20240529: オートファジーは腱の恒常性を維持する
腱は、収縮する骨格筋の力を骨に伝達して身体の動きを確保する緻密なコラーゲン結合組織であり、そのマトリックスはI型コラーゲン（Col-I）が大部分を占めています。腱コラーゲンマトリックスは主に小児期と青年期に合成されますが、成人期には、腱細胞は生理的な機械的負荷と病的な過負荷に反応してコラーゲンの合成と代謝回転を増加させます。最近では、マウスの腱細胞でCol-Iが毎日協調的に分泌されていることが実証されており 、腱細胞の細胞外マトリックス（ECM）をリモデリングする能力は、腱障害などの腱疾患の危険因子であることが示唆されています。しかし、腱障害発症の根底にある分子メカニズムは依然として謎のままです。
オートファジーはストレスに対する初期の細胞応答であり、組織構造のリモデリング中に不要なタンパク質や細胞小器官を除去するために重要です。オートファジーは、小胞（オートファゴソーム）に取り込まれ、リソソームと融合して分解される細胞成分の分解とリサイクルを仲介することで、組織の恒常性維持に重要な役割を果たします 。コラーゲン分子の前駆体であるプロコラーゲンは、多細胞動物で最も豊富な遺伝子産物です。特に、I型プロコラーゲン（PC1）は、2つのプロα1鎖と1つのプロα2鎖で構成され、ERで三重らせんタンパク質に折り畳まれます。プロコラーゲンの折り畳みプロセスは複雑であるため、新しく合成されたプロコラーゲンの一部は通常、誤って折り畳まれます 。 ER における過剰なコラーゲンの蓄積を防ぐため、オートファジーはさまざまな ER ファジー経路を介してプロコラーゲン凝集体を含む ER の一部を分解することができます 。実際、異所性プロコラーゲンは特定の ER サブドメイン、ER 出口部位 ( ERES ) に蓄積し、非標準的なマイクロ ER ファジーを介してリソソームに直接取り込まれます 。しかし、誤って折り畳まれたプロコラーゲンを認識するためのより選択的なメカニズムが報告されています 。この場合、ER 常駐シャペロン カルネキシンが内腔の誤って折り畳まれたプロコラーゲンを認識し、ER ファジー受容体 RETREG1/ FAM134Bと相互作用します。 RETREG1/FAM134Bは機能的なLC3相互作用領域（LIR）を有し、オートファゴソームへの結合を媒介し、カルネキシンとプロコラーゲンの両方を含むERの部分をリソソームに送り、分解する。本研究は、オートファジーが腱における活性メカニズムであり、プロコラーゲンの代謝に不可欠であるという概念実証を提供する。腱の恒常性におけるオートファジーの関与は、生理的に健康な腱生物学、負荷への適応、および腱病理の発達の間のギャップを埋める、新しいトランスレーショナルリサーチ分野の初の証拠となる。
オートファジーは腱組織で活発に働き、細胞内プロコラーゲン1の分解を促進する
腱におけるオートファジーが活発なプロセスであるかどうかを理解することを目的として、我々はヒト腱サンプルを使用し、オートファゴソーム構造を検出するために免疫蛍光分析を行った。ヒト薄筋腱において、我々は初めて、一般的にオートファジー小胞であると考えられているLC3B陽性斑点の存在を観察した。さらに、これらの腱は、PC1の近くに局在するAtg12陽性オートファジー小胞（AV）を示しており、（ピアソン係数：0.457 ± 0.168）、PC1がオートファジーによる分解の標的となる可能性があることを示唆している。この仮説は、マウスのアキレス腱におけるさらなる観察によって裏付けられ、LC3B と PC1 の間に強い共局在が検出されました（ピアソン係数：0.7397 ± 0.112）。この証拠は、PC1 がオートファゴソームに保持されていることを確認し、オートファジーがプロコラーゲンの処理に役割を果たしている可能性を示唆しました。興味深いことに、AV の数は、ヒト薄筋とマウスのアキレス腱の両方の筋腱接合部で増加しているようでした
mTor経路の阻害によるオートファジーの活性化は腱材料の特性に影響を与える
オートファジーの調節が機械的特性を変えるかどうかを評価するために、3D組織工学腱をTorin 1で処理し、引張力下での機械的強度を測定した。
ベースラインおよびコントロールの対照群と比較した場合、Torin1処理した人工腱では最大応力と最大ひずみは両方とも大幅に減少した。逆に、弾性係数には違いは見られず、ベースラインおよびコントロールサンプルは実施したすべての測定で同様の値を示した。これらの結果は、腱細胞の一定のオートファジーフラックスが、おそらく誤って折り畳まれたPC1の細胞内分解を維持することにより、腱の正しい構造を定義および維持することに関与しているという概念の証明を示している。
Torin 1 による mTOR の薬理学的阻害はコラーゲン原線維の形態を損なう
A～H TEM で分析した 3D 組織工学腱の代表的な横断画像。ベースラインおよびコントロール サンプルは、同様の原線維径と規則的な形状を示しました ( A ～F )。対照的に、Torin 1 サンプルは不規則な原線維を示しました ( G、H )。
本研究では、ヒト腱細胞における PC1 合成と恒常性の調節におけるオートファジーの重要な役割を明らかにしました。これは、私たちの知る限り、これまで文書化されていなかった役割です。健常腱組織におけるオートファゴソーム含有 PC1 の存在と、オートファジーが障害されたときの不溶性画分への PC1 の蓄積は、オートファジーが誤って折り畳まれた PC1 分子を優先的に分解して ER への蓄積を防ぐという仮説を裏付けており、これは Forrester らがマウス胎児線維芽細胞と骨肉腫細胞で最近発見した 。実際、腱細胞でオートファジー フラックスを阻害 (BafA1 と siAtg7 を使用) および促進 (Torin1 を使用) することによって異所的に誘導されるオートファジー フラックスのあらゆる変化が、PC1 の正しい合成、腱の恒常性、および特性に影響を及ぼすことを私たちは発見しました。特に、オートファジーの阻害により、CANXを介したERファジーが特異的に標的とするERサブドメインにPC1凝集体が蓄積することが観察されました。CANXは、ER内のモノグリコシル化糖タンパク質の折り畳みをサポートし、折り畳まれていないERタンパク質と一時的な複合体を形成し、折り畳まれるか分解されるまで続けます。しかし、ER常在オートファジー受容体RETREG1/FAM134BがCANXとLC3Bの両方と相互作用して、特異的なERファジー複合体を生成する新しい経路が最近発見されました。この複合体は、ER腔内の非ネイティブタンパク質を細胞質オートファジー機構に接続する、PC除去の特異的メカニズムが可能です。腱細胞では、CANX-PC1-LC3B複合体の形成が実証されており、PC1がER内に保持されている間にオートファジー基質になることが示されています。
Torin 1 による mTOR の薬理学的阻害はマトリックスの品質に影響を及ぼします。組織工学腱に加えられた引張力のグラフ表示。最大応力 ( B )、最大応力時のひずみ ( C )、および最大弾性率 ( D )
最後に、Torin 1によるオートファジーの薬理学的活性化が、細胞外コラーゲン原線維と3D組織工学腱の機械的特性に影響を及ぼすという証拠も示しました。Torin 1は、細胞の成長と増殖を調整し促進するラパマイシンキナーゼ（mTOR）キナーゼの強力かつ選択的な阻害剤です。mTOR経路はオートファジーを負に制御し、Torin 1はmTORを阻害することで細胞飢餓を模倣し、オートファジーを誘導します。オートファジー研究の先駆的な生物学的モデルである酵母では、 Tor阻害が、これまでに特定されている2つのERファジー受容体のうちの1つであるAtg40の上方制御を引き起こすことがわかっています。 Atg40は哺乳類のRETREG1/FAM134Bに類似したドメイン構造を持ち、
哺乳類だけでなく酵母でもmTOR阻害はERのリソソームへの送達を刺激する。
腱では、mTORシグナル伝達は試験管内における間葉系幹細胞の腱分化中にアップレギュレーションされるが、マウスにおける腱特異的なmTORの除去は、腱の形成不全と生体力学的特性の障害をもたらす。特に、他の結合組織の中でも、軟骨はオートファジーによって制御されることが広く報告されている。腱と同様に、軟骨は大量のコラーゲン性細胞外マトリックスで構成されており、mTOR阻害は軟骨変性の重症度の低下と関連している。オートファジーは、損傷したミトコンドリアを除去することで軟骨の完全性を保護し、ひいては酸化ストレスに対抗することが実証されている。しかし、軟骨変性におけるもう一つの潜在的な発症メカニズムは軟骨細胞ERストレスの増加であるが、ERの選択的オートファジーの役割はこれまで研究されていない。
本研究では、オートファジーが腱生理にも関与していることを示す新たなin vitroおよびin vivoの証拠を提示する。特に、オートファジーはPC1の正しい成熟の基礎となる品質管理機構として機能し、それによって腱組織の適切なECM合成と機械的特性に寄与していると考えられる。腱のECMリモデリング能力は腱病変の危険因子であることが示唆されているため 、この経路は腱損傷の発症に関与する重要なプロセスである可能性がある。しかし、オートファジーが腱にとって有益か有害かはまだ実証されていない。腱特異的な条件付きAtg5またはAtg7 KOマウスの使用は、将来この問題をより明確にするのに役立つ可能性がある。確かに、オートファジーは欠陥も過剰誘導も細胞に有害であるという二面性のあるプロセスであることを思い出す価値がある。これはおそらく腱の恒常性と正しいコラーゲン成熟にも当てはまり、オートファジーが腱障害の理解の背後にある知識不足を埋める可能性があると私たちは考えています。
まとめ
腱は、骨格筋から骨へ力を伝達し、人体の動きを可能にする、コラーゲンが密集した重要な特殊結合組織です。腱細胞は、生理的な組織負荷と病的な過負荷 (腱障害) に応じてマトリックスのターンオーバーを調整します。しかし、腱マトリックスの品質管理の調節はまだ十分に理解されておらず、腱障害の病因は現在のところ解明されていません。オートファジーは、細胞成分の分解とリサイクルの主要なメカニズムであり、いくつかの組織の恒常性維持に基本的な役割を果たしています。ここでは、オートファジーがヒト腱の生理機能にどのように寄与しているかを調査し、それがヒト腱組織で活発なプロセスであるという生体内証拠を示します。選択的小胞体オートファジー (ER ファジー) が、腱細胞外マトリックスの主要成分である I 型プロコラーゲン (PC1) の分泌を制御することを示しています。 mTOR 経路の阻害によるオートファジーの薬理学的活性化は、3 次元組織工学腱の超微細構造形態を変化させ、コラーゲン原線維のサイズ分布をシフトさせます。さらに、オートファジー誘導は組織工学腱の生体力学的特性に悪影響を及ぼし、引張力下での機械的強度の低下を引き起こします。全体として、私たちの結果は、オートファジーが PC1 品質管理を制御することで腱の恒常性を調節し、損傷した腱の発達に役割を果たしている可能性があるという初めての証拠を提供します。