【論文を読む-2】：Comprehensive profiling and characterization of chemical constituents of rhizome of Anemarrhena asphodeloides Bge.
→ハナスゲの含有化合物のプロファイル。参考文献として使いたい(主に表1)。
Abstract
Anemarrhena asphodeloides Bge.の根茎は、中国で一般的に漢方薬として使用されている。本研究では、超高速液体クロマトグラフィーと四重極飛行時間型質量分析計（UHPLC-QTOF-MS）を用いて、アスフォデロイデスの化学成分を包括的に分析した。インタクトな前駆体イオン、MS/MS フラグメンテーション情報、および過去の報告から、89 種類の化合物を同定した。その内訳は、環状ペプチド8種、フラボン11種（キサントン9種）、ステロイドサポニン45種、脂肪酸15種、リグナン3種、その他7種であった。二量体キサントンと環状ペプチドはA. asphodeloidesから初めて報告された。我々が開発した分析法はシンプルで信頼性が高く、効果的である。この結果はハナスゲの代謝物プロファイルに関する包括的な情報を提供し、ハナスゲの品質管理やさらなる利用に役立つと考えられる。
Introduction
漢方薬は、有機化学物質の複雑で特殊な混合物を含み、治療用や栄養補助食品として人気が高まっている。ユリ科に属するAnemarrhena asphodeloides Bge.は、中国、モンゴル、その他の東洋諸国に広く分布する多年草である。ハナスゲの根茎は、何千年もの間、伝統的な漢方薬として熱性疾患、発熱、咳、糖尿病の治療に用いられてきた。また、抗認知症、抗うつ、血糖値低下、抗炎症、血小板凝集抑制、抗酸化作用などの薬理効果も報告されている。
ハナスゲから単離された化合物には、ステロイドサポニン、フラボノイド、リグナン、多糖類などがある。チモサポニンBIIやAIIIなどのステロイドサポニンは、ハナスゲに高濃度で含まれ、薬理学的特性を示すことが報告されている。これには、インスリン抵抗性の改善や老人性痴呆の改善に加え、心臓保護作用、抗腫瘍作用、抗骨粗鬆症作用などが含まれる。ハナスゲで確認されたフラボノイドのほとんどは、マンギフェリンやネオマンギフェリンなどのキサントンC-グリコシドである。マンギフェリンもまた、アルツハイマー病に作用し、抗炎症作用や抗糖尿病作用を示すハナスゲの主要な活性化合物であることが、これまでの研究で確認されている。これまで、ハナスゲの化学組成を特徴づけるために、いくつかの分析法が開発されてきた。しかし、ほとんどの研究者は、包括的な分析ではなく、ステロイドサポニンとキサントンの同定に焦点を当ててきた。周知のように、天然医薬品の最大の特徴は、複数のターゲットと相互作用する複数の化合物の協調的な薬理学的介入によって治療効果をもたらすことである。従って、生薬の有効成分を同定することは、生薬の品質管理や作用機序の解明にとって重要である。
近年、四重極飛行時間型タンデム質量分析計を用いた液体クロマトグラフィー（LC-QTOF-MS）は、複雑なマトリックスの成分を迅速に同定するための強力な手法であることが証明されている。本研究では、A. asphodeloidesの化学成分を同時に同定するために、簡便、迅速、高感度なUHPLC-QTOF-MS法を開発した。UHPLC-QTOF-MS実験から生成されたデータは、Peakviewソフトウェアにより、Formula Finder、XIC Manager、IDA Explorer機能を用いて解析した。本研究は、A. asphodeloidesの包括的な品質管理を容易にし、薬理学的活性に関する今後の研究の基礎を築くものである。
Experimental
Chemicals and reagents
マンギフェリンとチモサポニンBIIの真正標準品は、国家医薬生物製品管理研究所（中国、北京）から入手した。ネオマンギフェリン、チモサポニンE1、チモサポニンBIII、アネマーレナサポニンI、チモサポニンAIII、チモサポニンAII、チモサポニンAIは、成都Must Biotechnology Co. (Ltd.（中国、成都）から購入した。チモサポニンNは我々の研究室から単離し、MSおよびNMRにより構造を同定・確認した。
精製水はMilli-Q水精製システム（Millipore Corporation, Bedford, MA, USA）から入手した。アセトニトリル（LC/MSグレード）はE. Merck社（Merck, Darmstadt, Germany）から購入した。純度99%のギ酸（UHPLCグレード）は、Anaqua Chemical Supply（ACS、米国ヒューストン）から購入した。試料調製にはHPLCグレードのエタノール（Nanjing Chemical Reagent Factory, China）を使用した。
Preparation of plant extracts and reference solutions
ハナスゲの標本は中国内蒙古自治区什峰で採集された。バウチャー標本は南京中医薬大学のTu-lin Lu教授によって同定された。標本は南京中医薬大学薬学院に寄託された。
ハナスゲの乾燥ハーブを粉末にし、40番メッシュでふるいにかけた。正確に計量した粉末（約25 mg）をエタノール（50 mL; 70%(v/v)）で30分間超音波抽出した。抽出液を50mLのメスフラスコに移し、70％エタノールを加えて50mLにした。混合物を13 000 rpmで5分間遠心し、得られた上清を注入液とした。標準物質を70% (v/v) アセトニトリルに溶解し、100 μg/mLの濃度になるように加え、UHPLCQTOF-MSシステムに注入した。
Instrumentation and conditions
UHPLC 分離は、Shimadzu 30A UHPLC システム (島津製作所, 日本) で行った。分離は、Agilent Eclipse Plus-C18カラム（2.1 × 100 mm、1.8 μm）に、Agilent Eclipse Plus-C18ガードカラム（2.0 × 5 mm、1.8 μm）を先行させて行った。移動相は、溶媒A（0.1%ギ酸水溶液、v/v）と溶媒B（ACN）から構成された。最適化されたUHPLC溶出プログラムは、0-5分、5-18% B; 5-10分、18-25% B; 10-20分、25-50% B; 20-25分、50-100% B; 25-28分、100% Bであった。流速は0.3 mL/分、注入量は2 μLであった。
MS検出は、ESIソースを備えたTriple TOF™ 5600+（AB Sciex社、米国）ハイブリッドトリプルQ-TOF質量分析計で行った。MSは正イオンモードと負イオンモードの両方で作動させた。MS分析の操作パラメーターは以下の通り。イオンスプレー電圧は、負イオンモードと正イオンモードでそれぞれ4500Vと5500Vに設定した： 550 °C；デクラスター電位：60 V；衝突エネルギー：35±15 eV；ネブライザーガス（ガス1）： 55psi；ヒーターガス（ガス2）： 55psi、カーテンガス 35 psi。ネブライザーおよび補助ガスには窒素を使用した。TOF MSおよびTOF MS/MSは、それぞれ100-2000および50-1000のm/z範囲で実施した。TOF MSとTOF MS/MSの蓄積時間はそれぞれ200 msと80 msで行った。再キャリブレーションは3時間間隔で行った。さらに、ダイナミックバックグラウンドサブトラクションと情報依存の取得技術を使用して、マトリックス干渉の影響を軽減し、分析の効率を高めた。すべての操作と取得は、Analyst TF 1.6 ソフトウェア（AB Sciex、米国）を使用して制御された。化合物の同定にはPeakview 1.2 software (AB Sciex, USA)を使用した。
Results and discussion
Optimization of chromatographic separation and mass spectrometric detection
異なる抽出溶媒（30％、50％、70％、95％エタノール、30％アセトン、メタノール）、抽出方法（超音波抽出、還流抽出）、抽出時間（30分、1時間、2時間）をテストした。70%エタノールで30分間の超音波抽出を選択したのは、得られたサンプルが最短時間でより多くのクロマトグラフィーのピークを得たからである。より高い分離効率と目的化合物の十分なクロマトグラフィー分離能を得るため、移動相系やカラム温度などのクロマトグラフィー条件を最適化した。C-22ヒドロキシル部分を含むフロスタノールサポニンはメタノールと反応してC-22メトキシ基を形成する可能性があるため、移動相にはメタノールを使用しなかった[20]。グラジエント溶出には、アセトニトリルと0.1％（v/v）ギ酸水溶液の混合溶媒を30℃の温度で使用した。
フラグメントを可能な限り網羅的に分析するため、負イオンと正イオンのMSモードを評価した。その結果、負イオンモードの方が正イオンモードよりも感度が高く、ステロイド系サポニン、キサントン、脂肪酸のマススペクトルが明瞭であることが示された。これは、これらの化合物が酸性であるためと考えられる。正イオンモードは、負イオンモードと比較して、環状ペプチドに対する感度が高く、ステロイドサポニンのアグリコン型の構造同定に有益なフラグメントをより多く生成した。さらに、負イオンモードは正イオンモードよりもバックグラウンドノイズが低かった。プリカーサーイオンが適切にフラグメンテーションされるように、20, 35, 45, 60 eVのコリジョンエネルギーが用いられました。ESI+とESI-モードでは、それぞれ20、35、45eV、35、45、60eVの衝突エネルギーを選択しました。これらのエネルギーで化学構造を正確に決定するのに十分なフラグメントが得られたからです。さらに、イオンスプレー電圧、ターボスプレー温度、デクラスターポテンシャル、ネブライザーガス、ヒーターガス、カーテンガスをすべて最適化した。
Characterization and identification of the constituents of A. asphodeloides
UHPLC-ESI-Q-TOF-MSのネガティブイオンモードとポジティブイオンモードで得られたA. asphodeloides抽出物のトータルイオンクロマトグラム（TIC）を図1に示す。成分はよく分離され、溶出順序と市販の標準物質、文献に報告されている標準物質、およびChemSpider、HMDB、PubChem、MassBankなどの公開データベースのMSデータ（質量、同位体分布、フラグメンテーションパターン）によって同定された。環状ペプチド、フラボノイド、ステロイドサポニン、脂肪酸、リグナンを含む合計89化合物が同定または仮同定された。同定された化合物の保持時間とMSデータを表1(論文参照)に、化学構造を図2(論文参照)に示す。
Characterization of cyclic peptides
環状ペプチドは、ペプチド結合で結ばれたアミノ酸モノマーの短い鎖から形成される生物学的に存在する環状化合物である。細菌、植物、海洋生物に広く分布している。その多くは複数の生理活性を示す。
文献で報告されている参照マススペクトルおよびフラグメンテーションスペクトルに基づいて、合計8つの環状ペプチド（ピーク1、10、14、16、19、22、26、30）を同定した。環状ペプチドは、それぞれm/z 227.17528、340.26013、453.34309、566.42694、679.51098、792.17528、905.67767、1018.75153の[M+H]+イオンを生成した。各イオンの間隔は113 Daである。各ペプチドのフラグメンテーション挙動は類似していた。これら8つの化合物のMS/MSスペクトルでは、18 Da (H2O)と113 Da (ロイシルまたはイソロイシル)の特徴的な損失が観察された。文献からのデータを用いて，それぞれ2，3，4，5，6，7，8，9個のロイシル（またはイソロイシル）基を含む環状ペプチドであることが同定された。これらのペプチドはA. asphodeloidesで初めて報告された。MS/MS分析によるイオンフラグメンテーションスペクトルと、ピーク14のフラグメンテーションパターン（案）を図3に示す。
Characterization of flavonoids
フラボノイドは、これまでの植物化学的研究において、A. asphodeloidesの主な化学成分であると報告されている。本研究では、合計9つのキサントンC-グリコシド、1つのフラボンC-グリコシド、および1つのフラバノンが検出された。ピーク5と11は、基準標準物質を用いてネオマンギフェリンとマンギフェリンと明確に同定された。これらの種は、糖部分の交差環開裂により、[M-H-90]-および[M-H-120]-のようなフラボンC-グリコシドに特徴的な一連のイオンを生成した。マンギフェリンのフラグメンテーション機構をFig.4に示す。ピーク6はネオマンギフェリンと同じフラグメンテーションパターンを示し、ネオマンギフェリンの異性体と同定された。
ピーク12では、m/z 421.11329の[M-H]-イオンが得られ、マンギフェリンと同じ分子量、同様のフラグメントパターンを示した。この分子イオンは、MS/MSスペクトルにおいてm/z 331.0435、301.0369、271.0245、および259.0613のフラグメントイオンを生成し、90 Da、120 Da、150 Da、および162 Daの部分の損失に対応した。90Daおよび120Daの部分の損失は、C-グリコシドに特徴的であり、化合物12が1つのグルコース残基を有することを示した。したがって、化合物12はイソマンギフェリンと同定され、これはA. asphodeloidesで以前に報告されている。
ピーク8は、マンギフェリンの二量体であるマンギフェロキサントンAと同定された。m/z 841.14965で[M-H]-イオンを生成した。MS/MSスペクトルでは、これらの[M-H]-イオンは[M-H-H2O]+イオン、[M-H-90]-イオン、[M-H-120]-イオンを生じた。M-H-90-90]-イオン、[M-H-90-120]-イオン、[M-H-12120]-イオン、[M-H-422-90]-イオン、[M-H-422-120]-イオンは、ピーク8が二量体フラボンC-グリコシド構造であることを示した。さらに、152 Daの損失は環B上のretro-Diels-Alder(RDA)反応によるもので、これはC4-C7′結合を持つキサントンを示す。ピーク8のMS/MSスペクトルには、H2Oの損失によって生じたイオンも観察された。8のMS/MSスペクトルとフラグメンテーション経路を図5に示す。ピーク2-4および9はすべてm/z 843(841.14674, 841.14726, 841.14668, 841.14677)の[M-H]-イオンを生成した。これらのイオンは存在量が低いため、MS/MSスペクトルは観測できなかった。ピーク2-4および9は、マンギフェロキサントンAの異性体であると暫定的に同定された。
ピーク17はm/z 431.09729で[M-H]-イオンを示し、MS/MSスペクトルで最も顕著なイオンはm/z 341.0668と311.0565で、これは[M-H]-からC3H6O3 (90 Da)とC4H8O4 (120 Da)ユニットが消失したことを表している。これはC-アグリコシド部分の特徴的なフラグメンテーションである。ピーク17はフラボノイド配糖体；ビテキシンまたはイソビテキシン[25]と同定された。ピーク60はイソサクラネチンと同定され、これはA. asphodeloidesで以前に報告されている。ESI-スペクトルのm/z 165、119、ESI+スペクトルのm/z 167,152、124のフラグメントイオンは、レトロディールスアルダー（RDA）反応によるものである。
Characterization of steroidal saponins
ステロイド系サポニンはA. asphodeloidesの主要成分として同定され、アグリコンに基づいて6種類に分類された 。サポニンはまず、フロスタノールサポニンとスピロスタノールサポニンに分けられた。次に、C-2、C-15、C-22、C-26に結合している水酸基と糖部分の違いによって、この2つのグループを細分化した。ほとんどのフロスタノールサポニンは、C-3とC-26にオリゴ糖鎖で置換されたビデスモシドサポニンであった。スピロスタノールサポニンとマイナーフロスタノールサポニンはC-3にオリゴ糖鎖で置換されたモノデスモシドサポニンであった。オリゴ糖鎖の最も一般的な糖部位はD-ガラクトース、D-キシロース、D-グルコース、ラムノースであった。前駆体イオン、ESI-とESI+の両モードからのMS/MS情報、および参照物質との比較によって、サポニンを分類するのは簡単であった。6種類すべてのMS/MSスペクトルと参照物質のフラグメンテーションパターンを図6に示す。さらに、サポニンの保持時間は他の要因にも影響される。例えば、サポニン上に存在する糖残基や水酸基が多いほど、ODSカラムでの保持時間は短くなる。C5(6)またはC25(27)アグリコンに二重結合置換基がある場合、保持時間はわずかに短くなる。
Characterization of peaks 15, 20–21, 23–25, and 28–29
m/z433、289、271、253の特徴的なイオンは、ピーク15、21、23、25、28-29は、チモサポニンNと同じフラグメンテーション挙動を示すことを示している。化合物21と28は、MSスペクトルの保持時間とフラグメンテーションを対応する標準物質と比較することにより、チモサポニンNとチモサポニンE1と決定的に同定された。化合物15、23および29は、m/z 919で[M+HH2O]+イオンを示し、チモサポニンNまたはチモサポニンE1と同一のフラグメンテーションを示した。保持時間と文献報告に基づき、化合物15、23、29はそれぞれ、チモサポニンN、マクロステモノシドJ、25RチモサポニンE1の異性体と仮同定された。
ピーク25はESI-モードでm/z 1229.57513と1275.58071の[M-H]-イオンと[M+HCOO]-イオンを生成した。ESI+モードでは、ピーク25はm/z 1213.59202[M+H-H2O]+、1051.5290[M+H-H2O-162]+、919.4882[M+H-H2O-162-132]+、757.4350[M+H-H2O-2×162-132]+、595.3827[M+H-H2O-2×162-132]+のフラグメントイオンを生成した。 3827 [M+H-H2O-3×162-132]+, 433.3056 [M+H-H2O-4×162-132]+, 415.3279 [433-H2O]+, 289.2174 [433.3359-C8H16O2]+, 271.2100 [289.2174-H2O]+, and 253.1942 [289.2174-2×H2O]+. 25のフラグメンテーションと保持時間をチモサポニンNのフラグメンテーションと保持時間と比較すると、ピーク25の化合物に由来するヘキソシル残基とペントシル残基がさらに存在することが示された。従って、ピーク25はプルプレアギトシドまたはその異性体と暫定的に同定された。
ピーク20および24はチモサポニンNと類似のフラグメンテーションパターンを示したが、ピーク20ではm/z 431, 289, 271, 253に、ピーク24ではm/z 431, 287, 269, 251に、チモサポニンNとは異なる特徴的なイオンが観測された。47456であり、ピーク24はm/z 1211.57218で[M+HH2O]+イオンを生成した。このことから、ピーク20はアグリコンのC25およびC27位に二重結合が付加しており、ピーク24はC5およびC6位に二重結合が付加していることが示された。フラグメントイオン、保持時間、文献の構造との比較から、ピーク20と24はそれぞれ25(27)-ene-timosaponin Nと25S-karatavioside Cであると暫定的に同定された。
Characterization of peaks 27, 31–40, 42, and 46–47
ピーク36は、リテンションタイムとMSスペクトルを基準物質と比較することにより、チモサポニンBIIであると確定した。ピーク27、31-35、37-40、42、46-47は、チモサポニンBIIと同様のフラグメンテーションパターンを示した。
ピーク31では、ESI+モードでm/z 1065.54912 [M+HH2O]+, 903.4952 [M+H-H2O-162]+, 579.3878 [M+H-H2O3×162]+, 417.3374 [M+H-H2O-4×162]+, 273.2215 [417.3374C8H16O2]+, 255.2101 [417.3374-H2O]+の主要フラグメンテーションが得られた。これらは、4つのヘキソシル残基、1つのC8H16O2 (142 Da)部分、および1分子の水が失われたことに起因する。したがって、ピーク31はトマトシドAと暫定的に同定された。ピーク32は、ピーク31と同じ式、同様のフラグメンテーション挙動を示し、ピーク31の異性体であると決定された。C18カラムでのステロイドサポニンのクロマトグラフィー挙動に基づき、ピーク32は31のC25R立体異性体またはその異性体[30]と暫定的に同定された。ピーク27はESI-モードでm/z 1127.54401 [M+HCOO]-の分子イオンを示し、31と同じフラグメンテーション挙動を示した。ピーク27は、アスパラゴシドGまたはその異性体と暫定的に同定された。
ピーク33-35, 37-39, 46-47はいずれもチモサポニンBIIに類似したアグリコン骨格を持つ。ピーク33-35、37-39、46-47の[M+HCOO]-前駆イオンは、m/z 1109.53611、963.47843、1111.54868、965.49371、965.49301、965.49367、817.42129、803.44367で観測された。フラグメンテーションイオンに基づき、A. asphodeloidesの既知化合物との比較から、ピーク33-35、37-39、46-47はそれぞれ25(27)-ene-gurilioside H、timosaponin L、gurilioside H、25R-timosaponin BII、25S-officinalisnin-I、officinalisnin-I、filicinoside A、timosaponin BIIaと同定された。
ピーク42は、m/z 1197.58972 [M+H-H2O]+、1065.5492 [M+H-H2O-132]+、741.4365 [M+H-H2O-132-2×162]+、579. 3876 [M+H-H2O-132-3×162]+, 417.3400 [M+H-H2O-1324×162]+, 273.2214 [417.3400-C8H16O2]+, and 255.2068 [273.2214×H2O]+. フラグメンテーション、保持時間、および文献の既知化合物との比較から、ピーク42はチモサポニンI1と同定された。ピーク40は、m/z 1195.58478 [M+H-H2O]+, 1033.5678 [M+H-H2O-162]+, 901.5092 [M+H-H2O-162-132]+, 739.4227 [M+H-H2O-1322×162]+, 577.3773 [M+H-H2O-132-3×162]+, 415. 2745 [M+HH2O-132-4×162]+, 271.2028 [415.2745-C8H16O2]+, および253.2097 [271.2028-H2O]+ から、ピーク42と比較して、C5およびC6の位置に追加の二重結合があることが示された。ピーク40はチモサポニンH1と同定された。
Characterization of peaks 43, 45, and 48–51
ピーク43、45、48および50-51は、チモサポニンBIII（ピーク49）と同様のフラグメンテーションパターンを示し、対応する標準物質との比較により同定された。ピーク43はm/z 919.48877 [M+H]+でフラグメンテーションを生じ、これはチモサポニンBIIIより16 Da多く、ピーク43がさらにヒドロキシル部分を有することを示した。ピーク45はピーク43と同じフラグメンテーション経路を示したため、ピーク43の異性体と判定された。フラグメンテーション、保持時間、および文献の既知化合物との比較から、ピーク43と45はそれぞれチモサポニンDとチモサポニンDの異性体と同定された。ピーク48と50はチモサポニンBIIIと同じフラグメンテーション経路を持ち、保持時間と文献との比較から、それぞれチモサポニンCと25R-チモサポニンBIIIと同定された。ピーク51から生じたm/z 1065.49284 [M+H]+のフラグメンテーションは、チモサポニンBIIIよりもヘキソシル残基が多いことを示した。ピーク51はチモサポニンBIVと同定された。
Characterization of peaks 55–56, 58–59, 61
ピーク 55 は、対応する参照物質との比較により、アネマーレナサポニン I と同定された。ピーク56はピーク55と同じ式とMSデータを有し、アネマレナサポニンIの異性体と同定された。リテンションタイムと既知化合物との比較から、ピーク56はアネマレナサポニンIIと同定された。ピーク58はESI+モードでm/z 739.43078 [M+H-H2O]+, 595.3755 [M+H-H2O-162]+, 415.3222 [M+H-H2O2×162]+, 289.2433 [M+H-H2O-C8H14O]+, 271.2069 [289.2433H2O]+, 253.1942 [271.2069-H2O]+のフラグメンテーションを生じた。ピーク59はピーク58と同じフラグメンテーション経路を示し、ピーク55と56と比較して、ピーク58と59はC25とC27の位置に二重結合が追加されていることが示された。これらのフラグメントイオン、保持時間、および文献の構造との比較に基づき、ピーク58および59はそれぞれ25(27)-ene-anemarrhenasaponin Iおよび25(27)-ene-anemarrhenasaponin IIであると暫定的に同定された。ピーク61は、その保持時間とMSスペクトルから、59の異性体であると暫定的に同定された。
Characterization of peaks 52–53, 57, 62–65, 67, 69–71 and 78
ピーク63、69、78はESI-モードでm/z 801.42616、785.42928、623.37719の[M+HCOO]-イオンを生じ、対応する標準物質との比較により、チモサポニンAII、チモサポニンAIII、チモサポニンAIであると明確に決定された。ピーク57、62、64はESI-モードでm/z 1095.51982、799.40970、1095.51950の[M+HCOO]-イオンを示し、フラグメンテーションパターンがチモサポニンAIIと類似していることが示された。これらのピークはそれぞれAnemarrhena F、25(27)-ene-timosaponin AII、Fgitoninと同定された。ピーク52-53、65-66、70-71は、チモサポニンAIIIと同様のフラグメンテーションパターンであった。ピーク52と53が生成するフラグメンテーションイオンは、チモサポニンAIIIよりもそれぞれ2つの水酸基と1つの水酸基を有することを示していた。従って、ピーク52および53は、それぞれチモサポニンFおよびチモサポニンGと暫定的に同定された。
ピーク65および70は、チモサポニンAIIIと同じ脱プロトン化分子イオン（m/z 741.44066、および741.44101）を有し、チモサポニンAIIIの異性体と同定された。保持時間から、また文献の既知化合物との比較から、ピーク65と70はそれぞれチモサポニンAIVと25R-チモサポニンAIIIと同定された。ピーク67はm/z 783.41424で[M+HCOO]-を生成し、チモサポニンAIIIと同じフラグメンテーション経路であった。ピーク67はピークtimosaponin AIIIよりもC25とC27の位置に二重結合が1つ多く、25(27)-ene-timosaponin AIIIと同定された。ピーク71が生成するフラグメンテーションイオンから、チモサポニンAIIIよりも1分子多いグルコースと1分子多いキシロースを含むことが示された。したがって、ピーク71はデスガラクトチゴニンと同定された。
Characterization of fatty acids
脂肪酸の特徴脂肪酸は、一方の末端にカルボキシル基、もう一方の末端にメチル基を持つ炭化水素鎖である。自然界には多くの脂肪酸が存在し、その長さや不飽和度は様々である。植物に含まれる脂肪酸の鎖の長さは炭素原子数12から22まで様々で、炭素数16から20が最も多い。脂肪酸は、細胞膜の安定化、細胞因子とリポタンパク質バランスの維持、心血管疾患との闘い、成長促進など、幅広い生物学的・薬理学的活性を持つことが報告されている。ピーク 54, 73-77, 79-80, 82-84, 86-89 は、ESI スペクトルの各化合物の準分子イオンの m/z を文献や関連データベース（ChemSpider, HMDB, PubChem, MassBank など）と比較することで、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸と同定した。同定された脂肪酸はすべて18個の炭素原子を含み、3個以上のヒドロキシル基と3個の二重結合を持たない（表1）。特定の酸化部位を特定したり、シス／トランス配座を同定するには証拠が不十分であった。しかし、天然に存在する不飽和脂肪酸のほとんどはトランス型ではなくシス型の二重結合を含んでいる。
Characterization of miscellaneous compounds (lignans and others)
本研究では、さらに 8 種類の化合物が同定された。ピーク7はm/z 407.09788で[M-H]-分子イオンを生成し、MS/MSスペクトルの主フラグメントイオンはm/z 329.0671[M-H2O60]-、317.0675[M-H-90]-、287.0557[M-H-120]-、245.0441[MH-162]-であった。ピーク7は文献[37]との比較からイリフロフェノン-3-C-グルコシドと同定された。ピーク13と18は、m/z 421.11329と421.11284で[M-H]-イオンを生成し、そのフラグメントイオン、保持時間、文献の構造との比較から、ピーク13と18はフォリアマンギフェロシドAとその異性体と仮同定された。ピーク41はN-シス（トランス）-フェルロイルチルアミンと同定された。ポジティブイオンモードで観測されたm/z 314.13896イオンは、C18H19NO4の[M+H]+イオンと一致し、m/z 177.0549 [M+H-C8H11NO]+のフラグメンテーションは、チラミン分子の消失と一致し、m/z 145.0282 [M+HC8H11NO-CH3OH]+は、メトキシル基の消失を示した。m/z 121.1187のもう1つのメインフラグメントイオンは、フェルロイル分子とNH2分子の損失により生成した。ピーク44は、m/z 261.07567の[M+H]+イオンを生成し、MS/MSは、m/z 167.0708および121.0584のフラグメントイオンを生成した。したがって，ピーク44は2,6,4′-トリヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノンと同定され，これはA. asphodeloidesで以前に報告されている。
ピーク66は負イオンモードでm/z 251.10842 [M-H]-の準分子イオンを有し、主要フラグメントはm/z 235.10425 [M-HCH4]-であった。ピーク66はcis-hinokiresinolと暫定的に同定され、これはA. asphodeloidesで以前に報告されている[22]。ピーク68と81はピーク66と類似のフラグメンテーションを示し、2つの化合物の[M+H]-イオンはそれぞれm/z 281.11823と265.14755であり、ピーク66と比較してさらにメトキシル基とメチル基が存在することが示された。ピーク68と81はそれぞれメトキシル-cis-ヒノキレシノールとモノメチル-cis-ヒノキレシノールと仮同定された。
ピーク72と85は、ESI+モードでm/z 344.30588の[M+H]+イオン、ESI-モードでm/z 339.23131の[M-H]-イオンを生成した。準分子イオンおよびフラグメンテーションをMassBankおよびNISTのデータと比較することにより、ピーク72および85はそれぞれフィトスフィンゴシンおよびジメチステロンであると暫定的に同定された。
Conclusion
シンプルで信頼性の高いUHPLC-Q-TOF-MS技術を開発し、A. asphodeloidesの成分を迅速に分離し、包括的に同定した。MSのフラグメンテーションと文献情報に基づいて、環状ペプチド8種、フラボン13種（キサントン11種）、ステロイドサポニン45種、脂肪酸15種、リグナン3種、その他の化合物5種を含む89種の化合物を明確に、あるいは暫定的に同定した。二量体キサントンと環状ペプチドはA. asphodeloidesで初めて報告された。この結果は、アスフォデロイデスの根茎に含まれる化学成分の包括的な調査を提供し、アスフォデロイデスのさらなる研究と利用に有益である。
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