供した（Ishimaru et al.）。 最近、われわれは、WTとp53ホットスポット変異体が生理的条件下でアミロイドフィブリルとして凝集するかどうか、また、突然変異体がWT p53の凝集の種となるかどうかを調べた（Ano Bom et al.2012）。いくつかの構造的および細胞的アプローチを用いて、我々はWTおよび変異型p53凝集体にアミロイドの性質があることを示した。さらに、R248Q p53ホットスポット変異体から形成されたアミロイド凝集体の種が、WT p53の凝集を促進することも明らかにした（Ano Bom et al.）。 我々は、p53によるプリオン様挙動が、ある種のp53突然変異のドミナントネガティブ効果やGoF効果を説明する可能性があることを立証した。
がんにおける凝集したp53の役割とそのプリオン様挙動を支持するものとして、乳がんMDA-MB-231細胞において、変異p53とアミロイドオリゴマーとの共局在化が、WT p53発現細胞（MCF7）よりも大きいことが観察された（Ano Bom et al.）。 がんの病態に直接関与することを示唆する同様の結果が、特定のp53変異（R175H、H193L、I195L、Y234C、G245S、またはR248Q）を有する乳がん患者の生検（Levy et al.2011）および基底細胞がん患者6人の皮膚からの生検（Lasagna-Reeves et al.2013）でも観察された。さらに、前立腺がんサンプルでは、変異型p53とWT p53を含む凝集体内で高レベルのp53免疫染色が観察された（Kluth et al.）。 最後に、がん幹細胞の性質を示す高悪性度漿液性卵巣がん（HGSOC）細胞集団において、p53凝集はp53 LoFおよびプラチナ耐性と関連していることが示された。しかし、HGSOC細胞が化学感受性の子孫に分化すると、腫瘍形成能とp53凝集形成能の両方が失われた（Yang-Hartwichら、2015年）。さらに、p53のポジティブレギュレーターであるp14ARFの過剰発現は、MDM2を介するp53分解を阻害し、p53凝集体の形成を促進するp53ターンオーバーの不均衡をもたらした。p14ARFを阻害すると、p53の凝集が抑制され、がん細胞はプラチナ製剤治療に感作されるようになった。さらに、Yang-Hartwichら（2015年）は、二次元ゲル電気泳動と質量分析を用いて、凝集したp53ががん細胞の生存と腫瘍の進行に関与するタンパク質と相互作用することで特異的に作用することを発見した。p53凝集とプラチナ製剤耐性との間のこの相関は、HGSOC患者の予後不良に関連している（Yang-Hartwichら、2015）。これらp53に関する最近の生体外実験を総合すると、がんにおけるp53凝集の関与が確認される。プリオン様メカニズムは、p53凝集時に観察されるドミナントネガティブ効果やGoF効果を説明するだろうが、このメカニズムががんの病因、浸潤性、転移の病因として定義されるには、まだいくつかの疑問が残っている（Silva et al.）。
【p53のアミロイド凝集はどのようにオンコジェネシスに関与するのか？】
アミロイド "という用語は、一般的に、大きくて不溶性の線維を形成することができるすべてのタンパク質に対して使われる（図3A）。原子レベルでは、アミロイドフィブリルはβシート構造の核となるアミノ酸配列の小さな凝集体またはシードから開始される（Sawaya et al. ）。一般的な構造は、骨格の水素結合を介して並列または反並列配向に関連してβシートを形成するいくつかのβストランドで構成されている。次に2本のプロトフィラメントが側鎖相互作用を介して関連づける。側鎖が互いに近接して相補的な構造になることで、立体的なジッパーコンフォメーションが形成され、界面のコアから水が排除される(Foguel et al. 2003; Sawaya et al. 2007; Reddy et al. 2010)。ほとんどの場合、界面は疎水性残基で構成されているが、極性配列も立体ジッパーを形成することがある（Balbirnie et al.）。 繊維軸に沿ってプロトフィラメントが加わると、フィブリル構造が伸長する。チオフラビンTやコンゴーレッドなどの色素はアミロイド構造に結合する傾向があり、その分光光度学的性質の変化を引き起こす。これらの色素は一般に診断ツールとして十分な特異性を持っているが、フィブリルのタイプによって結合様式が異なる可能性があり、偽陽性または偽陰性の結果を引き起こすことがある（Groenning 2010）。大きなアミロイド線維は小器官や組織を物理的に破壊するが、より小さな凝集体の方がより毒性が強いという証拠がある（Buxbaum 2004; Bitan et al.）。 この理由についてはいくつかの仮説があるが、現在のところ、アミロイドオリゴマー毒性の正確なメカニズムはよくわかっていない（Kayed and Lasagna-Reeves 2013）。アミロイドフィブリルは一般的に病理学的作用と関連しているが、アミロイドフィブリルの中には生物学的機能を果たすものもある。例えば、Pmel17のドメインによるアミロイド線維形成は、動物細胞におけるメラニン重合に関与しており、クモの糸線維の一部はスピドロインから形成されたアミロイド線維で構成されている（Chiti and Dobson 2006; Hammer et al.） 。アミロイド線維の形成は、適切な条件下で多くのタンパク質で示されているが、これらのタンパク質のすべてがプリオン様とは考えられていない（Bucciantini et al.）。 プリオンはアミロイドフィブリルの一種であり、正常な内因性細胞タンパク質をアミロイド構造に変換し、細胞間にこれらのフィブリルを拡散させることができる（Prusiner 1982, 1998; Prusiner et al.）。 p53や他のアミロイドフィブリルは、これらの凝集体が細胞膜を貫通して他の細胞に伝播する能力を持っていることから、プリオン様線維と呼ばれている（Brundin et al.） 。
図3.
～p53 DNA結合ドメイン（DBD）によるアミロイド形成。 A）凝集しやすい配列の分子動力学（MDs）シミュレーションに基づいて作成したp53 252-256アミロイドフィブリルのモデル。(B）アミロイド形成251-258領域（赤）、Trp91/Arg174（原子詳細）、および等価配列比較を示すp53のDBD構造（PDB ID: 2XWR）（Natan et al.）～
1997年のノーベル生理学・医学賞は、細胞形態（PrPC）からβシートに富んだ病原性形態（PrPSc）へと構造変化を起こす伝達性ポリペプチド粒子であるプリオンの発見により、スタンリー・プルシナーに授与された。プリオンタンパク質のこの構造修飾が、牛の海綿状脳症やヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病など、いくつかの疾患の伝達性や病因の基礎となっている（Prusiner 1998; Prusiner et al.）。 このように、プリオンと分類されるには、タンパク質がin vitroおよびin vivoで伝達可能でなければならない。p53とプリオンに共通する第一の特徴は、腫瘍形成過程におけるp53の構造変換（WT p53から変異型p53）であり、第二の特徴は、変異型p53がWT p53をアミロイド種に隔離する能力である。これらの知見にもかかわらず、p53をプリオンに分類するのは時期尚早かもしれない。しかしながら、最近の研究では、p53の分泌と細胞への取り込みの独立したメカニズムが示されており（Leeら、2009a, 2013; Forgetら、2013）、p53が伝達物質として働く可能性が示唆されている。最初の実験では、発がん性タンパク質Kristen-Ras（K-Ras）がSnailを誘導することによってp53の抑制に関与することが示された。Snailの枯渇は、K-Ras変異がん細胞ではp53発現を誘導したが、WT K-Rasがん細胞では誘導しなかった（Halaschek-Wienerら 2004; Leeら 2009b）。このように、K-Rasが介在するp53の抑制と腫瘍形成との間に直接的な相関関係があることが、他のがん種よりもK-Ras変異の頻度が高い肺がんや膵臓がんにおいて確立された（Karnoub and Weinberg 2008）。Snailは、細胞からのp53の分泌や、それに続くカベオリン-1を介したエンドサイトーシスによるK-Ras変異細胞への取り込みなど、K-Rasの発がん機能に反応してp53を抑制する（Lee et al.）。 さらに、完全長p53の凝集体はマクロピノサイトーシスを介してHeLa細胞やNIH-3T3細胞に浸透し、細胞内p53の凝集を誘導することが示された（Forget et al.）。 マウスモデルはまだ不十分であるが、このような驚くべきp53の細胞間透過性の機序は、プリオンのような機序が提唱されていることについて新たな議論を促し、p53凝集体ががんの病因と進行に関与していることを証明するために、我々のグループや他の研究者が継続的に実験を行う必要性を示している。
【p53ファミリーとそのメンバー間の相互作用】
p53の発見から約20年後、2つの関連遺伝子、TP63とTP73が同定された。これらの遺伝子はp53と類似しているが区別できる構造と機能を持つタンパク質をコードしている(Kaghad et al. 1997; Yang et al. 1998; Levrero et al. 2000)。p53と同様に、ファミリーメンバーには、細胞周期、増殖、分化、DNA損傷応答、アポトーシスの制御に関与する転写因子が含まれる（Levreroら、2000；Collavinら、2010）。p63とp73は、p21やPumaなどのコンセンサスp53応答エレメントに結合して活性化するだけでなく、ユニークな遺伝子標的を持つ（Fontemaggiら、2002；Osadaら、2005）。p63、p73、およびそれらの様々なアイソフォームは、部分的に冗長であったり機能が未知であったりするにもかかわらず、ロリクリンやインボルクリンを含む胚発生に関与する遺伝子を制御することが報告されている（De Laurenzi et al.2000）。マウスモデルによって、p53とそのパラログの明確な生物学的役割についての知見が得られた（Yang et al.）。 自然発生的な腫瘍の形成を回避するp53の重要な役割は、p53欠損マウスの研究によって示され、これらのマウスは若くしてがんで死亡することが示された（Donehowerら 1992; Yamamotoら 2000）。p53欠損マウスのサブセットは発育障害と生殖能力障害を示すが、一般的には生存可能であり、正常な胚発生を経る（Rotterら 1993; Sahら 1995）。逆に、p73欠損マウスは生存可能であるが、神経系の異常、水頭症、慢性炎症などの免疫学的障害を示す(Yang et al. 2000)。これらのマウスはまた、生殖および行動上の欠陥を示し、一般的に最初の２ヶ月以内に死亡する。p63欠損マウスは生存して生まれるが、出生後すぐに死亡する(Mills et al. 1999; Yang et al. 1999)。p63欠損マウスは重度の表現型を示し、四肢を欠損し、皮膚、前立腺、乳房、尿路上皮などの幅広い上皮構造を欠損することから、p63は上皮発生過程において増殖幹細胞のプールを維持するために必要であることが示されている（Senoo et al.）。
p53タンパク質ファミリーは、その転写活性化ドメイン、DNA結合ドメイン、オリゴマー化ドメインにおいて配列類似性を示す（図4）。p63とp73はp53よりも相同性が高く、様々なタンパク質に存在し、発生過程の制御に役割を果たす無菌αモチーフドメインを含む（Schultz et al.） 。各タンパク質は多数のアイソフォームとして発現され、通常N末端またはC末端領域を欠く。これらのDNA結合ドメインは最高のホモロジーを示し、約60%のアイデンティティを共有している。p63とp73のDNA結合ドメインは約86％の同一性を持つ。p53のDNA結合ドメインの配列がp63とp73のそれと最も強く異なるのは、L2ループ（ウィンドウ250の周囲；残基176-192）である。p63は、主に追加のN末端残基が含まれているため、p73よりもわずかに長い。構造的には、DNA結合ドメインはこれら3つのタンパク質間で非常によく似ており、同じβ-サンドイッチの折り目を保っている（Joerger and Fersht 2008）。p63とp73のオリゴマー化ドメインは互いに弱いヘテロ4量体を形成することができるが、p53の配列の類似性が高いため、p53のオリゴマー化ドメインでは形成することができず、p53の配列との類似性は低い（Li and Prives 2007; Joerger et al.）。
図4.
～p53ファミリータンパク質のドメイン構造と配列の比較。(A）トランス活性化ドメイン（TAD）、DNA結合ドメイン（DBD）、オリゴマー化ドメイン（OD）、無菌αモチーフ（SAM）ドメインを描いたp53、p63、p73の主なドメイン構造。(B)p53、p63、p73間の比較（上）、およびp63とp73間の比較（下）の配列類似性スコア。
（類似性スコアは、10残基の移動窓平均を用いた全長タンパク質配列のClustal Omega (Sievers et al. 2011)ギャップド・アラインメントに基づき、完全保存、高度保存、中程度保存、非保存、ギャップ位置を考慮して作成した。）～
in vivoおよびin vitroの研究から、ある種のp53変異体のDNA結合ドメインがp63およびp73と直接結合することが明らかになった（Di Comoら、1999；Stranoら、2000、2002；Gaiddonら、2001）。変異型p53がWT p53またはp63/p73と会合することにより、ドミナントネガティブ効果が生じ、腫瘍抑制機能が損なわれ、発がん性が増大する（Li and Prives 2007; Xu et al. 2011; Muller and Vousden 2014）。
【腫瘍抑制因子のプリオン様凝集の根底にあるメカニズム： ドミナントネガティブ効果と機能獲得効果】
この20年間、多くの研究者が細胞におけるp53の異常蓄積を検出してきた。1990年代初頭の研究では、p53変異を持つ、あるいは持たないがん細胞において、p53が大きく不溶性に蓄積することが示された（Mollら、1992、1995、1996）。その後、低濃度の塩酸グアニジンによって誘導されたp53凝集体が加圧下で解離することが発見され、この凝集体がアミロイドフィブリルの特性である水を排除した空洞を含んでいることが示された（Ishimaru et al.）。 2003年には、WTおよびR248Q変異型p53のDNA結合ドメインが、高いβシート含量を示す線維状凝集体を形成することが示された（石丸ら、2003a,b）。また、クラスI変異体は、WT配列に比べて凝集速度を増加させることも示された（Levy et al.）。 また、いくつかのクラスI変異体はp63/p73と共局在化した（Stranoら 2000, 2002; Gaiddonら 2001; Pucaら 2011）。p53欠失変異体のin vitroおよびin vivo研究では、変異型p53のDNA結合ドメインとp63/p73との直接的な相互作用が確認された。厳しく調製された、あるいは繰り返し凍結／解凍されたp53もp73と結合することが示された（Bensaad et al.）。 さらに、p53 DNA結合ドメインの通常アクセスできない領域に結合する抗体に対するp53変異体の感受性は、p63/p73結合能と関連していた(Gannon et al. 1990)。p53のDNA結合ドメインのコンフォメーションの変化は、p73と相互作用し干渉するための唯一の重要な要素である(Bensaad et al. 2003)。DNA結合ドメイン内の構造的なZn2+イオンの欠損もp53の凝集を促進する（Butler and Loh 2003）。生理的条件下では、p53全体のかなりの割合がZn2+を含まない状態で存在し、このApo DNA結合ドメインの集団はZn2+結合したp53 DNA結合ドメインの凝集を促進することができる。R175H p53変異体は、WT p53に比べてZn2+の損失が著しく加速されており、凝集傾向が強いことを説明できる可能性がある（Butler and Loh 2003; Xu et al.）。 興味深いことに、R175HやG245S、R249S、R248Qなどの他の構造変異体は、p53のZn2+結合ループの近くに位置している。
p53のDNA結合ドメインの構造変化と凝集傾向の亢進との関連は以前から認識されていたが、これらの凝集体の分子的詳細が明らかになったのはごく最近のことである。p53の配列をバイオインフォーマットスキャンしたところ、WT p53のDNA結合ドメイン内に保存されている凝集しやすいペプチド（残基251-258）が、凝集体形成の核となる部位である可能性が示唆された（図3）（Xu et al.2011；Ghoshら2014；Rangelら2014；Soragniら2016）。合成ペプチドを用いたこの短いセグメントのさらなる研究から、アミロイド様凝集体をWT p53で形成し、p63/p73と共凝集して、それらの機能を阻害することが明らかになった（Xu et al. 2011 ; Ghosh et al. 2014）。 さらに、p53の凝集と共凝集は、アルギニン変異（p53 I254R、p63 I324R、p73 I274R）の挿入、あるいはp53ペプチド配列のスクランブルによって抑制された。アルギニン、リジン、プロリンはしばしば凝集傾向の強い配列の側面にあり、凝集に対抗する能力を持つことからゲートキーパーアミノ酸と考えられている（Rousseau et al. 2006）。これらのアルギニン変異体とスクランブルp53ペプチドが凝集できないことを合わせると、p53の配列に基づくフィブリル構築は厳格であり、定義されたアミノ酸組成と順序が必要であることを示している。この発見は、立体ジッパー形成に必要な高い相補性と一致する。分子動力学（MDs）シミュレーションでも、251-258残基は凝集しやすいことが示されている。Ghoshら（2014）が251-258残基を複数コピーして行ったシミュレーションでは、251-258残基は自己会合しやすく、βシート含量に富むクラスターを形成することが明らかになった。われわれの実験でも同様の結果が得られ、252-256 LTIIT領域は安定な構造を形成して伝播する傾向があり、この配列に基づく潜在的なフィブリル構造のモデリングが可能であった（図3）。これらや他の研究により、特定のアミノ酸配列のコンフォメーションの偏りを評価し、アミロイドフィブリルの自己組織化に関する洞察を得るためのMDシミュレーションの有用性が示されている（Jang and Shin 2006; Cino et al. 2013） 。
p63とp73のDNA結合ドメインは、p53の凝集しやすい配列に対応する領域に類似したアミノ酸配列を含んでいるが（図3）、凝集する傾向ははるかに低いようである。それにもかかわらず、p63/p73とp53の共凝集は、それらの類似したモチーフ（p63 321-328とp73 271-278）を介して起こるようである。なぜなら、p63 I324R変異体とp73 I274R変異体は変異型p53と相互作用できなかったからである（Xu et al. 2011）。 注目すべきことに、p63とp73は、p53凝集領域の中央付近に位置するp53のT253に相当するi + 2位に、スレオニンの代わりにイソロイシンを含んでいる。この位置にスレオニンではなく嵩高いイソロイシンが存在すると、自己凝集に必要な立体的相補性が損なわれる可能性があるが、このメカニズムはまだ示されていない。
最近のin vitro研究では、不安定化したp53変異体がWT p53やそのパラログであるp63やp73と共凝集するメカニズムがさらに検討された（Wang and Fersht 2015）。Wang and Fersht (2015)によると、共凝集は播種や増殖の誘導よりも、むしろ捕捉によって起こることがほとんどである。
現在得られている証拠は、内在性の不安定性、突然変異、Zn2+の喪失が、p53 DNA結合ドメインにおける凝集しやすい領域の露出を引き起こし、自己会合とアミロイドフィブリルの形成につながるという仮説を支持している；しかしながら、p53とp63/p73の共凝集の根底にあるメカニズムは不明である（Muller and Vousden 2013; de Oliveira et al.）。 p53 DNA結合ドメインのTrp91とArg174間の相互作用は、Ser94のような数残基離れた位置から始まる構築物と比較して、融解温度を数度上昇させ、凝集速度を低下させる（Natan et al.）。 DNA結合ドメイン構造では、この相互作用によってN末端領域が、凝集しやすい領域の露出を打ち消すような向きに保持されているのかもしれない（図3）。p63とp73のDNA結合ドメインには、対応するW91/R174のペアが存在しないため、p53と共凝集する部分の露出が促進されているのかもしれない。この仮説を検証し、p53とp63およびp73の凝集の分子機構をより深く理解するためには、p63およびp73のDNA結合ドメインの構造と動態をさらに調べる必要がある。
【p53の凝集とプリオン様挙動を用いたがん治療の新しいアプローチ】
p53凝集の調節と発癌性p53変異体のプリオン様挙動は、癌や他のタンパク質ミスフォールディング疾患への治療応用に魅力的である（Silva et al.） 凝集の防止は、凝集体の形成やミスフォールディングタンパク質の蓄積や前駆体凝集体の形成を阻害する新規化合物の同定に焦点を当てた、広く研究されている戦略である。これらの化合物には、タンパク質を安定化させ、オリゴマー化や線維化を阻害する天然または合成の低分子、ペプチド、核酸アプタマーが含まれる（Chiti and Dobson 2006; Silva et al.） 新規抗癌剤開発のための他の有望な標的には、鋳型化、増殖、他の細胞への拡散などがある（Rangel et al.）
p53が誘導する遺伝子発現とその機能は、変異型p53をWT p53四量体に組み込んだり、DNA結合ドメインを介してWT p53を凝集させたりすることで影響を受ける可能性がある（Ishimaru et al.） あるいは、p53とp63/p73の共凝集は、それらのDNA結合ドメイン内の類似配列間の相互作用を介して起こる。結局のところ、これらのタンパク質が不活性な凝集体に隔離されることは、腫瘍抑制機能にとって有害であり、正常なp53機能を回復させるために様々なアプローチが試されている。
p53が関与する多数のタンパク質間相互作用は、治療目的で利用することができる。例えば、多くの潜在的治療法はMDM2によるp53の負の制御を阻害することを目的としている。WT p53が発現している場合、p53-MDM2相互作用を直接あるいは二次経路を介して阻害する低分子あるいはペプチドは、p53の分解を防ぎ、その機能を回復させることができる（Selivanova 2014; Stindt et al.） このアプローチは有望な結果をもたらしたが、p53インタラクトームは非常に複雑であり、特定のタンパク質や相互作用を標的とする治療法は予期せぬ副作用をもたらす可能性がある。あるいは、WT p53が発現していない症例に対しては、機能的p53遺伝子を導入するウイルスを用いた治療法が追求されている（Laneら、2010）。この方法は、より単純なアプローチであり、オフターゲット効果が少ないように思われるが、ウイルスを用いた遺伝子治療の方法論はまだ完成されていない。
WTのp53 DNA結合ドメインでさえも安定性はわずかであり、凝集しやすいため、その安定性を改善する努力がなされてきた。先に述べたように、p53のDNA結合特性は、p53の凝集によってしばしば失われる。我々のグループは、小さな同族二本鎖DNAがp53のDNA結合ドメインと全長p53の両方を安定化し、アミロイド形成を防ぐことを示した。従って、このようなDNA配列は、癌治療の新たなアプローチの一部として有用かもしれない（Ishimaru et al.）
変異p53の正常な機能を回復させるための努力も続けられている。p53のDNA結合ドメイン内の補償変異は、安定性を高め、ある種の一般的なp53変異体の高い凝集傾向を減少させることが示されているが、このような情報を用いて治療法を開発することは容易ではない（Bullock and Fersht 2001）。ほとんどの努力は、変異型p53を再活性化できる低分子を同定することに集中している。現在、いくつかの候補化合物が様々な開発段階にある（Wassman et al.） CDB3のような薬剤は、不安定なp53変異体のコンフォメーションをレスキューすることができ（Friedlerら、2003）、半減期が長くなったこれらのタンパク質が核に到達し、腫瘍抑制因子として働くことを可能にする。例えば、PRIMA-1は変異p53のチオールと付加体を形成する化合物に変換され、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する(Lambert et al. 2009)。さらに、CP31398はいくつかのクラスI変異型p53 DNA結合ドメインの安定性を高め、腫瘍抑制機能を回復させることが示されている（Foster et al. 1999; Tang et al. 2007）；しかしながら、CP31398はp53 DNA結合ドメインではなく、標的p53 DNA配列に結合するようなので、その作用機序は不明である（Rippin et al. 2002）。あるいは、ステージI/IIの臨床試験で良好な結果を示しているPRIMA-1は、p53 DNA結合ドメインのCys124に共有結合し、いくつかのクラスI変異体の機能を回復させる（Lambert et al.2009; Lehmann et al.2012; Wassman et al.2013; Bykov and Wiman 2014）。ドッキングとMDシミュレーションを用いて、PRIMA-1の結合部位としてだけでなく、スチクチン酸のような他の修復分子と結合する可能性のある、C124を囲む部分的にアクセス可能なポケットを同定した。R175HまたはG245SのクラスI p53変異体を持つ細胞をPRIMA-1またはステクチック酸で処理すると、コントロール処理に比べてp53遺伝子の標的であるp21とPumaの転写がかなり増加した（Wassman et al.） NSC319725やPhiKan083のようないくつかのp53再活性化化合物は、p53遺伝子標的の転写を誘導することが示されている。しかし、これらの化合物は特定のDNA結合ドメイン変異（それぞれR175HとY220C）に特異的である（Boeckler et al.） アレル特異的薬剤は、より標的を絞ったアプローチであるが、多様なp53変異体に結合する能力を示す化合物は、より実用的であろう。
核酸アプタマーやグリコサミノグリカンも、変異型p53に関連した癌におけるp53の凝集やプリオン様転換を防ぐ可能性がある（Ishimaru et al.） 同様のアプローチは、伝達性海綿状脳症のような、タンパク質のミスフォールディングに関連する他の疾患においても良好な結果を示している（Vieira et al.） ZnCl2の補充による変異型p53の活性型コンフォメーションへの復元も示されている。亜鉛処理によりp53とp73の相互作用が減少し、p53とp73の標的遺伝子プロモーターへの結合が回復した（Puca et al. 2011; D'Orazi and Givol 2012; Garufi et al.） 上述したように、Zn2+はp53の安定性と凝集速度を調節する主要な因子である。DNA結合ドメインの安定化と凝集抑制におけるZn2+の重要な役割が確立されていることは、DNA結合ドメインの安定化を介してp53の機能をレスキューする低分子化合物で観察された良好な結果と非常に一致している。Zn2+は、最も単純な潜在的治療薬の一つであることに加え、低分子化合物にとってはしばしば障壁となる血液脳関門を容易に通過する。どのような治療法が出現するかにかかわらず、開発中の方法論や薬剤の多さは、p53突然変異の頻度と重要性を浮き彫りにしている。
p53のDNA結合ドメインを安定化させる化合物はp53の凝集を抑制し、病気の進行を遅らせる可能性が高いが、p53の凝集体や共凝集体を溶解できるかどうかは不明である。上述した治療薬が既存の損傷を回復させることができる可能性は低い。レスベラトロールはアルツハイマー病モデルマウスにおいてAβ斑を消失させ（Marambaud et al. 実際、WT p53を一過性に導入したH1299肺がん細胞は、レスベラトロールのアポトーシス促進作用に感作された（Ferraz da Costa et al.） さらに、カレーのスパイスであるクルクミンは、生体内でAβ線維に結合して分解することが示されている（Yang et al.） これらの化合物の有効性を評価し、その作用機序とp53や他のアミロイド線維に対する効果をよりよく理解するためには、さらなる研究が必要である。
最近の研究では、タンパク質会合モジュレーター（CLR01）がp53 DNA結合ドメインの凝集に対して興味深い効果を示した（Herzog et al.） CLR01は中間の大きさのp53凝集体の急速な形成を誘導する一方で、さらなるp53凝集を阻害し、アミロイド凝集体の細胞毒性を低下させた（Herzog et al.） この挙動はある程度、PrPタンパク質に見られる挙動に似ており、ポリアニオンなどのいくつかの化合物は、条件によって凝集を刺激したり抑制したりする（Gomes et al.2008、Silva et al.2008、Vieira et al.2014）。
エレガントな最近の研究で、Soragniら（2016）は、変異型p53アミロイド凝集を阻害できる細胞透過性ペプチド（RecACp53と命名）を設計した。RecACp53は、p53のアミロイド形成セグメント（252-258）に結合して凝集を阻止する。RecACp53は、p53、特にR175とR248残基（最も一般的に変異している残基）に変異を持つHGSOC由来の細胞株とオルガノイドにおいて、p53の機能をレスキューすることができた。R248Q変異p53は乳癌の生検や細胞株で凝集することが以前に示されている（Levy et al.） RecACp53はまた、in vivoでの異種移植片の増殖と転移を抑えることができた（Soragni et al.） RecACp53は、細胞がWT p53を持つ場合には効果を示さなかった。
異なる戦略を用いて、Yang-Hartwichら（2015）は、HGSOCの幹細胞におけるWT p53も凝集する性質を持つことを見出した。これらの細胞は、化学感受性の子孫に分化すると、p53凝集能と腫瘍発生能を失った。p53凝集は幹細胞株におけるp14ARFの過剰発現に依存していたため、その阻害はp53凝集の抑制につながった（Yang-Hartwichら、2015）。HGSOCの幹細胞では、WT p53が変異型コンフォメーションとして振る舞うようだ。実際、我々のグループは、軽度変性条件（圧力と低温）を逆転させると、WT p53からR248Q変異体を模倣したコンフォメーションへの相互変換がin vitroで起こることを示した（Ishimaru et al.） WT p53を保有する腫瘍では、細胞の微小環境における酸性pHのような穏やかな変性条件が、プリオン様およびアミロイド形成特性を持つ変異体様コンフォメーションへの変換を促進する可能性がある（Ano Bom et al. 2010）。