特発性肺線維症におけるm5C関連遺伝子の診断と予測値

Diagnostic and predictive values of m5C‑associated genes in idiopathic pulmonary fibrosis.
 
In patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), the role of 5‑methylcytosine (m5C)‑associated genes in the pathogenesis and development of the disease remains unclear. The present study aimed to identify reliable diagnostic markers based on the expression of m5C‑associated genes for the early detection of IPF. Count data were obtained by screening the IPF genome‑wide assay in the Gene Expression Omnibus database, followed by a comparison of m5C gene expression in patients with IPF and controls. The GSE150910 and GSE173355 datasets yielded a total of 23 differentially expressed m5C‑associated genes, which were then investigated for their functions. A diagnostic model was built using eight m5C genes and validated with training sets and the GSE124685 dataset. IPF subtypes were identified based on expression of m5C‑related genes as well as clinical and immunological characteristics. Furthermore, a pulmonary fibrosis model was established in mice by administering bleomycin into the trachea. Lungs were harvested and analyzed using quantitative PCR to determine the expression of m5C‑related genes. The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis revealed that these genes were significantly enriched in 'base excision repair'. Immunoassay results revealed that 13 immune cell markers (naive, memory and B cell plasma, T cell CD4 naive, T cell CD4 memory resting, T cell follicular helper, T cell regulatory Tregs, NK cell resting, Monocyte, Macrophage M0, Mast cell activated, Eosinophil, and Neutrophil) were significantly associated with IPF. Patients with IPF had lower levels of resting memory CD4+ T cells, which were positively associated with Tet methylcytosine dioxygenase2 (TET2) and Thymine‑DNA glycosylase (TDG) but negatively correlated with NOP2/Sun RNA methyltransferase5 (NSUN5) expression. All samples were classified into based on the levels of the eight diagnostic m5C genes. Samples with high m5C scores are subtype 1, and those with low m5C scores are subtype 2. In subtype 2, male patients had lower levels of CD27 and CD70 but higher levels of CD274, CD86, Cytotoxic T‑lymphocyte‑associated protein4 and Hepatitis A virus cellular receptor2 (HAVCR2). When compared with normal mouse lung tissue samples, expression levels of NOP2/Sun RNA methyltransferase6 (NSUN6), Ubiquitin‑like with PHD and RING Finger Domains1, TDG and TET2 in lung fibrosis tissue samples were significantly higher, while expression levels　of NSUN5, NTH‑like DNA glycosylase1, DNA (cytosine‑5‑)‑methyltransferase3 β and Methyl‑CpG binding domain protein 3) were lower. It is possible that m5C‑associated genes play an important role in the diagnosis and typing of IPF. These genes may facilitate investigation of the pathophysiology of IPF and identification of potential treatment targets.
 
Journal Article
 
特発性肺線維症（IPF）患者において、5-メチルシトシン（m5C）関連遺伝子が本疾患の病因および発症に果たす役割は、依然として不明である。本研究では、IPFの早期発見のために、m5C関連遺伝子の発現に基づく信頼性の高い診断マーカーを同定することを目的とした。Gene Expression OmnibusデータベースのIPFゲノムワイドアッセイをスクリーニングし、IPF患者と対照群におけるm5C遺伝子発現を比較することにより、カウントデータを得た。GSE150910とGSE173355のデータセットから、合計23のm5C関連遺伝子の差次的発現が得られた。8つのm5C遺伝子を用いて診断モデルを構築し、トレーニングセットとGSE124685データセットを用いて検証した。m5C関連遺伝子の発現と臨床的および免疫学的特徴に基づいてIPFサブタイプが同定された。さらに、ブレオマイシンを気管に投与することにより、マウスに肺線維症モデルを確立した。肺を採取し、定量的PCR法を用いてm5C関連遺伝子の発現を解析した。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesの濃縮解析により、これらの遺伝子は「塩基除去修復」に有意に濃縮されていることが明らかになった。免疫測定の結果、13の免疫細胞マーカー（ナイーブ、メモリー、B細胞血漿、T細胞CD4ナイーブ、T細胞CD4メモリー安静時、T細胞濾胞ヘルパー、T細胞制御性Tregs、NK細胞安静時、単球、マクロファージM0、活性化マスト細胞、好酸球、好中球）がIPFと有意に関連していることが明らかになった。IPF患者では、安静時メモリーCD4+ T細胞のレベルが低く、これはTet methylcytosine dioxygenase2 (TET2)およびThymine-DNA glycosylase (TDG)と正の相関を示したが、NOP2/Sun RNA methyltransferase5 (NSUN5)の発現とは負の相関を示した。全てのサンプルは、8つの診断用m5C遺伝子のレベルに基づいて分類された。m5Cスコアが高い検体をサブタイプ1、低い検体をサブタイプ2とした。サブタイプ2では、男性患者はCD27とCD70のレベルが低く、CD274、CD86、細胞傷害性Tリンパ球関連蛋白4、A型肝炎ウイルス細胞受容体2（HAVCR2）のレベルが高かった。正常マウス肺組織サンプルと比較すると、肺線維症組織サンプルにおけるNOP2/Sun RNA methyltransferase6（NSUN6）、Ubiquitin-like with PHD and RING Finger Domains1、TDG、TET2の発現レベルは有意に高く、NSUN5、NTH-like DNA glycosylase1、DNA (cytosine-5-)-methyltransferase3 β、Methyl-CpG binding domain protein 3）の発現レベルは低かった。m5C関連遺伝子がIPFの診断とタイピングに重要な役割を果たしている可能性がある。これらの遺伝子は、IPFの病態生理学の研究と潜在的な治療標的の同定を容易にするかもしれない。