トランスゴルジ蛋白質TVP23Bはパネス細胞のホメオスタシスとゴブレット細胞のグリコシル化を通じて宿主と微生物の相互作用を制御する
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掲載：2023年6月20日
トランスゴルジ蛋白質TVP23Bはパネス細胞のホメオスタシスとゴブレット細胞のグリコシル化を通じて宿主と微生物の相互作用を制御する
https://www.nature.com/articles/s41467-023-39398-1
ラン・ソング
ウィリアム・マカルパイン
...
エムレ・E・トゥラー
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ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：3652（2023）この記事を引用する
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メトリックの詳細
要旨
腸管免疫は、抗菌ペプチドを含む粘液ゲルによって常在微生物や病原性微生物から宿主を分離する腸管バリアが重要な役割を担っている。我々は、前方遺伝学的スクリーニングにより、化学物質による大腸炎や感染性大腸炎に罹患しやすいTvp23bの変異を発見した。トランスゴルジ装置膜タンパク質TVP23ホモログB（TVP23B）は、酵母からヒトまで保存されている膜貫通タンパク質である。TVP23Bは、パネス細胞の恒常性と杯細胞の機能を制御し、抗菌ペプチドの減少と粘液層の透過性をもたらすことを発見した。TVP23Bは、同じく腸のホメオスタシスに重要なゴルジ体タンパク質であるYIPF6と結合しています。YIPF6とTVP23Bを欠損した結腸細胞のゴルジプロテオームは、いくつかの重要なグリコシル化酵素の共通の欠損を有していることがわかった。TVP23Bは腸の無菌ムチン層の形成に必要であり、その欠損は生体内における宿主と微生物のバランスを崩すと考えられる。
はじめに
腸のホメオスタシスは、粘膜上皮、免疫系、そして宿主のマイクロバイオームとの相互関係によってもたらされる。腸管ホメオスタシスの維持に失敗すると、潰瘍性大腸炎やクローン病に見られるような消化管感染症や慢性炎症にかかりやすくなる1,2,3. 組織レベルでは、腸の恒常性は、制御された免疫細胞の活性化、粘液の分泌、上皮細胞の完全性、細胞増殖など多くの要因に依存しています4,5。分泌された粘液層は、常在菌や病原性微生物の移動を防ぐ重要なバリアであり、高度にグリコシル化された抗菌ペプチドを含浸した粘液層で構成されている1. 宿主と微生物の相互作用を制御する重要な役割を担っているにもかかわらず、パネス細胞や杯細胞がこの無菌層を維持する仕組みは不明なままである。
消化管の恒常性維持に重複しない機能を持つタンパク質を同定するために、我々はN-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）変異原マウスを用いた前方遺伝子スクリーニングを行い、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）に対する過敏症を引き起こす変異を決定した5、6。このスクリーニングにより、Tvp23bの欠損がDSS誘発性大腸炎に対する過敏症を引き起こすことを見出した。トランスゴルジ装置膜タンパク質TVP23ホモログB（TVP23B）は、哺乳類、酵母、植物に代表される22キロダルトンの膜貫通タンパク質である。酵母のTVP23ホモログは、ゴルジ体のプロテオーム解析により発見され、ゴルジ体への小胞輸送を制御していることが明らかになった7,8。シロイヌナズナのホモログであるEchidnaは分泌輸送に必要であり、機能喪失によりトランスゴルジ蛋白質の局在異常や細胞の伸長をもたらす9。しかし、哺乳類のタンパク質であるTVP23Bの機能、および腸の恒常性維持における役割については、これまで明らかにされていませんでした。
本研究では、TVP23Bが無菌の腸管粘液層の産生を介して腸の恒常性維持に必要であることを報告する。ゴルジのプロテオームと糖転移酵素の局在を制御することにより、TVP23Bの欠損は、糖鎖形成の異常と抗菌ペプチドおよび粘液の喪失をもたらす。TVP23Bを欠損したマウスでは、宿主と微生物の分離が失われ、感染性大腸炎に罹患しやすくなった。このように、TVP23Bは生体内において腸管バリア機能に必須の構成要素であることを示した。
研究成果
TVP23Bの欠損は大腸炎感受性をもたらす
ENUを用いてランダム変異を発生させ、既述の近親交配スキームを用いてヘテロ接合体およびホモ接合体の変異状態のマウスを評価した5,6,10。2039血統の第3世代（G3）マウス55,867匹に飲料水中の黄砂を投与し、黄砂投与7日後のマウスの体重を記録した5,11,12（図S1a）。試験した55,867匹のG3マウスのうち、合計306匹（全体の0.5%）がDSS処理7日目までに20%の体重減少を示しました（図S1b)。血統R4840のマウスで体重減少の表現型が観察され、常染色体半優性遺伝モデルを用いてDSSによる体重減少の表現型がマッピングされた。この表現型はChipotleと命名された。Chipotleの表現型は、第11染色体上のTvp23b（p = 6.33 = ×10-5）の推定ドナースプライス部位変異（イントロン1の第3ヌクレオチドのG > Tトランスバージョン）にマッピングされた（図1a、b）。これにより、エクソン1がスキップされ、141bpの欠失が生じ、開始コドンが失われ、予測できないタンパク質産物が生成されると予測された。
図1: チポトレ表現型におけるTvp23bのマッピングと検証。
a 遺伝子型ごとにプロットしたDSS処理7日目の体重減少率［REF Tvp23b+/+（n = 8）；HET Tvp23b+/chipotle（n = 13）；VAR Tvp23bchipotle/chipotle（n = 2）］。b 加法遺伝モデルを用いて計算した、chipotleとchipotle血統で同定された変異との間の関連性のP値を示すマンハッタンプロット。log10のP値（y軸）を変異の染色体位置（x軸）に対してプロットしたものである。赤と紫の水平線は、それぞれボンフェローニ補正ありまたは補正なしのP = 0.05の閾値を表す。Tvp23bの変異とチポトレ黄砂表現型との連関に関するP値を示す。 c CRISPR/Cas9標的マウスから1.4％黄砂処理後のTvp23b+/+、Tvp23b+/-、Tvp23b-/-のマウス（全群でn = 5独立マウス）について体重減少解析を行った。(**P = 0.0015, ***P < 0.0001) d, e DSSチャレンジ7日後のマウス個体の疾患活動指数と大腸長（各群独立したn = 5匹）. (*P = 0.043, **P = 0.015, ****P < 0.0001). f DSS投与7日後のTvp23b+/+およびTvp23b-/-大腸の代表的なヘマトキシリンおよびエオジン染色. スケールバー： 50 μm. g C. rodentium経口感染後11日目のマウスの疾患活動指数（各群についてn = 8独立したマウス、**P = 0.0064）. h, i Streptomycin耐性コロニー形成単位 C. rodentium経口感染後のFeces (***P = 0.0006) とCecal content (***P = 0.0003). データは平均値±s.d.で表され、有意性はDunnettの多重比較による二元配置分散分析（c）、Dunnettの多重比較による一元配置分散分析（d、e）、Mann-Whitney検定（g、h、i）によって判定した。データは少なくとも3回の独立した実験（c-i）の代表値である。
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Tvp23bのChipotle対立遺伝子が表現型の原因であることを確認するために、CRISPR/Cas9ターゲティングを用いて、Tvp23b遺伝子の1bpフレームシフト対立遺伝子を持つマウスを作製した。CRISPR/Cas9ターゲティングマウス（Tvp23b-/-）は、DSSチャレンジに感受性があり、投与8日目までに20%以上の体重減少を示した（図1c）。また、Tvp23b-/-マウスは、下痢、直腸出血、および大腸短縮によって示される疾患活動性の上昇を示した（図1d、e）。Tvp23b-/-マウスの大腸は、リンパ球の浸潤と陰窩構造の喪失を特徴とする著しい病理組織学的変化を示した（図1f）。これらのデータから、TVP23Bは黄砂に応答して腸のホメオスタシスを制御するために重要かつ非冗長であることが確認された。
この感受性が他の形態の大腸炎にも及ぶかどうかを調べるため、ヒトの腸管病原性大腸菌感染を模倣したCitrobacter rodentiumモデルの大腸炎を採用した。Tvp23b-/-マウスに大腸病原体C. rodentiumを経口感染させると、激しい体重減少や下痢が見られた（図1g）。マウスは細菌を除去することができず、便の細菌量が増加したことが示された（図1h、i）。これらのデータは、TVP23Bが腸内病原体の除去に必要であることを実証している。
TVP23B発現の腸管上皮内在性要件
タンパク質の位置を理解するために、CRISPR/Cas9を用いて3XFLAGエピトープタグ付きノックインマウスを作製した。腸では、TVP23Bタンパク質は上皮細胞層で高発現している。(図2a)。小腸および大腸組織の免疫組織化学的解析では、これらの組織の上皮に限定され、陰窩に最も顕著な染色パターンが認められた（Fig. 2b）。エピトープタグ付きマウスの腸の、免疫細胞が豊富な下層の固有層や平滑筋を含む筋層では染色は観察されなかった。
図2】腸管上皮におけるTVP23Bの発現と必要性。
a Tvp23b+/+およびTvp23b+/FLAGマウスの組織のイムノブロット解析。 b Tvp23b+/+およびTvp23bFLAG/FLAG遠位小腸および遠位結腸の組織の代表的抗FLAG免疫組織化学染色。骨髄キメラを作製し、1.4％DSS投与後の初期体重の割合（c）、疾患活動指数（d）および結腸長（e）を測定した（n = 5独立したすべてのグループ；**P = 0.0051, ***P = 0.003, ****P < 0.0001）. f-h Villin-Creバックグラウンドでフロックスアレルを用いたTvp23bの腸特異的欠失（Tvp23bFL/FL）は、体重減少、疾患活動性および結腸長を評価して、DSS感受性を試験した（各遺伝子型についてn = 8個体のマウス、***P = 0.0005，***P < 0.0001）。データは平均値±s.d.で表され、有意性はDunnettの多重比較による一元配置分散分析（c-e）、二元配置分散分析（f）および無対スチューデントt検定（g、h）によって決定された。データは、少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。
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大腸炎表現型においてTVP23Bを必要とする起源細胞を確立するために、骨髄キメラマウスを作成した。ドナーおよび/またはレシピエントは、CD45.1またはTvp23b-/-（CD45.2）系統のいずれかを用いた。ドナー細胞の再構成効率は、遺伝子型に関係なく、末梢血で94-97％であった。DSS投与後、Tvp23b-/-造血細胞を投与したキメラCD45.1レシピエントマウスは、WT骨髄の移植を受けたコントロールCD45.1マウスと同様に、体重減少を示さなかった（図2c）。キメラTvp23b-/-レシピエントマウスは、ドナーの骨髄に関係なく、DSSチャレンジから保護されず、8日目までに最初の体重の20%を失った。この体重減少は、直腸出血や下痢の増加（図2d）、結腸の長さの減少（図2e）と一致した。さらに、TVP23B欠損動物の末梢免疫プロファイルは、野生型同腹子と比較して、主要な免疫サブセットの発達、抗体産生、アルデヒド産生において類似していた（補足図S2およびS3）。これらのことから、Tvp23b-/-大腸炎感受性表現型は、上皮細胞内在性欠損によって引き起こされることが示唆された。
上皮内在性欠損を確認するために、TVP23Bのエクソン2を標的とした条件付き対立遺伝子を作製し、その欠失によりネイティブタンパク質にフレームシフト変異が生じるようにした。マウスをVillin-Creバックグラウンドに交配して腸上皮特異的欠失を作製し、DSSで試験した。Tvp23bFL/FL;Villin-CREマウスは、Tvp23bFL/FL同腹子に比べ、体重減少、DAI増加、大腸短縮を示し、黄砂に対して敏感であった（図2f-h）。このデータは、TVP23Bが大腸炎を予防するために腸管上皮に必要であることを確証するものである。
TVP23Bはパネス細胞および杯細胞の形成と機能に必要である。
Tvp23b-/-動物の表現型が造血外来性であることを踏まえ、恒常性（すなわち、DSS非処理）の状態での腸管上皮を検討しました。組織学的に、Tvp23b-/-マウスの回腸では、PAS染色とリゾチームの免疫蛍光染色を用いて顆粒を含む細胞の欠如が観察された（図3a、b）。超微細構造解析では、パネス細胞の消失に伴い、小腸陰窩の密なコア顆粒（DCG）が小さくなり、DCGを含む細胞が少なくなっていることがわかった（図3c）。次に、質量分析計を用いて、終末回腸における小さな可溶性ペプチドを測定した。Tvp23b-/-の回腸では、23α-ディフェンシンがTvp23b+/-のレベルに対して少なくとも2倍減少していることがわかった（図3dおよび補足データ1）。このように小さな抗菌ペプチドが失われたことは、パネス細胞の恒常性または機能の欠陥と一致する。また、Tvp23b-/-の回腸では、抗菌ペプチドを含むパネス細胞特異的遺伝子の転写が著しく減少しており、パネス細胞の欠如が観察されたことと一致している（図3e）。これらのデータから、TVP23Bは生体内のパネス細胞の恒常性に必須であり、TVP23Bの欠損により、パネス細胞による抗菌機能が失われることが示された。
図3 TVP23B欠損小腸におけるパネス細胞および抗菌ペプチドの欠損。
a Tvp23b+/+およびTvp23b-/-の終末回腸の代表的な過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色と電子顕微鏡写真。 b Tvp23b+/+およびTvp23b-/-組織のリゾチーム免疫蛍光染色。d Tvp23b+/+およびTvp23b-/-の終末回腸の小さな可溶性ペプチド画分から質量分析によって決定された相対存在量の複合プロット（各遺伝子型についてn = 3）。正規化したタンパク質量［変異体サンプル／（変異体サンプル）＋（HETサンプル）］をY軸にプロットしている。Y=1の点は、変異体サンプルで同定されたタンパク質のみを示し、Y=0の点は、HETサンプルで同定されたタンパク質のみを示す。タンパク質量はスペクトル数と相関がある e パネス細胞特異的遺伝子、α-ディフェンシン-1、α-ディフェンシン-4、α-ディフェンシン-5、α-ディフェンシン-21、α-ディフェンシン-29、リゾチーム1の相対mRNA発現（n = 独立したマウスの回腸サンプル4個； ***P < 0.001, ****P < 0.0001). データは平均値±s.d.で表され、有意性は対になっていないStudent t-testによって決定された（e）。データは、少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。
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大腸の同様の検査では、Tvp23b-/-動物でアルシアンブルーによる杯細胞空胞の染色が減少したが、杯細胞の絶対数には有意な減少は認められなかった（図4a）。大腸上皮mRNAのバルクRNA-seqを用いると、主要な杯細胞マーカー（Muc2、Atoh1、Spdef1、Tff3）に変化は認められず、これは、変異動物において杯細胞の数が変化していないことと一致した（図S4）。電子顕微鏡を用いてゴブレット細胞を画像化したところ、野生型同腹子に比べ、異常に隔壁が多く、小さな粘液を含む液胞を持つことがわかった（図4b）。同様の表現型は杯細胞分化オルガノイド培養でも見られ、Tvp23b-/-細胞では平均PAS染色空胞サイズ（7.9 μm vs 5.3 μm）が小さく、この表現型は上皮に内在し微生物群に依存しないことが示されました（図4c、d）。ムチン分泌における役割を明らかにするために、遠位結腸を分離し、ムチン分泌を生体外で試験した。Tvp23b-/-の結腸は、ベースラインでも、恒常的な成長条件下でも、粘液の層が薄くなっていた（図4e、f）。LPSによる大腸の刺激は、ムチンをさらに分泌するために、センチネル・ゴブレット細胞を活性化することが知られている13。この反応は、Tvp23b-/-の大腸では消失していた（図4g）。これらのデータから、Tvp23b-/-マウスでは、粘液層を形成する大腸杯細胞の機能が損なわれていることがわかる。
図4：杯細胞の形態異常と粘液産生。
a, b Tvp23b+/+およびTvp23b-/-動物から得た遠位結腸の代表的なアルシアンブルー染色および電子顕微鏡写真。 c, d Tvp23b+/+およびTvp23b-/-動物からの代表的PAS染色コロノイド（20×）。コロノイドからのPAS+空胞サイズの定量化（3匹の独立したTvp23b+/+マウスおよび3匹のTvp23b-/-マウス由来のn = 80およびn = 73個のGoblet細胞、****P < 0.0001）. e, f Tvp23b+/-およびTvp23b-/-結腸からの生体外粘液厚および増殖率（n = 10独立したマウス/グループ **P = 0.0017, ***P = 0.0002）g Tvp23b+/-およびTvp23b-/-結腸におけるリポ多糖による生体外粘液誘導（n = 5独立したマウス/グループ *P = 0.0149, **P = 0.0091). データは平均値±s.d.で表され、有意性は無対称の学生t検定（d）一元配置分散分析とダネットの多重比較（e、f）および二元配置分散分析（g）によって決定された。
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宿主微生物がTVP23B欠損マウスの粘液層に侵入し、組織をコロニー化する
大腸の粘液への推定微生物の浸透を定量的に評価するために、蛍光ビーズを生体外で可視化した。Tvp23b+/-の大腸と比較して、Tvp23b-/-の大腸はSyto9染色組織と微生物サイズのビーズとの間の距離が小さかった（図5a、b）。また、Tvp23b-/-の大腸では、ヘテロ接合体の同胞と比較して、ビーズの粘膜層への浸透が増加した（図5c）。このことは、非吸収性FITC-Dextranに対する腸管透過性の増加によって強調された（図S5a）。これらのデータは、TVP23Bの主要な大腸機能は、ムチンを含む液胞の含有量と形成、およびその分泌を制御することである可能性を示している。TVP23B欠損動物は、同腹の対照動物と比較して、より浸透性の高い粘膜層を有しており、パネス細胞の抗菌ペプチドの喪失と相まって、過剰な宿主-微生物相互作用の可能性を強調している。
図5: 宿主と微生物の分離不全。
a Tvp23b+/-およびTvp23b-/-同腹子から得た組織のx/z軸断面を示す代表的な共焦点Zスタック；組織（青）、1μmビーズ（赤） b, c 大腸組織のビーズまでの距離と透過性を正規化（遺伝子型ごとにn = 8、**P = 0. 0072）。 d, e 蛍光in situハイブリダイゼーションを用いた大腸粘膜表面に対する微生物群の局在の可視化と定量化。 d 切片を、すべての細菌の16S rRNAを認識するプローブ（緑）にハイブリダイゼーションし、DAPI（青）でカウンターステインした。e マウス1匹につき少なくとも20切片で16S FISHから上皮の近くまで定量化した内側粘液層の平均距離（遺伝子型ごとにn = 4, ***P = 0.0006）．f レクチン小麦胚芽アグルチニン（WGA）と組織および細菌のカウンターステイン（Syto9、青）による代表的な粘液染色。 g 遠位結腸の16S rRNA遺伝子コピー数のqPCRにより粘膜関連細菌を定量化（n = 4 per genotype, ***P = 0.0001)。データ（c、e、g）は平均値±s.d.で表し、有意性は対にしないStudent t-testで判定した。
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16S FISHを用いて、上皮細胞と微生物叢の分離を可視化し、Tvp23b-/-大腸では宿主と微生物の間の無菌帯が大きく減少していることを示した（図5d、e）。細菌と粘液プルームの共染色により、Tvp23b-/-大腸の薄い粘液層内に多数の細菌が存在することが示された（図5f）。定量的16S PCRにより、TVP23B欠損動物では大腸組織関連細菌数が増加しており、組織への浸透とコロニー形成が増加していることが示された（図5f）。粘膜関連菌の16S配列決定も同様であったが、Tvp23b-/-マウスの組織内ではHelicobacter種が圧倒的に多いことが明らかになった（図S5b）。しかし、糞便ペレット中の細菌量については、Tvp23b-/-マウスとTvp23b+/-マウスの間に差は認められなかった（図S5c）。分割型糸状菌（SFB）の制御とレベルは、腸の炎症活性化の重要な要因である14。しかし、Tvp23b-/-では、組織関連細菌のSFBの有意な増加は観察されなかった（図S5d）。これらのデータから、TVP23Bは宿主と微生物の分離を維持するために重要であることが示された。TVP23Bの欠乏は、宿主上皮への常在微生物および病原性微生物による近接および侵入の増加をもたらす。
TVP23Bは上皮細胞タンパク質のグリコシル化を制御している
Tvp23b-/-の大腸では、WTの大腸に比べてレクチン染色が減少し、粘液層が薄くなっていることが観察された（図6a）。このことは、Tvp23b-/-結腸では粘液プロテオームが正常で、粘液量あたりのMUC2分子の数も正常であるにもかかわらず、である（図6b、c）。しかし、抗Muc2抗体を用いた結腸細胞のイムノブロットでは、Tvp23b-/-のサンプルは分子量が減少しており、グリコシル化または他の翻訳後修飾が減少している可能性が示唆された（図6d）。グリコシル化を直接調べるために、TVP23B欠損結腸細胞の偏りのないグリコミ解析を行った（補足データ2）。Tvp23b-/-結腸細胞では、コア3のO-グリコシル化が9倍減少していることが観察された（図6e）。O-グリコシル化コア1-4は、タンパク質に付加された最初の糖鎖部分によって決定される（図S6a）。O-糖鎖のシアリル化にはより小さな減少も見られた（Fig. S6b）。ムチンを含む腸管上皮細胞タンパク質のシアル化には、免疫調節作用があることが示されている15,16,17。Core-3 O-グリコシル化は腸管ムチンの主要なO-グリカン形態であり、宿主と微生物の分離に必要である18。したがって、Tvp23b-/-結腸細胞におけるMUC2分子量の低下とグリコームの変化は、TVP23Bがグリコシル化をサポートすることで腸管粘液形成に必要であることを示唆している。
図6：Tvp23b-/-結腸細胞の糖鎖形成異常。
a Tvp23b+/-およびTvp23b-/-結腸からの粘液層の代表的な染色。 b 結腸粘液層組成のプロテオーム解析。 c 粘液のフェムトリットルあたりで測定したMuc2濃度。(n=1群あたり5匹の独立したマウス) d Tvp23b+/-およびTvp23b-/-動物3匹の別々の結腸細胞におけるMucin-2のイムノブロット。 e 遺伝子型あたり2匹のマウスで3つの別々の実験から得られたTvp23b+/+およびTvp23b-/-結腸細胞におけるO糖鎖の代表コアリンケージ解析。データ（c）は平均値±s.d.で表され、有意性は対にならないStudent t-testによって決定された。
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TVP23Bはゴルジ体タンパク質YIPF6と複合体を形成している
酵母TVP23と同様に、哺乳類TVP23Bは細胞分画実験においてゴルジ体に強く局在した（図7a）。酵母TVP23は，哺乳類YIPF619のホモログを含むいくつかの直接結合パートナーを持っていることも注目された．哺乳類YIPF6は、以前、DSS感受性スクリーニングにおいて、腸のホメオスタシスの制御因子として関与しており、欠損すると、TVP23B欠損動物で観察されたのと同様の細胞表現がパネス細胞や杯細胞で生じる20。我々はまず、この相互作用を共免疫沈降法で確認しようとした。我々は、一過性に共トランスフェクトした細胞から、HAタグのTVP23BとFLAGタグのYIPF6を免疫沈降させた（図S7a）。さらに、FLAGタグYIPF6を導入した杯細胞株（HT29-MTXおよびLS174T）において、YIPF6と結合した内因性TVP23Bを検出した（図7b）。興味深いことに、Yipf6欠損動物（Yipf6Klz/Y）は、結腸細胞におけるTVP23Bのレベルが有意に低下しており、YIPF6がTVP23Bの発現に必要であることを示していた（図6c）。TVP23Bのこの安定化は、YIPF6共トランスフェクションにより293T細胞でも見られた（図S7b）。これらのデータは、TVP23BとYIPF6がin vivoで互いに結合し、YIPF6が細胞内のTVP23Bの安定性に必要であることを示す。
図7：TVP23BおよびYIPF6欠損結腸細胞のゴルジプロテオミクス。
a Tvp23b+/FLAG マウスにおける FLAG-TVP23B のゴルジ体濃縮を示すイムノブロット b 一過性にトランスフェクトした HT29-MTX および LS174T ヒト杯細胞株からの YIPF6 と TVP23B の共免疫沈降 c YIPF6 欠損半接合性雄マウス（Yipf6Klz/Y）における FLAG-TVP23B 蛋白質の安定化阻害．d Tvp23b-/- colonocytes のゴルジ体濃縮画分の複合プロテオーム（littermate control と比較） e Yipf6klz/y colonocytes のゴルジ体濃縮画分の複合プロテオーム（littermate control と比較）. dとeはLC-MS/MSで同定されたタンパク質。正規化タンパク質量［変異体サンプル／（変異体サンプル）＋（WTサンプル）］をY軸にプロットした。Y=1の点は、変異体サンプルで同定されたタンパク質のみを示し、Y=0の点は、WTサンプルで同定されたタンパク質のみを示しています。タンパク質の存在量は強度と相関がある。f Tvp23b-/-およびYipf6Klz/Yサンプルの両方で強度が2倍減少したタンパク質のベン図。 g, h Tvp23b-/-およびYipf6Klz/yサンプルのゴルジ濃縮画分におけるB3GNT6のイミュノブロット分析。すべてのゴルジプロテオミクスは、各サンプルで遺伝子型ごとに少なくとも4匹のマウスを用いて3回実施した。すべてのイムノブロットは、少なくとも3つの独立した実験の代表である。
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TVP23BとYIPF6がゴルジ体プロテオームを制御する
TVP23BとYIPF6は、いずれもゴルジ体への細胞内輸送に関与しているとされている21,22。これらのタンパク質の欠如がゴルジの組成を決定的に変化させるかどうかを検証するために、ゴルジプロテオームを調べるために、偏りのない質量分析的アプローチが取られた。Tvp23b+/+ および Tvp23b-/- 動物の結腸上皮から，スクロース沈降法によりゴルジ体を分離し，質量分析した（図 7d）．WTのゴルジ体に比べてTvp23b-/-のゴルジ体では，117個のタンパク質が50％以上減少し，308個のタンパク質が2倍以上増加した（補足データ3）．Yipf6+/Y と Yipf6Klz/Y のゴルジ体についても同様の解析を行ったところ，Yipf6Klz/Y のゴルジ体では対照ゴルジ体と比較して 179 個のタンパク質が減少し，196 個のタンパク質が増加していた（図 7e および補足データ 3）．いずれの変異体でも発現が減少したタンパク質のうち、25 個のタンパク質が Yipf6Klz/Y と Tvp23b-/- ゴルジ体の両方で減少し、そのうち 10 個は糖転移酵素としての機能が説明されている（図 7f）。その他、タンパク質の還元に重要なタンパク質（QSOX1）、イオンチャネル（SLC35A1、ATP2C2）も糖鎖形成に重要であることが知られている23,24。B3gnt6 は腸管ムチンの core-3 糖鎖付加に必要であり18，Yipf6Klz/Y と Tvp23b-/- の両ゴルジ体で完全に消失した（図 7d, e）．ゴルジ体画分には，より高分子量の，おそらくグリコシル化された B3GNT6 が見られ，これは変異動物では失われていた（図 7g, h）．このタンパク質の消失は、別のゴルジ体局在糖転移酵素であるGALNT4が変異体では変化しないのとは対照的である（図S8）。これらのデータから、TVP23B と YIPF6 は、腸のバリア機能に必要な糖転移酵素を含む主要なゴルジ体酵素の組成を協調して制御していることが示唆された。
考察
ENU を用いた生殖細胞系列遺伝学と CRISPR/Cas9 生殖細胞系列ターゲティングにより、ゴルジ体常在タンパク質 TVP23B の損傷変異が、DSS 誘発性大腸炎および感染性大腸炎に感受性を与えることを明らかにした（これはおそらく同じ粘液欠陥に起因すると考えられる）。Tvp23b-/-の大腸は、粘液層が薄く、浸透しやすいため、宿主と微生物の相互作用に影響を与える。これは、グリコシル化、特にコア3結合O-グリコシル化およびシアリル化における主要な欠陥に起因すると考えられる。分子的には、TVP23Bは、パネス細胞や杯細胞の恒常性に必要なもう一つのゴルジ体タンパク質であるYIPF6と結合して安定化している。これらのタンパク質は協調してゴルジプロテオームを制御し、B3GNT6はゲル形成ムチンであるMUC218のコア3 O-グリコシル化に必要である。これらのデータから、TVP23Bが腸の恒常性の維持と宿主と微生物の相互作用に必要であることが示された。
また、ゴルジ体プロテオミクスと糖鎖解析の結果、B3GNT6という糖転移酵素の存在が明らかになりました。TVP23BとYIPF6欠損のゴルジ体では、合計10種類の糖転移酵素が共通して減少しており、TVP23Bが腸の糖鎖形成に広く影響していることを物語っている。TVP23B欠損ゴルジ体で減少した他のタンパク質、QSOX1やSlc35a1も、直接転移酵素としては作用しないが、グリコシル化に影響を与えることが知られている23,24。TVP23B欠損の全体的な影響は、先天性糖鎖異常症（CGD）に類似している。CGDは、神経障害、成長障害、造血障害など幅広い影響を持つことが多いが、深部腸管障害も含まれることが判明している25。最近の報告では、ヒトの炎症性腸疾患の単発型が大腸の糖鎖異常と関連していることが報告されている15。本研究は、哺乳類の腸における糖転移酵素の分布についての理解を深めることで、糖鎖形成のカノンに追加するものである。
未解決の問題は、Tvp23b-/-およびYipf6Klz/Y動物におけるパネス細胞の喪失を理解することである。Mucin-2はパネス細胞に見られる高密度なコア顆粒を取り囲んでおり、Muc2欠損はパネス細胞数の減少につながる26。この経路を欠損した動物ではパネス細胞が欠損することが示されていることから、適切なグリコシル化が失われることでフォールディングプロテインが増加し、細胞死を引き起こすと推測することができる27,28。将来的には、これらの動物からパネス細胞を精製するか、パネス細胞特異的な切除を行うことで、このメカニズムが解明されるかもしれない。
TVP23Bマウスは、すべての細胞型において分泌の一般的な欠損を示すわけではなく、これまでのところ表現型は腸の分泌細胞に限定されている。TVP23Bの発現は多くの免疫細胞サブセットで見られるが、明白な表現型は見いだせなかった。これは、TVP23Bの冗長性や発現パターンを含む多くの要因によるものと思われる。マウスはTVP23AとBの両方を持ち、ヒトはTVP23A-Cを持っている。これらの複数のホモログは、異なる細胞タイプにおいて冗長な機能または代償的な役割を果たすと考えられ、調査に値する分野である。
TVP23Bの結合パートナーとしてYIPF6が同定されたことは、特に注目すべきことである。両タンパク質はENU前方遺伝学的スクリーニングにより同定され、変異によりDSS感受性とパネス細胞および杯細胞の形態喪失という同じ表現型がもたらされた29, 30。酵母TVP23は酵母YIPF4（哺乳類YIPF6のホモログ）と結合することから、この分子間相互作用は酵母まで保存されているようである。この複合体の分子機能は、ゴルジ体への荷物の輸送にあり、その結果、タンパク質組成が変化するようである。ゴルジ体プロテオミクスで得られた、部分的に重複しないタンパク質セットを考慮すると、YIPF6はTVP23Bに依存する機能と独立した機能の両方を持つ可能性がある。
YIPF6 と TVP23B は，ゴルジ体のタンパク質組成に幅広い影響を与えるが，多くの糖転移酵素が失われることが共通している（DAVID 解析 p 値 3.3 × 10-13）．これは、カーゴアダプターとしての潜在的な役割、特定のカーゴを小胞に結合、パッキング、輸送するなどの多くの可能なメカニズムを反映していると考えられる。以前の報告では、YIPF6 は特定のカーゴとゴルジ体の再構築に関連しており、これらは TVP23B の作用メカニズムとしてもっともらしい22。あるいは、これらのタンパク質は、主要なイオン輸送チャネルの局在と機能にとって重要である可能性もある。ゴルジ体の完全性とムチンの充填は、二価の陽イオン（すなわちMg2+とCa2+）の濃度とコンパートメントのpHに依存することが知られている31,32。TVP23B変異体のプロテオームには、いくつかの溶質チャネル（例：ATP2C2）が減少しており、この仮説は魅力的である。TVP23B欠損ゴルジのpHとCa2+濃度の測定は興味深く、今後の研究課題である。
炎症性腸疾患は、そのゲル形成特性のためにグリコシル化に依存している特定のムチンのバリア機能の欠陥と長い間関連していた33,34,35。ヒトのTVP23Bには複数の変異が見つかっている。アシュケナージ・ユダヤ人の集団では、ヘテロ接合性のイントロン変異が潰瘍性大腸炎と関連しており、この病気はムチンの欠陥によって悪化することが知られています36。ENUスクリーニングやCRISPR/Cas9ノックアウトマウスで述べたように、ヘテロ接合型Tvp23b変異体では、大腸炎感受性がわずかに上昇することがある。このヒトの変異がTVP23Bの発現や一次転写産物のスプライシングに影響を及ぼすかどうかは、その非コード化された位置から不明である。魅力的ではあるが、異質な背景のヘテロ接合性イントロン変異から結論を導き出すには注意が必要である。ヒトの病気との因果関係を立証するためには、強い劇症型変異（ナンセンスやスプライス）を持つ個体でのさらなる研究が必要であろう。
以上のことから、我々は、前方遺伝学を用いて、Tvp23bが生体内で宿主と微生物の分離と腸の恒常性維持に必須かつ非冗長な役割を果たし、腸のグリコシル化を制御することを明らかにした。
研究方法
倫理規定
マウスを用いたすべての実験手順は、テキサス大学サウスウェスタン医療センターのInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を受け、機関承認のプロトコルおよび動物の世話と使用に関するガイドラインに従って実施された。すべてのマウスは、テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの動物施設において、機関承認のプロトコルに従って繁殖・飼育された。
マウス
8～10週齢のC57BL/6JをThe Jackson Laboratoriesから購入した。ENU変異誘発を実施した6。DSSによる大腸炎誘発のため、マウスは飲料水に1.4％（wt/vol）のDSSを7日間投与され、その後3日間DSSを中止した。体重は毎日記録し、投与前からの体重減少量として報告した。C. rodentium感染については、抗生物質（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール）で最低3日間前処理を行った。その後、ストレプトマイシン耐性C. rodentiumを109CFU投与し、毎日体重を測定した。便を採取し、C. rodentium CFUの列挙のために連続希釈を実施した。疾患活動性指標スコアは、以前に記載されたように決定された体重減少、便の出血および便の一貫性の複合スコアである。簡単に説明すると、体重減少： 0、損失なし。1、1-10％の体重減少。2, 10-15%の体重減少。3、15〜20％の体重減少。4、20％以上の体重減少；便の硬さ：0（正常）、2（緩い便）、4（下痢）；そして出血： 0（血液なし）、1（ヘモカルテ陽性）、2（ヘモカルテ陽性でペレット出血を確認）、4（肉眼的出血および/または肛門周囲の血液）。すべてのマウスは、University of Texas Southwestern vivariumで飼育した。すべてのマウス実験は、雄と雌の両方のマウスを使用して行われた。マウスは22℃、12時間明暗サイクルで飼育した。動物は、標準的なチャウ食（2016 Teklad Global 16% Protein Rodent Diet）および新鮮なオートクレーブ処理された水で、自由摂取させた。
CRISPR/Cas9システムを用いたTvp23b-/-および3XFLAGタグ付きマウス系統の作製
Tvp23b-/-および3XFLAGマウスを作製するために、雌のC57BL/6Jマウスに6.5Uの妊娠雌馬血清ゴナドトロピン（PMSG；ミリポア）を注射し、48時間後に6.5Uヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG；Sigma-Aldrich）を注射して過剰栄養した。その後、過排卵マウスをC57BL/6J雄マウスと一晩交配させた。翌日、受精卵を卵管から採取し、in vitroで転写したCas9 mRNA（50ng／μl）とTvp23b small base-pairing guide RNA（KO．50 ng/μl; 5′-CTCACTGTTTGATGCAGAAG-3′）または（3XFLAG: 50 ng/μl; 5′-CGTCATGTTGTCGCAGGTGA-3′ ）を胚の細胞質または前核へ注入した。条件付きノックアウトアレル（CKO）は、2つのgRNA（5′-GTACTAGGGATTCACAGCGT-3′および5′-TCATCAAAAAGTGGACA-3′）およびTVP23Bのエクソン2をコードする単一のDNAテンプレートとフランキングLoxPサイトを使って生成した。注入した胚は、M16培地（Sigma-Aldrich）中、37℃、5％CO2で培養した。変異マウスの作製には、2細胞期胚を擬似妊娠中のHsd:ICR（CD-1）雌マウス（Harlan Laboratories）の卵管膨大部（卵管あたり10〜20個の胚）に移植した。
骨髄キメラマウスの作製
レシピエントマウスは、7GyのX線照射を5時間間隔で2回照射して致死的に照射した11。ドナーのTvp23b+/+またはTvp23b-/-マウスに由来する大腿骨を、25Gの針を用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でフラッシュした。700×gで5分間遠心分離し、細胞を1mLのPBSに再懸濁し、1.5mLのエッペンドルフチューブに移し、氷上に保存した。Tvp23b+/+またはTvp23b-/-マウスの骨髄細胞を、静脈注射により指示したレシピエントマウスに移植した。注射後4週間は、マウスを抗生物質で維持した。DSS大腸炎感受性の解析は、照射および再構成の10週間後に実施した。
細胞培養、トランスフェクション、感染
Lenti-X 293T細胞（Takara #632180 ）は、DMEM（Sigma）/10%（v/v）FBS（Gibco）/1%抗生物質（Life Technologies）中、37℃で5%CO2で培養した。プラスミドのトランスフェクションは、Lipofectamine 2000（Life Technologies）を用いて、製造者の説明書に従って実施した。細胞は、トランスフェクション後36時間から48時間の間に収穫した。HT29-MTX-E12 細胞（Sigma-Aldrich 12940401）および LS174T 細胞（ATCC CL187）は、DMEM（Life Technologies）／10％（v/v）FBS（Gibco）／1％抗生物質（Life Technologies）中、37℃で 5％CO2 で培養した。HT29-MTX-E12細胞およびLS174細胞の感染は、Lenti-X 293 T細胞にパッケージされた第3世代レンチウイルスシステムを使用して実施された。
クリプトの単離
大腸陰窩は、以前に記載されたように単離された5。簡単に言うと、マウスから大腸を分離し、内腔から便を除去した。大腸は5-10mmに切断し、5mM EDTAを含むPBS中で30分間、室温でインキュベートした。
腸管オルガノイドの培養
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Mouse)を用いて、大腸陰窩からオルガノイドを製造者の説明書に従って培養した。大腸オルガノイドは、γ-セクレターゼ阻害剤DAPT（10 µM）およびWnt阻害剤IWP-2（10 µM）を7日間添加することにより杯細胞へと分化した。コロノイドは切片化する前に低融点アガロースで包埋した。
免疫沈降とウェスタンブロット
細胞をグリセロール入りNP40溶解バッファー（50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% (v/v) Nonidet P-40, 5% (v/v) glycerol, and protease inhibitors）で溶解させた。免疫沈降は、抗FLAG M2磁気ビーズ（Sigma）を用いて4℃で1時間行い、タンパク質は150μg/mL 3× Flagを用いて4℃で1.5時間溶出した。タンパク質濃度はBCAアッセイ（Pierce）を用いて測定した。サンプルはNuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gels (Thermo Fisher Scientific) にロードし、ニトロセルロース膜 (Bio-Rad) に転写し、一次抗体を4℃で一晩、二次抗体を室温で1時間ブロッティングし、化学発光基板 (Thermo Fisher Scientific) により可視化した。
電子顕微鏡観察
マウスを0.9%生理食塩水で失血死させた後、0.1Mカコディレートバッファー中、4%パラホルムアルデヒド、1.5%グルタルアルデヒド、0.02% picric acidで灌流固定し、大腸と小腸を解剖して同心円状にカットした。組織は4℃で一晩インキュベートし、UT Southwestern EMコアによる標準プロトコルを用いて処理した。グリッドにマウントされた組織は、JOEL 1400+顕微鏡を使用して画像化された。
組織学および免疫染色
単離したばかりの大腸と小腸をスイスロールし、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。H&E、PAS、AB染色は、UT Southwestern Histologyコアの標準プロトコルで実施した。免疫染色のために、切片を脱パラフィンし、エタノール勾配で再水和した。抗原賦活は、クエン酸緩衝液（DAKO）でスライドを15分間煮沸することにより実施した。切片をPBS 3Xで5分間洗浄し、PBS中の10%ウシ血清アルブミン（BSA）でブロッキングした。一次抗体は、PBS中の5％BSAで希釈した。切片を4℃で一晩インキュベートし、その後3×で10分間洗浄した。次に、スライドを、PBS中の5％BSA中のAlexa fluor抗体（1：1000）で1時間インキュベートし、3×で10分間洗浄した。スライドをProlong Antifade Goldでマウントし、Zeiss LSM880共焦点顕微鏡を使用して可視化した。すべての測定は、ImageJソフトウェアを用いて行った。
糖鎖分析
結腸細胞は、Tvp23b+/+およびTvp23b-/-マウスからEDTAキレートにより単離した。各サンプルは2匹のマウスからプールした結腸細胞を表し、遺伝子型ごとに3サンプルを分析した。サンプルは、50mM重炭酸アンモニウムでホモジナイズした。サンプルはNew England Biolabs (NEB) Denaturing bufferを用いて変性させ、45℃で30分間インキュベートした。その後、10kDaカットオフスピンフィルターを用いて14,000×gで15分間遠心分離して徐々に脱塩し、50mM重炭酸アンモニウム400μLを使用して洗浄した。フィルターに残ったサンプルを清潔なエッペンドルフチューブに移し、500μLの50mM炭酸水素アンモニウムバッファー中でプローブソニケーションを行い、ホモジナイズした。放出されたN-糖鎖は、10 kDaカットオフスピンフィルターで濾過し、C18カートリッジで精製した後、凍結乾燥した。スピンフィルター上部のO-glycoproteinは、β-eliminationに進んだ。10kDaスピンフィルターを通過しなかったO-糖タンパク質は、凍結乾燥後、50mM NaOHに溶解させた。19 mg/250uL NaBH4 in 50 mM NaOHを加え、溶液を45℃で18時間加熱した。その後、試料を室温まで冷却し、10%酢酸を滴下して中和した。次に、サンプルをDOWEX H+樹脂カラムとC18カートリッジに通した。その後、サンプルを凍結乾燥し、N2気流下で9:1のメタノールと酢酸の溶液を使用してホウ酸塩を除去した。放出されたNおよびO-糖鎖は、ヨウ化メチルとDMSO/NaOH混合物を用いて過メチル化した。乾燥した糖鎖をメタノールに再溶解し、MALDI-TOFおよびLC-MS/MSでプロファイリングした。乾燥したペルメチル化糖鎖を、水100 µLとメタノール100 µLの溶液に再溶解し、総量を200 µLにした。サンプルは、Ultimate 3000 RSLCano ystemに接続されたThemo Fisher Orbitrap Fusion TribridタンデムMSで実行されました。N-およびO-糖鎖の両方を8マイクロリットルLC-MSに注入し、低から高への有機溶媒グラジエントで72分間実行した。O-糖鎖の定量には0.5μgのXylopentoseを用いた。N-糖鎖の定量には、0.5μgのキシロヘキソースを使用した。
質量分析に基づく粘液プロテオームのプロファイリング
粘液プロテオミクスは、既述の通り実施した37。簡単に説明すると、サンプルは水平灌流チャンバーに取り付けられた腸組織から生体外で収集された。粘液は、Maximum Recoveryピペットチップ（Axygen社製）を用いて粘膜表面から吸引し、2x complete protease inhibitor cocktail（Merck社製）と混合した。6M塩酸グアニジナム、0.1M Tris/HCl（pH8.5）、5mM EDTA、0.1M DTT（Merck）で一晩粘液を還元し、10kDaカットオフフィルター（Pall Life Sciences）を用いて以前に開発したプロトコルから適用したフィルター補助サンプル調製を行いました。タンパク質はヨードアセトアミド（Merck）でアルキル化し、フィルター上でLysC（Wako）とトリプシン（Promega）で順次消化した。ペプチドは、MS分析前にStageTip C18カラムで洗浄した。ナノLC-MS/MSは、ナノエレクトロスプレーイオン源を介してQExactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer（ThermoFisher）に接続したEASY-nLC 1000システム（ThermoFisher）で実施しました。ペプチドは、自社製の充填逆相C18カラムを用い、4-32%アセトニトリルグラジエントを60分間かけて分離した。320-1600m/zの分解能70,000でマススペクトルを取得し、最も強度の高い12ピークをフラグメント化して、分解能35,000、自動ダイナミック排除を使用してタンデムマススペクトルを取得しました。タンパク質の同定はMaxQuant (v1.5.7.4)を使用した。
ゴルジ体の濃縮
ゴルジの単離は、以前に記載したように行った（http://www.bio-protocol.org/e906）。簡単に言うと、EDTA分離結腸細胞を氷冷PBSで洗浄し、破砕バッファー（250mMスクロース、10mMトリス（pH7.4）、プロテアーゼ阻害剤）中でシリンジ20G針に通すことによりホモジナイズした。2mlのホモジネートを2mlの62%スクロースと41.7μlの100mM EDTA (pH7.4)と混合した。4mlのホモジネートを35%スクロース溶液4.5mlと29%スクロース溶液3.5mlで重層した。超遠心分離は、ベックマンSW 41 Tiローターで、288,000×g、4℃で1.5時間行った。超遠心分離後、35%/29%スクロース界面に位置する乳白色のバンドを回収し、ペレット化する前に3容量のPBSで希釈した。ペレットはCelLytic M buffer (Sigma, C2978)とプロテアーゼ阻害剤に再懸濁した。
大腸粘液の生体外分析
遠位結腸粘液の分泌と処理は、既述のように生体外粘液成長率を定量化することで評価した38。大腸組織をチャンバーマウントし、基底側灌流を5ml/hに設定し、チャンバーを37℃に加温した。senGC依存的／非依存的な粘液分泌反応を調べる実験のために、組織を大腸菌0111：B4（200μg／ml；Invivogen）からの超高純度LPSで先端的に処理した。粘液と組織を実体顕微鏡（Leica MZ125）で観察し、マイクロメーター（Mitotoyo）に取り付けた直径5μmのマイクロピペットを使って粘液の厚さを測定した。粘液の厚さの測定は30～60分かけて行い、粘液の成長速度は1分あたりのマイクロメートルで表した。
16S 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）
16S rRNA FISHは、以前に記述された通りに実施した39。簡単に説明すると、中大腸の腸組織は、Carnoyの固定液で固定し、その後、記載されているようにパラフィンに埋め込むことによってFISH分析用に準備された。組織を切開し、16S rRNA遺伝子に対するユニバーサル細菌プローブにハイブリダイズした： GCTGCCTCCCTCGTAGAGT。組織は、Zeiss Axio Imager M1 Microscopeを使用して可視化した。
16S rRNA解析のためのDNA抽出
大腸からの管腔内容物の分離のために、大腸の4cmセクションを縦に切り開き、糞便ペレットを抽出し、重量を測定した。組織関連細菌の分析には、管腔内容物の分析に使用したのと同じ組織サンプルを氷冷したPBSで洗浄した後、組織全体の重量を測定した。糞便および組織のDNAは、FastDNA Spin Kit（MP Biomedicals 116560-200）を用いて、製造元のプロトコルにしたがって抽出した。
16S Q-PCR 解析
16S Q-PCR 解析は、以前に記述したように行った13。0.2μMのユニバーサルフォワードプライマー27F（5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3）とリバースプライマー1492R（5-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3）、HotStarTaq polymerase kit（Qiagen, 203203）を用いて各検体から500ナノグラムのDNAを増幅した。サーモサイクル条件は、95 ℃を5分間で1サイクル、94 ℃を1分間、55 ℃を1分間、72 ℃を1.5分間で16サイクル、72 ℃を10分間で1サイクルである。次に、増幅されたDNAサンプル、スタンダードおよびコントロールを、ユニバーサル16Sフォワードプライマー（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）およびユニバーサル16Sリバースプライマー（ATTACCGCGCTGCTGG）を用いたSYBR Greenキット（サーモフィッシャー、4309155）によりQ-PCRによって分析した。16Sコピーの総数は、定量した標準プラスミドから作成した標準曲線を用いて決定した。サンプルから得られた16Sデータは、腔内含有量または組織重量に対して正規化した。SFBの存在量は、SFBフォワードプライマー（GACGCTGAGGCATGAGCA）およびSFBリバースプライマー（GACGGCACGGATTGTTATTC）を用いたQ-PCRによって決定された。すべてのプライマーはIDT technologiesから購入した。
タンパク質の消化と質量分析
分離したゴルジ装置からのタンパク質を23% TCAで沈殿させ、冷アセトンで洗浄した。回腸からのタンパク質は、抽出バッファー（90%メタノール、1%酢酸）40で組織を溶解した後、乾燥した上澄みから単離した。タンパク質は8M尿素100mM Tris pH8.5で可溶化し、5mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (Sigma-Aldrich, product C4706) で還元、55mM 2-Chloroacetamide (Sigma-Aldrich, product 22790) でアルキル化した。タンパク質は、2M尿素100mMトリスpH8.5中、0.5μgトリプシン（Promega, Madison, WI, product V5111）で37℃、18時間消化した。単相分析は、QExactive HF質量分析計（Thermo Scientific）を用いて実施した。
ゴルジ装置濃縮のために、タンパク質とペプチドの同定は、UniProt (uniprot.org) からダウンロードしたマウスタンパク質データベース（1遺伝子につき1配列 9/13/2022, 21984エントリ）を用いてMSFragger (version 17.1)41 (https://fragpipe.nesvilab.org/) で行い、共通の汚染物質と反転配列をMSFraggerで付加した。検索空間には、Cの固定修飾が57.021464、Mの可変修飾が15.9979、N末が42.0106の完全トリプシンペプチドの候補がすべて含まれていた。MS1の定量はTotal Intensityで行い、ラン間のマッチングは行わなかった。タンパク質の強度値は、レプリケートのために結合された。
回腸から抽出したタンパク質については、UniProt (uniprot.org) からダウンロードしたマウスタンパク質データベース（1遺伝子あたり1配列 9/13/2022, 21,984 エントリ）を用いて、ProLucid (version1.4)42 および DTASelect (v2.1.12)43 でタンパク質およびペプチド同定を行い、The Scripps Research Institute (goldfish.scripps.edu) でIP2 (Integrated Proteomics Pipeline (version 6.7.1) によって共通の汚染物質や反転配列を追加しています。検索空間には、C上の57.02146の固定修飾を持つすべてのペプチド候補が含まれ、タンパク質のスペクトルカウントは、複製について結合されました。
データの再現性と統計解析
すべての株は、同じ純粋な近交系背景（C57BL/6J）上で生成・維持された。実験的な分散の評価は行わなかった。除外されたデータはない。研究者は、実験中、遺伝子型やグループ分けについて盲検化されていない。差の比較は、すべての場合において、対にならない2つの実験グループ間で行われた。対になっていないt検定（Student's t test）が適切であり、このような比較に使用された。3群以上の実験には、一元配置または二元配置のANOVAとポストホックテューキーテストが適用された。マウス（C57BL/6J）およびこれらのマウスの初代細胞の表現型は、正規分布に従うことが期待される。実験グループ間の差の統計的有意性は、GraphPad Prism 7ソフトウェアとStudentのt検定（不対、両側）を用いて決定した。0.05未満のP値は、統計的に有意であるとみなした。このサンプルサイズは、対になっていない2つの実験グループ間の比較において、対になっていないt検定で統計的に有意な差を示すのに十分であった。
主要試薬
補足資料4をご参照ください。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されています。
データの利用可能性
すべてのプロテオミクス生データは、ソースコードPXD038751、PXD038895でProteomeXchangeに寄託されています。RNAシーケンスデータは、リファレンスGSE224516で入手可能です。ソースデータは本論文に添付されています。
資料の入手
リソースや試薬に関する詳細な情報およびリクエストは、リードコンタクトであるE.E.T. (emre.turer@utsouthwestern.edu)までお願いします。
参考文献
Hooper、L. V. 上皮細胞による腸管免疫への貢献。Adv. Immunol. 126, 129-172 (2015).
論文CAS PubMed Google Scholar
Hooper, L. V. & Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat. Rev. Immunol. 10, 159-169 (2010).
論文CAS PubMed Google Scholar
炎症性腸疾患における腸内環境の恒常性とその破綻。Nature 474, 298-306 (2011).
記事ADS CAS PubMed Google Scholar
Mukherjee, S. & Hooper, L. V. 腸の抗菌防御. Immunity 42, 28-39 (2015).
記事CAS PubMed Google Scholar
Turer, E. et al. クレアチンは腸のホメオスタシスを維持し、大腸炎から保護する。Proc. Natl Acad. Sci. USA 114, E1273-E1281 (2017).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Wang, T. et al. マウスの表現変異を引き起こす点変異をリアルタイムで解決する。Proc. Natl Acad. Sci.USA 112, E440-E449 (2015).
CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Tvp38、Tvp23、Tvp18、Tvp15：Saccharomyces cerevisiaeのTlg2含有ゴルジ/エンドソーム区画における新規膜タンパク質．Exp. Cell Res 313, 688-697 (2007).
記事CAS PubMed Google Scholar
TVP23は酵母のSNARE VTI1と遺伝的に相互作用し、初期エンドソームから後期ゴルジ体への逆行輸送に機能する。Biochem. J. 419, 229-236 (2009).
論文CAS PubMed Google Scholar
Gendre, D. et al. 保存されたシロイヌナズナのECHIDNAタンパク質は、ゴルジ網の移動と細胞の伸長を仲介する。Proc. Natl Acad. Sci. USA 108, 8048-8053 (2011).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Wang, T. et al. MutagenetixデータベースにおけるENU誘発変異による表現型的に検出可能なタンパク質損傷の確率. Nat. Commun. 9, 441 (2018).
記事ADS PubMed Central Google Scholar
McAlpine, W. et al. 過剰なエンドソームTLRシグナルは、SMCR8-WDR41-C9ORF72複合体の機能が欠損したマウスにおいて炎症性疾患を引き起こす。Proc. Natl Acad. Sci.USA 115, E11523-E11531 (2018).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Wang, K. W. et al. LRBA欠損マウスにおけるエンドソームTLRシグナルの過剰による化学物質誘発性大腸炎への感受性の向上。Proc. Natl Acad. Sci.USA 116, 11380-11389 (2019).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Birchenough, G. M., Nystrom, E. E., Johansson, M. E. & Hansson, G. C. A sentinel goblet cell guards the colonic crypt by triggerering Nlrp6-dependent Muc2 secretion. Science 352, 1535-1542 (2016).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Ivanov, I. I. et al. セグメント化された糸状菌による腸管Th17細胞の誘導. Cell 139, 485-498 (2009).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
粘液のシアル化によって、腸の宿主と共用のホメオスタシスが決定される。Cell 185, 1172-1188.e1128 (2022).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
シグレックと抗シグレック療法。Curr. Opin. Chem. Biol. 62, 34-42 (2021).
論文CAS PubMed Google Scholar
Macauley, M. S., Crocker, P. R. & Paulson, J. C. シグレックを介した疾患における免疫細胞機能の制御。Nat. Rev. Immunol. 14, 653-666 (2014).
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
An, G. et al. コア3由来のO-glycansを欠損したマウスにおける大腸炎および大腸腫瘍への感受性の増加。J. Exp. Med. 204, 1417-1429 (2007).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
ゴルジ体に局在するマルチスパン膜貫通タンパク質Yip1ドメインファミリー(YIPF)の特徴と機能。Front. Cell Dev. Biol. 7, 130 (2019).
記事ADS PubMed Central Google Scholar（パブメッド・セントラル・グーグル・スカラー
Brandl, K. et al. Yip1ドメインファミリー、メンバー6（Yipf6）変異は、マウスの自然発生的な腸の炎症を誘発する。Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 12650-12655 (2012).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Shin, J. J. H. et al. Spatial proteomics defines the content of trafficking vesicles captured by golgin tethers. Nat. Commun. 11, 5987 (2020).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Wang, L. et al. YIPF6は、FGF21のCOPII小胞へのソーティングを制御し、肥満を促進する。Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 15184-15193 (2019).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Ilani, T. et al. ジスルフィド触媒QSOX1は、ゴルジ糖転移酵素を制御することにより、大腸粘膜バリアを維持する。EMBO J. 42, e111869 (2023).
Martinez-Duncker, I. et al. Genetic complementation reveals a novel human congenital disorder of glycosylation of type II, due to inactivation of the Golgi CMP-sialic acid transporter. Blood 105, 2671-2676 (2005).
記事CAS PubMed Google Scholar
Reily, C., Stewart, T. J., Renfrow, M. B. & Novak, J. 健康および疾患におけるグリコシル化. Nat. Rev. Nephrol. 15, 346-366 (2019).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Stahl, M. et al. Muc2ムチンは、マウスパネス細胞顆粒を被覆し、その内容物の放出と分散を促進する。Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 315, G195-G205 (2018).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Kaser, A. et al. XBP1 links ER stress to intestinal inflammation and confers genetic risk for human inflammatory bowel disease. Cell 134, 743-756 (2008).
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Adolph, T. E. et al. 腸の炎症の起点となるパネス細胞。Nature 503, 272-276 (2013).
記事ADS CAS PubMed Central Google Scholar
Brandl, K. & Beutler, B. Creating diseases to understand what prevent them: Genetic analysis of inflammation in the gastrointestinal tract（消化管の炎症の遺伝子解析）。Curr. Opin. Immunol. 24, 678-685 (2012).
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Brandl, K. et al. ATF6駆動のunfolded protein responseを破壊するMbtps1低型変異によるDSS大腸炎に対する感受性の亢進。Proc. Natl Acad. Sci.USA 106, 3300-3305 (2009).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Li,J.とWang,Y. ヒトの健康と病気におけるゴルジ体金属イオンのホメオスタシス。Cells 11, 289 (2022).
Ambort, D. et al. ゲル形成性ムチンMUC2のカルシウムおよびpH依存的な充填と放出。Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 5645-5650 (2012).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Theodoratou, E. et al. IBDにおけるグリコシル化の役割. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 11, 588-600 (2014).
記事CAS PubMed Google Scholar
Breugelmans, T. et al. 健康時と疾患時の消化管バリア機能におけるムチンの役割. Lancet Gastroenterol. Hepatol. 7, 455-471 (2022).
記事 PubMed Google Scholar
ムチンと潰瘍性大腸炎の関係：システマティックレビュー。J. Clin. Med. 10, 1935 (2021).
Broad IBD Exomes Portal. 2021年1月15日アクセス(https://ibd.broadinstitute.org).
Birchenough, G. M. H. et al. Muc2-dependent microbial colonization of the jejunal mucus layer is diet sensitive and confers local resistance to enteric pathogen infection. Cell Rep. 42, 112084 (2023).
論文CAS PubMed Google Scholar
Gustafsson, J. K., Sjovall, H. & Hansson, G. C. Colon explantsによる粘液分泌のEx vivo測定。Methods Mol. Biol. 842, 237-243 (2012).
記事CAS PubMed Google Scholar
抗菌レクチンRegIIIgammaは、腸内の微生物と宿主の空間的な分離を促進する。Science 334, 255-258 (2011).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
ゴキブリLeucophaea maderaeの後腸から第2筋刺激性ペプチドを単離し、部分的に特性化した。Comp. Biochem. Physiol. C. Comp. Pharmacol. Toxicol. 76, 39-43 (1983).
記事CAS PubMed Google Scholar
MSFragger: Mass Spectrometry-based proteomicsにおける超高速かつ包括的なペプチド同定. Nat. Methods 14, 513-520 (2017).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Xu, T. et al. ProLuCID: an improved SEQUEST-like algorithm with enhanced sensitivity and specificity. J. Proteom. 129, 16-24 (2015).
記事CAS Googleスカラー
Tabb, D. L., McDonald, W. H. & Yates, J. R. 3rd DTASelect and contrast: tools for assembling and comparing protein identifications from shotgun proteomics. J. Proteome Res. 1, 21-26 (2002).
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
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謝辞
この研究は、以下の助成金により行われた： NIH R01 DK119360（E.E.T.．R.S.), NIH R03 DK125631 (E.E.T.), NIH K08-DK-123316 (J.N.), T32DK007745 (A.F.), NIH R01-AI125581 (B.B.), U19-AI100627 (B.B.), NIH P41GM103533 (J.Y.) and the Burroughs Wellcome Fund CAMS (J.N.). グリコミックス解析は、Complex Carbohydrate Research Centerで行われ、National Institutes of Health (NIH) -funded R24 grant R24GM137782 to (P.A.) から一部支援を受けた。E.E.L.NはSvenska Sällskapet för Medicinsk forskning, SSMF (PD20-0168)の資金提供を受けました。Helmsley IBD Exomes Programおよび比較のためにエクソームバリアントデータを提供したグループに感謝します。提供グループの全リストは http://ibd.broadinstitute.org/about に掲載されています。また、Andrew LemoffとUTSW Mass Spectrometry coreの協力に感謝したい。
著者情報
著者および所属
テキサス大学サウスウェスタン医療センター（ダラス、テキサス州、75390-8505、米国）宿主防御遺伝学研究センター
Ran Song, William McAlpine, Aaron M. Fond, Evan Nair-Gill, Jin Huk Choi, Xiaohong Li, Jeffrey A. SoRelle, James J. Moresco, Eva Marie Y. Moresco, Bruce Beutler & Emre E. Turer
テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンター内科、消化器科、ダラス、テキサス州、75390-8505、米国
アーロン・M・フォンド、シドニー・フィールド、ジョセフィン・ニー、エムレ・E・テュラー
キール大学生化学研究所、24118、キール、シュレスヴィヒ＝ホルシュタイン、ドイツ
エリザベス・E・L・ニュストレム（Elisabeth E. L. Nyström
ヨーテボリ大学バイオメディシン研究所生化学部門、分子・トランスレーショナル医学ワレンベルグセンター、40530、ヨーテボリ、スウェーデン
リーサ・アリケ＆ジョージ・M・H・バーケナウ
テキサス大学サウスウェスタン医療センター（ダラス、テキサス州、75390-8505、米国）病理学部門
ジェフリー・A・ソレール
スクリプス研究所分子医学部、10550ノーストーリーパインズロード、ラホヤ、カリフォルニア州、92037、USA
ジョン・R・イェーツ3世
複合糖質研究センター、ジョージア大学、アテネ、GA、30602、USA
パラストゥ・アザディ
寄稿文
概念化、E.E.T.およびR.S.、方法論、E.E.T.、R.S.およびG.B.、調査、R.S.、W.M、 A.M.F. 、 G.B. 、 E.N.G..、 E.E.L.N.、J.C.、L.A.、S.F.、X.L.、J.S.、J.J.M、J.N.; Visualization, R.S.and G.B. Writing-original draft, E.E.T.、 R.S.およびE.M.Y.M.; 執筆-レビューおよび編集, E.E.T., E.N.G., B.B., J.N., E.M.Y.M.; 資金獲得, E.E.T., B.B.; 資料, G.B., B.B., J.Y., P.A., E.E.T. and B.B.; 監督, E.E.T.
著者
エムレ・E・テュラーに連絡すること。
倫理的宣言
競合する利益
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
査読
査読情報
Nature Communicationsは、Jonathan Braun、Eduardo Villablanca、およびその他の匿名の査読者の方々の本作品の査読への貢献に感謝します。査読ファイルはこちらです。
追加情報
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Song, R., McAlpine, W., Fond, A.M. et al. Trans-Golgi protein TVP23B regulates host-microbe interactions via Paneth cell homeostasis and Goblet cell glycosylation. Nat Commun 14, 3652 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39398-1
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2022年12月14日受領
2023年6月09日受理
2023年6月20日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-39398-1
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消化器病学（Gastroenterology
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ネイチャーコミュニケーションズ（Nat Commun） ISSN 2041-1723（オンライン版）
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