Helicobacter pyloriの慢性感染による退形成腺への有効なコロニー形成者の選択

2023年1月8日 17:04

2023年1月4日
Helicobacter pyloriの慢性感染による退形成腺への有効なコロニー形成者の選択
著者 V. P. O'Brien, L. K. Jackson, J. P. Frick https://orcid.org/0000-0002-2254-1479, A. E. Rodriguez Martinez, D. S. Jones, C. D. Johnston https://orcid.org/0000-0002-6765-2383, N. R. Salama https://orcid.org/0000-0003-2762-1424 nsalama@fredhutch.orgAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.03116-22
PDF/EPUB
mBio
オンラインファースト
ABSTRACT
序論
結果
考察
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
ABSTRACT
Helicobacter pyloriの胃への慢性感染は、進行性の組織変化を引き起こし、最終的には癌に至るが、疾患発症中のH. pyloriがどのように組織環境の変化に適応しているかは十分に解明されていない。我々は、トランスジェニックマウス胃粘膜形成モデルにおいて、無関係な個体から分離された株は、胃への感染力、粘膜形成腺への定着力、粘膜形成関連タンパク質TFF3の発現変化において異なることを見いだした。一個人から分離された異なる病期のH. pyloriは、健康な胃腺とメタプラスチックの胃腺にコロニー形成する能力に差があった。形質膜の環境にさらされると、これらの菌株のうちの1つによって胃の高いコロニー形成が選択された。ゲノム解読の結果、シアル酸結合アドヘシン（SabA）遺伝子との組み換えにより、アドヘシンSabBの変異アリル頻度が変化していることが判明した。複数のH. pylori株でsabBを変異させると、正常胃組織と胃粘膜の両方への付着が強く減少し、マウスの胃のコロニー形成も高度に抑制された。このように、発病時の胃内環境の変化は、胃内コロニー形成の促進に関連する細菌アドヘシン遺伝子の変異を促進する。
重要性 Helicobacter pyloriの慢性感染は、胃癌発症の主要な危険因子である。ピロリ菌は、胃を構成する細胞に新たな細胞運命をもたらすなど、病気の進行に伴い変化する宿主組織環境に適応する必要がある。私たちは、同じ患者から採取した病気の初期と後期の代表的なH. pylori分離株を、病気に関連した組織変化を迅速に引き起こすことができるマウスモデルで試験しました。その結果、後期段階のH. pylori株のみが、疾患胃内環境に強固にコロニー形成することができました。また、胃に定着する能力は、sabBと呼ばれる細胞表面アドヘシン遺伝子の遺伝子変異と関連していることも明らかにしました。さらに、SabBは胃の組織への結合を促進し、後期高齢者株による胃のコロニー形成に重要であることを実験的に明らかにした。このように、H. pyloriは病気の進行に伴いゲノムを多様化させ、これらのゲノム変化は細菌の持続に重要な要因を浮き彫りにしている。
はじめに
Helicobacter pylori胃の感染は、胃がん発症の主要な危険因子であり、胃がん症例の75％は活動性感染が原因であると推定されている(1)。H. pyloriが胃癌を誘発するメカニズムは不完全に理解されているが、癌の発生に先立つ組織の変化についてはよく知られている(2)。すべての感染症は、胃粘膜の慢性炎症（胃炎）を引き起こす。これらの症例の一部は、萎縮性胃炎（酸分泌性胃壁細胞の消失）、SPEM（spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia）および／またはIM（intestinal metaplasia）へと進行し、異形成、そして最後に胃癌へと進行する（3, 4）。H. pyloriを形質転換前に除菌すると胃癌の発生リスクが低下することから（5）、H. pyloriが発癌に至る初期の組織変化を促進するというモデルが支持されています。
宿主と病原体の相互作用は、酸の恒常性、栄養の利用可能性、免疫反応の変動に伴い、感染を通じてダイナミックに変化する(6)。感染は通常、pHが中性に近い胃の前門部で成立する。しかし、胃体部の萎縮により、酸を分泌する胃壁細胞が失われると、ヒトおよび動物モデルにおいて、H. pyloriのニッチは胃壁から胃体部へと拡大する（7, 8）。これらの異なる地形領域において、H. pyloriは上皮の上の保護粘液層と腺内に見出される(9-11)。上皮の界面では、H. pyloriは宿主細胞だけでなく、周囲の環境にも直接エフェクターを分泌し、強固な炎症反応を引き起こす（12）。感染によって生じた炎症の副産物は、胃の上皮細胞に変異を蓄積させ、個体によっては発がん経路を活性化させるのに十分な量になると考えられている（13）。
我々は最近、H. pyloriの存在がSPEM、IM、異形成の軌跡を変えることを示した(14)。これらの研究は、H. pyloriが前がん組織の変化を調節し、その結果、感染細菌集団に選択的な圧力を与えることができることを示唆している。胃の環境における組織のリモデリングに対応するH. pyloriの存続は、突然変異によるゲノムの多様化と、ゲノム間およびゲノム内の組み換えによって促進されている(15)。同一人物から経時的に分離されたH. pyloriを比較すると、遺伝的多様性が認められ、単一宿主内の異なるニッチに適応していることが示唆される(16-18)。しかし、H. pyloriが形質膜組織環境と特異的にどのように相互作用し、また遺伝的に適応しているのかを明らかにした研究はほとんどない。本研究では、KRASによる胃粘膜上皮化モデルマウスを用い、胃粘膜上皮化の促進要因となる細菌の遺伝子型について検討した。
結果
モデルH. pylori株PMSS1は、胃の前がん病変の進行中に胃体部に強固に定着する。
我々は以前、Mist1-Krasマウスを用いて、H. pylori感染が胃体部における形質転換の進展にどのような影響を及ぼすかを検討した(14)。このマウスでは、タモキシフェン（TMX）の投与により、チーフ細胞に構成的活性Kras対立遺伝子（G12D）が発現し、4週以内に胃体部の痙攣性ポリペプチド発現性形質転換（SPEM）が急速に発症し、12週までに腸管形質転換（IM）および軽度異形成へと進行する(19)。本研究では、KRAS活性化マウス（KRAS+）または偽誘発マウス（KRAS-）を作製し、急性H. pylori感染を行い、H. pyloriと形質転換腺および健全な腺の相互作用を評価した（Fig. 1A）。まず、健常なマウスの胃に強固に定着するH. pylori株PMSS1を試験した（8, 20）。マウスは、SPEM（KRAS誘導後4週間）、腸溶性SPEM（SPEM-IC、KRAS誘導後8週間）、IM（KRAS誘導後12週間）中に1週間感染し、各時点で偽誘導マウスをコントロールとした（Fig.1B）。PMSS1は、以前に確立した野生型マウスをコロニー化する能力と同様に、各時点でKRAS-マウスを強固にコロニー化した。この株はまた、各時点でKRAS+マウスにしっかりと定着し、胃のメタプラスティックで生存できることが示された。興味深いことに、12週目の時点で、KRAS+マウスの一部は、偽誘導マウスよりも1～2ログ高い細菌量を示していた。これは、H. pyloriが肛門から胃体部へ拡大した結果ではないかと考えた。
図1

図1 胃の前がん病変の進行に伴い、ピロリ菌が胃体部にコロニーを形成する。(A) Mist1-Krasマウスにタモキシフェン（TMX）を投与し、上部細胞で構成的活性KRASを誘導し、形質転換の発生を促す、あるいはビヒクル（コーン油）で偽誘導を行った。SPEM（TMX後4週）、腸管化特性を有するSPEM（8週）、腸管形質転換（12週）発症後、マウスにHelicobacter pyloriを1週間感染させ、急性H. pylori-組織間相互作用を評価した。図版はBioRender.comで作成。(B）TMX投与（＋）または偽注射（-）の後、表示された週で、マウスをPMSS1に1週間感染させた。個々のマウスの細菌力価を示し、バーは中央値を示す。データは、1群あたりn = 7-13匹のマウスを用いたN = 2の独立した実験から得たものである。CFU, colony forming units; LOD, limit of detection. (C-E）厚い胃の切片（200μm）を、H. pyloriについて染色し、共焦点顕微鏡を介して画像化した。胃の全長に沿ってZスタックを収集し、蛍光ボクセルに基づいて細菌を列挙するために容積分析が使用された。(C) H. pylori strain PMSS1を1週間感染させたマウスの、KRAS誘導から12週間後の胃の切片の代表的な最大強度投影図である。灰色はDAPI、黄色はHp、青色はGS-II（メタプラシアマーカー）。スケールバー：50μm (D-E）KRAS-マウス（D）およびKRAS+マウス（E）の誘導または偽誘導の8週間後に感染したPMSS1についての腺分析の代表例を示す。グラフは、蛍光ボクセルで検出された腺内の細菌数を、胃の長さに沿ってミリメートル（mm）で示したものである。赤の棒は胃体部、青の棒は噴門部を示す。F）パネル1Bに描かれた処置および時点ごとに2〜3匹のマウスから得た厚い胃の切片で細菌を計数した。各点はパネル1Bの個々のマウスを表し、線は与えられたマウスのantrum（'A'）とcorpus（'C'）の値を接続する。
ヒトでは、H. pylori感染は、酸を産生する壁細胞のないantrumに最初に局在し、その後数年から数十年かけて徐々にcorpus（胃の本体）へ広がることができる（21）。同様の現象はマウスでも観察された。PMSS1は、野生型C57BL/6マウスでは、感染1週間後に前門部に局在し、1ヶ月以内に胃体部へと拡大した(8)。腺内の細菌を可視化するため、免疫蛍光顕微鏡を用いて、ホルマリン固定組織の厚い切片（200μm）でPMSS1を検出した（図1C、動画S1）。我々は以前、免疫蛍光顕微鏡を用いて、蛍光ボクセルに基づく胃腺内のH. pyloriの検出と定量を行った(8)。ここでは、この方法を用いて、PMSS1に感染したKRAS-マウスとKRAS+マウスの肛門腺およびコーパス腺の占有率を比較した。1つの時点につき2〜3匹のマウスの胃切片を調べた。各時点で、KRAS+マウスの胃腺内にはKRAS-マウスよりも多くのH. pylori細胞が存在していた（図1DからF；1Dと1Eでy軸の範囲が異なることに注意）。これは、胃腺の構造および微環境に対する形質転換がH. pylori腺のコロニー形成を促進すると思われる。KRAS+マウスでは、各時点で肛門腺よりもコーパス腺ではるかに多くの細菌が検出されたが（図1F）、KRAS-マウスでは予想通り肛門腺優位が維持された。このように、H. pylori strain PMSS1は、中胚葉性の胼胝腺に強固にコロニーを形成することができる。
補足資料
動画S1
タモキシフェン投与によりKRAS活性を誘導した12週間後に、H. pylori PMSS1株（緑）に1週間感染させたマウスの胃のZ-stack写真である。DAPI（青）は核を示す。GS-II（赤）は、腺の基部にある形質転換細胞を示す。組織はZeiss LSM 780共焦点顕微鏡で100倍の倍率で撮像された。ムービーS1、MOVファイル、4.7 MBをダウンロードする。
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遺伝子的に多様なH. pylori株が、胃のメタプラスト環境にコロニーを形成している。
ピロリ菌の分離株を用いて、健常胃と形質転換胃へのコロニー形成能力が異なる可能性のある菌株を探した（図2A）。NSH57は、よく研究されている臨床分離株G27のマウス適応版であるが、マウスへのコロニー形成は比較的悪い（22, 23）。この株は、我々の研究において、0/5のKRAS-マウスと1/9のKRAS+マウスにコロニーを形成した。7.13株は、十二指腸潰瘍株B128から派生したスナネズミ適応の発がん性H. pylori株である（24）。7.13株の力価はKRAS-マウスとKRAS+マウスで差はなかったが、KRAS-マウスの4/7のみが7.13株の力価を有していた。しかし、KRAS-マウスでは4/7、KRAS+マウスでは5/8しかコロニー形成されず、力価の中央値はPMSS1の力価より3〜4log低かった。このことから、胃の形質転換の状態にかかわらず、7.13は全体としてマウスに強くコロニー形成されないことが示された。このように、形質転換の誘導は、これらの菌株による胃のコロニー形成を促進しない。
図2

図2 最近分離されたC2株は、マウス胃へのコロニー形成をより良くするように適応できる。Mist1-Krasマウスを偽誘導（-）またはTMXで誘導（＋）した。8週間後、マウスをH. pyloriに1週間感染させた。(A) 感染1週間後の胃の力価を示す。検出限界（胃組織101CFU/g）以上にコロニー形成されたマウス全体の割合を各分離株名の下に記載している。C2「適応」株を分離したマウスを赤で示し、同じC2-Stock培養物（「ストック」）による感染と比較して、追加実験（B）に使用した。データポイントは、個々のマウスからの実際の値を表し、バーは中央値を表し、検出可能なCFUがないマウスは検出限界（LOD）以下にプロットされている。データはN = 2-3独立した実験から得たものである。*, P < 0.05; **, P < 0.01, Mann-Whitney U test.
次に、単一のヒト宿主から採取したH. pylori分離株のJ99株コレクション内の4つの異なる遺伝子サブグループから代表的な分離株への感染試験を行った（25、26）。J99株は、共有する遺伝子変異に基づき、4つの異なるサブグループに分類される(27)。サブグループ1Aと1Bは、患者が初めて十二指腸潰瘍を発症した1994年に採取された肛門生検標本から分離されたシングルコロニー株である。この患者は、感染を根絶するために処方された抗生物質の服用を拒否した。サブグループ2Aおよび2Bのシングルコロニー株は、6年後に酸分泌を失った萎縮性胃炎（メタプラズマの前段階）に進行した患者の肛門、体部および十二指腸の生検標本から分離されたものである（28）。J99株，SC4株，D1株，C2株は，それぞれサブグループ1A，1B，2A，2Bを代表する株である．
J99株は、KRAS-マウスで4/10、KRAS+マウスで3/11しか力価が回復せず、マウスへのコロニー形成が比較的悪い（Fig. 2A）。1994年のもう一つの株であるSC4株も同様にKRAS-マウス4/9匹、KRAS+マウス2/7匹からしか回収されなかった。D1株はKRAS-マウス8/11匹、KRAS+マウス12/13匹から回収され、メタプラシアの状態にかかわらずマウスに強固にコロニー形成することが示された。D1株はKRAS+マウスでKRAS-マウスより約1 log高い力価を示し（P < 0.01, Mann-Whitney U test）、この株は胃の形質膜に優先的に定着することが示唆された。もう一つの菌株であるC2は、KRAS-マウス5/10、KRAS+マウス5/10から回収された。C2株は、検出不可能なものから106 CFU/gを超えるものまで、全体的な細菌量に最もばらつきがあることが確認された。このことから、C2株は胃のメタプラスティック環境に適応する態勢を整えている可能性があると考えた。
この仮説を検証するため、マウスをC2株（図2A）またはKRAS+マウスから回収したC2株（図2Aで赤色で示した）に感染させた。驚くべきことに、C2-Adapted株の力価は、KRAS発現にかかわらず、C2-Stock株よりも有意に高かった（Fig. 2B）。C2-Stock株はKRAS-マウス2/5匹、KRAS+マウス2/7匹から回収されたが、適応株はテストしたすべてのマウスから回収された。このように、C2はin vivoで適応し、効率的にマウス胃に定着する態勢を整えているようである。C2-Adapatedの力価は、KRAS-マウスよりもKRAS+マウスで有意に高く（CFU中央値 5 ×104 vs 9 ×105、それぞれ、図2B）、この適応はメタプラスティックの環境を好む可能性さえあることが示唆された。これらの実験では、胃体部と前胃部の両方を含む胃の一部から細菌を培養した。C2-Adaptedの優先的なニッチが存在するかどうかを調べるために、胃体部および肛門部を別々に培養した。検出可能なCFUはすべてcorpusに存在した（Fig. S1）。
補足資料
図S1
C2-Adaptedは主にコーパスにコロニーを形成する。C57BL/6マウスをC2-Adaptedに感染させた。1週間後にマウスを安楽死させ、胃を無菌的に採取し、小弯にそって開腹した。胃は縦に二等分した。胃の半分（胃堤と胃堤を含む）をホモジナイズし、H. pyloriを培養した。もう一方の半分は、肉眼組織学に基づいて体部（'C'）と肛門部（'A'）を分離するために再度切断し、その断片をH. pyloriの培養のためにホモジナイズした。結果は、胃組織1gあたりのコロニー形成単位（CFU）としてプロットされている。各点は個々のマウスを表し、線は与えられたマウスの3つの組織片の値を結んでいる。ゼロは検出限界（'LOD'）以下でプロットされている。図S1、TIFファイル、0.1 MBをダウンロードする。
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H. pylori分離株は、メタプラスティック腺に感染する能力が様々である。
PMSS1はKRAS+マウスの体幹腺に強固なコロニー形成を示した（図1F）ので、他のH. pylori分離株もKRAS+体幹腺にコロニー形成することができるかどうかを検証した。薄切片（4μm）を抗H. pylori抗体で染色し（Fig. 3A）、盲検法で腺内の細菌の程度を半定量的にスコア化した。ここで、0は体腔腺に細菌が検出されないこと、1は体腔内に細菌がほとんど検出されないこと（視野あたり0〜5）、2は中程度から多くの細菌が体腔内に検出されること（視野あたり5超）を示している。これらの実験には、CFUが検出されたマウスだけが含まれる。予想通り、厚い切片の解析（図1EおよびF）に基づいて、PMSS1はKRAS+体液腺に強固にコロニー形成した（図3BおよびS1）。肛門腺では、試験したどの菌株の細菌もほとんど見られなかった（図示せず）。
図3

図3 H. pylori株は、異なる密度でコーパス腺に検出され得る。胃の薄切片（4μm）をH. pylori用に染色し、コーパスを細菌のコロニー化について評価した。(A）スコア2（robust gland colonization）のPMSS1に感染したマウスの代表的な画像を示す。黄色はHp、グレーはDAPI、スケールバーは50μm。(B）試験した各H. pylori株についての体腔腺コロニー形成スコアを示す。グラフの上部にマウスの数を示す。青色は強固なコロニー形成、黒色は疎なコロニー形成、灰色は観察可能なコロニー形成のない腺を示す。白は、胃の培養によってHp負荷が検出されなかったマウスを示し、これらは染色実験に含まれていない。
J99およびSC4に感染したほとんどのKRAS+マウスは、細菌負荷が検出されなかった（図2A）。検出可能な力価を有する少数のマウスでは、腺内にほとんど、あるいは全く細菌が観察されなかった（図3B）。このように、J99およびSC4は、マウスのコロニー形成能力が低く、メタプラスティック腺へのコロニー形成能力も低い。興味深いことに、D1株ははるかに良好な結果を示した。13匹中1匹だけが細菌力価が検出されず、10/13匹のマウスでKRAS+体液腺に細菌が観察され（図S2）、一方2/13匹のマウスは力価はあるが体液腺に細菌が検出されないという結果であった。再び、C2-Stock株は、最も多様な表現型をもたらした。14匹中8匹は力価がなく、解析から除外されたが、残りの6匹のうち3匹は腺で観察できる細菌がなく、1匹は細菌がまばらで、2匹は豊富な細菌を有していた。興味深いことに、このパターンはC2-Adapted株でも同様であった。8匹のマウスはすべて検出可能な力価を有していた(Fig. 2B)。腺分析のために無作為に5匹のマウスを選んだところ、3匹は腺に細菌を認めなかったが、1匹は細菌がまばらで、1匹は細菌が豊富であることが観察された。このように、C2-Adapted株はC2-Stock株よりもマウスによく感染するが、検出可能な力価を持つマウスでは、両株ともメタプラスティック腺に同程度にコロニー形成することがわかった。
補足資料
図S2
異なるH. pylori分離株は、KRAS+腺にコロニーを形成する性質が異なる。コーパス組織の代表的な画像を示す。灰色は核を、黄色はピロリ細胞を示す。矢印は腺内の菌の例を示す。スケールバー、100μm。図S2、TIFファイル、9.8 MBをダウンロードする。
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H. pylori株は形質膜の形成に異なる影響を与える。
我々は以前、Mist1-Krasマウスを用いて、H. pylori株PMSS1の慢性感染がKRAS+マウスのメタプラジア発生に影響を与えるかどうかを、模擬感染マウスと比較して検討した(14)。この実験では、KRAS活性を誘導するために、タモキシフェン投与前にマウスを感染または模擬感染させる。その結果、6週目にはSPEMマーカーと細胞増殖マーカーであるKi-67の発現がPMSS1感染マウスとモック感染マウスで異なることが判明した。PMSS1感染とKRAS活性を併せ持つマウスでは、Ki-67とSPEMマーカーCD44v10（ヒトCD44v9とオルソログ、以下CD44v）の発現が多く、IMマーカーTFF3の発現は少なかった(14)。そこで、ヒトの胃に定着する過程で進化した株、D1およびC2が同様の表現型を引き起こすかどうかを検証した。マウスは、KRAS活性の誘導前にD1、C2-StockまたはC2-Adaptedに感染し、6週目に安楽死させた（図S3）。胃の負荷の中央値は、異なるH. pylori株間で類似しており（図4A）、我々が以前にPMSS1について報告したものと同様であった（14）。興味深いことに、C2-Adapted株の力価はD1力価より有意に大きかった。また、感染1週間後よりも感染6週間後の方が負荷が低く、感染に対する適応免疫の発現と一致することに注目した（図1B、2Aとの比較）。
図4

図4 H. pylori分離株は、株依存的にメタプラズママーカーTFF3の発現を調節する。マウスを、示されたH. pylori株または模擬感染に感染させ、活性KRASを誘発させた。6週間後、マウスを安楽死させ、胃を評価した。(A)胃の負荷を示す。データポイントは各個体マウスからの実際の値を表し、バーは中央値を表し、検出可能なCFUがないマウスは検出限界（LOD）以下にプロットされている。(B-F）IHCを使用して、胃の薄切片における示された疾患マーカーの発現を検出した。データは、N = 2-3独立した実験からのものである。(B-D）モック感染マウスおよびH. pylori感染マウスにおいて、胃の形質転換マーカーの発現を評価した。1匹のマウスにつき3〜5枚の代表画像を定量的または半定量的に評価し、各マウスの中央値をプロットしている。グラフ上のバーは各処理群における中央値を示す。*, P < 0.05; **, P < 0.01, ns, not significant, Mann-Whitney U test. B-Dでは、各H. pylori群は模擬感染群に対して比較した。(B）Ki-67+/DAPI+核を列挙し、各画像のDAPI含有量（DAPI+画素の総数）に対して正規化した。(C）各画像のGS-II+, CD44v+（二重陽性）画素数を定量化した。(D）TFF3染色を盲検下で半定量的にスコア化した。(E-F）代表的な画像を示す。スケールバー、100μm。(E）胃をKi-67（赤）および汎サイトケラチン（青）、レクチンGS-II（緑）、およびDAPI（灰）に対する抗体で染色した。(F）胃をCD44v（緑）、TFF3（赤）、レクチンGS-II（青）、DAPI（灰）に対する抗体で染色した。
補足資料
図 S3
H. pylori株が形質転換体の発生に影響を与えるかどうかを評価するためのマウスモデル。マウスは様々なH. pylori株に初感染させるか、模擬感染させる。すべてのマウスにタモキシフェン（TMX）を投与し、KRASの活性発現を誘導する。6週間後、マウスは人道的に安楽死させる。胃を採取し、免疫蛍光顕微鏡による疾患マーカーの発現解析、H. pyloriの培養とシークエンスにより評価する。図版はBioRender.comで作成。図S3、TIFファイル、0.4 MBをダウンロードする。
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次に、免疫組織化学（IHC）を用いて、マウス体組織におけるKi-67（総DAPI含有量に対して正規化）、CD44vおよびTFF3の発現を評価した。比較のため、KRAS+マウスにPMSS1またはモック感染させた試験も行った（以前の研究（14）から、この研究のために2つの複製を追加した）。健康なマウスの体部では、Ki-67は腺の峡部（内腔付近）で発現し、レクチンGS-IIはムチンMUC6と結合し、頸部の細胞で発現し、CD44vとTFF3は発現していない。KRASの活性化によって引き起こされる形質転換では、Ki-67+細胞は峡部から下に広がり、GS-IIとCD44vは腺の基部にある細胞を標識し、TFF3は体全体に発現している。以前報告したように、PMSS1感染マウスでは、Ki-67とCD44vの発現が模擬感染マウスに比べて上昇し、TFF3の発現が低下していた（図4B〜F）。他のH. pylori株でもKi-67とCD44vの発現が上昇しており、これらの表現型は形質転換を伴うH. pylori感染に対する共通の反応である可能性を示している。しかし、H. pylori株PMSS1のみがTFF3発現を低下させた。このように、胃の前がん病変の進行のいくつかの特徴は、異なるH. pylori株間で共有されているが、他の特徴は株依存的である可能性がある。
D1株とC2株の塩基配列の比較から、外膜タンパク質の変異が明らかになった。
J99コレクションからの分離株は、異なる個体からの分離株と比較して多型が比較的少ないにもかかわらず、KRAS+マウスとKRAS-マウスで異なるコロニー形成パターンを示した（図2A）。つまり、D1は、例えばPMSS1よりもC2に遺伝的に類似していると言える。そこで、D1株とC2株の間に存在する349の多型遺伝子座について、全ゲノム配列解析の結果をもとに、コロニー形成の遺伝的要因の可能性を検討した(27)。本研究では、外膜タンパク質（OMP）および予測されるOMPを含む68の遺伝子で検出された123の非同義一塩基多型（SNP）および52のインデルを含む、アミノ酸配列に変化をもたらす175の多型に注目した。
H. pyloriゲノムは繰り返し領域に富んでおり、特にOMPをコードする遺伝子では高い確率で組み換えが可能である(29, 30)。したがって、これらの変化の多くは、ゲノム間あるいはゲノム内の組換え事象、あるいは配列同一性の高いパラログへのショートリードのミスマッピングを反映していると予想された。ClonalFrameMLを利用して、分岐したDNAの輸入によって導入されたと予測される変異を持つ遺伝子をバイオインフォマティクス的に予測した(31)。予想通り、これらの変異の半分以上（65％）は組換え事象を介して導入されたと予測され、14の遺伝子にのみ検出された。組換えから生じたと予測されない、C2とD1を区別する残りの46のSNPと16のインデルを表S1およびS2に示す。
補足資料
表S1
分離株D1とC2株間の非同義語SNPs（n = 46）。表S1、DOCXファイル、0.01 MBをダウンロードする。
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補足資料
表S2
分離株D1とC2株との間の挿入または欠失事象（n = 16）。表S2、DOCXファイル、0.01 MBをダウンロードする。
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ショートリードのデータをリファレンスの拡張リピートにマッピングすることの限界にさらに対処するため、パシフィックバイオサイエンス（PacBio）の単一分子リアルタイム（SMRT）シーケンス技術（32）を用いて、分離株D1のロングリード・アセンブリを作成しました。ロングリードアセンブリの結果、組換えによって導入されると予測されたこれらの多型の一部は、ショートリードが繰り返し領域で参照株とミスアラインした結果であることがわかった。しかし、14個の遺伝子のうち10個は、ショートリードとロングリードの両方のデータを用いて検出された変異や有意な構造上の差異を有していた（表S3）。10個のうち6個は外膜タンパク質をコードしている：sabA, sabB, homA, hopJ, hopK, and hopQ. jhp0440、jhp1031、hopQの3つの遺伝子は、タンパク質長が大きく変化していた。分離株D1では、タンパク質の開始位置が異なり、C2 HopQタンパク質よりも17アミノ酸短くなった。
補足資料
表S3
C2とD1の間の変異は、組換えの結果であると予測される。表S3、DOCXファイル、0.01 MBをダウンロードする。
著作権 © 2023 O'Brien et al.
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sabB遺伝子座は、生体内でダイナミックな遺伝子変換イベントを起こしている。
C2-Stockよりも強固に胃に定着したC2-Adapted（図2B）も、PacBio SMRTシーケンスプラットフォームを使ってシーケンスし、胃のメタプラスティック環境での急性定着時に遺伝的変化が起こるかどうかを検証した。注目すべきは、両株の間で異なっていた唯一の領域が、外膜タンパク質SabBのC末端であったことである。C2-Adaptedのコンセンサス配列はC2-Stockと5カ所で異なっており、すべて50塩基の短い領域内であった。553位のスレオニン（極性側鎖を持つアミノ酸）からアラニン（疎水性側鎖を持つアミノ酸）への変異である（図5A、赤色のアスタリスク）。個々のC2-Stockイルミナリードをさらに解析したところ、C2-Adapted株で検出された5つの多型は低い頻度で存在し、この集団には2つのアレルの存在が考えられることがわかった（Fig.5A）。優勢な対立遺伝子（バリアント1）の頻度は約80%であるのに対し、マイナーな対立遺伝子（バリアント2）の頻度は約20%であると推定される。PacBioシーケンシングリードを用いた同様の解析により、C2-Adapted株では、バリアント2の存在頻度が約40～50%に増加することが示された（図5A）。したがって、胃の感染時にバリアント2が選択されたのだと推測された。
図5

図5 C2株は、in vivo感染時に頻度が変化するsabB遺伝子座の2つの対立遺伝子を持つ混合集団である。(A）配列ロゴは、C2-Stock（上）およびC2-Adapted（下）のsabB C末端領域の各位置に各塩基が出現する確率を示したものである。アスタリスクはヌクレオチドバリアントが存在する位置を強調する。赤いアスタリスクは非同義変化を示す。(B)マウス胃のホモジネート上清からsabBを増幅し、配列決定するためのスキーマ。図版はBioRender.comで作成。(C）C2-Stockに6週間感染させた標記マウスの胃ホモジネート上清について、sabB変異体1（グレー）および変異体2（黒）のTOPOクローンの比率を示す図である。(D）D1株、C2変異体1株、C2変異体2株のsabBのC末端領域を示す配列アラインメントで、塩基変異は灰色で強調表示されている。赤色のアスタリスクは非同義変化を示す。C2-StockのsabAの相同領域も示している。
C2-Stock株とAdapted株から分離したゲノムDNAからsabBバリアント2をサンガーシークエンスで検出しようと試みたが、DNA抽出前に細菌をプレート上で培養するとバリアント1が選択されるためか、うまくいかなかった。この問題を回避するため、C2-Stock株に6週間感染させたマウスの胃のホモジネート上清（図5B）から直接DNAを単離した（図4Aより）。sabBをPCR増幅した後、TOPOクローニングとシークエンスにより、各マウスにおけるバリアント1と2の頻度を検定した。このことから、C2-Stockには2つの対立遺伝子が存在し、この遺伝的変異はin vivoでのコロニー形成時に動的であることが確認された（図5C）。
SabBにはSabAとHopQというパラログがあり、それぞれシアル酸やCEACAMへの結合を促進する(33, 34)。これらのアドヘシンやアドヘシン候補の間の遺伝子変換現象は、慢性感染時の炎症組織への接着を調節すると考えられている（35, 36）。C2 sabB variant 2の5つのSNPsはすべてsabAの相同領域と共通しており、組換え事象によってsabB variant 2が生じたことが示唆された(Fig. 5D)。また、D1株のsabB C末端領域もC2 variant 2およびsabAと5つのSNPsを共有していたが、D1 SabBはC2 SabBと全体的に大きく乖離していた（図S4）。したがって、sabBのバリアント2は頑健なマウス感染に関連しており、sabAの組み換えから生じたと考えられる。
補足資料
図S4
外膜タンパク質SabBは、PMSS1とJ99コレクションの菌株の間で異なっている。PMSS1とD1、J99、C2変異体1および2とのSabBタンパク質の配列アライメントを示す。アミノ酸の変化が示されている。図5Dで注目したC-末端領域は、赤線で示されている。図S4、TIFファイル、11.8 MBをダウンロードする。
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SabBは、マウス胃の組織付着とコロニー形成を促進する。
インシリコ解析の結果、sabBは感染時に重要である可能性が示唆されたため、我々はこの遺伝子についてさらに調査を行った。SabBがそのパラログと同様にH. pyloriの胃組織への付着を促進するかどうかを調べるために、C2-Adapted株とD1株でΔsabB変異体を作成し、親株と比較してex vivo胃組織への付着能を試験した。KRAS-胃組織では、コーパス、アントロームともに、親株の付着力が同系統のΔsabB変異体の付着力より大きかった（Fig.6A）。KRAS+胃でも同様であり（Fig. 6B）、特に親株はKRAS-組織に比べて約2倍もよく結合した。興味深いことに、KRAS-組織ではC2-Adapted株はD1よりも付着力が強かったが、KRAS+組織では両株は同程度であった。また、非常に扱いやすいモデル H. pylori 株である G27 の派生株で ΔsabB 変異を起こした（37）。この菌株のバックグラウンドでsabBを欠損させると、KRAS+の体腔および肛門組織への接着も著しく低下し、その欠損はsabBを中性の遺伝子間座で発現させると回復した（38）（Fig. 6C）。
図6

図6 SabBは、D1およびC2-Adapted株による健常胃およびメタプラスチックのコロニー形成を促進する。(A-C）組織付着は、以前に記載されたex vivo結合アッセイを使用して評価した（36）。表示されたH. pylori株をフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識し、マウス組織切片に適用し、視野（FOV）あたりの細菌スポットの数を定量化した。各データポイントは1FOVを示し、バーは中央値を示す。2つの異なる日に標識した細菌を用いて2〜3回のテクニカルレプリケーションを行い、代表的な実験を示す。(A）KRAS-組織に標記菌株を付着させた。C2A、C2-Adapted株。(B-C）KRAS+組織に標記菌株を付着させた。(C）G27の誘導体（LSH100）にsabB変異（ΔsabB）を生じさせ、中性遺伝子間座で相補（「comp.」）させた。(D-F）単一感染およびコンペティションを行い、野生型および同系統のΔsabB株を比較した。(D）Mist1-Krasマウスにおいて、活性KRASを誘導または偽誘導した。8週間後、マウスをC2-Adaptedと同系統のΔsabB変異体の1：1混合物で1週間感染させた。(E-G）C57BL/6マウスを、表示された株で1週間感染させた。データはN=2つの独立した実験から得たものである。データポイントは個々のマウスからの実測値、バーは中央値を表し、CFUが検出されなかったマウスは検出限界以下にプロットされている。DとFでは、同じマウスの野生型と変異型の力価を線で結んでいる。*はp＜0.05、**はp＜0.01、**はp＜0.001。A-Fについては、統計的有意性はMann-Whitney U検定で、Gについては、有意性はKruskal-Wallis検定で評価された。
最後に、SabBが生体内で必要かどうかを調べるために、ΔsabB変異体および／または親株をマウスに感染させた。まず、積極的なKRAS誘導または偽誘導の8週間後に、マウスをC2-Adapted株とΔsabB変異体の1：1混合物に感染させた（図6D）。ΔsabB変異体はKRAS-マウスではやや減弱、KRAS+マウスでは高度に減弱しており、SabBが胃のコロニー形成を促進することが示された。ΔsabB変異体はKRAS-マウス（すなわち健常者）でも表現型を有していたため、C57BL/6マウスを用いて、胃感染におけるSabBの役割をさらに検討した。C2適応ΔsabB変異体は、単一感染において親株よりも成績が悪く（図6E）、その生体内減衰は野生型株が存在するか否かにかかわらず起こることが示された。驚くべきことに、D1ΔsabB株は競合感染ではどのマウスからも回収されず（図6F）、単発感染では5匹中1匹からしか回収されなかった（図6G）。また、2番目のクローンはどのマウスからも回収されなかった（図6G）ことから、コロニー形成不全はsabBの欠如によるものであり、構築した菌株のオフターゲット効果によるものではないことが示唆された。以上のことから、SabBはH. pyloriの組織への付着と胃の感染を促進することが明らかとなった。
考察
H. pyloriの長期感染が前がん組織の変化を引き起こすことはよく知られているが、疾患発症の後期における宿主と病原体の間の動態についてはほとんど知られていない。本研究では、Mist1-Krasマウスモデルを用いて、胃の上皮化過程におけるH. pylori株特異的な胃と腺のコロニー形成の決定因子を検討した。その結果、H. pylori株は、胃の形質転換がある場合とない場合（+/-KRAS）で感染しやすい性質が異なることがわかった。KRAS+マウスに強固にコロニー形成できる株は、マウスの長期（4週間以上）慢性感染で観察されるのと同様に、コーパス腺に拡大したニッチを持つ（8, 10）。推定接着剤SabBは、健常胃と形質転換胃の両方の環境でのコロニー形成を促進し、形質転換（KRAS+）組織環境では特に重要であると思われる。さらに、H. pyloriのKRAS+マウスへの感染能力は、sabB対立遺伝子頻度の変化を通じて、メタプラスティック組織への急性感染時に選択される可能性がある。
同じ患者の異なる病期に由来するJ99株（25, 26）は、KRAS+マウスへのコロニー形成に差異を示した。J99株は、KRAS-マウス、KRAS+マウスのいずれにおいても比較的コロニー形成能が低い。早い時期に分離されたが、J99とは異なる遺伝子サブグループに属するSC4も、KRAS +/-マウスのコロニー形成が比較的不良であった。胃の萎縮期に患者から採取されたD1は、KRAS-、KRAS+両マウスに強固にコロニー形成し、力価はKRAS-胃よりKRAS+胃の方が高かった。一方、D1と同じ時期に発生したC2は、あるマウスでは比較的コロニー形成が悪く、他のマウスでは非常に強固なコロニー形成が見られた。C2は、sabB遺伝子座の低頻度対立遺伝子を選択することにより、KRAS+胃でのわずか1週間の感染でin vivoコロニー形成に適応することができることを明らかにした。
臨床分離株のすべてがKRAS+マウスのメタプラスティック胃に定着するわけではなく、メタプラスティックへの定着には細菌による決定因子が存在することが示された。臨床株が分離された宿主環境は、ある種の分離株をよりコロニー形成に適応させるのかもしれない。ゲノム解読の結果、C2株は外膜タンパク質SabBの変化により、胃のメタプラスチックの環境に素早く適応することが示唆された。
この研究以前は、SabBの役割についてはほとんど知られていなかった。他のグループの研究により、SabBの存在と相変化状態が、宿主のsirt7（39）とPREX2（40）の発現増加、およびマウスのコロニー形成の増加に寄与していることが示唆されている（41）。また、相変化によるsabBの "off "状態は、十二指腸潰瘍の発生しやすさと関連することが示唆されている(42)。しかし、我々の研究は、試験管内での増殖がsabBの遺伝子型を変化させることを示唆しており、このことがこれらの結論の基礎となるデータに影響を与えている可能性がある。
SabBは、CEACAMに結合するHopQとシアル酸に結合するSabAを含むパラロガスファミリーの一部であるタンパク質である(33, 34)。SabAは、H. pyloriとSPEM（metaplastic）細胞との相互作用を媒介することが以前に報告されており（43）、このタンパク質ファミリーがH. pyloriのツールボックスにおいて疾患後期の持続のための重要なツールであることが示唆されている。これらのタンパク質は、H. pyloriゲノムの中で最も可変性が高く、胃の環境の変化に素早く適応するために組み換えることができる(36, 44)。sabBにおける遺伝子変換イベントと対立遺伝子の多様性は、ヒトのH. pylori分離株のいくつかの全ゲノム配列決定データセットで確認されている（16, 17, 36）。SabBバリアント2内の塩基の変化は、C2-Stock株のパラログsabAと一致しており、これらの変化はsabAとsabB間のゲノム内組み換えイベントによって導入された可能性が高いことが示されている。このことは、H. pyloriが炎症組織への結合を調節するために、sabAとsabBを遺伝的に変化させていることを示唆している。このことは、H. pyloriが炎症組織への結合を調節するために、sabAとsabBを遺伝的に変化させている可能性を示唆している。しかし、それだけではないようである。C2とD1のその他の相違点としては、2つのフコース転移酵素、fucAとfucUの変異があり、これらは免疫検出を回避するために、細菌のリポ多糖を宿主上皮の表面糖に似せて修飾することに関与する(45)。またcomB8、comM、hsdR、hsdM、hsdSなどのDNA取り込み、代謝、修復にかかわる遺伝子にいくつかの変異が認められる。
ヒトでは、ピロリ菌は慢性胃炎の引き金となる。この胃炎は、胃の萎縮（酸を産生する壁細胞の消失）を引き起こし、その後、形質転換、異形成、そして最終的には癌へと進行する個体がある。このような病原性カスケードが始まると、ピロリ菌はそれ以上がんの発生に寄与せず、これらの組織の変化はピロリ菌の増殖に好ましくない、と考えられている。これは胃癌発生の "ヒット・アンド・ラン "理論と呼ばれる(46)。このことは、胃癌が発生したらH. pyloriの除菌は必要ないことを意味している。しかし、コロンビアのコホートによる長期研究では、形質転換病巣の発見後にH. pyloriを除菌すると胃癌のリスクが低下することが示され、胃癌の発生または加速にH. pyloriが関与していることが示唆されている(47)。悪性化前の組織変化における宿主-病原体間の相互作用についてはあまり研究されていないが、我々は最近、H. pyloriが疾患の進行に影響を与え、免疫反応を歪めるような形で組織と相互作用することを明らかにした(14)。胃の萎縮とSPEMの別のモデルマウスでは、壁細胞の化学的切除によって誘発され、H. pyloriは胃体部腺内のSPEM細胞と優先的に相互作用することが示された(43)。KRAS+マウスは、M2マクロファージの増殖を伴う中等度の胃炎を発症する（14, 19）。本論文では、このような既存の炎症環境にもかかわらず、ある種のH. pyloriが容易に胃に定着し、感染を軽減あるいは消失させることが予想されることを示す。さらに、いくつかのH. pylori株は、胼胝腺に拡大したニッチを示した。これらのデータは、メタプラスチックの環境がH. pyloriの増殖に適していること、あるいは望ましいことを示唆しており、発癌のヒットアンドアウェイ説を覆すものである。この新しいモデルは、H. pyloriと形質膜組織および形質膜腺に特異的な細胞型との相互作用をさらに探求する道を提供するものである。
我々の研究の限界は、組織の厚切りあるいは薄切りのいずれを用いたとしても、表面粘液は固定や切片化に耐えられないため、腺の上の粘液層の細菌を捉えることができないことである。胃のホモジネートを培養すると、胃腺と粘液の両方の細菌が捕捉されるが、胃体部と肛門部を別々に培養したところ、胃体部からしか細菌が回収されなかった。この実験では検出限界が比較的高かったため、肛門からの培養ができなかったのかもしれない。しかし、KRAS陽性マウスの厚切・薄切のいずれにおいても、ピロリ菌は圧倒的に体腔内に存在していた。このモデルにおける肛門のコロニー形成の役割とSabBの寄与の有無を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
H. pyloriがそのニッチを拡大し感染を増加させるためにSPEM、IM、異形成などの前腫瘍性組織の変化を利用するように進化してきたのか、前腫瘍はH. pyloriにとって有利ではないが許容される細菌増殖の意図しない結果であるかは不明である。しかし、我々の知見は、ある種の細菌株特異的な因子がメタプラスティック胃のコロニー形成を促進し、これらの因子は疾患発症の過程で単一の感染者における分離株間で変化し得ることを示唆している。SPEM時にコロニー形成を促進する細菌遺伝的要因の追加的研究により、感染リスクおよび／または疾患進行の重要な予測因子が同定される可能性がある。
材料と方法
倫理規定
すべてのマウス実験は、「National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」の勧告に従って実施された。Fred Hutchinson Cancer Centerは、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careから完全に認定されており、米国農務省、公衆衛生局、ワシントン州、および地元地域の動物福祉に関する規制を遵守している。実験は、Fred Hutch Institutional Animal Care and Use Committee（プロトコル番号1531）の承認を得た。
H. pyloriの培養。
本研究で使用したH. pylori株は、PMSS1（20）、7.13（48）、G27（49）誘導体のNSH57（23）およびLSH100（37）、ならびにJ99培養コレクション（25、27、29）から代表的に分離した4株であった。J99、SC4、D1、C2である。すべてのH. pylori分離株は、固体培地である馬血清寒天培地（HB寒天培地）上で増殖させた。HB寒天培地は、4％コロンビア寒天培地（Oxoid）、5％脱繊維化馬血液（Hemostat Labs）、10 mg/mL バンコマイシン（Thermo Fisher）、2.5 U/mL ポリミキシン B（Sigma-Aldrich) 、8 mg/mL アンホテリシン B（Sigma-Aldrich) および 0.2% βシロデキストリン（Thermo Fisher)を含んでいる。マウス胃のホモジナイズからH. pyloriの増殖に用いたHB寒天培地プレートには、マウス微生物叢の発育を防ぐために5 mg/l cefsulodin (Thermo Fisher), 5 mg/l trimethoprim (Sigma) and 0.2 mg/mL of bacitracin (Acros Organics, Fisher) を添加した。競合実験では、変異型（クロラムフェニコール耐性）菌と野生型（クロラムフェニコール感受性）菌を区別するために、15μg/mLのクロラムフェニコールを添加した。振盪液培養は、10％熱不活性化FBS（Gemini BioProducts）を添加したBB10, Brucella broth（Thermo Fisher）で培養した。プレート上および液体培養のH. pyloriは、トライガスインキュベーターを用いて微好気条件下（10% CO2、10% O2、80% N2）で37℃にて増殖させた。
Mist1-Krasマウスモデル。
すべての実験は、以前に記載されたMist1-CreERT2 Tg/+; LSL-K-RAS G12D Tg/+ ("Mist1-Kras") マウス（19）または指示通りのC57BL/6Jマウスを使用した。マウスは、滅菌マイクロアイソレーターケージに、照射済みげっ歯類飼料、オートクレーブ処理したコーンコブ敷料、および酸性化逆浸透精製水を入れて飼育した。マウスは、以前に記載されたように、耳かきから遺伝子型を決定した（19）。KRASトランスジーンの発現は、コーン油（Sigma-Aldrich）中の5mgのタモキシフェン（Sigma-Aldrich）の3日間連続の皮下投与により誘導された。シャム誘導マウスは、同じスケジュールでコーン油を皮下投与した。すべてのマウス実験は、以前に記載したように行った(14)。各感染のための接種物は、示された株または系統の5×107個の細胞であった。胃の切除後、森林胃を除去し、胃を小弯にそって開口した。胃は肛門部と胃体部の両方を含む3分の1または半分に等分された。培養のため、胃の一部を0.5 mLの滅菌BB10培地に入れ、重量を測定し、ホモジナイズした。ホモジネートの連続希釈液を非選択性HBプレート、または競争実験のために非選択性プレートとクロラムフェニコール含有プレートの両方にプレーティングした。ホモジネートをベンチトップ遠心分離機(Eppendorf 5424)で15000rpmでペレット化し、上清を-20℃に保存した。トリガスインキュベーターで5〜9日後、CFU（cfu）を計数し、胃組織1グラム当たりのCFUとして報告した。
腺の占有率分析
PMSS1腺の占拠は、以下の修正を加えて、以前に記載されたように評価した（8）。胃の1/3を1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS、Gibco）中の4％アガロースに埋め込み、Leica VT1200S Vibratomeを用いて200μm厚の縦切片に切断した。次に組織切片を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の3％ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）、1％サポニン（Sigma-Aldrich）および1％トリトンX-100（Sigma-Aldrich）からなるブロッキングバッファー中で穏やかに揺することにより4℃で一晩透過化させた。胃を1:1,000ウサギポリクローナル抗H. pylori PMSS1抗体（スタンフォード大学 Manuel Amievaのギフト）および1:2,000 GS-II 488（グリフォニアシンプルシフォリアの結合レクチン、Fisher）とともに4℃で2時間、穏やかにロッキングしながらインキュベートした。PBSで10分間洗浄した後、サンプルを1:2,000 Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG (Invitrogen) および 1:2,000 DAPIとともに室温で2時間、穏やかに揺らしながらインキュベートした。PBSで10分間洗浄した後、切片をProLong Diamond Anti-Fade Reagent（Molecular Probes）中のParafilm（Bemis）から切り出したイメージングスペーサーでスライドグラスにマウントし、VaLP（1：1：1 Vaseline:Lanolin:Paraffin ）でカバースリップを密封した。胃の切片は、Zeiss LSM 780 レーザー走査型共焦点顕微鏡、または UltraView スピニングディスク顕微鏡（PerkinElmer）で画像化された。胃腺内のピロリ菌を可視化するためにZスタックを収集し、Volocity（Quorum Technologies）で評価し、以前に記載したように蛍光ボクセルに基づいて胃腺内のピロリ菌を計数した(8)。
組織マーカーを評価するための免疫組織化学。
免疫組織化学は、以前に記載されたように行った(14)。簡単に言えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織の薄切片をヒストクリア溶液（National Diagnostics）で脱パラフィンし、濃度を下げてエタノールで再水和した。スライドをTarget Retrieval Solution（Agilent Dako）で15分間圧力釜で煮沸し、抗原賦活を行った。スライドをProtein Block, Serum Free (Agilent Dako)と共に室温で90分間インキュベートした。一次抗体（表S4）をProtein Block, Serum FreeまたはAntibody Diluent, Background Reducing（Agilent Dako）で希釈し、4℃で一晩スライドに塗布した。二次抗体はProtein Block, Serum Freeで1:500に希釈し、スライドは遮光して室温で1時間インキュベートした。スライドはDAPIを含むProLong Diamond antifade reagent (Invitrogen) でマウントし、室温で24時間硬化させてから画像化した。スライドはZeiss LSM 780レーザー走査型共焦点顕微鏡でZenソフトウェア（Zeiss）を使用して画像化した。H. pylori腺のコロニー形成の評価のために、各コーパスの全長をH. pylori細胞について検査し、サンプルあたり3〜5枚の代表画像を撮った。上皮疾患マーカー（Ki-67, CD44v, TFF3）の評価については、1サンプルにつき3〜5枚の代表画像を撮影し、サンプルは既報（14）と同様に定量化した。
補足資料
表S4
H. pylori腺のコロニー形成および上皮疾患マーカーの発現を評価するために使用した抗体およびレクチン。表S4、DOCXファイル、0.01 MBをダウンロードする。
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PacBioロングリードシーケンス
PacBio Sequel-I instrument (Pacific Biosciences, USA)を用いて1分子リアルタイムシーケンス(SMRT-Seq)を行った。配列決定するゲノムDNAは、Wizard Genomic DNA purification kit（Promega）を用いて精製し、Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit（Thermo Fisher）を用いて濃度を測定し、NanoDrop One（Thermo Fisher）を用いて純度を算出した。ゲノムDNAサンプル（3μg）は、ライブラリー調製前にG-tube（Covaris）を介して平均12kbのサイズにせん断された。その後、SMRTbell Express Template Prep kit 2.0mでライブラリーを作成し、プールしたライブラリーをBluePippinシステム（Sage Sciences）を用いて最小閾値4 kbでサイズセレクションを行った。D1株のシーケンシングリードをPacific Biosciences SMRTAnalysis pipeline version 8.0.0.80529 で処理し、Microbial Assemblerでアセンブルを行った。ゲノムアセンブリでは、21,312本のポリメラーゼリードをさらに210,582個のサブリードに分割し、N50値は5,441塩基、サブリードの総塩基数は767,735,588、平均カバー率は397×であることがわかった。D1のゲノムアセンブリの結果、1,685,094 bpの染色体配列という1つのコンティグが得られた。C2-Adapted株のシーケンシングリードをPacific Biosciences SMRTAnalysis pipeline version 8.0.0.80529 で処理し、Flye de novo assembler (50) を用いてアセンブルを実施した。ゲノムアセンブリでは、5,657本のポリメラーゼリードが得られ、さらに41,337個のサブリードに分割され、N50値は6,850塩基、サブリード塩基数の合計は141,837,408、平均被覆率は69×であった。C2-Adapted株のゲノムアセンブリの結果、1,653,204 bpの染色体配列という1つのコンティグが得られた。
バイオインフォマティクス
C2-Stock株とD1株のショートリードは、NCBI SRAデータベース（BioProject accession: PRJNA622860）からダウンロードした。D1とC2-Stockを区別する一塩基変異は、BreSeq v0.35.0ソフトウェアでデフォルトパラメータを用いてJ99 reference (AE001439) にショートリードをアライメントすることにより決定した(51)。ClonalFrameMLは、組換え候補部位の予測に使用した(31)。D1およびC2-Adapted単離株は、PacBio Sequel装置で配列決定し、長い配列リードを生成した。閉じた参照配列は、SMRT Link web-based analysis suite (https://www.pacb.com/support/software-downloads/) または Flye (https://github.com/fenderglass/Flye) assembly pipelines を用いて作成し、ゲノムは Helicobacter pylori (species ID: 210) を参照として Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC, [https://www.patricbrc.org]) annotation tool で注釈をつけた。ショートリードアセンブリで予測された組換えイベントは、ロングリードアセンブリから生成された配列と比較することで検証された。C2-Stock株とC2-Adapted株のゲノム比較は、C2-Adapted PacBioアセンブリをリファレンスとしてBreseq v0.35.0でアライメントして行った。ショートリード配列の各位置の各塩基の頻度行列は、既報のSAMtools pileup (27, 52, 53)にSequenzaパッケージのpileup2acgtを使用して作成した。ロングリードデータの頻度行列は、Minimap2 (54) を用いてリードをFlyeアセンブリにマッピングし、出力をbam-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount) で実行することにより生成した。配列ロゴは、ggplot2 (55) から ggseqlogo (https://github.com/omarwagih/ggseqlogo) を用いて作成した。
TOPOのクローニングと塩基配列の決定
DNAは、保存されているマウス胃のホモジネート上清から、酵素消化およびフェノール-クロロホルム抽出により単離された(56)。sabBのC末端領域をプライマー5'aagctcaaggcaatctctgtgc3'（sabBFor）および5'gatcatgcgtttgatccctgg3'（jhp0660R）（36）を用いてPCRにより増幅させた。PCR産物はアガロースゲル電気泳動で確認し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen)を用いてTOPOクローニングに使用した。カナマイシンでの選択後、クローンはsabBForとjhp0660RプライマーとGo Taqマスターミックス（Promega）を用いたコロニーPCRでスクリーニングした。jhp0660Rプライマーを用いたBigDye（Thermo Fisher）による染色体配列決定はFred Hutch Genomics Shared Resourceが行い、結果はSnapGene software version 5.2.4（Insightful Science）を用いて解析された。
H. pylori変異体の構築。
SabBの欠失変異体（ΔsabB）を4つのH. pylori株バックグラウンド（D1、C2-Adapted、LSH100 rdxA::aphA3sacB 、LSH100 hp0203-0204 intergenic region::sabB ）に構築した。D1およびC2-AdaptedからのsabBの欠失は、J99 sabB::catsacB (36)のgDNAで親株を形質転換することにより作製した。gDNAはWizard Genomic DNA purification kit (Promega)を用いて抽出した。クローンは、以前に記載されたように、15μg/mLクロラムフェニコールでHBプレート上で選択した(57, 58)。クローンは、プライマー5′ tgggttgagatcatgcaagcat 3′（jhp0658F）及び5′ gatcatgcgtttgatccctgg 3′（jhp0660R）（36）による診断PCR及びサンガー配列決定により確認された。LSH100 rdxA::aphA3sacB sabB::catsacB は同じ戦略で作製したが、D1ΔsabB から抽出した gDNA を使用した。系統は、オフターゲット変異の可能性を減らすために戻し交配された。変異を補完するために sabBは、プライマーMcGee_sabB_fwd (5′ tagaactagtggatccattcatttctcatgtttacaataaaaattactttaag 3′) およびMcGee_sabB_revを用いて株D1から増幅された。(5′ atcgataagcgaattcttaagcaaacataattgagatacgctataaagc 3′) を、カナマイシン耐性カセット (59) を含むpDYC40プラスミドに、In-fusion cloning (TaKaFusion) によりクローニングした。 Fusion cloning (TaKaRa)を介して、カナマイシン耐性カセットを含むpDYC40プラスミドにクローニングした。このプラスミドは、以前に特徴付けられた、中立的な遺伝子間染色体部位（hp0203-0204遺伝子間領域）（38）での相補性のために設計されている。得られたpDYC40::sabBプラスミドでLSH100を形質転換し、25μg/mLカナマイシンを含むHB寒天培地でクローンを選択した。次に、D1ΔsabBから調製したPCR産物で形質転換し、プライマーjhp0658Fおよびjhp0660Rを用いてcatsacBで中断されたsabB領域を増幅し、15μg/mLのクロラムフェニコールでHB寒天培地を選択することによって、本来のsabB遺伝子座を突然変異させた。全ての変異体はPCRとサンガーシークエンスで確認した。
ex vivo組織付着アッセイ。
ex vivo組織付着アッセイは、以前に記載したように行った(36)。簡単に言えば、アッセイに用いる細菌を10〜20mLのBB10（ブルセラブロス中の10％FBS）中で一晩培養し、600nmにおける光学密度（OD600）が0.5〜1.0となるようにした。細菌は遠心分離によりペレット化し、PBS-T（リン酸緩衝生理食塩水中の0.05% Tween 20）で洗浄した。細菌を炭酸バッファーに再懸濁し，DMSO（ジメチルスルホキシド，Alfa Aesar）に溶解したフルオレセイン5(6)-イソチオシアネート（FITC，Sigma）と10分間インキュベートし，酸化1％ウシ血清アルブミン（BSA）で洗浄した。標識生物は酸化1％BSA中で-80℃保存した。マウス胃組織切片のスライドは，Histo-Clear solution (National Diagnostics) で脱パラフィンし，イソプロパノール，エタノール，脱イオン水，PBSで再水和した．スライドを酸化1%BSAで2時間半ブロックした後、FITC標識細菌（OD600 = 0.01）でさらに2時間インキュベートした。過剰の細菌をPBS-Tで洗い落とし、スライドをDAPI入りProLong Diamond antifade reagent（Invitrogen）でマウントした。スライドを室温で24時間硬化させた後，Zenソフトウェア（Zeiss）を用いてZeiss LSM 780レーザー走査型共焦点顕微鏡で倍率400倍でイメージングした。組織に付着したFITC標識細菌の定量化のため，FIJIソフトウェア（National Institutes of Health）を用いて，肛門または体腔あたり4〜6枚の代表画像を解析し，各画像フィールドの細菌スポット数をカウントした．
統計解析
統計解析は、Prism v9 ソフトウェア（GraphPad）を用いて、各図の凡例で指定された検定に従って行った。0.05以下のP値は統計的に有意とみなし、アスタリスクで示した（, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001）.
データの入手方法
C2-Stock株の既発表のIlluminaシーケンスリード（27）は、NCBI SRAデータベース（BioProject accession number PRJNA622860）で入手可能である。本研究で行ったPacBio SMRTシーケンスから組み立てた完全なゲノムは、NCBI GenBankのBioproject PRJNA786001で入手可能である。
謝辞
H. pylori J99株コレクションを提供してくれたVanderbilt UniversityのRichard M. Peek, Jr.に感謝する。この研究は、Fred Hutchinson Cancer Research CenterのPathogen-Associated Malignancies Integrated Research CenterからのInnovation Grant、NIH R01 AI54423 to N.R.S. and NIH R01 DE027850 to C.D.J. Research was supported by Cellular Imaging, Comparative Medicine and Genomics & Bioinformatics of the Fred Hutch/University of Washington Cancer Consortium (P30 CA015704).による資金提供で行われたものである。V.P.O.はCancer Research Institute Irvington Fellowの支援を受けており、Sally Mandelを記念してDebbie's Dream Foundation-AACR Gastric Cancer Research Fellowship（18-40-41-OGRI）からも支援を受けていた。L.K.J. は Chromosome Metabolism and Cancer Training Grant (NCI T32 CA009657) の支援を受けている。一部の研究では、M. J. Murdock Charitable Trustからの助成金で購入した顕微鏡を使用した。
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Taylor JA, Bratton BP, Sichel SR, Blair KM, Jacobs HM, DeMeester KE, Kuru E, Gray J, Biboy J, VanNieuwenhze MS, Vollmer W, Grimes CL, Shaevitz JW, Sarama NR. 2020. 異なる細胞骨格タンパク質は、ヘリコバクター・ピロリにおける細胞壁合成の強化ゾーンを定義する。Elife 9.
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クロスリファレンス
国際標準化機構
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