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molbio08先生がレプリコンワクチン（自己増殖型とご理解ください）を解説している

壺助

自己増幅型ワクチンに関して、少し詳しく説明します。この前紹介した論文のタイトルが「Self-amplifying RNA vaccines for infectious diseases」というものでした。これを直訳すると「感染症のための自己増幅型RNAワクチン」ということになります。そこで、この前のスレッドでは自己増幅型ワクチンと書きましたが、自己増幅型ｍRNAの構造を見ると、これは自己複製するための要件を満たしています。そのため今後はレプリコンｍRNAワクチン、あるいはレプリコンワクチンと呼ぶことにします。レプリコンと言う言葉は「複製するもの」という意味です。自己増殖型と呼んでもいいでしょう。 レプリコンワクチンと言えど、基本はｍRNAワクチンです。また感染症用であれば外来の病原性の細菌やウイルスの抗原遺伝子を細胞内に導入することになります。外来のウイルスの抗原タンパク質を産生する細胞は免疫系から見れば感染細胞として認識されます。そのため従来型のｍRNAワクチンの問題は解決されるわけではなく、より長期的に副作用が起きる可能性が想定されます。また体液性免疫（抗体を産生する免疫）と細胞性免疫には、いずれも免疫記憶がありますので、免疫が確立した時点以降の抗原産生は不要です。やたらと長期間、抗原産生を持続されることは望ましいことではないでしょう。 また、ブレーキの機構がないのも問題で、長期的にｍRNAの複製が持続するようなものを人体に接種することには大きなリスクがあります。エクソソームはｍRNAを運搬できることは早くから知られていました。細胞間の情報伝達の仕組みとして最近注目を集めているのがエクソソームです。細胞間の伝播がおきるのは当然ですが、個体間の伝播の可能性が否定できないものを実用化することには強く反対します。

細胞にレプリコンワクチンが導入された後にどのような反応がおきるかについて、少し詳しく説明します。前回紹介した論文のFigure1をもう一度掲載します。Figure1の中央に示されているものがレプリコンワクチンです。アルファウイルスのnsP1-4遺伝子のｍRNAと抗原のｍRNAが連結されており、これが最初に細胞内に導入されます。細胞内で最初に合成されるタンパク質はアルファウイルス由来のRNA合成酵素であるnsP1-4と抗原タンパク質です。ヒト細胞にはRNAからRNAを合成する酵素はありませんが、nsP1-4、これはRNA依存的RNA合成酵素です。RNA依存的RNA合成酵素とはRNAからRNAを合成する酵素です。 これができあがると、ｍRNAの複製反応がスタートします。この反応はRNAを複製することになりますので、この酵素はレプリカーゼと呼ばれることもあります。Fiogure1のB）に示されたRNAはそれ自体から翻訳反応、つまりタンパク質合成が可能であり、これはプラス鎖と呼ばれます。プラス鎖を鋳型にして合成されるRNAをマイナス鎖と呼びます。マイナス鎖はプラス鎖を生産するためにもっぱら使用されます。RNAの両端には名前がついており、左側が5‘末端で、右側が3’末端です。この表記はDNAでも同様です。DNA合成酵素、RNA合成酵素ともに合成反応の方向は5‘から3’方向です。したがって最初に合成されるマイナス鎖はプラス鎖の3‘末端つまり、右端から左端に向かって合成されます。このときに必要な配列が3’CSE部分です。この部分にはRNA合成が開始するのに必要な配列があります。マイナス鎖ができると次にマイナス鎖の左端にある5‘CSE部分にRNA合成酵素が結合してプラス鎖の合成が始まります。こうして細胞に導入されたｍRNAは複製されて増えていきます。

文字通り、こうしてレプリコンワクチンは増えていきます。問題はこの反応がどのような仕組みでいつ止まるのかということです。RNA合成の量的なコントロールはどうなっているのか不明です。この構造では緑で示されたRdRP（RNA依存的RNA合成酵素）もどんどん増えていきます。抗原タンパク質もたくさんできるのですが、RdRPのたくさんできるため、ｍRNAの増殖は続いていきます。ｍRNAがエクソソームによって他の細胞に運ばれると、その細胞でもｍRNAは増殖していきます。 RdRPに高温感受性変異を導入して体表付近でしか増えないように工夫しているものもあります。具体的には、体表付近は温度が低いためそこだけで増殖できるものの、温度が高い体幹では増えなくしようというものです。しかし、RdRPによるRNA合成反応はゲノムのDNA複製よりも変異の確率が高いのでRdRPbに導入された変異の復帰変異がすぐにおきるものと思われます。 哺乳類細胞の温度感受性変異株の復帰変異率は10のマイナス7乗程度です。RdRPによるRNA合成反応では、これよりも変異率が高いことを考えると高温感受性変異の復帰株はすぐ出現し、しかも復帰変異株の方が増殖優位性がありますので、すぐ優勢になるでしょう。かくしてブレーキのない複製マシーンは細胞から細胞へと広がっていきます。個体間伝播までおきると悲劇を招くでしょう。抗体がIgG4化されてウイルスを除去できない体になり、むしろ接種することでウイルスに対して弱くなってしまう。このレプリコンワクチンの実用化はすぐに止めるべきだと思います。


molbio08
@molbio08
J Antibiot (Tokyo). 2022; 75(2): 60–71. Published online 2021 Dec 21. doi: 10.1038/s41429-021-00491-6 PMCID: PMC8688140 PMID: 34931048 The mechanisms of action of ivermectin against SARS-CoV-2—an extensive review このレビュー論文の表に次のような記述がありました。IVMの作用機構です。アルファウイルスを含む多様なウイルスのRdRPに結合して阻害するという論文が引用されています。その説明が以下です。 B. Action on host targets for viral replication Level 4: Action as an antiviral IVM has antiviral properties against other viruses including the RNA viruses such as Zika virus (ZKV), dengue virus, yellow fever virus (YFV), and West Nile virus (WNV), Hendra virus (HEV), Newcastle virus, Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV), chikungunya virus (CHIKV), Semliki Forest virus (SFV), and Sindbis virus (SINV), Avian influenza A virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), human immunodeficiency virus type 1 as well as DNA viruses such as equine herpesvirus type 1 (EHV-1) and pseudorabies virus (PRV) この論文のリンクを貼っておきます。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7290143/

Ivermectin: a systematic review from antiviral effects to COVID-19 complementary regimen

molbio08

@molbio08

mRNAをシュードウリジン化しておくと分解されにくくなってしまい長期間細胞に保持されます。シュードウリジン化されたmRNAから複製されるmRNAはシュードウリジン化されていない通常のmRNAと同じ性質を持ちます。したがってコピーされてできたmRNAは寿命は短くなります。それが他の細胞にエクソソームで伝播した時に、分解される速度が速いのかあるいは複製される速度が速いのかで結果は変わると思います。アルファウイルスのRNA合成酵素の複製反応と細胞内のRNA分解酵素の競争になるわけです。 複製阻害は効果はありそうですが、レプリコンワクチンを投与したマウスに事前にイベルメクチンを飲ませておくといった実験結果がないので、現段階では何とも言えません。RNAワクチンそのものが問題の多い技術ですので、研究開発を進める意味はほとんどないと思います。

molbio08

@molbio08

アルファウイルスのRNA依存的RNA合成酵素がなぜ選択されたかというとアルファウイルスのRNA複製酵素はRNA分解酵素による分解にめげずに元気にどんどん複製するからです。というわけで、アルファウイルスのRNA依存的RNA合成酵素を用いるとRNA分解酵素による分解よりも複製の効率の方が高いことは容易に想像できます。したがってエクソソームによって他の細胞に届けられたｍRNAはシュードウリジン化されていなくても増殖のサイクルに入ることができると思います。やはり、リスクは高いという結論です。

#レプリコンワクチン
#自己増殖型



例えばですが、従来型のmRNAワクチンのモディファイドRNA（スパイク蛋白を作れという命令書、設計図）で考えてみましょうか。


モディファイドRNAをスパイク蛋白を作る「設計図」だと比喩します（あくまでも比喩ですよ比喩）。このモディファイドRNA設計図1枚でスパイク蛋白を10個作ることができると仮定しましょう。スパイク蛋白を100個作りたいならモディファイドRNA設計図は10枚、ワクチンの溶液の中に入れなければいけませんね。スパイク蛋白1000個作りたいなら、モディファイドRNA設計図は100枚必要になります。じゃあスパイク蛋白を10兆作りたいと考えた時、モディファイドRNA設計図は「何枚」ワクチン溶液の中に入れないと、いけませんか？


レプリコンワクチン（自己増殖型）の場合、モディファイドRNA設計図「そのもの」を無限に複写できるわけです。モディファイドRNA設計図を1枚、ワクチン溶液の中に入れたと仮定して、このモディファイドRNA設計図はスパイク蛋白を10個作ることができると仮定しましょう。設計図は1枚しか入っていませんから、スパイク蛋白は10個しか作れないはず。しかし、今回は「レプリコンワクチン＝自己増殖」型のワクチンですから、モディファイドRNA「そのもの」を自己増殖できるわけです。

ってことは？

モディファイドRNA設計図を「無限」に増殖できるわけですから、結局「無限」にスパイク蛋白を量産できることになりますね（比喩です、あくまでも）。

レプリコンワクチン自体には「増殖を食い止めるブレーキ機能」は搭載されていません。ブレーキのない暴走列車を人体に注入することになる。この自己増殖を「どうやって」停止するんですか？荒川央博士は「接種された人間が持っている自前の免疫機能で、ブレーキを掛けることになると思うが、その免疫ブレーキが効かない場合は、レプリコンワクチンの暴走を食い止める人体のフェールセーフは無い」と指摘されてますね。

すでに従来型のmRNAワクチンを接種している接種組の場合、自然免疫機能も、獲得免疫機能も「劣化」している可能性があり、レプリコンワクチンの自己増殖機能を、阻止できるんでしょうか？


阻止できなかった場合、一体「誰が」責任を取るのですか？



明治製菓レプリコンワクチンの解説

超最新型国産レプリコンワクチン

明治製菓レプリコンワクチンの副反応

明治製菓レプリコンワクチンの解説

レプリコンワクチンを接種した可能性のある治験参加者の証言です





Key Points

  • RNA viruses are able to undergo two forms of recombination: RNA recombination, which (in principle) can occur in any type of RNA virus, and reassortment, which is restricted to those viruses with segmented genomes.

  • Rates of RNA recombination vary markedly among RNA viruses. Some viruses, particularly those with negative-sense single-stranded genomes, exhibit such low rates of recombination that they are effectively clonal. By contrast, some positive-sense single-stranded RNA viruses and some retroviruses such as HIV exhibit high rates of recombination that can exceed the rates of mutation when measured per nucleotide.

  • Although recombination is often argued to represent a form of sexual reproduction, there is little evidence that recombination in RNA viruses evolved as a way of creating advantageous genotypes or removing deleterious mutations. In particular, there is no association between recombination frequency and the burden of a deleterious mutation. Similarly, there is little evidence that recombination could have been selected as a form of genetic repair.

  • The strongest association for rates of recombination in RNA viruses is with genome structure. Hence, negative-sense single-stranded RNA viruses may recombine at low rates because of the restrictive association of genomic RNA in a ribonucleoprotein complex, as well as a lack of substrates for template switching, whereas some retroviruses recombine rapidly because their virions contain two genome copies and template switching between these copies is an inevitable part of the viral replication cycle.

  • We therefore hypothesize that recombination in RNA viruses is a mechanistic by-product of the processivity of the viral polymerase that is used in replication, and that it varies with genome structure.

要点
RNA ウイルスは、2 種類の組換えを起こすことができます。1 つは (原則として) どのタイプの RNA ウイルスでも起こり得る RNA 組換え、もう 1 つはセグメント化されたゲノムを持つウイルスに限定される再集合です。

RNA 組換えの速度は、RNA ウイルスによって大きく異なります。一部のウイルス、特にマイナス鎖一本鎖ゲノムを持つウイルスは、組換え速度が非常に低いため、実質的にクローン化しています。対照的に、プラス鎖一本鎖 RNA ウイルスや HIV などの一部のレトロウイルスは、ヌクレオチドあたりで測定すると突然変異速度​​を超える高い組換え速度を示します。

組換えは有性生殖の一形態であるとよく主張されますが、RNA ウイルスの組換えが有利な遺伝子型を作成したり有害な突然変異を除去したりする方法として進化したという証拠はほとんどありません。特に、組換え頻度と有害な突然変異の負担との間には関連性がありません。同様に、遺伝子修復の一形態として組み換えが選択されたという証拠もほとんどありません。

RNA ウイルスにおける組み換え率と最も強い関連性があるのは、ゲノム構造です。したがって、マイナス鎖一本鎖 RNA ウイルスは、リボ核タンパク質複合体におけるゲノム RNA の限定的な関連性とテンプレート切り替えの基質の欠如により、組み換え率が低い可能性があります。一方、一部のレトロウイルスは、ビリオンに 2 つのゲノム コピーが含まれており、これらのコピー間のテンプレート切り替えがウイルス複製サイクルの不可避的な部分であるため、急速に組み換えます。

したがって、RNA ウイルスにおける組み換えは、複製に使用されるウイルス ポリメラーゼのプロセッシングのメカニズム的副産物であり、ゲノム構造によって変化すると仮定します。


Conclusions

Understanding the evolution of recombination remains one of the most challenging problems in biology. We suggest that it is optimistic to believe that a single explanation applies to all organisms and that the precise mechanisms of recombination must be understood in each case. In particular, although it is clear that recombination is a key aspect of sexual reproduction in most cellular species, such that its evolution can be discussed in terms of the generation and removal of specific types of mutation, we argue that this does not seem to be the case in RNA viruses. Indeed, it is striking that high levels of recombination appear to be a sporadic occurrence in RNA viruses, such that they cannot be universally advantageous, whereas theories for the evolution of sexual reproduction in eukaryotes attempt to explain recombination and clonality on the assumption that these are common and sporadic, respectively63. Rather, a review of the available data suggests that the differing rates of recombination and reassortment that characterize RNA viruses may reflect the mechanistic constraints that are associated with particular genome structures and viral life cycles. If this hypothesis is upheld, then recombination should be considered a mechanistic by-product of RNA polymerase processivity (a trait that varies according to the genomic architecture of the virus in question) and not as a trait that is optimized by natural selection for its own selective value, although it may on occasion generate beneficial genotypes (Box 3). It is important to note that RNA viruses produce large numbers of progeny and that this, rather than recombination, is more likely to be the key to their evolutionary survival, as it buffers them from the adverse effects of the accumulation of deleterious mutations and regularly produces advantageous mutations. However, it is equally clear that our knowledge of recombination and its determinants remains patchy for most RNA viruses, such that far more data are needed for a definitive understanding of the evolution of recombination. For example, it will be important to accurately measure recombination rates in viruses that differ markedly in their strategies for controlling gene expression. Fortunately, the development of next-generation sequencing methods is likely to facilitate the acquisition of data that will lead to important new insights into the causes and consequences of recombination in this major class of infectious agent.

結論

組み換えの進化を理解することは、生物学における最も困難な問題の 1 つです。すべての生物に単一の説明が当てはまり、組み換えの正確なメカニズムをそれぞれのケースで理解する必要があると考えるのは楽観的すぎると私たちは考えています。特に、組み換えはほとんどの細胞種における有性生殖の重要な側面であり、その進化は特定の種類の突然変異の生成と除去という観点から議論できることは明らかですが、RNA ウイルスの場合はそうではないようです。実際、RNA ウイルスでは高レベルの組み換えが散発的に発生し、普遍的に有利になることはないのは驚くべきことです。一方、真核生物の有性生殖の進化に関する理論では、組み換えとクローン性はそれぞれ一般的で散発的であるという仮定に基づいて説明しようとしています( 63)。むしろ、入手可能なデータを検討すると、RNA ウイルスの特徴である組換えと再集合の異なる速度は、特定のゲノム構造とウイルスのライフサイクルに関連する機構的制約を反映している可能性があることが示唆されます。この仮説が支持される場合、組換えは RNA ポリメラーゼのプロセッシビティ (問題のウイルスのゲノム構造に応じて変化する特性) の機構的副産物と見なすべきであり、有益な遺伝子型を生成することがあるとしても、自然選択によってその選択価値のために最適化される特性とは見なすべきではありません (ボックス 3)。RNA ウイルスは多数の子孫を生成し、組換えよりも、これがウイルスの進化的生存の鍵である可能性が高いことに留意することが重要です。これは、有害な突然変異の蓄積による悪影響からウイルスを保護し、定期的に有利な突然変異を生成するためです。しかし、ほとんどの RNA ウイルスについて、組み換えとその決定要因に関する知識がまだ不十分であることも同様に明らかであり、組み換えの進化を完全に理解するには、はるかに多くのデータが必要です。たとえば、遺伝子発現を制御する戦略が著しく異なるウイルスでは、組み換え率を正確に測定することが重要になります。幸いなことに、次世代シーケンシング法の開発により、この主要な感染性因子の組み換えの原因と結果に関する重要な新しい洞察につながるデータの取得が容易になる可能性があります。

この秋レプリコン打たせる真の目的

2024/8/27

Abstract

Several vaccines have been widely used to counteract the global pandemic caused by SARS-CoV-2. However, due to the rapid emergence of SARS-CoV-2 variants of concern (VOCs), further development of vaccines that confer broad and longer-lasting protection against emerging VOCs are needed. Here, we report the immunological characteristics of a self-amplifying RNA (saRNA) vaccine expressing the SARS-CoV-2 Spike (S) receptor binding domain (RBD), which is membrane-anchored by fusing with an N-terminal signal sequence and a C-terminal transmembrane domain (RBD-TM). Immunization with saRNA RBD-TM delivered in lipid nanoparticles (LNP) efficiently induces T-cell and B-cell responses in non-human primates (NHPs). In addition, immunized hamsters and NHPs are protected against SARS-CoV-2 challenge. Importantly, RBD-specific antibodies against VOCs are maintained for at least 12 months in NHPs. These findings suggest that this saRNA platform expressing RBD-TM will be a useful vaccine candidate inducing durable immunity against emerging SARS-CoV-2 strains.

要約
SARS-CoV-2 によって引き起こされた世界的パンデミックに対抗するために、いくつかのワクチンが広く使用されています。しかし、懸念される SARS-CoV-2 変異体 (VOC) が急速に出現したため、出現する VOC に対して広範かつより長期にわたる保護を与えるワクチンのさらなる開発が必要です。ここでは、N 末端シグナル配列と C 末端膜貫通ドメイン (RBD-TM) との融合によって膜に固定された SARS-CoV-2 スパイク (S) 受容体結合ドメイン (RBD) を発現する自己増幅 RNA (saRNA) ワクチンの免疫学的特性を報告します。脂質ナノ粒子 (LNP) で送達された saRNA RBD-TM による免疫は、非ヒト霊長類 (NHP) で T 細胞および B 細胞応答を効率的に誘導します。さらに、免疫されたハムスターと NHP は SARS-CoV-2 攻撃から保護されます。重要なのは、VOCに対するRBD特異的抗体がNHPにおいて少なくとも12か月間維持されることです。これらの知見は、RBD-TMを発現するこのsaRNAプラットフォームが、新興のSARS-CoV-2株に対する永続的な免疫を誘導する有用なワクチン候補となることを示唆しています。


カニクイ猿で実験

https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1038%2Fs41467-023-38457-x/MediaObjects/41467_2023_38457_MOESM1_ESM.pdf


ネズミの腹部にルシフェラーゼ酵素を入れる

スパイク蛋白「全長」を、長期間作る危険があり、接種組は血管毒性のリスクに晒される可能性がある。


レプリコンワクチンを接種した接種組が、その後、変異株のコロナウイルスに再感染したと仮定。レプリコンワクチン接種組の場合、自己増殖機能部分（ベネズエラウマ脳炎由来のレプリカーゼ機能）は、接種組の体内に残存している可能性が濃厚である。再感染した際の「変異株」と、体内に残存しているレプリカーゼ機能とか合体（結合）してしまい、「組み換えウイルス」がこの瞬間に誕生。この結果、この接種組は「ずっと風邪をひきっぱなし」の状態が維持される可能性がある。あるいは一本鎖RNAウイルスと、レプリカーゼ機能が結合してしまい、腸炎を引き起こすウイルスに「組換え」られてしまう可能性もある。腸炎がレプリカーゼ機能によって「長期間」維持される結果、感染者（レプリコンワクチン接種組）は、腸炎による脱水症状に悩まされ、結果死亡する可能性がある。


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