「33 歯周組織”内”にバイオフィルムがあった」

2018年、韓国。歯周病の歯周組織内でアルシアンブルー染色とatomic force microscopyによりバイオフィルムが観察された。ただしサンプルサイズは７名。また健康な歯周組織との比較もなし。pilot studyに近い。

１，参考文献

Complex Intratissue Microbiota Forms Biofilms in Periodontal Lesions - PubMed

２，ABSTRACT

歯周炎は、歯肉下細菌の歯肉組織への細菌侵入の増加によって引き起こされる。健康な状態から歯周炎への移行に伴う構造の変化はよく知られているが、歯周病巣の歯肉組織内に存在する細菌の性質はわかっていない。歯周病変部の組織内の微生物相を明らかにし、プラーク微生物相と比較するために、慢性歯周炎患者7名から歯肉組織と歯肉下プラークを入手した。16S rRNA遺伝子の塩基配列解析の結果，種の豊富さと多様性は2群間で有意差はなかった．しかし，組織内群集の被験者間変動は，プラーク群集のそれよりも小さかった．また、プラークコミュニティと比較すると、組織内コミュニティは、Firmicutesの存在量が減少し、FusobacteriaとChloroflexiの存在量が増加する特徴があった。特に、Fusobacterium nucleatumとPorphyromonas gingivalisは組織内で非常に濃縮されており、全菌数の15%から40%を占めていた。さらに、結合組織繊維の分解が顕著な組織内では、アルシアンブルー染色とatomic force microscopyでバイオフィルムが観察された。結論として、歯周病巣の歯肉組織内には、非常に複雑な細菌群集がバイオフィルムの形で存在し、持続的な感染のリザーバーとなる可能性がある。この新しい知見は、歯周炎の治療戦略に関する新たな研究を促進する可能性がある。

３，METHODS

1) Study Samples
高麗大学校アナム病院に通院中の患者で、フラップ手術が必要となった慢性歯周炎の成人7名。

2) Preparation of Bacterial DNA Samples, Estimation of Total Bacterial Loads

3) Hematoxylin and Eosin Stain, Alcian Blue Stain, In Situ Hybridization, and Image Analysis

4) Atomic Force Microscopy

４，RESULTS

1) Intratissue Bacterial Communities Were as Complex as the Subgingival Plaque Communities but Had Altered Composition

16S rRNA遺伝子のリアルタイムPCRで推定された総菌数は、歯肉縁下プラークサンプルよりも組織内サンプルの方が1～4 orders 少なかった(Fig. 1A）。(菌数は、歯肉縁下プラークサンプルに対して組織内サンプルは1/10~1/10000と少なかった）

Figure 1. Alpha and beta diversities of subgingival plaque and intratissue communities within periodontal lesions. Subgingival plaque and gingival tissue samples were obtained from 7 patients with chronic periodontitis. Bacterial genomic DNA was prepared as described in the Materials and Methods section and subjected to MiSeq sequencing of the 16S rRNA gene. (A) Total bacterial load in each sample was estimated by real-time polymerase chain reaction with universal primers targeting the bacterial 16S rRNA gene. The total bacterial load was expressed as the 16S rRNA gene copy number in the total DNA obtained from each sample. P, patient. (B) The Chao1 and Shannon index are expressed with box and whisker plots (P value by 2-tailed Wilcoxon signed-rank test). (C) The principal coordinates analysis (PCoA) plot was generated with weighted UniFrac metric. Samples from the same subject are connected with a solid line. (D) The intersubject UniFrac distances of the subgingival plaque and intratissue communities were obtained with a weighted metric. *P < 0.05 by 2-tailed Wilcoxon signed-rank test.

歯肉縁下プラークと組織内プラークでは、細菌組成に違いがみられた。歯肉縁下と比較すると、組織ではFusobacteriaとChloroflexiが有意に増加し、Firmicutesは減少していた（Fig. 2A）。このうち、F. nucleatumとP. gingivalisは、組織内プラークにおいて全菌数の15％～40％を占める高濃度菌であった（Fig.2C）。

Figure 2. Differences in bacterial composition between the subgingival plaque and intratissue communities. The relative abundance of each taxon between the subgingival plaque and intratissue communities was compared. P, patient. (A) The members of top 10 phyla are shown (left panel). Three phyla were differently distributed between the 2 communities (right panel). (B) Seven genera were differently distributed between the 2 communities (P value by 2-tailed Wilcoxon signed-rank test). (C) A heat map was generated for the species/phylotypes whose relative abundance was >2.5% in any sample. (D) The relative abundance of Fusobacterium nucleatum subspecies is shown. #P < 0.05 compared with animalis subspecies in plaques. †P < 0.05 compared with animalis subspecies in tissues by Kruskal-Wallis test, followed by Mann-Whitney U test. *P < 0.05 by 2-tailed Wilcoxon signed-rank test.

2) Bacterial Aggregates in the Form of Biofilms Were Observed within Gingival Tissues

歯肉組織における高濃度の2種F. nucleatumとP. gingivalisの分布を、特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーションにより検討した。両種は、すべての歯肉生検のポケット上皮、結合組織、口腔上皮の切片全体に検出されたが、特に炎症性浸潤部に多く見られた（Fig. 3A-C）。

これらの細菌が、バイオフィルムを形成しているとの仮説を立てた。この可能性を確認するために、バイオフィルムの細胞外高分子物質（EPS）に含まれる多糖類を可視化するためにアルシアンブルー染色を行った。低倍率では、ヘマトキシリン・エオジン染色断面において、ポケット上皮に沿った密な結合組織のほぼ半分に弱いアルシアンブルー染色が観察され、そこには豊富な白い空間が観察された。高倍率では、結合組織繊維の分解によって形成された自由空間に、ビーズ状の細菌クラスター（Fig. 3Dの矢印）を持つクモの巣状の構造が容易に観察されたが、繊維が比較的無傷な部分（Fig. 3Dのアスタリスク）にはほとんど観察できなかった。

Figure 3. Distribution of Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, and biofilm within the gingival tissue. (A) Tissue sections were stained with hematoxylin and eosin (H&E). Three areas (a, b, c) were examined under high magnification (×1,000) with differential interference contrast microscopy. Arrows indicate the potential directions of infection spread. PE, pocket epithelium. (B, C) Tissue sections were in situ hybridized with F. nucleatum– and P. gingivalis–specific probes, respectively. Arrows, bacterial signals; insets, areas with biofilm-like structure are magnified. (D) Tissue sections were stained with 1% alcian blue for acid mucopolysaccharide and counterstained with nuclear fast red. Arrows, biofilm-like structures; arrowheads, mast cells; asterisk, area with intact connective tissue fibers. (E) Correlation plots between bacterial signals and biofilm formation (r and P values by Spearman’s rank correlation test). ROI, region of interest. See Appendix Figure 3 for DIC images taken by confocal microscopy.

歯肉組織内のバイオフィルムの存在は、さらにAFMで確認した。まず、組織と共生しているプラークバイオフィルムの一部を検査した。その中央部はアルシアンブルーで染色されておらず、AFM下できっちり詰まった細菌細胞が確認された。プラークバイオフィルムの周辺部はアルシアンブルーで染色され、AFM下で細菌クラスターを伴うクモの巣状の構造を示した（Fig. 4A-C）。また、コラーゲン線維が著しく劣化した組織内でも、同様のクモの巣状構造が観察された（Fig. 4D, E）。繊維が無傷の部分では、コラーゲン繊維に付着した細菌細胞が散在しているのが観察された(Fig. 4F）。

Figure 4. Atomic force microscopy examination of biofilm. (A) A piece of plaque biofilm coembedded with tissue was located in a hematoxylin and eosin (H&E)–stained section (between 2 arrows in top panel). CT, connective tissue. Area corresponding to the white-boxed region in the H&E-stained section was examined in the serial section stained with alcian blue under high magnification (×1,000, bottom panel). Two typical areas were chosen based on alcian blue staining and examined by atomic force microscopy: (B) blue- and (C) red-boxed areas from panel A. Areas a–c (D–F, respectively) from Figure 3A were examined by atomic force microscopy. Thick arrows indicate biofilm-like structures within tissue. Thin arrows indicate scattered bacterial cells. C, eukaryotic cell.

５，DISCUSSION

本研究で最も興味深かったのは、歯肉組織内にバイオフィルムが存在することであり、アルシアンブルー染色とAFMにより確認された。

バイオフィルム形成領域ではF. nucleatumとP. gingivalisが検出されたが、組織内のバイオフィルム形成の程度はF. nucleatumとP. gingivalisのいずれの量とも関連していない。組織内のバイオフィルム形成には、他の生物種が関与している可能性がある。

Fig.3Aでは、歯周炎の進行に伴い、細菌感染は接合上皮の先端移動に沿ってa領域からb、c領域へと広がっていったと考えられる（Bosshardt and Lang 2005）。歯周炎の初期には、接合上皮と感染の中心はa領域付近にあり、それがb領域付近に移動したものと考えられる。b領域で見られた大量の免疫細胞の浸潤は、バイオフィルムによる保護のためか、すでにa領域を通過して感染細菌を除去したが完全ではなかったと推測される。c領域は、細菌感染が広がったが、まだ免疫細胞がほとんど到達していない領域である可能性がある。歯肉組織でバイオフィルムが形成されるきっかけは今のところわかっていない。

歯肉組織にバイオフィルムが存在することの臨床的意義は、まだ明確ではない。バイオフィルムは細菌の持続性を示す最良の例の一つであるため、慢性炎症の原因となっている可能性がある。あるいは、細菌の全身的な拡散を制限することによって有益である可能性もある。現在のパラダイムによれば、歯周炎の機械的治療は歯肉縁下バイオフィルムの除去に重点が置かれている（Drisko 2014）。バイオフィルムを含む歯肉組織の除去が長期予後を改善するかどうかは、さらなる研究が必要である。