抗菌性CRISPR-Casを持つ工学的ファージがマウスの大腸菌負担を選択的に軽減する

哉百名


公開日：2023年05月04日
抗菌性CRISPR-Casを持つ工学的ファージがマウスの大腸菌負担を選択的に軽減する

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01759-y

ユルマズ・エムレ・ジェンカイ
ダジウギンタ・ヤシンスキテレ
...
モーテン・オットー・アレクサンダー・ゾンマー（Morten Otto Alexander Sommer
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Nature Biotechnology (2023)この記事を引用する
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指標詳細
概要
抗生物質による治療はマイクロバイオームに有害な影響を及ぼし、抗生物質耐性をもたらす。臨床に関連する多様な大腸菌に対するファージ療法を開発するために、162種類の野生型（WT）ファージのライブラリーをスクリーニングし、大腸菌を広くカバーし、細菌表面の受容体に相補的に結合し、挿入したカーゴを安定的に運ぶ能力を持つ8種類のファージを特定した。選択されたファージは、テールファイバーとCRISPR-Cas装置によって大腸菌を特異的に標的とするように設計されました。バイオフィルム内の細菌を標的とし、ファージ耐性のある大腸菌の出現を抑え、共培養実験では祖先のWTファージを凌駕することが示された。SNIPR001と呼ばれる4つの最も相補的なバクテリオファージの組み合わせは、マウスモデルとミニブタの両方で良好な忍容性を示し、マウスの腸内の大腸菌負荷を、構成要素を別々に投与するよりも低減します。SNIPR001は、血液がん患者の致命的な感染症を引き起こす可能性のある大腸菌を選択的に死滅させるために臨床開発が行われています。
主な内容
血液悪性腫瘍の治療に用いられる化学療法レジメンは、骨髄抑制や腸管透過性の上昇に伴う消化管粘膜炎を引き起こします1,2,3,4。大腸菌を含む腸内細菌の消化管からの移行は、血流感染症の頻繁な原因となっています5。大腸菌などの腸内細菌による血流感染症に関連する死亡率は15～20％6。感染の可能性を減らすため、血中の好中球数が少ないリスクのある人には、治療前に抗生物質を投与することがあります7。フルオロキノロン系抗菌薬は、使用後に免疫不全患者における細菌感染の減少を示した2つの無作為化試験の結果に基づいて、米国では適応外で使用されています7,8,9。フルオロキノロン系抗菌薬には副作用があり、がん患者への使用は耐性菌の増加を伴っている10。化学療法による好中球減少症を発症した免疫不全の血液悪性腫瘍患者では、大腸菌が菌血症全体の25.1～30％を占めており11,12、造血幹細胞移植を受けた血液癌患者の血流感染症から原因菌として分離した大腸菌の最大65％がフルオロキノロンに耐性である13。このような脆弱な患者の感染症、特にフルオロキノロン耐性大腸菌を予防するような他の臨床オプションが必要である。
バクテリオファージ療法は、抗生物質が広く普及する以前から用いられてきたが14、現在では、細菌の抗菌薬耐性が高まり、いくつかの成功例の報告16,17,18と相まって再び注目を集めている15。しかし、野生型（WT）ファージを用いた臨床試験はほとんど行われておらず19,20,21,22、大腸菌を対象としたものもあるが、ファージカクテルによる標的株のカバーが不完全なためか、大規模ランダム化比較試験で納得できる結果を得ることはできなかった23。最近では、Klebsiella pneumoniae株を標的とするファージ（n = 41）24やVibrio株を標的とするファージ（n = 248）25など、標的株を幅広くカバーするファージの大規模な系統的スクリーニングが行われている。また、T3ファージのテールファイバーも操作され、操作されたファージが標的とする菌株のスペクトルが増強されています26。最後に、CRISPR-Casシステムは、ファージの溶菌活性を補完する殺傷方法として、ターゲティングの有効性に貢献することができます。CRISPR-Cas複合体は、あるシステムでは、相同なDNA標的配列に結合し、DNA分解をもたらすことができる27,28。原核生物は、エラーを起こしやすい非相同末端結合を持たず、DNA損傷の修復を相同組換えに頼っているため、DNA分解に伴う細胞死が起こりやすい。この脆弱性を利用して、黄色ブドウ球菌、大腸菌、クロストリジオイデスディフィシルなどの細菌に対して、CRISPR-Casを抗菌モダリティとして使用しています29, 30, 31, 32, 33, 34, 35。
血液悪性腫瘍の患者さんに対する新しい予防薬に対する大きなアンメットメディカルニーズに応えるため、私たちは、多様な大腸菌を特異的に標的とする4つのCRISPR-Cas武装ファージ（CAP）の組み合わせであるSNIPR001を開発しています。SNIPR001を設計するための私たちの研究プロセスには、いくつかの段階があります（図1）。つまり、WTファージのライブラリー（n = 162）を、標的菌である大腸菌の生態を代表する系統的に多様な大腸菌株のパネルでin vitro試験しました。最も広く、最も補完的な標的菌株をカバーするWTファージが、さらなるエンジニアリングのために選択された。選択されたWTファージは、テールファイバー工学とCRISPR-Casアーミングの両方を行い、CAPのライブラリーを作成した。CAPライブラリーは、製造可能性、in vitro安定性、有効性のスペクトル、in vivo薬物動態および有効性について評価されました。4つのCAPの組み合わせが選択され、開発候補のSNIPR001が誕生し、現在、臨床開発に入っています（ClinicalTrials.gov ID NCT05277350）。
図1: SNIPR001の作成プロセスの概要。
まず、WTファージを大腸菌のパネルに対してスクリーニングする。次に、大腸菌に対して幅広い活性を持つファージを、テールファイバー工学や大腸菌に特異的な配列を含むCRISPR-Casシステムで武装させ、CAPを作成します。これらのCAPは、宿主範囲、in vivoでの有効性、CMCの仕様についてテストされます。SNIPR001は、4つの相補的なCAPから構成され、大腸菌を選択的に標的とする新しい精密抗生物質で、好中球減少のリスクを抱える血液がん患者の菌血症を予防します。
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成果
ファージスクリーニング
SNIPR001の開発にあたり、まず、廃水、ファージバンク、市販のファージカクテルに由来する162種類の溶菌ファージのライブラリーをスクリーニングしました（補足表1）。ファージの宿主範囲と効力は、系統的に多様な大腸菌429株の内部パネル、または429株の全パネルを適切に代表するように選択した大腸菌82株の省略パネル（図2a）に対する厳しいin vitro増殖動力学アッセイで評価されました。大腸菌は、血流感染症5および尿路感染症の患者、既知の疾患のないヒトの糞便、および大腸菌参照コレクション36に由来している。そのうちの一部について、広く感受性を持つ2つの株、その深層コア（∆rfaD）リポポリサッカライド（LPS）変異体派生株、およびその表面タンパク質ノックアウト変異体（Tx、LamB、OmpC、OmpA、TolC、OmpF）に対するEoPアッセイを用いて受容体を決定しました（補足図2）。その結果、直交性、広域性、細菌表面レセプターとの相補的結合、挿入されたカーゴを安定的に運ぶ技術性などから、α15、α17、α20、α31、α33、α46、α48、α51（いずれもテブンビリーナ属）の8つのファージが選ばれた（図2b）。
図2：野生型ファージのスクリーニングと開発ファネル。
a, 成長速度に基づく82の大腸菌株（縦軸）に対する162のWTファージ（横軸）の効力を示すヒートマップ。iAUC値は緑のグラデーションで示されている。シーケンシングデータに基づくファージゲノムサイズは、上部の棒グラフに示されている。選択したファージ群について、同族細菌受容体タンパク質を決定し、下のパネルに示した。シーケンシングデータに基づくファージの分類は、下段のバーに注釈が付されている。上の木は、成長速度に基づくファージ間の関係を示しています。工学的に選択された8つのファージ（α15、α17、α20、α31、α33、α46、α48、α51）を円で強調し、そのうちSNIPR001のベースとなる4つ（α15、α20、α48、α51）は緑色に着色されています。b, 162個のWTファージから始まり、エンジニアリングとセレクションアッセイを経て、SNIPR001の4つのCAPからなる最終的なカクテルが完成したSNIPR001の開発ファネル（CAPごとの詳細は拡張データ表1aに記載）。
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尾部繊維工学
α20はLPSとマルトポリンLamBの両方を必要とし、残りのファージはLPSまたはヌクレオシドトランスポーターTsxに依存して宿主に感染することがわかりました（図2a）。α20の二重受容体利用やTsxタンパク質の保存性を考慮すると、今回のファージの大部分では、尾部繊維工学の最初の必要性は小さいと判断された。しかし、テストパネルの中で最も広い宿主範囲を持つファージの一つであるα15は、増殖宿主である大腸菌b52のLPSにのみ依存していました（図2aおよび補足図2）。LPSは非常に多様で、多くのLPS生合成遺伝子の一つに変異を持つファージ耐性クローンが治療中に容易に進化し得ることから37、α15の受容体のレパートリーを広げたいと考えました。T-evenファージは、その長い尾部繊維や、これらの三量体繊維の遠位端を覆う単量体アドヒシンを用いて細胞受容体と結合する38。そこで、我々はα17ファージからTsx結合アドヒシンを選び、それをα15.2に組み込んで、1つのファージに両方の親和性を集約させた。このファージのウイルスは、2つのレセプターの親和性を確率的に組み合わせて持っており、両方のレセプターを介して細菌細胞に感染することができる（図3aおよび補足図2）。そこで、α15.2は、祖先であるLPS依存性のWTα15と比較して、抵抗性細菌の数を減少させるように選択するはずであるという仮説を立てた。そこで、キネティックアッセイでα15.2がWTα15を上回る臨床大腸菌株b1460、b1475、b1813を選び、ローンキルアッセイに供した。実際、α15.2は、試験菌株ごとにレベルは異なるものの、WTα15と比較して生存者数の減少を実質的にもたらした（図3b-d）。各試験菌株のWTα15チャレンジグループから無作為に精製した10個のコロニーを、WTα15およびCAPα15.2によるEoP試験でも同様に試験した。その結果、LPS依存性のWTα15に対して、尾部繊維工学を用いたα15.2が明らかに有効であることが示された。α15の生存者は、WTα15に抵抗性を示すにもかかわらず、CAPα15.2に対する感受性をほとんど保持していたからだ（図3b-d、挿入部分）。
図3：尾部繊維工学。
a, LPS依存性のWTα15、Tsx依存性のWTα17、およびWTファージの受容体を統合したCAP α15.2のEoP結果。提示力価（PFU ml-1）は、独立した生物学的三連体から得られたものをドットとして、平均値をバーとして図示した。 b-d、大腸菌のLawn kill assay結果をボックスプロットとして示し、ヒゲは最大値と最小値を、ボックス境界は25％および75％を、中央線は中央値を示す；B1460（b）、B1475（c）、B1813（d）はファージWTα15、CAPα15.2と共に示した。有意 *P < 0.05 および ***P < 0.001, P値（両側Mann-Whitney Uテスト）は、10個の複製からなる2つの独立した生物学的二重複製から計算した。Holmの方法で調整したP値は、b1460、b1475、b1813についてそれぞれ1.59 × 10-7、3.36 × 10-2、1.6 × 10-7。WT α15 lawn kill assayから精製した生存コロニーの10のEoPプロファイルの分布（b-d insets）。抵抗性：試験したファージでプラークが形成されない；敏感：親株と同程度のEoP；減少：親株のEoPより低い（>1-2 log10）。
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大腸菌を標的としたファージのCRISPR-Casによる武装化
選択した溶菌ファージをCRISPR-Casで武装させ、CAPのライブラリを作成するために、系統的に多様な大腸菌株を標的とする大腸菌39のI-E型CRISPR-Casシステムを操作した（補足図1）。cas3遺伝子（ygcB）とcasA（ygcL, cas8e）、casB（ygcK, cas11）、casC（ygcJ, cas7）、casD（ygcI, cas5）、casE（ygcH, cas6）がコードする下流カスケード遺伝子複合体を含むCRISPR誘導ベクターを作成、さらにCRISPR配列により大腸菌ゲノムに照準を合わせました（図1）。CRISPR-Casシステムの殺傷効率を評価するために、CGV-EcCasを大腸菌b52株に結合させたところ、空ベクターと比較して平均3.5 log10 CFU ml-1の減少を示した（補足図3）。予想通り、CGV-EcCasを非標的の大腸菌に結合させても、効果は見られなかった（補足図3）。CGV-EcCasの殺傷効率は、さらに82株の大腸菌の略パネルで評価された。空ベクターの共役送達は、75%の分離株で達成された（図4a）。CGV-EcCasが導入されたすべての菌株で、細菌数は1～6 log10の減少に相当する検出限界（LOD、200 CFU ml-1）以下に減少し、CRISPR-CASによる強力な殺菌が強調されました（図4a）。
図4：CRISPR-Casを介した大腸菌の除去、バイオフィルムでの活性、およびCAPの競争優位性。
a、CGV-EcCAS（緑）または空ベクター（灰）のコンジュゲーションによる82の大腸菌臨床分離株のCRISPR-Cas駆動による排除。コンジュゲーション効率は、抗生物質を添加したLB寒天培地にコンジュゲーション反応の希釈系列をスポットすることで決定した（n = 3はドットで表示）。LODは200 CFU ml-1であった。 b, CRISPR-Casシステムの発現を駆動するプロモーターのみが異なるCGVによるバイオフィルムの代謝活性の低下（細菌の染色体を標的にしている）。実験は3連で行い、プロモーターなしの発現と所定のプロモーターの発現の間の相対代謝活性を測定した。PrelBとPbolAの平均相対活性は有意に異なり、点として図示し、平均値は棒として図示した（両側スチューデントt検定、P = 0.0052）83.7±6.7%、および45.3±2.5%）。c-f, RT-qPCRは、ハウスキーピング遺伝子gapA転写物に対するcas3転写物のレベルの増加（複製はドット、平均はバー）を示し、同期感染における未吸収ファージの数の減少（複製はクロス、平均はライン）と負の相関を示した。Cas3活性はgapA転写物に対するcas3転写物の比率として、未吸収ファージ数はPFU ml-1で測定される。示された結果は、テクニカルトリプリケートを用いた2つの独立した生物学的複製の平均である。棒または線はそれぞれ、これらの複製物の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 g, 両ファージに感受性のある宿主株との共培養中のCAPおよびWTファージの分画を示す。CAP α15.2は、2回の連続継代で、WTファージと比較して相対存在量が7％から86％に増加した。 h, CAP α20.4は、共通の標的E. g,hは、α15.2、α15、α20.4、α20に感受性のある宿主株（大腸菌b230）との共培養におけるCAPとWTファージの比率を示した。CAP α15.2はWTファージに比べて相対量が7%から86%に増加し（g）、CAP α20.4はWT α20WTに比べて10%から68%に向上した（h）。
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私たちは、腸内やバイオフィルムで観察されるような、制限された細菌増殖条件下で機能するCRISPR-Casシステムを開発することを目的としました40。標準的な増殖条件（リソジェニーブロス（LB）、37℃）で増殖したプランクトン細胞と、96ウェルプレートのペグ蓋上で増殖したバイオフィルムの両方で、2つの関連プロモーター（PrelB41およびPbolA42）の性能をテストしました。大腸菌のバイオフィルムでは、PrebolAからCRISPR-Casシステムを発現させた場合、PrelBと比較して、代謝活性の低下として測定される有意な死滅が観察された（図4b）。プロモーターPbolAが異なる条件下で総合的に最も優れた性能を示したため、CAPにおけるCRISPR-Casシステムの転写に選択されました。
選択された8つのWTファージをCRISPR-Casで武装し、15のCAPバリエーションを作製した（Extended Data Table 1a）。プロモーターPbolAに加えて、CRISPR-Casシステムは、CRISPR-Casの発現をさらに強化するために、合成構成的に発現する大腸菌プロモーター（PJ23100）から発現するように操作された（補遺図1）。CRISPRアレイは、複数の病原性遺伝子（スペーサー1、2、3）または必須遺伝子（スペーサー4、5；拡張データ表1b）を標的とするように設計されており、複数の領域を標的とすることで耐性進化を防止できることが示されている43）。CAPにおけるCRISPR-Cas活性を確認するため、WTα15と比較してCAPα15.2の感染倍率（MOI）が等しい同期感染後5、15、30分に得られたサンプルにおけるcas3転写物をRT-qPCRで測定したところ、CAPα15.2感染時のみcas3 RNAレベルの上昇が認められた（補図4）。次に、このアッセイを4つのCAP（α15.2、α20.4、α48.4、α51.5）すべてに拡張したところ、標的株の感染時にCAPがCRISPR-Casシステムを発現することを強調するcas3転写物のレベルが増加した（図4c-f）。
CAPの競争優位性を示すために、CAP（α20.4とα15.2）とそのWT祖先ファージを、競合する両ファージの標的として大腸菌b230株と共培養する競合実験を行いました。CAPファージ1個とWTファージ9個のおおよその初期比率で共培養し、液体培養の新鮮な標的細胞上で4回継代しました。それぞれの継代後、CAPとWTファージ粒子の相対的な存在量が評価されました。CAP α20.4は4回で68%、CAP α15.2は2回で86%に達し（図4g-h）、WTファージと比較してフィットネスが向上していることが示されました。
最適なCAPカクテルの選択と特徴づけ
15種類のCAPの活性を、大腸菌パネル（n = 429）に対して、増殖速度アッセイを用いて試験した（補足図5）。個々のCAPは、試験した菌株の4.1〜29.4%に対して活性を示した。CAPを最大限に活用するため、広範で相補的な活性スペクトルを持つCAPを合理的に組み合わせることを目指した。そこで、個々の活性を用いたインシリコ予測に基づき、CAPカクテルのサブセットを作成し、in vitroでのコンビナトリアル性能を試験しました。その結果、我々の予測によく合致していることが分かりました（補足図6）。最初の15種類のCAPは、宿主域のプロファイルに基づいて4つのクラスターに分類することができました（補足図5）。次に、カクテルの予測において宿主域が重複していることから、最下位の7つのCAPを除外しました（補足図7）。そこで、8つのCAP（α15.2, α15.4, α17.2, α20.4, α46.4, α48.4, α51.5, α51.6 ）を選び、さらに評価を行った。まず、8つのCAPすべてをマウスに個別に経口投与し（n = 3）、その正規化回収率（補足図8）から、すべてのCAPが糞便から回収できることが示された。次に、加速条件下（40℃、n = 3）でのin vitro安定性を評価した。これらの結果に基づき、2つのCAP（α15.4、α17.2）は、その力価が出発物質の1％以下に低下したため、選択解除された（補足図9）。得られた6つのCAPをマウスの有効性モデルで個別に試験し（n = 6）（補足図10）、これらの結果をシミュレーションカクテルの予測宿主範囲（補足図11；n = 15）と組み合わせ、感染のために表面受容体を補完的に使用することを検証した結果、SNIPR001の最適CAPとしてCAP α15.2，α20.4，α48.4，α51.5 を選択しました。
CAPα15.2、α20.4、α48.4、α51.5の祖先は、Tevenvirinae亜科に分類される。具体的には、α15、α48、α51はそれぞれ大腸菌ファージT2と96.4%、96.6%、96.1%の配列類似性を持ち、α20の近縁は大腸菌ファージRB69（96.8%、補足図12）である。SNIPR001のゲノムをインシリコ解析した結果、CAPは既知のトランスポザーゼやインテグラーゼ遺伝子をコードしておらず、このファージは温帯性でないことから、細菌細胞内にDNAを挿入する能力はないと予測された。さらに、ファージゲノムには抗菌剤耐性マーカーや病原性遺伝子は観察されなかった（補足表2）。SNIPR001 CAPが一般的なトランスダクションを起こすかどうかを調べたところ、トランスダクションの頻度のLODが2×10-7であり、トランスダクションを起こす証拠は見つからなかった（補足表3）。
個々のCAPから医薬品を開発する
4つの工学的ファージ粒子からなる安定した医薬品を製造するには、ファージと細菌の宿主コレクションを確立し、細菌マスターセルバンクとマスターファージシードを作成し、得られた4つの個々の医薬品物質を最終的にSNIPR001医薬品とする必要があります（補足図13）。化学・製造・管理（CMC）プロセスにおいて重要なことは、個々の成分の経時的安定性を維持することです。我々は、医薬品物質の段階で個々のCAPの力価を測定したところ、5ヶ月の保存期間中、安定性に問題があることを示すものは見つかりませんでした（補足図14）。CMCプロセスにおける人工ファージ部分の存在を確認するため、サンプルの全ゲノム配列決定に基づいて試験基準（補足表2）を設定した。4つのCAPはすべて受け入れテストに合格し、CRISPR-Casシステムの存在とCAPの参照配列との全体的な同一性が検証されました（補足表2）。原薬の最終的な放出試験基準を補足表4に示す。
SNIPR001は他の腸内関連細菌に影響を与えない
ファージを用いた治療は、マイクロバイオームの非標的属を妨害しないことが理想的であるため、SNIPR001の大腸菌に対する特異性は、大腸菌の近縁種である非大腸菌種、および腸内細菌の常在菌群に関連する様々な科を含む菌株パネル（および陽性対照としての大腸菌）に対する影響を調べることで評価しました。細菌は、CAPなし、SNIPR001カクテル、または個々のSNIPR001 CAPで培養した（n = 4）。CFU ml-1での増殖は、4時間にわたって評価した（ΔCFU ml-14 h-0 h）。並行して、陽性対照として大腸菌b2480を同条件で増殖させた（補足図15）。その結果、SNIPR001カクテルまたはSNIPR001 CAPのいずれかが大腸菌以外の菌株に対して有意な効果（P＞0.05、両側スチューデントt検定、Holmの方法でFDR補正）は認められなかったが、大腸菌の増殖は有意に阻害された（P＜0.05、両側スチューデントt検定、Holmの方法でFDR補正）。したがって、SNIPR001は、標的である大腸菌以外の腸内細菌叢に影響を与えないことが予想されます。
臨床標的集団におけるSNIPR001のin vitroホストレンジ
血液がん患者に関連する菌株における潜在的な影響を理解するために、SNIPR001の適用範囲を、当社の内部大腸菌パネル（429株）および臨床大腸菌382株セット（JMI研究所）に対してテストしました。これらのJMI株は、2018年から2020年にかけて4つの異なる地域（アジア太平洋54株、ヨーロッパ161株、ラテンアメリカ26株、北米141株：補足図16）で血液腫瘍科に入院した血流感染症の患者に由来する。患者集団の大腸菌の遺伝子型分布を全ゲノム配列決定で決定したところ、9つの系統群と118の多座位配列型（MLST：図5aおよび補足図17）を代表する多様性があることが判明した。大腸菌パネルに対するファージの感染性をスポッティングアッセイで記録しました。単一プラークが確認できない場合は、目に見える単一プラークを溶解ゾーンと区別した。すべてのスポッティングアッセイは二重で実施した。JMI大腸菌パネル382株ではSNIPR001の90.4±1.6%、内部大腸菌パネル（429株）ではSNIPR001の95.6±0.3%のカバー率が確認されました。さらに、JMIパネルでは53.1±7.7%にプラーク、37.3±6.1%にライシスゾーンが観察され、同様に内部パネルでは60.1±6.6%にプラーク、35.4±6.3%にライシスゾーンが見られた（図5b）。SNIPR001は、JMIパネルの53%を占めるB2ファイログループで100%のカバー率を示した。この系統群は、多剤耐性や病原性に相関している。さらに、SNIPR001は、多剤耐性（MDR）に分類される株の91.7%（n = 55）、カルバペネム耐性株の100%（n = 5）、拡張スペクトルβラクタマーゼ生産株の92.2%（n = 95）、ciprofloxacinやlevofloxacinなどのフルオロキノロンに耐性を持つ株の88.9%（n = 176）にも及ぶことを確認しています（図5c）。
図5: SNIPR001の臨床大腸菌に対するin vitroでの検証。
a, 9つの系統群と118のMLSTを持つ382株の大腸菌の臨床パネルを表示したJMI株の根付かない系統樹です。プラクティングデータは、1回のプラクティングレプリケートを反映している。長い分岐を持つ1株（大腸菌b4038）は、元の長さの37%に切り詰められている（切れ目で示す）。b, スポットアッセイにより、血流感染から分離された大腸菌382株（JMI研究所）の臨床パネルおよび社内の大腸菌429株パネルに対するSNIPR001の有効性を分析した。スポットアッセイは2回の独立した実験として実施され、バーは平均累積パネル割合を示し、ドットは事前の平均値に対する各複製株の結果を示す。 c, SNIPR001の適用範囲は抗生物質耐性表現型に依存しない。結果として、SNIPR001はカルバペネム耐性、ESBL産生またはMDRの大腸菌株の90%以上、フルオロキノロン耐性大腸菌株の89%を標的とした。各緑色または灰色のバーに示された数字は、382株のスクリーニングから生成された各耐性カテゴリーについて、それぞれSNIPR001に感受性または耐性の菌数を示し、所定の耐性を有する菌株の数にサブセットした。 d, 血液がん患者の糞便サンプルから分離したフルオロキノロン耐性大腸菌72株の中点根の系統樹。72株のうち合計67株がSNIPR001の4つのCAPSのうち少なくとも1つに感受性があることがわかる。e, dのフルオロキノロン耐性大腸菌（n = 72）の82%が、少なくとも2つの異なるCAPに感受性があることを示す冗長性分布。
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最後に、血液がん患者の糞便サンプルまたは肛門周囲スワブから分離されたフルオロキノロン耐性大腸菌株の臨床パネル（n = 72）においてSNIPR001を検証しました。この集団は、現在進めている予想される臨床標的患者集団に相当します（SNIPR001はFDAによりファスト・トラックに指定されています）。これらの菌株のサブセットは血流感染を引き起こした（図5d）。大腸菌の82%（n = 72）はSNIPR001の少なくとも2つ以上のCAPに感受性があり、93%の菌株はSNIPR001のカクテル全体に感受性がありました（図5e)。これらのデータは、有効スペクトルの改善に関して、個々のCAPと比較したSNIPR001の利点を示しています。
ミニブタにおけるSNIPR001の忍容性と回復性
SNIPR001の忍容性と消化管回復性は、雌のゲッティンゲンミニピッグで評価しました。2×1012PFUのSNIPR001またはビヒクルを経口投与した後、7日間にわたり血液および糞便を採取した。血漿からはCAPが回収されず、全身への曝露がないことが示された。一方、CAPはSNIPR001投与後7日まで糞便中に回収され、投与後24時間で2 × 107 PFUのピークを示した（図6a）。ミニブタは臨床症状を示さず、血液学や生化学のパラメータに有意な変化は見られず、特に、どの免疫細胞にも変化は見られず（補足図18）、SNIPR001が良好な耐性を有することが裏付けられた（補足図19、22〜25、および補足表5）。同様の回復が個々のCAPで得られた（図6b）。結論として、SNIPR001はゲッティンゲンミニピッグにおいて、胃腸の回復を伴う十分な忍容性があるようです。
図6：マウスおよびミニブタにおけるSNIPR001のin vivo評価。
a, ミニブタに2×1012PFUのSNIPR001（n = 8、緑）またはビヒクル（n = 6、灰）を1週間にわたりp.o.投与し、毎日サンプリングした後の糞便中のCAP回収率。傾向線は平均回収ファージを糞便1gあたりPFUで示し、ドットは個々の測定点を示す。b、毎日サンプリングして1週間にわたり2×1012PFUの単一CAP（n = 8匹のミニブタがα15.2、α20.4またはα51.5のいずれかを受け、n = 7匹のミニブタがα48.4を受けた）をp.o.投与後のミニブタの糞便中のCAP回収。傾向線は平均的な回復を示し、点は個々の測定値を示す。回収率は、糞便1gあたりのPFUで測定した。33PFUグラム-1糞便のLOD（点線）。 c、様々な用量のSNIPR001（低、中、高についてn＝10、緑）、ビヒクル（n＝10、灰）またはゲンタマイシン（n＝4、灰）の1日3回投与による治療開始後8時間、24時間、48時間後のマウス糞便中のCAP回復。回復量はPFU g-1糞便で測定され、LODは371 PFU g-1糞便（点線）。d、マウス糞便における大腸菌b17の回復量は、用量の増加とともにSNIPR001の効果が増大することを示す。色の凡例およびグループサイズはcと同じ。 *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0. 001；統計解析は、すべてのSNIPR001治療群の比較には両側Kruskal-Wallis検定、Holmの方法で補正したビヒクルとの治療群の比較には両側Mann-Whitney U検定を各日別々に用いて実施した。正確なP値は、拡張データ表5に示されている。回復量は糞1gあたりのCFUで測定し、LODは371CFU g-1 fecesとした。e、CAPα15.2、α20.4、α48.4またはα51.5（各CAPについてn＝6）およびSNIPR001としての組み合わせ（n＝6）の1日3回の投与による治療開始後8時間および24時間におけるマウス糞便の大腸菌b17回復量は、CAP、ビークル（n＝6）およびゲンタマイシン（n＝3）の相乗効果を確認した。グラムあたりのCFUの差は、両側Mann-Whitney U検定で検定し、P値はHolmの手法で補正した。ビヒクルとSNIPR001の比較の調整済みP値は、2日目と3日目でともに0.022であった。
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マウスコロニーゼーションモデルにおける有効性
大腸菌を減少させる4種類のCAPのin vivoでの有効性を評価するため、文献にあるマウス腸管コロニー形成モデルを適応しました。44から大腸菌b17株のマウス腸管コロニー形成モデルを適応した（補足図20）。ストレプトマイシンを3日間投与してマウス消化管からグラム陰性菌を減少させた後、ストレプトマイシンの投与を中止し、動物に大腸菌b17株（1×107CFU）を1回経口接種した。定着したコロニーに対するCAPの有効性を評価するため、接種後2日目から投与を開始し、コロニー形成が低下し始める接種後4日目に試験を終了させました。CAPの最大曝露量を確保するため、マウスは1日3回、8時間間隔で投与され、2日間で合計6回投与されました。
マウスは、SNIPR001、ビヒクル（陰性対照）またはゲンタマイシン（陽性対照）の高、中または低用量（それぞれ2×1011PFU、2×109PFUおよび1×107PFU）を経口ガベージにより投与しました。糞便中のCAP回収率は、低用量で3×107 PFU g-1、高用量で1×1010 PFU g-1であり、GI通過が成功したことが確認された（図6c）。これらのレベルのCAPは、投与24時間後（3日目）に、ビヒクル処理マウスと比較して、標的大腸菌集団の有意な（P < 0.05, 両側Mann-Whitney Uテスト、FDR補正）用量依存的減少に関連していた。高用量では、SNIPR001は4 log10 CFU g-1の減少につながった（図6d）。ビヒクル群で示されたように、おそらく結腸菌株のクリアランスに起因する、4日目の細菌回復の変動が増加したにもかかわらず、同様の減少が、2日間の治療後（4日目）に観察された。中用量では統計的有意差は認められなかったが（P < 0.05, 両側Mann-Whitney Uテスト）、それでもビヒクル群と比較して数値的な減少が見られた。続いて、このモデルにおいて、個々のCAPの効能をSNIPR001カクテルと比較しました。この実験では、SNIPR001を用いた場合、単一のCAP（数値的には減少したが、統計的には有意ではなかった）と比較して、標的株のコロニー形成がより減少したことから、併用による有効性が強調されました（図6e）。また、ランダムに採取した生存菌の耐性プロファイルを測定したところ、SNIPR001カクテルに耐性を持つ分離株は見つかりませんでした。しかし、カクテルの4つのファージのうち3つに耐性を持つ1つの動物からの分離株が確認されました（補足図21）。全体として、これらのデータは、SNIPR001が結腸したマウスのGI管で標的大腸菌を減少させる能力を実証しています。
考察
本論文では、好中球減少症の血液がん患者において血流感染を引き起こすために頻繁に血流に移行する腸管大腸菌を標的としたSNIPR001の開発について説明する。フルオロキノロン系抗菌薬が適応外で使用されていますが、これらの患者さんには高い罹患率と死亡率が続いています。従来の抗生物質の使用により、細菌の耐性開発が著しく、2019年の細菌の抗菌薬耐性に起因する死亡者数は127万人と推定されており、大腸菌が主要な病原体である45。本研究では、免疫不全患者における抗生物質耐性に関連する課題に対処する可能性を持つ、工学的ファージの組み合わせであるSNIPR001の開発について説明します。
SNIPR001は、最先端のファージスクリーニング、ファージ尾部繊維工学、CRISPR-Cas武装を組み合わせています。従来、ファージ療法は実験的に用いられてきましたが、その特性は限定的であり、また、個々のファージの宿主域が狭いため、高度に個別化された方法で適用されることが多くありました46. 我々は、病原性ファージ47の操作を可能にしたファージ工学の最近の進歩、およびテールファイバー26の設計とファージのCRISPR-Cas武装能力を基に、SNIPR001を構成するファージの効力を高め、現在の治療法に耐性のある株を含む、より広範囲の臨床関連大腸菌を標的とすることを可能にしました。
臨床試験に適した開発候補品を提供するため、トレーサブルな製造工程を確立し、安定したCAP物質を得ることができました。我々のin vivoモデルで観察された大腸菌の4 log10減少は、以前の研究35,48と比較して明らかに改善されています。
SNIPR001は、MDR株で活性を示したことから、直交する抗菌アプローチといえます。さらに、正常なマイクロバイオームを維持することは、免疫学的な調子を維持するために重要であり、がん治療の結果に寄与する可能性があるという新たな証拠が得られており49、これは発熱性好中球減少症のリスクがある患者の予防的管理に関する最新のガイダンスにおいても認識されています7。このような背景から、SNIPR001のin vitro試験では、大腸菌に対する特異性が示され、試験された大腸菌以外の菌株に対するオフターゲット効果はなく、マイクロバイオームへの有害な影響が少ないことが示されています。将来的には、フルオロキノロンのような広域スペクトル抗生物質と併用するのではなく、SNIPR001のような狭スペクトル抗生物質の個別の組み合わせが第一選択薬として使用されるようになるかもしれません。
非臨床試験と同様に、in vitroおよび前臨床試験で得られた知見をヒトに適用できるかどうかについては、特にMDR株については調査が必要です。マウスではSNIPR001に対する構造的な耐性は観察されませんでしたが、耐性発現やCAPの組み合わせがもたらす相乗効果については、SNIPR001のような複雑な医薬品をin vivoで研究することは困難です。さらに、SNIPR001の活性スペクトルの一部は、プラーク化ではなく溶解帯形成によってもたらされており、この表現型が臨床効果にどのように反映されるかは調査する必要があります。そのため、SNIPR001の安全性を確認し、腸内細菌叢全体を乱すことなく腸内の大腸菌を減少させる能力を評価する臨床試験が現在米国で進行中です（NCT05277350）。SNIPR001は、ハイリスク患者集団に対する抗菌薬の分野において、潜在的に重要な治療上の進歩を示すものであり、ハイリスク患者集団の生命を脅かす他の抗菌薬耐性病原体に対するナロースペクトル療法の青写真となる可能性があります。
方法
ファージ収集と分離の手順
ファージスクリーニングの出発点は、162個の溶菌性WTファージのコレクションであり、82個は市販のカクテルと環境ソースから社内で分離され、71個はファージバンク（LyseNTech、韓国）から、2個はATCCから、1個はコペンハーゲン大学から、6個はトルコのキリカレ大学から提供された50 (Supplementary Table 1). ファージの単離は、大腸菌の菌株パネルを用いて行った（大腸菌パネルと単離手順を参照）。簡単に言うと、各大腸菌株の一晩培養物100μlを、各ファージカクテルまたは廃水サンプル100μlと混合した。室温で6分間インキュベートした後（この間に感染が起こるはず）、Ca2+を含む予め温めた上面寒天3mlを大腸菌／ファージまたは廃液の混合物に加え、LBプレート上に直ちに注いだ。あるいは、各カクテルの10倍希釈液を分離株で準備した芝生にスポットした。乾燥後、プレートを37℃で一晩インキュベートした。各プレートからプラークを摘み取り、500μlのSMバッファーに再懸濁し、ボルテックスして4℃で保存した。10倍希釈液を、プラークが最初に摘出された分離株上にスポットした。単一のファージに対応するプラークを得る可能性を高めるため、この手順を少なくとも3回繰り返した。前回の増殖で摘出した単一プラークから溶解液を調製し、DNAを抽出し、そのゲノムの塩基配列を決定した。
大腸菌パネルと分離手順
本研究では、3つの大腸菌パネル、1つの内部SNIPR Biomeパネル、2つの臨床関連パネルが含まれた。内部パネルは、血流感染症や尿路感染症の患者の血液、未病のヒトの糞便、動物、環境から分離された、系統的に多様な大腸菌429株で構成されています。これらの菌株は、7つの異なる系統群（A、B1、B2、C、D、E、F）、114のMLSTグループ、血清型（K型、O型）、抗生物質耐性プロファイル、分離された地理的位置の違いをカバーしています。
JMIパネルは、JMI研究所から入手した382株の大腸菌臨床コレクションから構成されています。これらの菌株は、世界28カ国以上、150以上の医療機関のネットワークで構成されるSENTRY Antimicrobial Surveillance Program（2018-2020）を通じて入手した、4つの地域（アジア太平洋 54株、ヨーロッパ 161株、ラテンアメリカ 26株、北米 141株）の血液内科や腫瘍内科に入院した血流感染症の患者から分離されました（ https://www.jmilabs.com/sentry-surveillance-program ）。
最後に、フルオロキノロン耐性大腸菌72株からなるパネルは、造血細胞移植のために入院した血液がん患者の糞便サンプルまたは肛門周囲スワブのいずれかから分離された51,52.
大腸菌は、液体培地または1.5％（wt/vol）寒天を含む寒天プレート上でLB中37℃、250rpmで培養された。必要に応じて、培養液にアンピシリン（100μg ml-1）、カナマイシン（50μg ml-1）、ゲンタマイシン（15μg ml-1）またはアミカシン（50μg ml-1）を補充した。コンジュゲーションドナーである大腸菌JKE201株（文献53）およびその誘導体の増殖のためのすべての培地に、1，6-ジアミノピメリン酸（80μg ml-1）を添加し、そのオーソトロフィーを補完した。
α15.2、α48.4、α51.5の生産に使用した大腸菌b52株とα20.4の生産に選択した大腸菌b2479株はいずれも系統群Aに属する。大腸菌b17株はSNIPR001 CAPすべてに感受性がありSNIPR Biome株バンクに属するためin vivo有効性モデルのコロナイズ株として用いた。
増殖速度論によるファージスクリーニング
162種類のWTファージに対する内部大腸菌パネル（n = 429）のin vitroでの感受性を、成長速度論アッセイを用いて評価しました。このアッセイは、細菌の増殖中に凝集するテトラゾリウム色素の紫色化合物への還元を追跡することにより、細菌の代謝活性を測定する。OmniLog (Biolog)を用いて、24時間にわたり15分ごとに比色測定値を記録した-文献から引用した。54. 曲線下阻害面積（iAUC）は、実験の過程における動態曲線から計算され、ファージ処理された細菌増殖曲線の正規化AUCと細菌のみのコントロールの間の比として定義された。感受性は、iAUC値≧0.2で定義されました。48個のファージを含むプレスクリーニングをMOI 10で実施し、その後、114個のファージをMOI 1でスクリーニングした。
iAUCを用いた細菌増殖抑制の計算
SNIPR001の増殖抑制効果は、OmniLog装置を用いて構築された増殖速度曲線を用いて決定された。タイムポイント間の測定における技術的なばらつきを抑えるため、Scalaのumontreal.ssj.functionfitパッケージを使用して、3次平滑化スプライン関数をデータに適用した。適切なρと重みの変数を特定するために、ρと重み0.1と0.5のあらゆる組み合わせを0.1刻みで適用した（つまり、0.1, 0.2, ... 0.5とする）。平均絶対誤差が最も小さいスプラインを選択し、曲線下面積（AUC）計算を行った。最初のタイムポイントにおける蛍光色素の初期累積量は、ウェルごとにわずかに異なり、特定のウェルのAUCを人為的に膨らませることにつながる。最良の平滑化平方スプラインを用いて、測定可能な成長が起こる前の最初の1.5時間の平均信号をすべての成長曲線から除去し、成長ゼロの信号切片に近似させた。iAUCの合計は、平滑化された正方形スプラインに沿った各タイムポイントのリーマン中点和として計算されました。最後に、iAUCをiAUC = 1 - AUCSample/AUCControlとして計算した。ここで、AUCSampleは所定の細菌とSNIPR001で作成したスプラインのAUCを指し、AUCControlは所定のファージやCAP、またはそれらの組み合わせなしで所定の細菌で作成したスプラインのAUCを指している。したがって、iAUC値は通常0と1の間にあり、0は増殖抑制がないことを、1は完全な増殖抑制を示す。生物学的および技術的なノイズにより、iAUC値がこれらの範囲外になることがありますが、無視できる程度と考えられます。
宿主範囲は、各繰り返しで iAUC < 0.2 となったパネルの割合として算出した。標準偏差は、iAUC < 0.2である菌株数の偏差として計算し、s.d.をパネルのサイズで割ることにより、パネルのサイズに正規化したものを報告した。
組合せ相補性予測
ファージとCAPの相補性は、相補性を仮定してシリコで評価しました-ファージの組み合わせのうち少なくとも1つのCAPが所定の細菌株を強く阻害できる場合、CAPの組み合わせはその細菌株を強く阻害すると仮定します。In vitro試験では、あるCAPまたはファージの組み合わせの1つ以上のメンバーによって阻害されたパネルの割合を計算することによって、総宿主範囲を推定しました。OmniLogスクリーニングでは、ファージのiAUCがコントロールと比較して0.2以上であれば、菌株は阻害されたとみなされました。プラッキングの結果を使用する場合、プラークまたは溶解領域が観察された場合、菌株は阻害されたと見なされた。
In vivo試験では、CAPの組み合わせによる効果は補完的なものと考え、個々のCAPの有効性は、ビヒクルと所定のCAPの間の1gあたりのCFUの差をlog10変換した値として評価しました。したがって、組み合わせの予測効果は、組み合わせの各メンバーについて、これらのlog10減少の合計として評価された。
インシリコ限界宿主域の計算
有効なCAPの組み合わせに参加するCAPの能力を概観するために、各CAPの限界宿主域を評価した。限界宿主域は、あるCAPを組み合わせに組み込んだときに得られる宿主域の指標です。これは、対象となるCAPを含む組み合わせと含まない組み合わせの宿主域の差として計算されます。各CAPの組み合わせの限界ホストレンジを計算することで、ホストレンジを追加する有用性に関して、異なるCAPを比較することができます。しかし、CAPパネルの構成によって、不公平な採点が行われることがあります。構成するCAPの1つが非常に類似した阻害プロファイルを持つCAPを組み合わせに追加すると、限界宿主域が不当に低くなってしまいます。同様に、阻害プロファイルが非常に類似しているCAPの組み合わせにCAPを追加した場合、限界効用利得が不当に高くなる可能性があります。スクリーニングされるCAPのセットが、異なるタイプの阻害性プロファイルを均等に表していない場合、一部のCAPは、誤解を招く限界宿主域分布を持つことになります。この問題を回避するため、同じWTファージに由来する複数のCAPを含むCAPの組み合わせは生成しないようにしています。
限界宿主域が良好な傾向にあるCAPを識別するために、最頻値を用いてCAPを差別化しました。各ファージの分布の最頻値は、R v. 4.1.0のdensity()関数を用いて、ファージの全体的な有用性を計算するために使用されました。
CRISPR-Casシステムによるファージのエンジニアリング
ファージは相同組換えを利用してCRISPR-Cas武装させた。pin（宿主Lonプロテアーゼの阻害剤をコードする）遺伝子とvs.7（保存された仮説タンパク質をコードする）遺伝子の間の領域に、ペイロードを挿入しました。組換えは、ファージ増殖中の細菌細胞で行った。細胞は組換え鋳型となるプラスミドを保有していた。組換えテンプレートプラスミドは、ファージゲノムに挿入することを目的とした配列を、挿入部位でファージ配列と相同な配列を挟んで〜200bpと700bpの間に持っていました。各ファージに対して、大腸菌に内在するI-E型CRISPR-Casシステム（Genbank CP032679.1）、すなわちcas3遺伝子（ygcB）とカスケード複合体をコードする下流遺伝子、casA（ygcL）、casB（ygcK）、casC（ygcJ）、casD（ygcI）およびcasE（ygcH）、ならびに選択した大腸配列を狙ってCRISPR配列の挿入が行われました。選択されたすべてのCAPについて、大腸菌に由来するcas遺伝子は同一である。CRISPR-Casシステムの挿入により、ピン-対7でファージDNAの〜7kbpの欠失が生じた。得られたCAPの配列はNGS（BaseClear）により確認された。
バイオフィルムにおけるCGVのトランスダクション
大腸菌b52細胞を96ウェルプレートで培養し、ペグの蓋にバイオフィルムを発生させた。各ウェルには、20mMグルコース、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2、0.1% Amicase（Sigma-Aldrich）および0.1%マンニトールを補充した180μl M9 medium（Sigma-Aldrich, M6030）を入れた。ウェルに1μlのオーバーナイトb52培養液を接種した。ペグ蓋を挿入し、マイクロタイタープレートを37℃で24時間静置培養した。次に、ペグ蓋を洗浄せずに新鮮な培地を入れた新しいプレートに移し、さらに24時間インキュベートした。インキュベート後、100μlの培地と100μlのCGV導入粒子（～108粒子）を各ウェル（3反復）に入れた新しいプレートを準備した。ペグ上で成長したバイオフィルムを、新しいプレート上に移す前に、滅菌H2O（200μl）で3回すすいだ。プレートは37℃で5時間静置培養した。
バイオフィルム中の細胞の代謝活性を測定するために、蓋を滅菌H2O（200μl）で3回洗浄してから、20μlのAlamarblue stain（Thermo Fisher Scientific）と180μlの培地を各ウェルに入れたプレート上に置いた。プレートを37℃で1.5時間インキュベートし、マイクロプレートリーダー（Synergy H1、Biotek）に移した。各ウェルについて、蛍光（励起、560nm；発光、590nm）および吸光度（600nm）を記録した。
プロモーター（PrelBまたはPbolA）のいずれかを有するCGVで処理したバイオフィルムの代謝活性は、cas遺伝子を転写するプロモーターを有しないCGVで処理したバイオフィルムの代謝活性と比較して報告された。
プラスミドと菌株の構築
CGV-EcCasを構築するために、大腸菌由来のcas3およびcascade遺伝子を増幅し、カナマイシン、ゲンタマイシンおよびアミカシン耐性マーカー、およびoriT RP4を含むColE1型プラスミド、pZE21（文献55）にクローニングした。
大腸菌の遺伝子を標的とする3スペーサー配列をコードするDNA断片は、AarI制限酵素で挟まれたgBlock断片（IDT）として合成した（gB149、gB150、gB152およびgB153；補足表6）。同様に、構成プロモーターJ23100（ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc）をgBlockフラグメント（IDT）として合成し（gB-d2；補足表6）、CRISPR配列の発現を駆動した。このアレイは、ダイレクトリピートで区切られた標的遺伝子座ごとに大腸菌のゲノムからのヌクレオチドを含んでいる。プロトスペーサー隣接モチーフは、大腸菌のゲノム中の選択された標的配列に隣接して配置されている。
大腸菌由来のcas3およびcascade遺伝子は、AarI制限部位を含むプライマー（TH556およびTH558；補足表6）を用いて増幅された。同様に、cas遺伝子の発現を駆動するpM0構成プロモーター（ggattaacaatataagctgaccttcaagtattgaat）は、プライマーTH402およびTH403で増幅された（補足表6）。cas3およびカスケード遺伝子をCRISPRアレイと組み合わせるために、すべてのプラスミドをBsaIで消化し、T4 DNAリガーゼでライゲーションした。最後に、CGV-EcCasを生成するために、プライマーTH712からTH715を用いたInFusion HDクローニングにより、CRISPR-Casシステムを共役プラスミドpZE21に移した（補足表6）。
形質転換アッセイ
一晩培養したものを新鮮なLB培地で希釈（1:100）し、指数関数期半ば（OD600≈0.6）まで培養した。その後、細胞をエレクトロポレーション用に調製し、氷冷したMilliQ水で50倍に濃縮した。その後、細胞を適切なプラスミドでエレクトロポレーションし、超最適ブロス中で37℃で1時間回復させ、抗生物質を補充したLBプレートにプレーティングした。
コンジュゲーションアッセイ
CGV-EcCasの移入および殺傷効率を評価するコンジュゲーション実験は、ドナーとして大腸菌JKE201を、レシピエントとして大腸菌臨床分離株（コントロールとしてターゲットおよび非ターゲットと大腸菌株を含む）を使用して確立した。プラスミドは、液体交配によって大腸菌のレシピエントにコンジュゲートされた。簡単に言うと、一晩培養したものを新鮮なLB培地で希釈し（1:100）、OD600≈0.4まで増殖させ、洗浄し、そして新鮮なLBでOD600≈0.25まで懸濁した。125μlのドナー細胞懸濁液と25μlのレシピエント細胞懸濁液を96ウェルマイクロプレートで5：1交配するために混合し、37℃で16時間インキュベートした。結合効率は、結合反応の希釈系列を、抗生物質を補充したLB寒天にプレーティングすることによって決定した（トランスコンジュガントを選択するため）。特異的殺傷効率は、90μlのコンジュゲーション反応物を選択プレートにプレーティングすることによって定量化した。CGV-EcCasプラスミドは、カナマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン耐性をコードし、トランスコンジュガントの選択を可能にする。生存率はプレート上のCFUを数えることで算出し、データは生存細胞濃度（CFU ml-1）として記録した。
同期CAP感染とcas3発現アッセイ
試験菌株をLBで一晩培養したものを100倍に希釈し、LBで37℃、振とうしながら定常期まで培養し、その後10mlのアリコートを50mlのファルコン管に分離した。その後、各アリコートに個々のCAPの高力価溶解液50μlを播種し、同条件でインキュベーションを継続した。さらに、各CAPの模擬10 ml LB容量にも50 μlのCAP溶解液を播種し、0分間のファージエニュメレーションに使用した。播種後5分、15分、30分で、全RNA抽出とファージ列挙のためにアリコートを採取した。ファージ列挙のアリコートは、シリンジフィルター（0.2μm、Sartorius AG）でろ過し、EoPアッセイに供した。総RNA抽出のために、個々の培養物の1mlアリコートを、卓上遠心分離機を使用して13.3kgで15秒間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、ペレットを直ちに冷たいRNA Later（Thermo Fisher Scientific、AM7020）に再懸濁し、抽出まで-20℃で保存した。GeneElute Total RNAキット（Sigma-Aldrich）を用いて、細菌からのRNA抽出のための製造者のプロトコルに従って、全RNAを抽出した。最初の溶出後、1μlのDnase I（1U µl-1）を加え、37℃で一晩インキュベートした。70℃で15分間インキュベートすることで反応を終了させた。RNAをGeneEluteカラムで再精製し、35μlのキット溶出バッファーで溶出した。Total RNA濃度をNanoDrop装置（Thermo Fisher Scientific, One/OneC）で推定し、0.5-2 µgのRNAをSuperScriptIII RT酵素（Thermo Fisher Scientific）とランダムデカマーを含むcDNA合成反応に加え、20-µl反応容量で合成を開始しました。cDNA反応液は水で100μlに希釈した。RT-PCR は、テンプレートとして 5 µl の cDNA、10 µl の Power SYBR Green PCR Master mix (Thermo Fisher Scientific) および 0.2 µM の各 PCR プライマーを用いて三重で実施した。PCRは、AB QuantStudio5システム（Applied Biosystems）で、Power SYBR Green PCR Master Mixの標準2段階サーモサイクリングプロトコルを用いて、60℃アニーリング/エクステンションで実施しました。gapA（参照遺伝子）のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、5′-cgctaacttcgacaaatgctggc-3′であった、 と5′-aggacgggatgatgttctgggaa-3′、cas3については5′-caagtatgctaccaacggctaaag-3と5′-ccaatcaaaatcaacgtcgagtga-3′である．これらのプライマーペアのシングルPCR産物は、融解曲線解析により確認した。転写物の相対レベルは、精製したPCR産物の10倍希釈液を標準として推定し、値はcas3転写物とgapA転写物の比として表した。
ファージ競合アッセイ
つのファージの溶解物を9：1（WT：CAP）比で混合し、ファージ混合物を、10mM CaCl2および20mM MgCl2を含む10ml 2xYT培地に加え、両方の競合ファージの標的となる大腸菌株b230を100μl一晩加えた。37℃の振盪インキュベーターで2時間培養した後、培養物を遠心分離し、上清の1μlを新しいb230の培養物に添加した。同じ手順を2回繰り返した。
ファージの比率は、3つのプライマーを用いたPCRによって評価され、その結果、WTファージとCAPの2つの特異的産物が得られた（α15/15. 2-5′-ttcattgcgtatttgtagatgaagctc-3′、5′-cttcagacttctgcttaagaagttacaagttct-3′、5′-gtacgactgattgatccacagc-3′；α20／20。 4-5′-atggctttattgctaccgggt-3′、5′-aaatctagagcggtcagtactcaaggaaatcatccagaaactc-3′、5′-tgctatctttggctccactgtgat-3′）。PCR産物を1％アガロースゲルで分離し、DNAバンドをSYBRsafeで染色し、ChemiDoc XRS + System (model 1708265, Bio-Rad) で可視化および定量化した。WTファージに対応するバンドのバックグラウンドを補正した強度を、同じレーンのCAPに対応するバンドの強度で除し、2つのバンド強度の比（WT/CAP）を求めた。全ファージ量（WT＋CAP）に占めるCAPの割合は、2つのファージの異なる混合物のセットを使用し、測定したバンド強度比（WT／CAP）に曲線を当てはめることによって作成した検量線に基づいて決定された。報告された値の推定誤差は20％未満である。
芝生殺傷アッセイ
試験菌株をLBで一晩培養し、109 CFU ml-1に調整した。CFU ml-1調整株の100μlアリコートを、CAP α15.2またはWT α15のいずれかの感染多重度が1になるように109 PFU ml-1の100μlと15mlファルコン管で混合し、溶融してプレテンパーしたトップアガー3mlと混合してLBプレートに撒いた。ローが固まった後、プレートを37℃で一晩インキュベートし、翌日にCAP α15.2またはWT α15群について生存コロニーの総数をカウントした。アッセイは、各実験が10回の技術的複製を構成する独立した生物学的複製として実施された。統計的有意性は、両側Mann-Whitney Uテストを使用して、両方の複製を使用して確立された。
一般的なトランスダクションアッセイ
各CAPのトランスダクション能力は、一般化トランスダクションアッセイによって評価された。簡単に説明すると、大腸菌MG1655 lamB::Cm上で各CAPを増殖させることにより、トランスダクションライセートを調製した。この株は、クロラムフェニコール選択マーカーを有するようにWT MG1655（700926、American Type Culture Collection）から改変した。実験は、よく知られた溶菌性T4ファージ（ネガティブコントロール）、およびその導入変異体T4GT7（文献56；ポジティブコントロール）と並行して行われた。このステップに続いて、WT大腸菌MG1655株を、0.5、0.1、0.01のMOIで各導入溶解液をOD600で感染させ、クロラムフェニコール含有LBプレートに撒いた。翌日、各CAPとコントロール、異なるMOIについて、トランスダクションコロニー数を記録した。トランスダクションの頻度は、トランスダクションの数をトランスダクションライセートの力価で割ったものとして計算した。
CAPの塩基配列解析
個々のSNIPR001 CAPの配列は、データベースを用いて抗生物質耐性、ビルレンス遺伝子、ライソジニー関連遺伝子（トランスポザーゼおよびインテグラーゼ）の存在について解析した（Extended Data Table 2）。さらに、CMCプロセスにおけるリリース基準のために（補足表2）、ファージサンプルは全ゲノム配列決定を用いて解析された。これにより、通常、全ファージゲノムの1000倍以上のカバレッジが得られる。アセンブリは、ファージの平均カバレッジ1000倍までデータをダウンサンプリングし、SKESAを使用してアセンブルすることで構築されます。サンプル間の差異を検出し、非主要変異を検出するために、BWA（バージョン0.7.17）を用いて生リードをアセンブリにマップし直しました。
液体殺傷アッセイを用いたファージ特異性アッセイ
SNIPR001 CAP（α15.2、α20.4、α48.4、α51.5）およびSNIPR001の殺傷特異性は、ヒト関連、好気性（n = 6）および嫌気性（n = 3）の細菌株のパネルに対する生物効力アッセイを通じて評価された。ファージによる殺傷の陽性対照として、大腸菌b2480株が含まれていた（Extended Data Table 3）。
簡単に言うと、一晩の培養をLBブロスで106 CFU ml-1に調整した。SNIPR001 CAPまたはSNIPR001（各CAPを等比で組み合わせたもの）を、4時間のインキュベーションの前にMOI 1で添加し、細菌増殖のコントロールとして未処理の細菌を並行して培養した。CFUカウントはファージ処理後0時間と4時間で記録し、データはアッセイ終点CFU/ミリリットル（4時間）から初期接種量（0時間）を引くことによりΔlog10 CFU ml-1で表されます。
CMC
ファージのin vitro安定性は、2〜8℃および加速温度（40℃）での製剤緩衝液の時間経過におけるCAPの力価を追うことによって評価された。ポリプロピレン製クライオバイアルに各ファージ1ミリリットルを充填し、適切な温度で保存した。各タイムポイントにおいて、各ファージの効力は、3連でEoP法により評価された。T0は保存開始前に測定した。
スポッティングアッセイとEoP
ファージ力価をカウントするために、ファージ溶解液またはSNIPR001 CAPの等量混合液を、それぞれSMバッファまたはPBSで10倍に連続希釈した。細菌ローンは、100μlまたは300μlの細菌一晩培養物を3mlまたは10mlの0.5%トップアガー（Ca2+およびMg2+を含む）に加え、これを短くボルテックスして丸または角LBプレートに流し込むことにより調製した。その後、試験ファージの希釈系列5マイクロリットルを芝生にスポットし、蓋を開けて室温で乾燥させた後、37℃で一晩培養を行った。b52株、b2479株、b17株はアッセイのコントロールとして使用し、各ラウンドのアッセイに含めた。
翌日、結果が評価された（Extended Data Table 4）。このアッセイでは、感受性株は、1ミリリットルあたりPFUでカウントできるプラークを生成する株と、プラークが見えないが細菌の増殖に障害がある（つまり、溶解帯がある）株と定義される。カバレッジは、感受性株の総数に対する割合を定義する。すべてのプレートの画像が記録された。EoPの結果を示す図は、まず力価をlog10変換し、その後標準偏差と平均値を算出した。臨床パネルと対照株は、2回の独立した実験で試験した。
動物および飼育環境
マウス試験は、Charles River社の雌のCD-1 IGSマウス（到着時に約6-7週齢）を用いて実施した。動物は、12時間の明暗サイクル（照明、07:00-19:00）下の気候制御された部屋（温度、20-23℃；相対湿度、30-70％）内で、ケージあたり3-5匹のマウスのグループに収容されました。標準的なペレットチャウと水道水は、自由摂取が可能であった。実験開始前に少なくとも7日間の馴化期間を設けた。Ellegaard Göttingen minipigs A/Sの30匹の雌のGöttingen minipigs（到着時約4-7ヶ月齢）を、忍容性および動力学的試験に使用した。動物は、実験開始前に少なくとも14日間の順化期間を設けた。豚は2～3匹のグループで飼育し、標準的な豚の食事を1日2回与え、水道水は自由摂取とした。すべての手順は、デンマーク環境食糧省デンマーク動物実験検査局のガイドラインに従い、機関ライセンス（BioAdvice、動物ライセンス2015-15-0201-00540）に従って実施された。
マウス腸内コロニー形成モデル
マウス腸内コロニー形成モデルは、文献から引用した。44. 簡単に説明すると、大腸菌b17を接種する3日前に、飲料水中のストレプトマイシン（5g l-1）による前処理を行い、常在菌のレベルを減少させた。0日目に、3×107 CFUの大腸菌b17の接種液を凍結グリセロールストックから調製し、0.25 mlですべてのマウスに経口ガベージで投与した。
投与は接種の2日後から2日間、1日3回実施した。各投与の直前に、4つのCAPを1：1：1：1の比率で混合し、SNIPR001を高、中、または低濃度で形成し、その結果、用量レベルは2×1011、2×109、1×107PFUとなりました。処理時に、マウスに0.1 mlの10%炭酸水素ナトリウムを経口ガベージで投与し、その後、0.3 mlのSNIPR001、生理食塩水（ビヒクル）または43.5 mg kg-1ゲンタマイシンを経口投与しました。
CAP回復および忍容性試験
ゲッティンゲンのミニブタには、まず、SNIPR001または単一のCAPの投与前に、ネオマイシン（60 mg kg-1、経口、1日1回、4日間）とセフキノーム（2 mg kg-1、1日1回、3日間筋肉内）を含む抗生物質のカクテルが与えられ、消化管内のグラム陰性菌のレベルを減少させてファージの複製が制限された。その後、動物を一晩絶食させ、軽く鎮静させてから、10％重炭酸ナトリウム50mlの経口投与後、100ml中2×1012PFUの単回CAP、またはSNIPR001カクテルを1回経口投与した。プラークアッセイによるCAPの定量化のため、毎日糞便サンプルを採取した。さらに、忍容性試験のために、C反応性タンパク質を含む血液学および血液化学分析、およびプラークアッセイのために血液サンプルを採取した。SNIPR001投与後の動物は注意深く観察され、体温は定期的に記録されました。
糞便中の大腸菌b17およびCAPの定量化
糞便サンプルをホモジナイズし、SMバッファーで連続的に希釈した。次に、各希釈液の10μlの三倍体を、ストレプトマイシン（1mg ml-1）を補充したマコンキー寒天プレート（Sigma-Aldrich、M7408）上にスポットし、大腸菌列挙のために37℃で12〜16時間インキュベートした。
プラークアッセイは、糞便サンプル中のCAPの列挙のために実施された。簡単に言うと、ホモジナイズしたサンプルを10,000gで10分間遠心分離し、上清を連続的に希釈した。各希釈液の10μlの3倍量を大腸菌b17オーバーレイにスポットし、37℃で12～16時間インキュベートした。
インビボ抵抗体の存在を定量化するために、3つの異なる時点の中用量グループの各マウス糞便サンプルから3つのコロニーをマコンキー寒天プレートから摘出した。コロニーをLBブロス中で37℃で12〜16時間インキュベートし、LB寒天プレート上でトップアガーオーバーレイを作るために使用した。その後、プレートをLAFベンチで15分間乾燥させた。SNIPR001カクテル、ならびに4つの個々のCAPを、1×105 PUF ml-1のストックから希釈系列としてスポットした。対照として、コロニー形成株である大腸菌b17の寒天培地を同じようにスポッティングした。プレートは蓋をしたままLAFベンチで乾燥させ、その後37℃で12〜16時間逆さまにして培養した。
JMI産大腸菌の全ゲノム配列決定
全ゲノムDNAは、KingFisher Cell and Tissue DNA kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて、ロボット型KingFisher Flex Magnetic Particle Processor（Thermo Fisher Scientific）ワークステーションで抽出・精製された。
全ゲノムDNAは、ライブラリー構築のための入力材料として使用した。Nextera XTライブラリー構築プロトコルおよびインデックスキット（イルミナ）を用いてDNAライブラリーを調製し、MiSeq Reagent Kits v3（600サイクル）を用いてMiSeq Sequencer（イルミナ）で配列決定した。
耐性表現型の定義
大腸菌については、セフトリアキソン、セフタジジムおよび／またはアズトレオナムの最小発育阻止濃度（MIC）値≧2 mg l-1として拡張スペクトルβラクタマーゼ表現型を定義した（https://clsi.org/）。
カルバペネム耐性Enterobacteralesは、イミペネム、ドリペネム、メロペネム耐性でMIC＞2 mg l-1を示す分離株と定義した（https://clsi.org/）。
全ゲノムシーケンスデータのアセンブリ
Trimomatic57（バージョン0.39）を用い、「LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36」の設定で生シーケンスリードをトリミングした。トリミングしたリードは、SPAdes58（バージョン3.14.1）を用いて、デフォルトの設定でアセンブルしました。500bpより短いコンティグ、または配列深度が2倍以下のコンティグは、最終的なアセンブリから削除した。
臨床大腸菌の比較ゲノム法
MLSTは、2021年7月1日にダウンロードしたMLSTデータベースをMLST2リポジトリ（https://bitbucket.org/genomicepidemiology/mlst_db/src/master/）からダウンロードし、アセンブルした大腸菌のゲノムに対してMLST2（文献59）を用いて、デフォルトの設定で実施した。系統分類は、アセンブルされた大腸菌ゲノムに対して、ClermonTyping60を用い、デフォルトの設定で実施した。系統樹構築のための距離行列は、MASH61を使用して、k-merサイズを21、ゲノムあたり10,000スケッチで作成しました。その後、スケッチを比較し、ペアワイズでMASH距離を作成し、大腸菌ゲノムの距離行列を作成した。
ファージシンテニー解析
シンテニープロットを作成するために、最終カクテルに含まれる4つのファージと、近縁でよく知られている2つの参照ファージ（RB69 AY303349.1 とT2 NC_054931.1）のWT配列をRASTで注釈し、予測タンパク質配列を抽出した。各ファージの全タンパク質配列を、tblastn (v 2.12.0)を用いて他のファージゲノムと照合し、E値カットオフを1 × 10-10とした。次に、drawSvgライブラリ（v 1.9.0）を用いて、カスタムPython（v 3.7.10）スクリプト（Data availability参照）を用いてシンテニープロットを作成した。このプロットは、ファージゲノムを類似性の高い順に表示し、すべてのtblastnヒットを、タンパク質の同一性で陰影をつけたシンテニーブロックとして表示する。2つの参照ファージのタンパク質は、機能グループ「DNA代謝」、「構造」、「その他」のそれぞれに属するものとして手動で分類され、それに応じて色分けされた。
データ処理と可視化
図と主要統計量はRバージョン4.1.0を使用して作成した。図の生成には、以下のパッケージを使用した： RcolorBrewer v. 1.1-2, ape v. 5.5, ggsignif v. 0.6.2, ggpubr v. 0.4.0, matrixStats 0.59, reshape2 v. 1.4.4, ggimage v. 0.3.0, here v. 1.0.1, purr v. 0.3.4, ggtree62 v. 3.0.2, systemfonts v. 1.0.2, Cairo v. 1.5-12.2, cowplot v. 1.1.1, reaxxl v. 1.3.1, ggplot2 v.3 .3.3, openxlsx, v. 4.2.3, patchwork v. 1.1.1, dplyr v. 1.0.7, ggh4x v. 0.2.3. 平均値および標準偏差は、例えばlog10スケールが使用されている場合、log10変換後に算出される。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細は、本記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご覧いただけます。
データの利用可能性
この研究で生成されたすべてのデータと結果は、https://github.com/sniprbiome/SNIPR001_paper に寄託されています。追加のデータは、論文、オンラインメソッド、補足表で入手できます。結果を再現するためには、それ以上のデータは必要ありません。
ファージゲノム配列は、Genbankにアクセス番号OQ067373 - 76で寄託されている。
MLSTデータベースは、2021年7月1日にMLST2リポジトリからダウンロードした（https://bitbucket.org/genomicepidemiology/mlst_db/src/master/）。CAP配列のアノテーションには、ResFinder 4.1 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder), VirulenceFinder-2.0 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/), PHASTER Prophage/Virus DB (https://phaster.ca/) などのツールやデータセットを使用しました。
コードの入手方法
本研究に必要なすべてのコードは、https://github.com/sniprbiome/SNIPR001_paper で入手可能です。
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謝辞
SNIPR Biomeは、Combating Antibiotic-Resistant Bacteria Biopharmaceutical Accelerator (CARB-X)からの資金提供を了承しています。本書で報告された研究は、CARB-Xの支援を受けています。CARB-Xのこのプロジェクトの資金は、ASPR/BARDAからの協力協定番号IDSEP160030とWellcome Trustからの賞によって支援されています。内容はあくまで著者の責任であり、必ずしもCARB-Xまたはその資金提供者の公式見解を表すものではありません。また、SSI社（デンマーク）およびMinerva Imaging社（デンマーク）の共同研究者の原稿への貢献に感謝したい。図1のイラストを描いてくれたE. Søndberg（SNIPR BIOME）に謝意を表したい。
著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した： Yilmaz Emre Gencay, Džiuginta Jasinskytė, Camille Robert, Szabolcs Semsey, Virginia Martínez, Anders Østergaard Petersen.
著者および所属
SNIPR BIOME ApS, コペンハーゲン, デンマーク
Yilmaz Emre Gencay, Džiuginta Jasinskytė, Camille Robert, Szabolcs Semsey, Virginia Martínez, Anders Østergaard Petersen, Katja Brunner, Ana de Santiago Torio, Alex Salazar, Iszabela Cristiana Turcu, Melissa Kviesgaard Eriksen, Lev Koval, Adam Takos, Ricardo Pascal, Thea Staffeldt Schou, Lone Bayer、 Tina Bryde, Katja Chandelle Johansen, Emilie Glad Bak, Aurelie Gram, Joana Carvalho, Lene Jessen, Björn Hallström, Jonas Hink, Birgitte Damholt, Alice Troy, Mette Grove, Jasper Clube, Christian Grøndahl, Jakob Krause Haaber, Eric van der Helm, Milan Zdravkovic & Morten Otto Alexander Sommer
JAFRAL, リュブリャナ, スロベニア
フレンク・スムレカー（Frenk Smrekar
JMIラボラトリーズ、ノースリバティ、IA、米国
ティモシー・B・ドイル
米国ニューヨーク州ニューヨーク市ワイルコーネル医学部感染症部門
マイケル・J・サトリン
ノボノルディスク財団バイオサステナビリティセンター、DTUバイオサステイン、デンマーク、コンゲンス・リングビー
モーテン・オットー・アレクサンダー・ゾンマー（Morten Otto Alexander Sommer
寄稿文
E.v.d.H., J.K.H., K.B., Y.E.G., D.J., V.M., C.R., A.S., A.S.T., J.C., L.J., B.D., M.G.,J.H., A.T.,J.C., C.G, M.Z. and M.O.A.S. は本作品を構想し設計した。K.B.、Y.E.G.、D.J.、V.M.、C.R.、A.S.、S.T.、A.T、 L.B.、 T.B. 、M.K.E、 K.C.J 、 L.K 、 R.P. 、 T.S.S 、 i.T. 、 A.Ø.P.、E.G.B.、B.H.、A.G.、M.J.S.、J.K.H.、E.v.d.Hがデータの取得と解析に携わりました。すべての著者がデータの解釈と最終確認に貢献した。
対応する著者
Morten Otto Alexander Sommerに対応する。
倫理的宣言
競合する利益
SNIPR Biomeに所属するすべての著者は、SNIPR Biomeの現在または過去の従業員であり、株式またはワラントの保有者である可能性がある。F.S.とT.B.D.は、SNIPR Biomeの下請け業者である。M.J.S.は、Merck、BiomérieuxおよびSNIPR Biomeから研究資金を得た。M.J.S.はSNIPR Biomeの無給のコンサルタントであり、塩野義製薬のコンサルティングを受け、AbbVieのデータ安全性監視委員会に参加したことがある。本記事に記載された資料に基づき、特許出願が行われています。SNIPR、CRISPR-Guided VectorsおよびCGVは、SNIPR Biome ApSの商標です。SNIPR Biomeは、これらの側面について特許保護を確保する過程にあるため、現段階では論文に含めることができないため、論文に含まれないデータは商業的に機密です。ご要望があれば、SNIPR Biomeは、競合する利害関係のない他の当事者とすべてのデータを共有することをいとわない。
ピアレビュー
査読情報
Nature Biotechnologyは、Antonia Sagonaおよび他の匿名査読者の査読への貢献に感謝する。
その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して、中立を保っています。
エクステンデッドデータ
エクステンデッドデータ 表1 a SNIPR001を構成する4つのCAPの結果、選択されたWTファージから生成された15のCAPの概要。アレイを構成する5つのスペーサーの標的となる大腸菌遺伝子とその配列を以下に示す。
フルサイズ表
拡張データ 表2 SNIPR001 CAP配列の解析に使用したデータベースのリスト
フルサイズの表
Extended Data Table 3 バイオポテンシーアッセイで試験した細菌株（好気性：n = 6、嫌気性：n = 3、好気性/嫌気性：n = 1）のパネル（グラム型分類、増殖条件、ソース/IDを示す）。
フルサイズの表
拡張データ表4 スポットアッセイの結果を評価し、標準46,63に従って菌株の感受性を定義するために使用した基準
フルサイズの表
拡張データ表5 図6Dに示したデータの統計解析の結果得られた正確なP値
全角の表
補足情報
補足情報
補足図1-25および補足表1-6。
報告書の概要
権利と許諾
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズのライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可する。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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Gencay, Y.E., Jasinskytė, D., Robert, C. et al. 抗菌性CRISPR-Casを持つ工学的ファージがマウスの大腸菌負担を選択的に軽減する. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01759-y
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2022年5月31日受領
2023年3月22日受理
2023年5月04日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41587-023-01759-y
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医薬品開発
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分子生物学
前臨床研究
ネイチャーバイオテクノロジー（Nat Biotechnol） ISSN 1546-1696（オンライン） ISSN 1087-0156（プリント）。
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