神経回路ダイナミクス研究のための光刺激・ドラッグデリバリー可能な3次元高密度微小電極アレイ(MEA)
公開日：2021年1月21日
Hyogeun Shin, Sohyeon Jeong, ...Il-Joo Cho
元記事はこちら。
Nature Communications 12巻 記事番号：492（2021）
概要
神経回路のダイナミクスを解明することは、脳領域間の機能的結合の解明や脳機能障害のメカニズム解明のために極めて重要である。
しかし、3次元神経回路モデルにおいて、神経活動を高精度にモニタリングし、変調させる技術はまだ開発されていない。具体的には、周囲の神経細胞を刺激し、神経回路形成の時間変化をリアルタイムでモニターする機能を統合した3次元微小電極アレイ（MEA）は存在しないのである。
本発表では、人工3次元神経組織内の神経回路ダイナミクスを調べるための、光刺激とドラッグデリバリーを備えた3次元高密度多機能MEAを紹介します。その結果、3次元神経回路網におけるシナプス遅延の正確な計測を実証した。この3次元多機能MEAは、3次元脳モデルを用いた神経回路ダイナミクスの精密なin vitro調査を通じて、神経回路研究の可能性を開くことが期待される。
はじめに
神経回路ダイナミクスとは、シナプスで結ばれた神経細胞が時空間的に変化し、活性化したり、沈黙したりする活動パターンのことである。
神経回路ダイナミクスの解明は、脳疾患に関わる回路機能異常のメカニズム解明のために、脳内領域間の機能的結合の解読に不可欠である。マイクロフィジオロジーシステム（MPS; tissues/organs-on-chips） は、創薬の増強や生体の生理・病理状態の精緻化において、ますます有望なin vitroツールとなってきている1 が、脳に関しては、これまで神経ネットワークや回路のチップ上での再構成が中心であった。動物実験では不可能なことを実現する補完的なモデルとして、これらのin vitroモデルのニーズは高まり続けている。
近年、in vitroプラットフォームの開発により、神経細胞間のダイナミクスを測定するための制御可能な環境が整いつつある2。例えば、2次元培養による健常モデル細胞と疾患モデル細胞の神経ダイナミクスの比較から、脳疾患による回路機能障害に関連する潜在的なメカニズムが明らかにされました3,4,5。しかし、現在でも広く用いられている2次元培養では、3次元の生体組織の構造や機能を再現することはできません6。特に脳・神経組織においては、脳オルガノイド、マイクロフィジオロジーシステム（ブレインオンチップ）、3Dプリントされた人工組織などを用いて、in vitroでの生理・病態モデルの開発が期待され、3D培養への関心が高まっている7,8,9,10,11。特に、皮質ニューロンを播種したシルクベースのモジュール式足場を組み立てることで、多層の3次元皮質組織を構築することができた12。また、コラーゲンミクロフィブリルの方向性を揃えることで、in vitroで機能的な海馬の神経回路を3次元組織スケールで再構築することが可能になった13。
3次元神経回路モデルの構築は進んでいるものの、in vitroで神経回路モデル内の神経活動を精密にモニタリングし、変調させる技術はまだ開発されていない。2次元の神経細胞培養では、カルシウムイメージングや2次元微小電極アレイ（MEA）による平面的な細胞外電気生理が一般的であるが、3次元のin vitroモデルで神経活動をモニターする方法論としては、依然として主流である14,15,16,17,18,19,20。これらの測定技術の大きな欠点は、3次元の微小環境における神経細胞の結合や神経ネットワークのダイナミクスを解析することが困難であることです。同様に、生体内の神経回路の調査も、3次元接続の性質上、依然として限界があります21。
優れた代替手段として、3D微小電極アレイ (MEA)はin vitroの3D脳モデルで神経ネットワークを研究する機会を提供してきた22,23。しかし、これまで報告されてきた3D MEAは、密度が低い23ことと、記録部位がランダムに配置されている22ことから、神経回路のダイナミクスをモニタリングするには限界がある。また、これまでの3D MEAは周囲の神経細胞を電気的に刺激することしかできなかったため、特定の細胞種を刺激することは困難であった24,25。しかし、局所的な光刺激と薬物送達機能を持つMEAは、細胞タイプに特異的な刺激と神経化学的調節により、in vitroでの神経回路の機能的結合性のマッピングに役立つと思われる26。また、3D MEAでは、コンパクトなシステムで、例えば、毎日の記録によって、発達中の神経ネットワークの成長段階を時間分解的にモニターすることが求められる27,28,29,30。この特徴は、インキュベーターに収容可能な2D MEA27,28,29,30,31,32上での発達中の神経細胞結合の解析の利点であった。
したがって、in vitroでの神経回路ダイナミクスを調べるために使用できる理想的な3D MEAは、人工3D in vitroモデルの全容積にわたる空間的カバー、3D in vitroモデルの種類やサイズ（例：人工神経組織、オルガノイド）に応じた設計の柔軟性、3D in vitroモデルのニューロン間の機能結合を分析する高い空間分解能、正確に変調する局所光学および化学刺激能力、インキュベーター内で時間分解測定するコンパクト集積などの必要要件を満たさなければなりません。
上記の課題を解決するために、我々は、3次元高密度微小電極アレイ、小型発光ダイオード（LED）と結合した細い光ファイバーおよびマイクロ流体チャンネル（いずれも神経ネットワークを正確に変調するためにシャンクに埋め込まれている）、および発達中の神経ネットワークの日々の記録のための小型インキュベーションおよび記録システムを統合した3次元多機能MEAシステムを発表します（図1）。
3次元MEAのマルチシャンク構造に組み込まれた高密度電極アレイにより、区画化された神経組織から神経ネットワークのダイナミクスを計測することができます。また、細い光ファイバーやマイクロ流路を搭載することで、局所的な光刺激や薬物送達による異なる神経細胞群間の機能的な結合を精密に調べることが可能です。また、小型化されたインキュベーション・記録システムは、発達する神経ネットワークのダイナミクスの時間的変化を調べるのに適した環境を提供します。
このように、3D多機能MEAは、in vitroの3D脳モデルの精密な解析に極めて重要な機能を提供します。そこで、大脳皮質の2つのニューロン集団の間に機能的結合が形成された区画化3次元神経組織において、2週間にわたる神経回路ダイナミクスの時間的変化を解析し、3次元多機能MEAの機能を実証することにしました。
また、当社の多機能3次元MEAの高密度電極と局所的な光刺激とドラッグデリバリー機能による精密な刺激変調の両方によって可能となる、区画化された3次元神経組織内の神経ネットワークのシナプス遅延と伝達速度の測定を行っています。さらに、神経細胞のin vitro3次元培養から、シナプス潜時や伝達速度を測定しています。この3次元多機能MEAは、in vitroの3次元脳モデルを用いて神経回路のダイナミクスを精密に調べることにより、神経回路と神経疾患の両方の研究に様々な可能性を開くことができると期待されます。
a 積層・接着前の3つの2次元多機能MEA（左）、PDMS流体インターフェースと光・化学刺激用多機能シャンクで組み立てた3次元高密度多機能MEA（中）、体細胞領域と神経細胞領域の2つに区画された3次元神経ネットワークモデルへの応用（右）。 b 3次元多機能MEAの写真（左、スケールバー、5mm）と3次元電極配列の走査電子顕微鏡（SEM）画像（右、スケールバー、1mm）。c 細くした光ファイバー（青）、埋め込みガラス（緑）、および埋め込みガラス層の下のマイクロチャネルの出口を持つ多機能シャンクの SEM イメージ（左；スケールバー、100μm）、および白金（Pt）電極を持つ記録シャンクの SEM および光学イメージ（右；スケールバー、50μm）。 d 小型発光ダイオード（LED）とプリント回路基板（PCB）上のフレキシブルプリント回路（FPC）コネクタと統合したパッケージ化 3 D 多機能 MEA の写真（スケールバー、10 mm）。(e アクリル製筐体にカスタムマイクロドライブとPDMS 3D培養チャンバーを備えた3D多機能MEAシステムの写真（左、スケールバー10mm）、およびin vitro 14日目（DIV）における区画化した2群神経ネットワークの3Dレンダー共焦点蛍光画像（神経突起（緑、TUJ-1）、アストロサイト（赤、GFAP）および核（青、DAPI））を示す。スケールバー、100μm。MEAシステムの作製とパッケージングは、再現性を確保するために独立して少なくとも10回繰り返し、同様の結果を得ており、その代表的な画像を図に示している。
研究成果
3次元多機能MEAの設計・製作
3次元多機能MEAは、3×6配列のシャンク（多機能シャンク1本と記録用シャンク17本）で構成されている。
18個のシャンクに63個の記録用電極を均等に配置し、多機能シャンクには直径60μmの細径光ファイバと5本の平行マイクロ流路を埋め込んだ（図1a、1b）。すべての電極、光ファイバー、マイクロ流路を統合することで、人工3次元神経組織内の全領域の神経活動の測定と、光刺激や化学刺激による特定部位の神経ネットワークの局所変調の測定が可能になりました（図1a）。各シャンクの長さは6mmで、3D神経組織とパッケージ機器のプリント基板（PCB）の間にスペースを確保するのに十分な長さであった。これは、培養液に浸されたPCBが誤って短絡したり、培養液が汚染されたりするのを防ぐためであった。3次元MEAを埋め込んだ3次元神経組織の構造忠実度を維持するため、プローブの寸法を最小化することを目指しました。多機能シャンクの幅は145μm、記録用シャンクの幅は63μm、シャンクの厚さは40μmであった。3次元神経組織の体積に占める3次元MEAの割合はわずか2.63％であり、事前に挿入した3次元MEAが3次元神経ネットワークの形成に与える影響はほぼ無視できるレベルであることがわかった。3次元MEAのシャンクは、下から見ると3行6列のマトリックスを形成していました（図1a、1b）。行と列の間隔はそれぞれ500μmと360μmである。各シャンクの先端には3本または4本の記録用微小電極（20×20μm2）を集積し、隣り合う電極間の距離は85μmであった。
私たちは、2つの体細胞の間にある神経突起領域からなるモノリシックな3次元神経組織コンストラクト（1.85 × 1 × 0.3 mm3）内の神経ネットワークのダイナミクスをカバーするように3D MEAを設計しました（図1aおよび1b）。注目すべきは、微小電極が対応する体積の範囲が約114サイト・mm-3であったことです。記録部位の密度は約33部位・mm-3であり、最近報告された3次元MEAの密度よりかなり高い23。
我々は、これまでに開発した微細加工プロセス26,33,34を用いて、2次元MEAを3層に分離して作製した3次元多機能MEAを考案した（補足図1）。具体的には、本体サイズの異なる3つの2次元MEAを連続的に接合して3次元構造を構築しました（図1a、補足図2）。2次元MEAの多機能シャンクを作製した際のハイライトは、薬液を供給するためのマイクロ流体チャンネルを薄いシャンクに直接埋め込んだ時である34。幅20μm、高さ12μmの3本のマイクロ流路の終点となる多機能シャンクの先端に、それぞれ幅30μm、長さ12μmの流出口を設置した（図1c）。このように、2次元のMEAアレイでも、3次元のMEAアレイでも、シャンクの位置を正確に調整することで、自由度の高い電極の配置が可能となった（補足図2）。全体として、私たちが設計・製作した3D多機能MEAは、in vitroの3D神経組織の全領域にわたって神経活動をミリメートル単位でモニタリングしながら、神経ネットワークを局所的にマルチモーダル操作する能力を提供します。
3D多機能MEAのパッケージングとキャラクタリゼーション
図1dは、in vitro実験のためにパッケージングした3D多機能MEAを示す。これは、外部記録システムとの電気的接続のためにカスタム設計したPCB上に接着し、カスタムマイクロドライブを用いて組み立てたものである。
次に、薬物送達のための流体インターフェースとして、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体チップを3D MEAに接着しました。そして、ファイバーの先端に小型LEDを貼り付けました。LEDは、レーザーなどの外部光源を必要とせず、細い2本の電気配線だけで動作するシンプルな環境を提供しました。その後、白金（Pt）電極にPt-black36を電着し、有効表面積を増加させることで神経記録能力を向上させた（補足図3a）。
神経ネットワークのダイナミクスを解析する前に、私たちが開発した3次元多機能MEAの3つの重要な機能を評価しました。まず、63個の微小電極の電気インピーダンスを測定した。その結果、白金黒を1kHzで電着した後の平均電気インピーダンス（0.015 ± 0.004 MΩ）は、裸の白金（1.761 ± 0.346 MΩ）よりも2桁低くなったことを確認しました（補足図3b）。これは、同じサイズのイリジウム（Ir）電極と比較して、インピーダンスが約44倍と大幅に低下し26、より高いS/N比が得られるため、神経活動の細胞外計測に非常に有利になった。白金黒電極の長期安定性を評価するため、37℃のインキュベーター内で、白金黒電極を1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸漬し、電気インピーダンスを測定した。その結果、インピーダンスは1日目（0.017 ± 0.004 MΩ）から14日目（0.018 ± 0.004 MΩ）まで劣化せずにほぼ一定であることが確認された（補足図3c）。
次に、3次元MEAを空気中に曝した状態、3次元MEAを無細胞コラーゲン中に挿入した状態、3次元MEAを細胞播種コラーゲン中に挿入した状態の3種類の条件でマイクロ流路の流速を測定した。PDMSチップの入口から50～200kPaの圧力をかけました。0.25%[w/v]のI型コラーゲンを選んだのは、神経組織13を含む人工組織コンストラクト37の足場として広く用いられている種類と濃度だからである。このコラーゲンには、ラット大脳皮質初代神経細胞（E18）を 4×107 個・mL-1 の密度で播種し、本研究で用いた in vitro 実験条件と同じにした。100kPa の圧力において、これらの条件での流速は 0.557 ± 0.007 μL⋅min-1 (in air), 0.542 ± 0.011 μL⋅min-1 (in cell-free collagen), および 0.539 ± 0.015 μL⋅min-1 (in neuron-seed collagen) で、いずれも統計的に有意ではなく、水力抵抗 26 に基づく計算と同様、つまり、。0.568 μL・min-1であった（補足図3d）。これらのデータから、予測計算に基づいて注入量を正確に制御できていることが確認できた。
最後に、光刺激の体積的な広がりを予測するために、ファイバー先端の出力光パワーを測定し、透過光分布のシミュレーションを行いました。まず，LEDのデータシートを参照し，LEDの発光効率を5.15％と算出した（補足図3e，詳細計算は補足注1）。その結果、1Wの入力電力をLEDに供給したときのLEDの出力光パワーは51.5mWであることを確認しました。LEDから51.5mWを出力した場合、ファイバチップからの出力光パワーは0.15mWとなり、光結合効率は0.29％となりました（補足図3e、補足説明1中の詳細計算）。光結合効率は0.29%であり，我々が以前に報告した1.42%より低い26が，提案したプローブは光源としてコヒーレントレーザーの代わりにノンコヒーレントLEDを組み込んだものであった。
LEDは指向性に乏しいため、本来は光出力が低いのですが、LEDを組み込むことでコンパクトでシンプルな構成となりました。また、ファイバー先端から測定された光パワーは76mW・mm-2となり、チャネルロドプシン-2（ChR-2）を活性化するための最小光強度（1mW・mm-2）38を上回った。入力電力が1 WのときにLEDから透過した出力光パワー（0.15 mW）の測定値、つまり51.5 mWの光パワーに基づき、モンテカルロシミュレーション39,40を用いてコラーゲン中の透過光量のプロファイリングを行いました。(ファイバー端から220μmの距離での放射照度は、チャネルロドプシン-2（ChR2）が活性化する閾値強度である1mW・mm-2以上であることを確認した（補足図3f）。また、x-y平面における光の分布を検査することで、刺激された体積の範囲がシャンクの先端を超えないことを確認した。これらのデータから、我々の3D MEAは所望の部位に局所的に光刺激を与えることができることが示された（補足図3f）。
モニタリング装置と3次元神経培養の組み立て
人工神経組織内の神経活動をリアルタイムに記録するために、3次元多機能MEAを組み込んだ小型キュービクルを考案した（図1e）。この小型キュービクルは、3D MEAの垂直位置を調整・保持するためのステンレス製の特注マイクロドライブ、ニューロン播種コラーゲン足場を閉じ込め、培養液を供給するためのウェル付きPDMS培養チャンバー（2.5 × 1.5 × 0.5 mm3）、培養期間中および神経ネットワークのダイナミクス測定中に培地の望ましくない蒸発を最小限に抑えるアクリル製の筐体（10 × 8 × 8 cm3）から構成されています。
特注のマイクロドライブは可動部と底板からなり、2本のネジを接続孔に挿入して締め付けることで組み立てる（補足図4a）。マイクロドライブの可動部中央にある長いネジを回すことで、3次元MEAの上下位置を容易にかつ精密に調整することができる（補足図4b）。このように、システム全体が小型で、3次元多機能MEAを含めた構成も単純である（補足図5、6）。また、MEMSを用いたバッチプロセスでは、1枚のウェハから20～30個の電極アレイを作製できるため、本システムをスケールアップして複数の実験を同時に行うことも十分可能である。
まず、3次元神経回路モデルを作製するために、PDMS培養チャンバーをカスタムマイクロドライブの底板に、界面接着剤として未硬化PDMSを薄く塗布して固定化した（補足図6a）。マイクロドライブに取り付けた培養チャンバーをオートクレーブ滅菌した後、PDMSウェルの内面にポリドーパミンをコーティングし、コラーゲンスキャフォールドに接着させた。その後、2本の小さなネジを使って3D MEAをマイクロドライブの可動部に組み付けた（補足図6b）。
その結果、3次元MEAをコラーゲン足場に装填するタイミングが最も重要な変数であることが分かりました。具体的には、シャンク近傍のコラーゲンミクロフィブリルを均一に分布させるためには、コラーゲンのゲル化が始まる前に3次元MEAをロードする必要がある（補足図7a、補足動画1）。一方、完全にゲル化した後のコラーゲンへの3D MEAの挿入では、コラーゲンが繊維状で粘弾性を持つため、3D MEAを浸透させることが困難であり、結果として構造変形を悪化させた（補足図7b、補足ムービー1）。
3次元神経回路網のモデルとして、1群神経回路網と区画2群神経回路網の2種類を開発した（補足図8）。単群モデルは小さな単位（すなわち個々のニューロン）間の結合性を解析するために使用し、2群モデルはネットワークレベルで大きな単位間の結合性を解析するために使用しました。区画された神経組織は、まず中央の区画に無細胞コラーゲンを連続的に充填し、次に両側の区画に神経細胞を播種したコラーゲンを20分間隔で追加することで形成した。すなわち、中央の区画の無細胞コラーゲンを 20 分間部分的にゲル化させた後、側面の区画に神経細胞を播種したコラーゲンを充填した。ウェル内のコンパートメントを分離するために、厚さ約125μmのポリエステル（PET）フィルムを使用した。(補足図 8 および「方法」セクションのより詳細なプロトコルを参照)。40分未満（例えば、30分；サイドコンパートメントにロード後10分）でPETシートを除去すると、サイドゾーンとセントラルゾーンの間にブリードスルーが発生することに留意した。
小型化したキュービクルでは、コラーゲン中のラット大脳皮質初代神経細胞が高い生存率を維持し（補足図9、補足動画2）、1群神経ネットワークモデル、2群神経ネットワークモデルともに2週間かけて神経突起の一過性成熟伸長を伴う構造的結合性を形成することを確認した（補足図10、11、補足動画3,4）。興味深いことに、胚脳（E18）から神経細胞に富む集団を単離したものの、両方のタイプの神経組織でGFAP陽性アストロサイトの小さな部分を発見しました（補足図10, 11, 12）。また、神経突起が中央の神経突起領域で広がる一方で、2つの体節領域に残る神経細胞核に基づき、我々の区画化のアプローチが成功したことに注目したい（補足図11、12、補足動画4）。
我々は、0.25％[w/v]コラーゲンが300μmの全厚みを通して均一な神経細胞密度を可能にすることに注目します。これは、今回の研究と我々の以前の研究の両方で100μmまでのz-stackイメージングが均一な播種密度を示したからです13。しかし、コラーゲンやマトリゲルの濃度が低いと、播種したニューロンが足場がゲル化する前に重力で沈降してしまいます。残念ながら、本研究で用いた高い細胞播種密度（すなわち、4×107細胞・mL-1）は、ラットの脳内の細胞密度41に近いため、共焦点顕微鏡などの従来のイメージング方法では、Zスタックイメージングは100μmに制限されていました。組織クリアリングアプローチのような高度な3Dボリュームイメージング技術は、この限界を克服する優れたソリューションとして機能する可能性がある。
3次元神経培養における神経ネットワークのダイナミクス
3次元での神経細胞間の機能的結合の形成に応じた神経ネットワークのダイナミクスを解析するために、まず、単一グループモデルにおいて、試験管内で最長14日間（DIV）の神経活動を測定しました。DIV6から一部の電極で自発的な活動が現れ始め、14日間毎日記録を続けると、ニューロンの発火率（図2a、カラーマップしたラスタープロット図2b、平均スパイク速度図2c）、活性電極数（図2d）とも増加した。(これらのデータは、主に神経突起の実質的な伸長と神経細胞間のシナプス形成を含む十分な成熟が、in vitroで培養した神経細胞の機能的活性に必須であることを再確認した2Dおよび3Dのin vitro神経モデル27,28,29,30,31のデータと一貫して同様であった27,42,43,44。また、各電極の信号を精査したところ、3次元での神経細胞の発火率は、神経組織全体でグローバルに増加していることが確認された（補足図14）。
a 試験管内日数（DIV）6および14における代表的な自発活動：電界電位のトレース（左）およびオーバーレイスパイクプロット（右） b DIV6から14にかけて3D多機能MEAの63電極から記録した自発活動を示すカラーマップ付きラスタープロット c-j DIV6から14における自発活動の時間発展を示す棒グラフ（すべてのデータについてn = 5独立サンプル）：平均スパイクレート (c; P = 0. 032) 。0102（DIV10と11の間）、アクティブ電極数（d）、平均バースト率（e；DIV10と11の間P = 0.032）、バースト期間（f）、バーストのスパイク数（g）、バースト活動におけるスパイク間間隔（ISI）（h）、バースト間間隔（IBI）（i）、全スパイクにおけるバーストスパイクのパーセント（j）。データは平均値+/- s.e.m.で表示。統計的有意性は両側不対t検定で検定した。Source DataはFig. 2b-jのSource Dataファイルとして公開されている。
個々の活動に加えて、私たちの3D高密度MEAは、in vitroのバースト活動、すなわち神経細胞が高い周波数の発火を繰り返す頻度を測定することを可能にした。バースト活動は、in vitroでもin vivoでも、神経細胞のコミュニケーションに不可欠な要素である45,46。DIV10までニューロンのバースト活動は徐々に増加したが、DIV10以降、バースト活動の全体的な頻度と各ニューロンの発火パターン内のバースト活動の比率が増加した（図2e-2j）。これらの結果は、3次元的に形成された神経細胞間の機能的な結合を裏付けるものである。一般に、in vitroでのバースト活動は、細胞の播種密度を上げることで観察できますが、電極を高密度に集積した我々の3D MEAは、バースト活動の捕捉確率を飛躍的に高め、in vitroでの神経ネットワークを精密に解析する空間分解能を向上させることに成功しました。
また、成熟した神経回路網で起こることが知られている同期活動についてもin vitroで解析しました。各電極対に同期の度合いを示す0（最低）から1（最高）のスコアを割り当てる同期性法を用いた32,47。同期性スコアが高ければ、2つの電極周辺の神経細胞間で機能的な神経回路網が形成されていることを示唆する。培養期間が長くなるにつれて、活性電極間の同期が顕著になり、同期している電極の数も増加することが確認された（図3a-e、補足図15）。これらのデータは、in vitroの単一グループ神経回路網モデルのニューロン間のシナプス数が、DIV10以降に驚異的に増加することを示していた。また、神経細胞間の機能的な神経ネットワークを3次元的に可視化するために、グラフィカルなネットワーク解析であるLouvainアルゴリズム32,48を適用した。各電極をノード、電極間の同期を重みとし、ノード間の同期スコアが0.5より大きい場合に可能なネットワークに統合した。その結果、DIV8から少数のネットワークが形成され始めたことがわかった（Fig. 3b）。
興味深いことに、ネットワークの数はDIV9でピークに達し、その後in vitroでわずかに減少した（図3fおよび補足図15）。これらのデータから、DIV10以前の早い段階で隣接する神経細胞間に短い結合がどんどん形成され、その短い結合が比較的大きなネットワークとなり、ネットワークあたりの結合数が連続的に増加しながらネットワーク数が減少して成熟していくことがわかった（図3、補足図15、および補足表1）。
a-e 電極間の同期スコアを表示したカラーマップ相互相関行列(i)と、ノード度による接続性、およびノード間の相関を示す3Dネットワークマップ(ii)、試験管内日数6 (a), 8 (b), 10 (c), 12 (d), 14 (e) における自発活動に基づく。ノードの色は、電極間で接続されたネットワーク指標を示し、例えば、DIV14の紫色のノードは、同じネットワーク内にあることを示す。ノードの次数は、各電極からの接続電極数を示し、例えば、最大値の1は、その電極がすべての電極と接続されていることを表す。f DIV6から14までのネットワークの数（赤の三角形と点線；DIV9と10の間の**P = 0.002）とネットワークごとの接続電極数（青の丸と点線）を示すプロットである。データは、個々のデータ点（青い輪郭の円；DIV11、12、14ではn=3ネットワーク；DIV8、9、10、13ではn=4ネットワーク）の平均値+/- s.d.として示される。統計的有意性は、両側不対t検定で検定した。Source DataはFig.3a-fのSource Dataファイルとして公開されている。
光刺激と化学刺激による神経ネットワークのダイナミクス
機能的神経ネットワーク形成前後のシナプス結合を3次元的に正確に調べるために、細胞種特異的な刺激が可能な検証ツールとして、オプトジェネティクスを利用した38。光感受性イオンチャネルである,チャネルロドプシン-2（ChR2）をコラーゲン内で培養したラット大脳皮質初代神経細胞に AAV-EF1α-ChR2-eGFP のウイルス感染により発現させ（補足図 16、補足動画 5）、ChR2-神経細胞からの光刺激による活性化神経信号を測定することに成功した（ 0.2 Hz、デューティーサイクル50%、76 mW⋅mm-2 、トータルパワー0.15 mW）により、光ON-OFF間の移行時に光起電力効果による刺激アーチファクトが発生するにもかかわらず、ChR2ニューロンの活性化神経シグナルの測定に成功した49,50（補足図17）。光刺激による神経信号の活性化を観察した後、3D MEAの全てのシャンクから記録しながら、多機能シャンク周辺のChR2-ニューロンを局所的に刺激した。DIV6では、光刺激部位の周囲の神経細胞のみがそれに対応して多く発火した（図4a、4c、および補足図18a）。一方、光刺激時には、DIV14の神経細胞は、刺激部位の周囲だけでなく、神経組織全体が非常に多く発火した（図4b、4d、および補足図18b）。これらの結果から、自発活動（LED-off時の神経活動）は若干低下しているものの、機能ネットワークにおいて2週間かけて成熟した神経細胞のほとんどがシナプス結合を介して活性化できることが示された（図4e、補足表2）。この活性の低下は、図2に示した非感染細胞培養からの活性と比較して、ChR2-ウイルス感染による生存率および神経活動への潜在的影響51,52に起因することが考えられる。
a-b試験管内日数（DIV）6（a）および14（b）の局所光刺激（0.2Hz、50％デューティサイクル）中に63電極から記録した神経活動を示すラスター・プロット。水色の長方形は光照射の開始を示す。c-d DIV6における光刺激のLEDオフ（白）サイクルおよびオン（青）サイクル時の多機能シャンクおよび他の記録シャンク付近の3次元培養神経細胞の発火率（c；**P = 0.多機能シャンク付近では 0058、その他の記録シャンク付近では ns P = 0.058） および 14 日（d；**P = 0.0072 多機能シャンク付近；**P = 0.0080 その他の記録シャンク付近） e DIV 6（左）および 14（右）における光刺激による神経活動から作成した電極間の 3D ネットワークマッ プ。ノードの色、次数、線の色はそれぞれ、電極間に接続されたネットワーク指数、各電極からの接続電極数、電極間の相関を示す。f-h DIV14におけるCNQX/AP5注入前（f）、注入後（g）およびCNQX/AP5ウォッシュアウト後（h）の局所光刺激時に63電極から記録した神経活動を示すラスタープロット i-k 光刺激のLEDオフサイクル（白）およびオンサイクル（青）における多機能および他の記録シャンク付近の3次元培養ニューロンの発火率 before (i; ****P = 0. 000079).000079（多機能シャンク付近）；***P = 0.0008（他の記録シャンク付近））およびCNQX/AP5注入後（j；*P = 0.0041 （多機能シャンク付近）；ns P = 0.0707 （他の記録シャンク付近）、および洗い流した後（k；P = 0.0707 （多機能シャンク付近））、光刺激を行った。DIV 14における多機能シャンク付近では0012；他の記録シャンク付近ではP = 0.0005）。 DIV 14におけるCNQX/AP5注入前（l）、注入後（m）およびCNQX/AP5洗浄後（n）の光刺激による神経活動から作成した電極間の3Dネットワークマップ。データは、個々のデータ点（白丸；すべてのデータについてn＝6刺激試行）による平均値＋／-s.d.で示した。統計的有意性は、両側不対t検定で検定した。Source Dataは、Fig.4a-nのSource Dataファイルとして入手可能である。
シナプス伝達による神経細胞の化学的活性化をオプトジェネティックな調節と組み合わせて実証するために、DIV14で、多機能シャンクのマイクロ流路を通して興奮性シナプス伝達のシナプス遮断剤を注入した。具体的には、CNQX（20μM）およびAP5（50μM）1μLを0.25μL・min-1の流速で4分間注入し、30分間待機して十分な拡散が行われたことを確認した。CNQX/AP553に曝露すると自発神経活動は速やかに回復するが、シナプス伝達は洗い流されるまで遮断されることが知られている54。同様に、LED消灯時の平均発火率は、CNQX/AP5注入前後で同程度であった（図4i、4j）。化学物質によるサイレンシング前は、神経活動（活性電極と発火率）は刺激部位から離れて同期していたが（図4f、4i、補足図18c）、光パルスを照射すると、神経活動が同期する領域は光刺激部位周辺に優位に限定されるようになった（図4g、4j、補足図18d）。シナプスブロッカーを新鮮な培地で30分かけて3回洗浄し、1時間安定化させると、神経活動は3次元神経組織全体で再び同期した（図4h、4k、補足図18e）。さらに、ネットワーク解析の結果、興奮性シナプス受容体の遮断により、より広範囲なネットワーク（図4l）がいくつかの小さなネットワーク（図4mおよび補足表3）に分離され、同様に、洗浄後にシナプスネットワークが回復することがわかった（図4n）。
コンパートメント化した2つの神経集団間のネットワークダイナミクス
神経回路ダイナミクスを調べるためのin vitroモデルとして、2つのコンパートメント化された神経群間の機能的結合を調べた。2群神経ネットワークモデルの培養チャンバーは、中央の神経突起領域で区切られた2つの側部体細胞領域で構成されていた（図5a）。区画化された3次元神経組織全体の神経活動を測定するために、各領域に6本のシャンクが配置され、刺激機能を持つシャンクは第1体性領域に配置されました（図5a）。
免疫染色により可視化したところ、DIV6からDIV14で2つの体細胞領域にわたって神経突起が密に伸長し、体細胞-神経突起-体細胞の構造のみの再構築に成功した（図1eおよび補足図11）。単一グループモデルと同様に、DIV10以降、発火率および活性電極数が大幅に増加した（補足図19、20）。また、我々の3次元MEAでは、DIV9に同期した活動の測定が可能となり、2群の大脳皮質ニューロン間の機能的結合が形成され始めたことが間接的に示された（Supplementary Fig.）
a 2つの体細胞領域（ピンク）と神経細胞領域（オレンジ）からなる区画化された3次元神経組織に挿入された3次元多機能MEAの模式図です。各領域に6本のシャンクが配置され、多機能シャンクは第一体性領域の角付近に配置されています。b-d 2群3次元神経回路モデルにおける試験管内日数（DIV6）での局所光刺激による神経活動の変化。 b局所光刺激（0.2Hz、デューティサイクル50%）中に区画領域内の3次元MEAの63電極から記録した神経活動のラスタープロット表示。水色の長方形は光刺激の開始を示す。c コンパートメント型ニューラルネットワークモデルにおけるシャンクマップの3次元可視化（上）、およびLEDオンサイクル時の発火率上昇をLEDオフサイクル時と比較してz平均したカラーマップ（下）、上図に示した各シャンク近くの小領域に対応する。d LEDオフ（白）サイクルと光刺激オン（青）サイクルにおける刺激部位、第1体節、神経突起、第2体節の3次元培養神経細胞の発火率（刺激部位ではP = 0.0443; ns P = 0.3409）。3409（第一体性領域）。 e-g 2群3次元ニューラルネットワークモデルにおけるDIV10での局所光刺激による神経活動の変化。e ラスタープロット；（f）LEDオンサイクル時のシャンクマップとz平均、カラーマップによる発火率上昇の3次元可視化；（g）各領域での3次元培養ニューロンの発火率（P = 0.刺激部位で0220、第一体細胞領域でP = 0.0444、神経突起領域でns P = 0.4506、第二体細胞領域でP = 0.0436） h-j 2群3次元神経回路モデルにおけるDIV 14での局所光刺激による神経活動の変化。h ラスタープロット；（i）シャンクマップの3次元可視化、LEDオンサイクル時の発火率のz平均、カラーマップ化；（j）3次元培養神経細胞の各部位の発火率（*P = 0.0218 刺激部位；*P = 0.0229 第1体細胞領域；*P = 0.0214 神経突起領域；*P = 0.0228 第 2 体細胞領域）。データは、個々のデータ点（白丸、すべてのデータについてn = 6刺激試行）を持つ平均値+ /- s.d.として提示されている。統計的有意性は、両側不対t検定で検定した。Source DataはFig.5b-jのSource Dataファイルとして公開されている。
機能的結合の形成を検証するために、ChR2を発現している神経細胞に対して空間的に分解した局所光刺激を行い、その後、時間的に分解した日次計測を行った。DIV6では、刺激部位周辺の神経細胞のみが光パルスによって活性化された（図5b-d、図6a-c）。その後、DIV7から9にかけて、第一体性領域で光活性化されるニューロンが徐々に増加した（補足図21）。DIV9では、第一体性領域の光刺激後すぐに第二体性領域の一部のニューロンが活性化し、二つの異なるニューロン集団の間に機能的結合が形成されていることが確認された（補足図21、22）。DIV10では、光刺激による両領域の発火率の有意な上昇と活動の同期の両方が観察された（Fig. 5e-g, Fig. 6d-f, Supplementary Fig. 22 and 23）。また、刺激部位周辺の電極（E5とE6）から記録された活発なバースト活動により、第二体性領域よりも第一体性領域で高い発火率が観察された。この結果は、毎日の光刺激による反復的な神経活性化によって、第一体性領域の局所的なネットワーク形成が促進されたことに起因すると考えられる55。DIV11からDIV13にかけて神経突起領域を介した2つの体細胞領域間の結合性が高まるにつれ（補足図22、23、24、補足表4）、DIV14にはすべての領域でより活発な同期活動、神経細胞発火率、ネットワーク数の増加が起こった（図5h-j、図6g-i）。また、3次元高密度MEAにより、DIV11から14にかけて神経突起領域での細胞外活動電位の測定が可能となり、2つの異なる神経細胞集団間で活動電位の伝播が起きていることが示された56（補足図21、23、24）。
電極間の同期スコアをカラーマップで表示した相互相関行列（a、d、g）、体外培養6日目（a-c）、10日目（d-f）、14日目（g-i）の光刺激による神経活動から、ノード度と接続性を示したネットワークマップのトップダウンビュー（xy平面；b、e、h）および3Dビュー（c、f、i）。ノードの色、次数、線の色はそれぞれ、電極間で接続されたネットワークインデックス、各電極からの接続電極数、電極間の相関を示す。Source DataはFig.6a-iのSource Dataファイルとして公開されている。
重要なのは、DIV14で2つの神経群間のシナプス遅延を3次元的に解析できたことである（図7a-c）。シナプス遅延は、2つの領域間の機能的結合を示す直接的な証拠となる。シナプス遅延は、各電極から記録された信号の相対的な時間点を、光刺激時の基準タイムスタンプと比較することで推定した（Fig. 7d）。その結果、刺激部位を除く3つの領域で、シナプス遅延は10msより短く、すなわち2〜8msの範囲であった（図7dおよび図7e）。しかし、第2体性領域ではより遅延したシナプス潜時が明らかになり、刺激部位からの距離が長いほど信号が遅延することが示された。その結果、第1体性領域では6ms（S1上の電極1とS6上の電極21の間）、第2体性領域では8ms（S1上の電極1とS16上の電極57の間）が最もシナプス遅延が長くなることを確認した（図7fおよび図7g）。以前報告された典型的なシナプス遅延が約1〜4ms57であることを考慮すると、電極21または57付近のニューロンを複数のシナプスが接続していると推察された。また、一部のシャンク（例えばシャンク15；S15）では、信号遅延がz軸に沿って変化していた（図7dおよび図7e）。このことから、z軸上の異なる位置にあるニューロンは、異なるシナプス入力を受けている可能性が示唆された。要約すると、各領域のシナプス遅延の分布は、2つの神経回路網の間で約3〜8msの信号遅延を示した（Fig. 7h）。
a-c DIV14において、第一体性領域（a；電極1-21）、神経突起（b；電極22-42）、第二体性領域（c；電極43-63）の63電極から光刺激によって記録されたニューロンの過渡的なスパイク信号。d シャンク1への光刺激に対する各電極のシナプス潜時を3Dカラーマップしたもの。黒丸は、電極から信号が記録されていないことを示す。e 第1体節（シャンク1-6）、神経突起（シャンク7-12）、第2体節（シャンク13-18）領域における各電極（白丸）のシナプス潜時。赤線は、各シャンクの各電極から記録された信号の平均シナプス潜時を示す。データは、個々のデータ点（白丸；シャンク4、5、9、10、11、12、14、15、16、18のn＝3信号記録電極、シャンク1、2、3、6、7、8、13、17のn＝4信号記録電極）の平均値+/- s.d. として表示されている。-g 刺激部位から第一体性域のシャンク6上の電極21（f）、第二体性域のシャンク16上の電極57（g）までのシャンクマップの3次元可視化（左図の赤点線）。電極1と21から記録した神経細胞（f）、電極1と57から記録した神経細胞（g）（右図）の過渡的なスパイク信号で、刺激部位から第一体性領域内のシナプス潜時を表示した。青い三角形は光刺激の開始時刻を示す。h 各シャンクの平均シナプス潜時をカラーマップしたもの。 i 刺激部位から全電極までの距離を、シナプス潜時に応じて散布図にしたもの。点線は線形回帰の最良適合を、斜線は95%信頼区間を示す。j 縦方向（橙色、挿入図中の橙色矢印）と横方向（緑色、挿入図中の緑色矢印）の刺激部位から電極までの距離のシナプス潜時による散布図 k 横方向と縦方向のシナプス伝達速度を示す棒グラフ。データは個々のデータ点（白丸；横方向はn=7信号記録電極、縦方向はn=19信号記録電極）の平均値+/- s.d.で示す。**P = 0.0010.統計的有意性は、両側不対t検定で検定した。Source DataはFig.7e, h-kのSource Dataファイルとして公開されている。
興味深いことに、縦方向（すなわち、y=0のときのxz平面）に沿ったシナプス伝達は、横方向（すなわち、x=0のときのyz平面）に沿ったシナプス伝達よりも時間がかかった（図7dおよび図7h）。代表的な例として、光刺激部位から約1mm離れた2カ所での相対的な平均信号遅延は、シャンク5（S5）で4ms、シャンク8（S8）で2.35msだった（Fig.7d）。したがって、光刺激からの距離に対するシナプス遅延の線形回帰曲線の傾きは、シナプス伝達速度と考えることができる。その結果、シナプス伝達速度は、方向に関係なく230 ± 42.6 mm⋅s-1 、縦方向に沿って449 ± 106 mm⋅s-1 、横方向に沿って202.6 ± 69.8 mm⋅s-1 であることがわかった（図7iおよび図7j）。また、縦方向のシナプス伝達速度は横方向のそれの約2倍であった（図7k）。これらの結果から、2つの群間の神経細胞は1つまたは複数のシナプスを介して複雑に結合していることがわかった。
この違いは、私たちの3次元培養モデルにおいて、信号の伝搬経路に神経突起領域が存在することに起因すると考えられます。具体的には、神経突起の配置と多機能3次元MEAの組み合わせが、横方向よりも縦方向の伝達速度の速さを推定する上で極めて重要な役割を果たしたのである。また、神経突起領域のシナプス密度は、ソーマ領域のそれよりもはるかに低いことが分かりました。シナプス潜時は、シナプス前部からシナプス後部への信号伝達の所要時間を表し、神経突起（より具体的には軸索）に沿った信号伝達よりも長いことが知られている58。そこで我々は、シナプス伝達速度はシナプス密度に反比例すると仮定した。つまり、縦方向の経路（神経突起領域）に沿ったシナプスの数ははるかに少ないため、縦方向の伝達は横方向の伝達よりも著しく阻害されないと考えたのである。
この仮説を証明するために、ソーマ領域と神経突起領域の長手方向に沿ったシナプス潜時を比較した。その結果、神経突起領域の縦方向の速度は、体細胞領域のそれよりも速いことが確認された（補足図25）。さらに、シナプスの数が双方向で同程度であった第一体細胞領域において、縦方向と横方向の速度を比較したところ、第一体細胞領域では縦方向の速度が速く、第二体細胞領域では横方向の速度が速いことがわかった。その結果、2方向に沿ったシナプス伝達速度は同程度であることが再確認された（補足図26）。
このように、3次元多機能MEAは、高い時空間分解能で3次元培養された2つの異なるニューロン集団間の機能的結合を直接確認することにより、神経ネットワークのダイナミクスを明らかにすることができました。
ヒト由来オルガノイドへのさらなる応用
オルガノイドは、幹細胞による自己複製と自己組織化により、生体臓器と同様の構造と機能を持つ3次元細胞集合体である59。そのため、ヒト由来オルガノイドは、次世代のin vitroモデルとして脚光を浴びている59,60。しかし、ヒト由来の脳や脊髄のオルガノイドの機能解析は、これまで2次元のMEA29,30で行われることがほとんどであり、3次元構造を持つオルガノイド内部の機能連関を調べるには固有の限界がある。
そこで、本システムのヒト由来オルガノイドへの適用性を検証するために、ヒト人工多能性幹細胞（iPSC）由来の脊髄オルガノイドを用いた（補足図27a-c）。このオルガノイドの大きさ（直径700μm程度）は、体細胞や神経細胞領域の大きさに近いことから、16個の電極とマイクロ流路を集積したニードル型MEAを用いて、成熟（＝3ヶ月齢）オルガノイドの神経活動を測定した（補足図27c）。その結果、16個の電極のすべてからオルガノイド内の神経活動を測定することに成功した（補足図27d-e）。特に、オルガノイド内の神経信号は、ほとんどの電極の周りで同期していた（補足図27f）。この結果は、オルガノイド内の神経細胞が強固に相互接続されていることを示している。
この機能的な結合と時間経過のモニタリング能力を確認するため、ニューロンのナトリウム チャンネルを遮断するテトロドトキシン（TTX）を、MEAのマイクロ流路から注入した。TTX注入直後、オルガノイドの神経活動は劇的に停止し（補足図27d、27g）、それに伴い、ニューロン間の強固な相互結合も消滅した（補足図27h、補足表5）。このように、我々の多機能 MEA システムは、3D オルガノイドにも容易に適用でき、オルガノイド内の神経活動をモニターし、調節できることを明らかにした。さらに、患者由来のオルガノイドを用いた医薬品候補物質の安全性と有効性の評価にも応用できる。
考 察
2Dや3D MEAなどの既存の神経学的ツールでは、高密度の電極配列による正確な変調能力が、in vitroの3D神経組織の開発における神経回路のダイナミクスを解析するための大きな障壁となっていた。この障壁を克服するために、我々は、3次元培養、日々の記録、局所刺激の機能を同時に持ち、インキュベーター内に統合された小型システムを開発した。具体的には、高密度・大規模電気記録機能、3次元ボリューム、局所光学刺激、ドラッグデリバリー機能など、in vitroの人工3次元神経組織における神経活動の精密解析と変調に不可欠な機能を備えた3次元高密度多機能MEAシステムを発表しました。3次元シャンクアレイ構造上に高密度微小電極を設置することで、2週間の培養期間中にリアルタイムに記録を行い、in vitroにおける神経細胞同士の結合で形成される神経ネットワークの動態を調べることができました。また、光刺激と化学刺激機能は、単一グループと2つのコンパートメント化された神経群の両方において、ニューロン間の機能的結合性を統合的に検証するツールとして機能した。特に、大脳皮質ニューロンの2つの異なる集団がin vitroで機能ネットワークを形成する3次元神経組織内で、シナプス遅延とそれに対応するシナプス伝達速度を測定することができたことは特筆に値する。また、私たちの3D多機能MEAを挿入した3D神経組織をin vitroで作製すれば、神経細胞間受容体アゴニストやアンタゴニストなどの様々な生化学的因子をマイクロ流路を通して同時に供給し、シナプス活動をリアルタイムに解析するなど、神経ネットワークに対する薬理介入の効果を研究する強力なツールセットとして機能することが期待できます。これらの実現技術により、より複雑な神経回路のモデルを再構築し、ヒト疾患モデルのin vitro開発を強化することが可能となる。
我々は、従来の2次元多機能MEA26では不可能であった、人工3次元神経組織における3次元神経回路動態をin vitroで調べることを主目的として、3次元多機能MEAを開発しました。スタッキング法35を応用して実装した3次元高密度電極アレイにより、3次元神経組織全体における神経細胞間の機能的結合を正確にマッピングすることが可能となりました。また、電極に白金黒鉛を電気メッキすることで、従来のデバイス26に比べて記録性能を向上させた36。さらに、光刺激用の小型LEDを内蔵することで、外部光源を排除し、インキュベーター内での使用を可能とした。さらに、2光子顕微鏡システムも、神経活動を3次元的に選択的に変調して測定するのに有用なツールである61。しかし、このシステムは、3次元in vitroモデルに適用するために、別途インキュベーションシステムを必要とする比較的複雑な構成となっている。また、時間分解能が低い（30fps）だけでなく、レンズを通して画像を取得するため、240 × 240 × 300 μm3 という限られた視野しかカバーできず、本システムの測定可能体積（1850 × 1000 × 300 μm3）と比べてわずか3%に過ぎない。このように、我々の3D多機能MEAシステムは、これまでに報告されているシステムよりも、in vitroの3D神経ネットワークの機能性を調べるために有利な特徴を示しています。
また、3D in vitroモデルの大きさにもよりますが、少なくとも当社の3D MEAの記録用シャンクアレイは、システムをさらに複雑化することなく容易にスケールアップすることが可能です。しかし、シャンクの多機能化は、システム全体を複雑化させ、技術的なハードルにもなり得ます。例えば、LED結合ファイバを各シャンクに組み込むには、複数の光学インターフェースが必要になります。また、複数のポンプとチューブをプローブシャンクに統合して独立した薬物送達を行うには、煩雑な流体インターフェースが必要です。これらの制限は、各シャンクにμLED62,63を取り付け、アクティブバルブ64,65を適用してデバイス上で流体制御することで克服することが可能である。さらに、ニューロテクノロジーの進歩に伴い、本システムは、いくつかの機能を追加することで、さらに改善できる可能性がある。例えば、同じ体積の人工神経組織内にある微小電極の数を増やせば、軸索活動電位の伝播のような、より高度な観察が可能になる66。また、すべてのシャンクの先端に光源アレイを組み込むことで、より複雑なin vitroの回路研究が可能になる。さらに、相補型金属酸化膜半導体（CMOS）ベースの微小電極アレイ67やモノリシックμLEDアレイ68を我々の3D MEA構成に統合すれば、in vitroの3D脳モデルへの有用な適用範囲が広がる。
最後に、本システムは、従来の2次元多機能MEA26と同様に、in vivoでの様々な神経回路の機能マッピングに容易に適用することができる。この3次元MEAを生体内に応用することで、3つ以上の脳領域間の複雑な機能的結合を調べることが可能になります。さらに、我々の3D MEAシステムとクリアリング法などの高度な3Dボリュームイメージング技術により、構造的ネットワークと機能的ネットワークの相関を解析することで、3D神経モデルから幅広い神経細胞情報を導き出すことができる69。以上より、我々の3次元多機能MEAは、in vivoを含む3次元神経モデルにおいて機能的な神経細胞ネットワークを調べることにより、神経回路研究の可能性を開くことが期待される。
メソッド
3次元多機能MEAの作製とパッケージング
3次元多機能MEAの作製は主に3つのステップに分けられる。(1)マイクロエレクトロメカニカルシステム（MEMS）プロセスにより、マイクロ流路と一体化した3つの2次元多機能MEAを作製、(2)2次元MEAを積層して3次元多機能MEAを構築、(3)電気・流動・光学インターフェースを形成することです。
まず、先に開発した作製プロセス34により、マイクロ流路と一体化した2次元多機能MEAを作製した。40μm厚のトップシリコンを持つ4インチSOIウェーハに、深堀り反応性イオンエッチング（DRIE）により側面（高さ25μm、幅25μm）および中央（高さ25μm、幅10μm）のキャビティを形成した。真空中でキャビティ付きSOIウェハを厚さ500μmのホウケイ酸ガラスウェハ（Borofloat®33、ショット社）に陽極接合した。その後，RTA（KVR-4000，Korea Vacuum Tech, Ltd.）を用い，750 ℃，90 分間のリフローを行い，キャビティを部分的に埋め，埋め込みガラス層の下にマイクロ流路を作製することができた．リフロー後、CMPにより不要なガラスを除去した。次に、厚さ400 nmの第1パッシベーション層（SiO2）を形成した。次に、20nm厚のチタン（Ti）層、300nm厚の金（Au）層を順次成膜し、信号線形成のためのパターニング、エッチングを行った。その後、第2パッシベーション層（SiO2）を成膜し、反応性イオンエッチング（RIE）により微細電極部を開口した。電極部分は、20 nm厚のTi層と150 nm厚のPt層を蒸着し、その後リフトオフプロセスによりTiとPtを選択的にパターンニングした。2次元MEAの形状にトップSi層をパターニングした後、DRIEにより裏面から構造体を放出した。
次に、2次元MEAを積層・接着することにより、3次元多機能MEAを形成した。各2次元MEAは、十分な接合マージンを確保するために本体サイズを変えて設計した。例えば、底面の1層目MEAの本体幅は2層目MEAのそれよりも3mm広くした。2層目のMEAは、顕微鏡下で速硬化エポキシを用いて底面の1層目のMEAの上に手作業で接着させた。同様に、3層目も2層目に接着した。
最後に、作製した3次元多機能MEAをパッケージ化し、流体、電気、光学の各インターフェースを提供した。まず、MEAの注入口とドラッグデリバリーシステムをつなぐ流体インターフェースとして、PDMSマイクロ流体チップを作製した。エラストマー基材と硬化剤を10：1の重量比で脱気した混合物を，流体経路をパターン化した底面を有する金型に流し込み，80℃で1時間硬化させた後，プラズマ発生器（Covance-MP， Femto Science）を用いて酸素プラズマにより，剥離したPDMSチップを3次元MEA本体に接着させた．次に、マイクロドライブシステムとの電気的・機械的接続のために、3D MEAをカスタムPCB上に速硬化エポキシで接着した。3次元MEA本体の電気パッドはカスタムPCB上のパッドにワイヤーボンディングし、3次元MEAとインタン記録システム（RHD 64-Channel Recording Headstages付RHD USBインターフェースボード、インタンテクノロジー社製）間の電気接続には2つのFPC（フレキシブルプリント回路）コネクターをハンダ付けした。直径50μmのコアと直径125μmのクラッド層を持つマルチモード光ファイバー（GIF50、Thorlabs社）を49％[w/w]フッ酸（HF）溶液で直径約60μmに細径化した。この細径化した光ファイバーを、顕微鏡下でマイクロ流路を埋め込んだシャンク上に位置合わせを行った。光ファイバーをシャンク上に位置合わせした後，紫外線硬化型エポキシ（NOA 148, Norland Products, Inc.）を使用して光ファイバーを固定した。インキュベーター内で光刺激を与えるため，ファイバー先端に小型青色LED（XQ-E High Intensity LED, Cree, Inc.）を結合し，反射率整合材としてUV硬化型エポキシを用いて光ファイバーとLEDの隙間を充填した。次に、LEDから漏れる光を遮断するために、紫外線硬化型エポキシの上に黒色インクを塗布した。最後に，ボンディングワイヤーを保護するために，生体適合性エポキシ（EPO-TEK 320，エポキシテクノロジー社）を3D MEAの胴体部に塗布した。
3次元多機能MEAの特性評価
白金電極に白金黒を電着して有効表面積を増加させるため、3%[w/v] ヘキサクロロ白金酸水和物（HCPA）、0.025 N HCl、および 0.025%[w/v] 酢酸鉛を脱イオン水で混合したものを電着液36として使用し、これに3D MEAとPtワイヤー、およびAg/AgCl ワイヤーを浸けて、電着させた。3 つの電極構成（すなわち、作用電極（WE）。63 本の Pt 微小電極、対向電極 (CE)。参照電極(RE):Ag/AgClワイヤ）を用い、ポテンショスタット（PalmSens3, PalmSens）を用いて電位（CEからWEまで0.2V、35秒）を印加することにより、3次元MEAのPt電極上に選択的にPtブラック粒子を電気メッキすることができました。
電気めっき後、我々は以前に報告された測定セットアップによって3D多機能MEAの機能特性を評価した26。簡単に説明すると、PtおよびPt-black微小電極のインピーダンスを測定するために、飽和カロメル電極（CHI 151, CH Instruments, Inc）を用いて1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で電気化学インピーダンス分光法（EIS）を実施した。インピーダンスアナライザー（nanoZ、Neuralynx）を用いて、63個の微小電極のインピーダンスを周波数掃引モード（10Hz〜10kHz）で測定した。
高速応答を得るために，圧力駆動のドラッグデリバリーシステムを使用した．3次元MEAの埋め込みマイクロ流路を流れる流量を測定するために、3次元MEA上の界面PDMSチップをタイゴンチューブ（ID: 0.5 mm, OD: 1.5 mm; S-54-HL) と23ゲージ針を通してマスフローコントローラ（MFC、National Instruments）に接続しました。入力圧を精密に調整するために、窒素タンクから電空レギュレーター（ITV0051-2BL, SMC Pneumatics）を接続した。3種類の環境（空気、0.25% [w/v] 神経細胞播種コラーゲン、0.25% [w/v] 無細胞コラーゲン）の3D MEAのマイクロ流路から1×PBSを注入し、チューブ内の液体の移動距離を測定した。
3次元MEA上のファイバー端から出力される光パワーを測定するために、光パワーメーター（1936-R、Newport, Inc.）と結合した光検出器（918D、Newport, Inc.）を使用した。ファイバーの先端を光検出器の近くに置き、LEDを点灯させたまま出力パワーを測定した。測定された電力の変動は±0.002mW以内であった。モンテカルロシミュレーションを用いて、ファイバーから透過する光の分布をプロファイリングした39,40。コラーゲン足場は、ドメインサイズ383×250×120（ボクセルのマトリックス）、ボクセルサイズ0.3×0.3×0.3mm3でシミュレートした。吸収係数0.3（1・mm-1）、散乱係数29（1・mm-1）、異方性0.89、反射率1.34を適用した。光源はボクセル(83, 83, 0のマトリックス)に配置し、光角は21.9°であった。光源は473nmで0.15mWに相当する3.7×1011photons・ms-1を発射した。
3次元多機能MEAシステムの構成
成長中の3次元神経回路網モデルの神経活動をインキュベータで計測するために、小型化したキュービクルを考案した。小型化したインキュベータ構造は、(1)特注マイクロドライブ、(2)ウェル付きPDMS培養チャンバ、(3)アクリル筐体から構成されています。マイクロドライブは機械加工により製作され、可動部と支持部で構成されている。また、CO2インキュベーター内での腐食を防ぐため、全体はステンレス鋼で構成された。特注のマイクロドライブは、可動部と支持部の両方を備えている。可動部には、3次元MEAを固定するための1mmの穴が2つ開いた可動子（31×5×10mm3）、可動子の高さを制御するための20×1.5mmのネジが中央にあり、左右に2つの支持円筒が配置されていた。可動子の最大作動距離は20mmで、ネジの1回転で0.3mmの上下動が可能であった。支持部は可動部を強固に固定し、培養チャンバーを3次元MEAと一体化させるために使用された。培養チャンバーは PDMS 製で、培養容積は 2.5 × 1.5 × 0.5 mm3、全体の大きさは 20 × 20 × 10 mm3 であった。培養チャンバーは顕微鏡上で水平にアライメントする際に3次元MEAの下に配置し、その後、未硬化のPDMSで接着した。この工程は、3D MEAを区画された培養領域内に位置させるために不可欠であった。具体的には、体細胞領域と神経細胞領域という2つの領域ごとに6本のシャンクをPETフィルムで分離して配置しました。そして、顕微鏡上にカスタム構造のリニアアクチュエータ（M-561D, Newport）を用いてチャンバーをX軸、Y軸方向に押し、PDMSチャンバーの位置を50μm以上の分解能で精密に制御した。また、3次元ニューラルネットワークモデルにおける3次元MEAの高さを精密に制御するために、顕微鏡下でカスタムマイクロドライブを用いてMEAを培養チャンバーの底面に接触してわずかに曲がるまで下げた。その後、MEA が完全にまっすぐになるまでゆっくりと上昇させました。その結果、3D MEAの先端は培養槽の底面に接触していた。アクリル製の筐体（10 × 8 × 8 cm3）は培養液の蒸発やコンタミネーションを防ぎ、カスタムマイクロドライブを培養室と 3D MEA と一緒に収納できる大きさであった。上下の穴は、それぞれFPCBケーブルの挿入とマイクロドライブの固定に使用された。O2、CO2供給用の穴（直径1mm）を筐体の各面に2つずつ開けた。
コラーゲンミクロフィブリルの染色
コラーゲン負荷前後に3D MEAを挿入した際のコラーゲンミクロフィブリルの分布を観察するため、既報13と同様に5-（アンド）-カルボキシテトラメチルローダミン スクシンイミジルエステル（TAMRA；Invitrogen）でコラーゲンミクロフィブリルの染色を行った。簡単に言うと、5μMのTAMRAを1×PBSに混合し、培養チャンバーに塗布した。室温で1時間インキュベートした後、培養チャンバーを1×PBSで3回リンスした。共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM 800, Carl Zeiss）で、3D MEAのシャンク付近の染色したコラーゲンミクロフィブリルを観察し、zスタック画像（スタックサイズ：25μm、ステップサイズ：1μm）を観察した。
3次元神経回路網の2種類のモデルの作製
妊娠中のSprague Dawley（SD）ラット（embryo 18; E18）を購入し（株式会社DBL）、3次元神経培養のために生け贄とした。ラットの一次皮質ニューロンの採取は、以前に報告されたプロトコル13に従った。簡単に説明すると，妊娠したSDラットの胚を断頭し，大脳皮質を解剖して取り出した．抽出した大脳組織をパパイン溶液で処理し、細胞を解離させた。次に，解離した細胞を計数し，コラーゲンへの所望の播種密度に必要な細胞懸濁液の量を算出した．次に、0.5 mL のコラーゲン溶液（2.5 mg・mL-1）をアイスペール内に調製した。具体的には、コラーゲンストック（354249、Collagen type I rat tail high concentration, 9.40 mg⋅mL-1, CORNING）133μLを1.5mLマイクロチューブに移し、10×Dulbecco Modified Eagle Medium（DMEM; Sigma-Aldrich） 50μLおよび1×DMEM 207μLを順次加え、十分に混合した後に化合物を添加した。無細胞コラーゲンは、1×DMEMを307μL添加した。その後、0.5N NaOHを10μL加えて中和、すなわちpHを〜7にした。生体内と同様の細胞密度4×107個・mL-1となるように細胞懸濁液を100μL加え、穏やかに攪拌した41。1群3次元神経回路網モデルの場合、ニューロン播種したコラーゲンを細胞培養ウェルにロードし、37℃のCO2インキュベーター内で30分間完全にゲル化させた。2群3次元神経回路網モデルでは、厚さ125μmのポリエステル（PET）フィルム2枚を細胞培養領域の溝に挿入し、3つの一時的なコンパートメントを作成した。中央のコンパートメントに無細胞コラーゲンを投入し、37 ℃のCO2インキュベーター内で20分間部分的にゲル化させた。次に、神経細胞を播種したコラーゲンを側面のコンパートメントに装填し、CO2インキュベーター内で37 °C、20分間ゲル化させた。最後に，PETフィルムを慎重に剥がし，2% [v/v] B27 Plus supplement (Invitrogen), 2 mM Glutamax-I (GIBCO) および 1% [v/v] Penicillin-Sreptomycin (P/S; GIBCO) を添加したニューロベースプラス培地からなる培養液 1.5 mLを細胞培養チャンバー内に適用した．感染していない細胞培養では、2日後に培地の半分を新鮮な培地に交換した（図2-3および補足図9-15）。その後、細胞に十分な栄養を供給するために、毎日、培地を新鮮な培地に完全に交換した。ChR2感染培養（図4-7および補足図16-26）については、1日後に培地を、5μLのAAV-EF1α-hChR2（H134R）-eGFPウイルス（1.25×1012 GC⋅mL-1, KIST Virus Facility）を含む新しい培地に完全に置き換えた。さらに2日後、培地の半分を新鮮な培地に交換した。その後、細胞に十分な栄養を供給するために、毎日、培地をすべて新鮮な培地に交換した。DIV6およびDIV14でChR2感染神経細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM 800, Carl Zeiss）で観察し、緑色蛍光を発し、zスタック画像を取得した（スタックサイズ：25μm、ステップサイズ：1μm）。
本研究では、栄養供給不足により14日目以降に細胞死が観察され始めたため、成熟度に応じた神経細胞間の結合性の変化を観察するために14日間まで培養を行った。他の典型的な 3 次元 in vitro 神経モデル13,15,22,23 よりも高い細胞播種密度と、胚性脳から初代ニューロンを分離する際に含まれるごく一部の非神経細胞（グリアなど）の継続的増殖の両方のため、14 日以降は栄養を十分に供給するために培養液をより頻繁に変える必要がありました。我々は、最長14日間の3次元培養がシナプス形成に十分であったことに注目している。しかし、既報のように、コラーゲン中での細胞播種密度を 28-60 日間下げることにより、培養期間をより長くすることが可能である13。
ヒト脊髄オルガノイドの作製
ヒト脊髄オルガノイド（hSCO）の作製は、以前に記載したプロトコールに従って行った70。簡単に言えば、hiPSCコロニーをSB431542（10μM、TOCRIS、1614）およびCHIR99021（3μM、SIGMA、SML1046）で3日間処理し、尾神経幹細胞を誘導した71。化学処理3日目にコロニーをディッシュから静かに剥離し、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）添加培地で4日間、神経スフェロイドを形成させた。その後、神経スフェロイドは、bFGFを含まないレチノイン酸（RA）含有培地でさらに8日間培養した。その後、成熟培地（DMEM/F-12 と neurobasal medium (Life Technologies, 21103-049) の 1:1 混合培地、培地には 0.5% N2, 2% B27, 0.5% NEAA, 1% P/S, 0.1% β-mercaptoethanol, 1% GlutaMAX (Life Technologies, 35050-061) および 0.1 μM RA が含まれる）において神経スフェロイドから脊髄様オルガネオー ドを順次成熟化させた。
生細胞/死細胞生存率アッセイ
DIV14の単群3次元神経モデルのサンプルから、細胞生存率を評価した。試料を、0.5μg・mL-1カルセイン-アセトキシメチル（カルセイン-AM；Sigma-Aldrich）および2μg・mL-1ヨウ化プロピジウム（PI；Sigma-Aldrich）を含む1×PBSに、37℃のCO2インキュベーター内で30分間浸漬させた。1×PBS で3回、各回30分間洗浄した後、共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM 800, Carl Zeiss）で生細胞（緑蛍光）と死細胞（赤蛍光）を有するz-stacked画像（スタックサイズ：50μm、ステップサイズ：1μm）を取得した。
免疫蛍光染色とイメージング
DIV3、6、14における1群および2群3次元神経ネットワークモデルの構造的連結性を可視化するため、ニューロン特異的クラスIIIβチューブリン（マウス抗Tuj-1、1：200、T8678、Sigma-Aldrich）抗体で神経細胞を、グリア線維酸性タンパク質（チキン抗GFAP、1：200、AB5541、Sigma-Aldrich）抗体でアストロサイトの染色を実施した。まず，1×PBS中4％[w/v]パラホルムアルデヒド（PFA）中で室温，シェーカーで4時間固定した．1×PBS で5回、それぞれ30分間洗浄した後、0.1% [v/v] Triton X-100 と3% [w/v] Bovine serum albumin (BSA) in 1×PBS のブロッキング溶液で24時間4℃、シェイカー上でブロッキングをした。1×PBS で3回、それぞれ30分間洗浄した後、ブロッキング液中の一次抗体（Tuj-1、GFAP）と共に48時間、4 ℃、シェーカー上でインキュベートした。1×PBS で5回、それぞれ30分間洗浄後、ブロッキング液中で2次抗体（ヤギ抗マウス結合Alexa Fluor 488, 1:200, A-11001, Invitrogen; ヤギ抗ニワトリ結合Alexa Fluor 647, 1:200, ab150171, Abcam）とともにシェーカー上で4℃にて24時間インキュベーションした。1×PBS で5回、それぞれ30分間洗浄した後、4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:1000, D1306, Invitrogen) と共にブロッキング液中で6時間、室温、シェーカーでインキュベートした。最後に，1×PBSで5回，それぞれ30分間洗浄した後，スライドグラスにマウントした。蛍光画像は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（LSM 800, Carl Zeiss）の20倍の対物レンズを通して取得した。2群3次元ニューラルネットワークモデルの3次元画像は、z-stacked（スタックサイズ：75μm、ステップサイズ：1μm）およびタイルスキャンした画像をレンダリングすることにより取得した。
ヒト由来脊髄オルガノイドの神経細胞および非神経細胞集団を可視化するために、オルガノイドを1×PBS中4％[w/v] PFAで4℃、一晩振盪機で固定した。1×PBS で 5 回、それぞれ 10 分間洗浄した後、固定したオルガノイドを 1×PBS 中の 30% [w/v] ショ糖で、4℃、シェーカー上でインキュベートした。ドライアイス上で凍結後、各オルガノイドを40μmの厚さに切開した。スライスしたオルガノイドを 0.2% [v/v] Triton X-100 と 3% [w/v] BSA in 1×PBS を含むブロッキング溶液中で室温、1 時間、シェーカー上でインキュベートした。次に、スライスしたオルガノイドを、ブロッキング溶液中の以下の一次抗体とともに、4℃、シェーカー上で一晩インキュベートした。NeuN（ウサギ抗NeuN、1：1000、ABN78、Millipore）、微小管関連タンパク質2（MAP2；鶏抗MAP2、1：5000、AB5543、Millipore）、ニューロフィラメント-m（NF-M；マウス抗NF-M、1：250、2H3、DSHB）およびアストロサイトとグリア線維性酸性タンパク質（GFAP；ラット抗GFAP、1：500、13-0300、Invitrogen）。1×PBS で 5 回、それぞれ 10 分間洗浄した後、一次抗体を結合したオルガノイドを、ブロッキング溶液中で以下の二次抗体とともに、シェーカー上で室温で 30 分間インキュベートした：ロバ抗ラビット結合 Cy3、1:500, 711-165-152, Jackson; donkey anti-chicken conjugated Alexa Fluor 488, 1:500, 703-545-155, Jackson; donkey anti-mouse conjugated Alexa Fluor 488, 1:500, A21202, Invitrogen; donkey anti-rat conjugated Cy3, 1:500, 712-166-150, Jackson.5×PBSで洗浄後、1:500, 1:500,712-166-150,ジャクソン.を添加した。1×PBS で5回、それぞれ10分間洗浄した後、二次抗体結合オルガノイドを、ブロッキング溶液中の Hoechest33342 (1:1000) とともに、室温で30分間、シェーカー上でインキュベートもした。最後に、1×PBSで5回、それぞれ10分間洗浄した後、免疫染色したオルガノイドをスライドグラスにマウントした。蛍光画像は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（TCS SP8、Leica）の25倍の対物レンズを通して取得した。
電気生理
神経細胞は培地交換後数時間発火を停止することが多いため、1群および2群の3次元神経回路網モデルから毎日神経活動を測定し、新しい培地に交換する直前に測定した。神経活動は毎日10分間記録し、自発的な活動（最初の5分間）と局所的な光刺激による活性化信号（次の5分間）を記録した。電気生理学的記録はすべて37℃のCO2インキュベーター内で、RHD 64チャンネル記録ヘッドステージを備えたRHD USBインターフェースボードを介して行った。記録された信号はIntan USBインターフェースボードのソフトウェア（チャンネルあたり20 kS⋅s-1, 300 Hzハイパスフィルター、6 kHzローパスフィルター）によりフィルター処理され、デジタル化された。3次元神経モデルへの光刺激には、スライドスイッチで刺激周期とパルス幅を調節するカスタム設計のLEDドライブを使用しました。このLEDドライブは、3D MEAの刺激ピンに細い電線で接続し、LED結合ファイバで光を伝送するとともに、RHD USBインターフェースボードのデジタル入力ポートに接続して刺激時間の読み取りを行いました。刺激周波数は0.2Hz、パルス幅は2.5秒、デューティーサイクルは50%であった。3次元神経モデルへの化学刺激には、圧力駆動型ドラッグデリバリーシステム、USB給電型小型電源（Analog Discovery 2, Digilent, Inc.）、11.1Vリチウムポリマー電池を使用しました。小型電源と電池は，圧力駆動型ドラッグデリバリーシステムの電空レギュレータに接続し，圧力制御と電力供給を行った．また，小型電源はRHD USBインターフェースボードのデジタル入力ポートに接続し，注入時間の読み取りを行った．以上の設定により、3D MEAのマイクロ流路から3D神経培養に薬剤を注入しました。図4では、光刺激による神経細胞の反応を観察した後、20μM CNQX（0190、Tocris Bioscience）と50μM AP5（0106、Tocris Bioscience）を混合した培養液1μLを0.25μL min-1の流速で4分間注入しました。インキュベーター内でCNQX/AP5をさらに十分に拡散させた後、30分間、光刺激による神経信号の記録を再開し、神経活動の変化を観察した。そして、培養室内に残ったCNQX/AP5を除去するために、ヒュームフード内で3回、培養液を全て新鮮な培地に交換した。さらに、神経細胞を安定化させるために1時間待機した。CNQX/AP5を除去した後、光刺激による神経信号の記録を繰り返し、神経活動の回復を観察した。
ヒト由来脊髄オルガノイドの神経活動を観察するため、マイクロドライブの底板に溝（直径1mm、高さ0.3mm）のあるカスタマイズPDMSチャンバー（直径30mm、高さ10mm）を固定した。顕微鏡下で成熟した（3ヶ月齢）オルガノイドを溝に設置した後、マイクロドライブを用いてMEAをオルガノイドにゆっくりと挿入した。正しく挿入された後、マイクロドライブをアクリル製の筐体に固定し、インキュベーター内でオルガノイドの神経活動を測定した。3分間自発活動を測定した後、マイクロ流路から6μMのTTXを0.25μL min-1の流速で3分間注入し、神経活動を抑制した。TTX注入後、さらに3分間神経活動を測定し、時間発展を観察した。
信号の解析
神経スパイクの検出には、既報の MATLAB Spike-sorting algorithm26 を用いた。ピーク振幅の平均値を背景ノイズの標準偏差で割ってSNR（信号対ノイズ比）を算出した。そして、ノイズのレベルの3倍（約50μV）を超える振幅の閾値を設定し、神経信号データを抽出した。各信号は、ラスタープロット、カラーマップ付きラスタープロット、2D/3D電極マップに表示した。また、各信号をカウントし、バープロットで表示した。バースト活動は、ISIN-threshold法73を用いて、ISI閾値を0.1秒、バーストあたりのスパイクの最小数を3として解析した。すべての統計解析は、GraphPad Prismを用いてStudentのt-検定により評価した。
電極とネットワーク間の同期スコアを、既報の方法に基づいて解析した32。電極間の同期性はPyspikeを用いて解析した。簡単に説明すると、2つの電極からのスパイクが一致するほど、同期スコアは1に近くなり、高い同期性を表す。逆に、2つの電極からのスパイクの不一致が大きいほど、同期スコアは0に近くなり、高度な非同期性を表す。神経細胞間のコミュニティを可視化するために、カスタムコードを用いてLouvainアルゴリズムにより電極間のネットワークを表現した。電極をノード（例：ネットワークマップの円）とし、電極間の同期の度合いをエッジ（例：ネットワークマップの線）として設定した。ノードの位置は実際の電極の位置と一致させた。また、同期のスコアが0.5未満のリンクはフィルタリングで除外した。同じ色（＝電極）のノードは同じコミュニティネットワークを表していた。カラーマップされた同期スコアは0（青）から1（赤）までの範囲であった。また、接続された電極の数が大きくなるほど、ノードのサイズも大きくなる。
倫理的記述
ヒト由来多能性幹細胞（PSC）関連実験を除くすべての手順は、韓国科学技術院動物愛護委員会が承認した動物愛護ガイドラインに従って実施された。ヒト多能性幹細胞に関する実験は、高麗大学校の機関審査委員会により承認された。
統計解析
すべての統計解析は、MATLAB (Math Works), Python (Python Software Foundation), または GraphPad Prism (GraphPad Software) を用いて、Studentのt-testで行った。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryをご覧ください。
データの入手方法
著者らは、この研究の結果を裏付けるすべてのデータが、論文およびその補足情報ファイル内で、または妥当な要求があれば対応する著者から入手可能であることを宣言する。ソースデータは本論文に添付されています。
コードの入手方法
本研究のデータ解析は、主にPython 3.7とオープンソースパッケージのPy spikeとpython-louvainを用いて行いました。これらはhttps://github.com/mariomulansky/PySpike/ とhttps://github.com/taynaud/python-louvain/ で公開されています。3Dネットワークマップの可視化に使用したカスタムコードは、https://github.com/Hyogeun-Shin/Visualization-of-3D-network-map/tree/v1.0.0 (https://doi.org/10.5281/zenodo.4306072) で自由に利用できます。
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謝 辞
本研究は、韓国政府（MSIT）が出資する国家研究財団（NRF）の脳融合研究プログラム（NRF-2019M3E5D2A01063814）、韓国政府（MSIT）が出資する国家研究財団（NRF）のバイオ・医療技術開発プログラム（NRF-2017M3A9B3061319）によって支援されたものです。the Brain Research Program of the National Research Foundation (NRF) funded by Korean government (MSIT) (NRF-2017M3C7A1028854), and Korea Institute of Science and Technology (KIST) intramural grant (2E30080, MI)．
著者情報
著者および所属
韓国科学技術院（KIST）脳科学研究所バイオマイクロシステムズセンター、韓国、ソウル市
Hyogeun Shin、Sohyeon Jeong、Nakwon Choi & Il-Joo Cho
韓国科学技術大学(UST)KISTスクール バイオメディカル科学技術部
Hyogeun Shin、Sohyeon Jeong、Nakwon Choi、Il-Joo Cho
高麗大学校医科大学解剖学教室（韓国・ソウル
Lee Ju-Hyun & Woong Sun（イ・ジュヒョン＆ソン・ウオン
高麗大学校KU-KIST融合科学技術大学院（韓国・ソウル
チェ・ナクウォン
延世大学校電気電子工学部（韓国・ソウル
趙 一柱
韓国・延世大学・Yonsei-KISTコンバージェンス研究所
Cho Il-Joo
貢献度
H.S.は実験のほとんどを行い、データを解析し、図を作成し、原稿を書いた。S.J.は、in vitro実験の準備に携わった。J.-H.L.はオルガノイドを作製した。W.S.、N.C.、I.-J.C.は、結果について議論し、コメントを提供し、原稿の一部を執筆した。著者全員が原稿に目を通した。
対応する著者
Nakwon ChoiまたはIl-Joo Choにご連絡ください。
倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利益を宣言していない。
追加情報
査読情報 Nature Communicationsは、Luca Berdondini氏、Nicholas Fischer氏、およびその他の匿名査読者の方々による本論文の査読に感謝します。
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図および所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。
補足情報
補足情報、補足動画、要約
権利と許可
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